机械刺激后快速动态的亚细胞重组拟南芥表皮细胞模拟对真菌和卵菌攻击的反应

埃德里安娜·R·哈德汉姆¹，
Daigo Takemoto^1，2＆
迷迭香G白^3.

BMC植物生物学体积8，文章号:63（2008）引用本文

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摘要

背景

植物细胞对潜在的真菌或卵菌病原体的反应是通过建立基础防御反应，包括细胞质的聚集，细胞骨架、内膜和其他细胞成分的重组，以及感染部位下方细胞壁对应的发展。这种反应是由不适应的、无毒的和有毒的病原体诱导的，在大多数情况下，对植物表面的微生物达到渗透抗性。为了探索触发这种亚细胞反应的信号的性质，并确定其诱导的时间，我们监测了gfp标记的肌动蛋白、微管、内质网(ER)和过氧化物酶体的重组拟南芥植物-用微针接触表皮表面后。

结果

3 - 5分钟内接触表面拟南芥子叶表皮细胞与细细的玻璃针或钨针、肌动蛋白微丝、ER和过氧化物酶体在与针接触点下方开始积聚。在接触部位肌动蛋白索聚焦后形成密集的肌动蛋白斑块。接触细胞表面诱导微管局部解聚，形成微管缺失区，围绕针尖下方的gfp微管蛋白密集斑块。当针穿过细胞表面时，肌动蛋白、gfp -微管蛋白、ER和过氧化物酶体的浓度集中在接触部位，当针被拔出时迅速分散。

结论

我们的研究结果表明，植物细胞可以检测到微针对表皮细胞表面的轻微压力，并以类似于潜在真菌或卵菌病原体攻击时诱导的方式重组亚细胞成分。本研究结果表明，在植物与病原菌相互作用过程中，植物感知到病原菌试图侵入表皮细胞表面时所施加的物理力，从而诱发了基础防御反应。

背景

植物-病原体相互作用的早期研究记录了入侵病原体细胞下细胞质流和细胞质积累的活性的增加，这是植物对其表面微生物反应的第一个结构表现[1- - - - - -4]。细胞质聚集伴随着细胞骨架和内膜成分的重组，这些成分集中在感染部位[5- - - - - -8]。细胞质重组之后是细胞壁增厚和加强，在入侵的病原体下方形成壁位或乳突[9]。由于胼胝质的局部沉积和其他细胞壁成分和抗微生物化合物(包括酚类物质、硅、H₂O₂和致病相关的蛋白质[10- - - - - -12]。壁对位一旦形成，就构成了抵御入侵病原体的增强物理和化学屏障，是基础防御反应的核心组成部分[9，13，14]。这种基础防御反应是非特异性的，因为它是在非宿主、不相容或相容相互作用开始时出现的。这种穿透性能够成功地阻止大多数真核微生物的攻击。

细胞壁物质和毒素的局部分泌依赖于肌动蛋白骨架，肌动蛋白骨架被认为负责内质网的分布，并负责将dicyosomes、分泌囊泡和其他细胞成分运输到感染部位[15- - - - - -19]。通过对gfp标记的细胞成分的研究，在活细胞中探索了病原体攻击期间细胞骨架和内膜重组的动态[20.- - - - - -24]。这些研究表明，一旦启动，植物细胞成分的重排可以迅速发生。例如，ER的分布和形态在a下重组开始的15分钟内发生了广泛的变化疫霉突变菌丝在外表皮细胞壁上生长[20.]。然而，很难确定亚细胞反应的诱导时间与感染阶段的关系。

鉴于接种非适应性、无毒和毒真菌或卵菌后诱导亚细胞重组缺乏特异性，我们假设该反应可能由病原体试图穿透植物表皮时施加的压力的物理检测触发。在这里报道的研究中，我们通过监测表皮细胞中gfp标记成分的反应来验证这一假设拟南芥当用细的微针轻轻触摸子叶时。我们的研究结果表明，在3到5分钟内，植物细胞对这种机械刺激做出反应，表现出与病原体入侵期间观察到的相似的亚细胞重组。

结果

图片收藏

在用微针接触子叶表面前后，通过外表皮细胞壁下的皮层细胞质收集z系列光学切片，对gfp标记细胞成分的组织进行成像。在将针与细胞壁的外表面接触之前，确定皮质细胞质的深度和扫描所需的光学切片的数量。在初步试验中，发现由5-7个切片组成的z系列是最优的，这意味着光学切片的间隔为0.8-1.0 μm，并且z系列之间的时间仅为20-40秒。

成像后，针接触前表皮细胞中gfp标记成分的排列(图。1)，针与子叶表面接触，连续收集z系列，持续20-60分钟。超过一小时的图像收集受到GFP荧光猝灭的阻碍。通过比较针尖的焦平面和皮质细胞质内荧光细胞器的焦平面，以及注意到针头缓慢前进时细胞壁和下层细胞质的焦点有轻微变化，可以判断针头已经接触到细胞壁的外表面。如果针头伸得太远，它就会刺穿细胞，导致细胞内容物突然和广泛的破坏，并经常导致细胞死亡。在大多数情况下，生成快照，即每个z系列中收集的图像的最大投影，用于数据分析。在较长的序列中，有足够的快照图像，可以使用Premier (Adobe)将它们编译成电影。在某些情况下，连续收集同一焦平面上的单个光学切片，以监测gfp标记的细胞器的快速动态。

在被玻璃或钨微针接触后，细胞的行为没有明显的差异。在大多数情况下，通过玻璃针可以看到gfp标记的成分，尽管在某些情况下，针后的荧光强度降低了(例如图。2 f j）.另一方面，钨针挡住了它后面的细胞器的视图，并且可以通过反射光线看到针尖的位置(例如图。3.，4，5）.

接触部位下方肌动蛋白微丝聚集

在被微针触碰前，肌动蛋白微丝位于皮层细胞质下的外表皮细胞壁答:芥子叶形成了一个由粗细电缆组成的网格，围绕着分散的细丝网络(图2)。1）.用微针接触子叶表面导致细胞内肌动蛋白丝的排列迅速改变。针接触约3分钟后观察到第一次变化(范围= 118-246 s;平均= 177±51秒，n = 6)，包括在接触部位出现一团细丝(图。2）.肌动蛋白丝的网状结构迅速组装成直径约10 μm的圆形荧光斑块。在相隔20-30秒拍摄的连续图像中，微丝的排列和斑块的形态发生了变化，表明阵列中肌动蛋白微丝发生了运动、聚合和/或解聚。细胞其他区域的肌动蛋白通常更稳定，尤其是肌动蛋白索在10-20分钟内只显示出微小的变化(图。2;附加文件1，2）.图中箭头所示的粗肌动蛋白索的位置。2例如，在整个51分钟的观察期内都保持了这种状态。如果微针脱离细胞表面，肌动蛋白斑块分散(附加文件2）.当微针再次与表皮细胞表面接触时，贴片在4分钟内重新形成(附加文件2）.

在四个序列中，有三个序列记录了针接触超过15分钟时的变化，肌动蛋白电缆在接触表面15 - 20分钟后聚焦在接触点上。3.;额外的文件3.）.在一个序列中，针尖下的荧光非常亮，其中无法区分单个微丝(附加文件)4）.在27分钟的观测中，这团明亮的漫射荧光云的形状和位置不断变化。

接触部位下方皮质微管阵列改变

在接触子叶表面之前，表皮铺装细胞皮层细胞质中微管的组织因细胞区域的不同而不同。在裂片延伸之间的颈部区域，微管形成平行阵列，横向排列于延伸方向(图2)。1 b）.在叶内，皮质微管组织不太好，没有明显的方向性。

皮层微管阵列的第一次变化大约在3分钟(范围= 129 - 259秒;均值= 196±56 s;N = 4)微针与外表皮细胞壁接触后。在微管阵列中观察到三种主要的反应。(1)弥散荧光的线性区域出现，通常是先前出现微管链的地方(图1)。4 a e）.(2)靠近针尖处出现密集的明亮荧光云(图2)。4 f-l;额外的文件5）.(3)在针尖荧光云周围形成一圈含有微管密度降低的细胞质，从而在接触点周围形成直径约20 μm的微管缺失区(图2)。4，5、5 b;额外的文件5）.微管缺失区的形成伴随着弥散荧光云的早期发展，直到针接触后约10分钟。随着漫射荧光云的持续扩大，微管耗尽区不再可见(图2)。5氟;额外的文件5）.

当每个z系列光学切片的快照(最大投影)被编译成电影时，围绕接触点的微管阵列内变化的动态是明显的(附加文件)5，6）.上述三种反应可见发生在相对稳定的微管链框架内，在观察的大部分时间内仅发生微小变化。针尖处明亮荧光云的大小和形状在连续的z系列之间以大约30秒的间隔发生变化，云呈现为局部集中的gfp微管蛋白的旋转区域。如果针穿过子叶表面，密集的漫射荧光云也随之移动，保持在接触部位的下方(附加文件)5，6）.漫射荧光的线性区域波动迅速。一些似乎从中央荧光云辐射出去，另一些来了又走，经常在消失之前出现横向移动。对单个光学切片的分析表明，线性漫射荧光束位于皮层阵列的下方，即它们比更稳定的皮层阵列离质膜更远。在实验中如图所示。4，5氟及附加文件5，针接触子叶表面约1小时后，弥漫性荧光云密度减小，可见皮层微管阵列围绕针接触点大致呈周向排列(图2)。5 e, 5 f;额外的文件5）.

微管阵列在控制中的观察答:芥未用微针接触的子叶显示，在这些细胞中既没有看到密集的荧光云，也没有看到皮质微管的周向排列。然而，漫射荧光的移动线性区域在不同的时间出现在不同的位置(附加文件7）.就像在被针触碰过的细胞中一样，弥散的细胞链位于稳定的皮层阵列下，这些阵列由界限明确的微管组成。

接触部位下的ER重组

在用针接触表皮细胞之前，内质网在皮层细胞质中形成了花边状的网络(图2)。1 c，6;额外的文件8）.在将针与外表皮细胞壁接触后，通常会有一个快速的，有时是短暂的反应，在针附近的ER晶格呈现出珠状的外观，因为ER管状切片的荧光减弱，晶格的间隙变得更加突出(图。6 b）.在大约4分钟内检测到更广泛的ER分布变化(范围= 146-289 s;均值=227±73 s;N = 3)接触子叶表面。此时，弥散荧光束在接触部位附近形成，尽管它们不一定集中在针接触部位(图2)。6 d - h）.同时，在接触部位聚集了明亮的弥漫荧光圆形区。这种明亮荧光区域的大小和强度随时间增加(图2)。6 d - h;额外的文件9）.当针从子叶表面抬起时，荧光聚集物分散;如果针穿过子叶表面移动，荧光聚集移动到接触区下方(数据未显示)。

为了确定如上所述，用针触摸子叶后观察到的所有变化是否与触摸反应直接相关，还在未用微针触摸的子叶中观察到ER的结构(附加文件8）.在这些对照组中，未接触细胞的ER网络成像显示，虽然没有观察到短暂的珠状和圆形荧光带的形成，但有时会形成与被触摸细胞中看到的弥散荧光束(附加文件)8(图A-C, E和F)。这些漫射荧光束在对照组细胞中形成的频率较低，而且比在被针接触的细胞中看到的荧光束更短暂。

过氧化物酶体聚集在接触部位下方

在用微针接触表皮细胞表面之前，过氧化物酶体分布在整个细胞质中，大多数是高度可移动的，在视野中快速移动(图2)。1 d;额外的文件10）.用针接触子叶表面约5分钟后(范围= 266-324秒;均值=297±29 s;n = 3)，过氧化物酶体开始在针尖下方积累(图。7问;额外的文件10）.一般来说，一旦过氧化物酶体移动到针尖的簇中，除了轻微的抖动运动外，它在整个观察期的剩余时间内都保持在那里。即使在针下形成了一簇过氧化物酶体后，距离接触点超过20-30 μm的其他过氧化物酶体继续在细胞周围移动。然而，随着时间的推移，该区域的过氧化物酶体被耗尽，而这些过氧化物酶体与针尖的簇无关。

讨论

植物细胞能够对其表面潜在的真菌或卵菌病原体做出快速反应。随着病原体感染结构的发展并试图穿透表皮，基础抗性机制被动员起来，在大多数情况下，成功地抑制了非适应性病原体对疾病的建立。在与病原体接触的植物细胞内，细胞质流加速，细胞质链集中在感染部位，并在病原体细胞下形成细胞质聚集体[1，13，25]。免疫荧光标记、细胞成分的gfp标记和药理学研究表明，细胞质分布和行为的这些变化与肌动蛋白细胞骨架的重组有关，并依赖于肌动蛋白细胞骨架的重组，肌动蛋白细胞骨架集中在感染部位[6，20.，21，26- - - - - -30.]。肌动蛋白细胞骨架的重组也伴随着ER的重排以及感染部位的dicyosomes和过氧化物酶体的聚集[20.，31]。这些变化被认为促进了感染部位细胞壁物质和抗菌化合物的局部分泌[15，16]。除了正常的细胞壁成分外，细胞壁的增厚区域，称为壁位，含有胼胝质，酚类物质，植物抗毒素和H₂O₂它们共同加强了细胞壁，使其成为抵御病原体入侵的更有效的屏障，并提供局部浓度的毒素，抑制和杀死入侵的病原体[11，13，16，32]。基础抗性是对非适应的、无毒的和毒性的真菌和卵菌病原体的反应[20.]，这表明存在一种触发因素，所有这些潜在的病原体都可以被植物检测到。其中一个触发因素可能是病原体试图穿透植物表面时施加的压力。

植物对机械刺激反应迅速。在30分钟内，触摸植物会引起基因表达的广泛变化，包括抗病基因的上调[33- - - - - -35]。它还会导致细胞内组织的快速变化。用玻璃或钨微针或毛细管接触细胞表面可导致叶绿体远离接触部位，或细胞核和细胞质向接触部位迁移[36- - - - - -38]。刺激的去除导致细胞质聚集消失，细胞核恢复到原来的位置[37，38]。目前的研究拟南芥含有gfp标记细胞成分的植物表明，接触植物表面也会诱导亚细胞成分的重组，类似于在试图感染时观察到的情况。在接触子叶表面的3 - 5分钟内，肌动蛋白、ER和gfp微管蛋白开始在接触部位下方形成密集斑块，过氧化物酶体开始在针尖下方的细胞质中聚集。亚细胞反应是高度动态的，肌动蛋白、ER和gfp微管蛋白斑块的形态不断变化，包括当针尖穿过表面时跟踪针尖，并在针压消失后几分钟内分散。

对表达多种不同结构的gfp标记肌动蛋白结合域的转基因植物中肌动蛋白阵列的研究表明，在某些情况下，并非肌动蛋白细胞骨架的所有成分都可见，并且/或肌动蛋白阵列的动力学和组织可能受到干扰[39- - - - - -44]。然而，没有证据表明这些问题发生在本研究中使用的GFP-hTalin植物中。事实上，肌动蛋白阵列集中在接触部位的速度，它在压力消除时分散的速度相似，以及这种响应时间与微管阵列相似的事实，都表明在GFP-hTalin植物中肌动蛋白动力学没有受到阻碍。在产生GFP- htalin植株的实验中，单个品系表现出一系列GFP荧光强度[20.]。为后续使用所选择的品系应具有中等水平的转基因表达(由GFP荧光水平指示)，且无表型异常[20.]。在我们的实验中，除了没有任何迹象表明这些植物的肌动蛋白阵列受到干扰外，这拟南芥GFP-hTalin线也被用于研究肌动蛋白在调节质体stromule形态和行为动力学中的作用[45]。在野生型和GFP-hTalin植物之间，没有发现质体或Stromule的形态或运动的差异，但Stromule的形成是一个非常微妙的过程，很容易受到干扰。总之，这些结果为目前研究中使用的转基因植物中肌动蛋白细胞骨架的完整性和正常动力学提供了证据。

随着时间的推移，肌动蛋白、ER和gfp -微管蛋白的初始浓度继续巩固。在接触点周围的一些现有的肌动蛋白电缆在新的或重新定向电缆集中在接触点之前被拆除。大量积累的证据表明，径向肌动蛋白阵列负责将各种细胞成分，包括过氧化物酶体、dictyosomes和分泌囊泡运送到攻击部位[15，17，46- - - - - -48]。除了实现细胞壁物质和毒素的局部分泌外，过氧化物酶体靠近感染部位被认为有助于其抗微生物功能[49- - - - - -51]。

对接触的持续反应包括在接触部位周围形成微管缺失区。类似的局部微管解聚区域已报道在感染欧芹，大豆和大麦疫霉、大豆霉、谷丹毒f . sp。hordei，分别[52- - - - - -54]。广泛的微管解聚也被报道发生在烟草处理数小时后拟南芥悬液培养细胞与隐连蛋白诱导素和轮枝菌属毒素，分别[55- - - - - -57]。微管解聚可能会增加细胞质中微管蛋白单体、二聚体或低聚物的水平，从而在接触部位下方形成密集的弥散荧光云(如图2)。4 h l，5中）.gfp微管蛋白和ER云的动态行为可能是通过持续的肌动蛋白驱动的细胞质运动而产生的，正如在大部分观察期间过氧化物酶体运动所表明的那样。在我们的研究中，通过机械刺激对ER网络和微管细胞骨架的干扰也导致了ER或微管弥漫性链的出现，这些链在皮质细胞质内移动。在没有接触过微针的对照组细胞中也看到了类似的链，但它们的频率要低得多，而且不局限于细胞中的任何特定位置。Cyr及其同事在研究烟草细胞表达MDB-DsRed或YFP-TUA6的皮层微管阵列动力学时，描述了在表达gfp -微管蛋白的植物中观察到的弥散束与模糊微管相似[58]。这些作者提出，微管的模糊图像是由于微管的运动没有锚定在质膜上。在本研究中观察到的弥散微管束与质膜的距离比聚焦微管阵列更大，因此不太可能附着在质膜上。在我们对细胞中的微管阵列对机械刺激的反应的研究中，在大多数情况下，这些弥散的微管链随后消失了。对这些数据的一种解释是，从质膜分离后，微管或微管束不太稳定并解聚。这种现象可能是微管阵列正常动力学的一部分，但也可能是生物或非生物因素机械刺激后微管阵列重构的重要机制。

人们可能会质疑真菌菌丝或其他感染结构是否能够施加足够大的压力或力以被植物细胞感知。事实上，这是毫无疑问的。现在已有多种技术方法用于计算或测量真菌和卵菌菌丝和附着性穿透钉施加的力，得到的值一般在5-100 μN [59- - - - - -63]。由于所涉及的结构尺寸很小，很难完全理解这些力的大小，但从长远来看，如果我们可以用一根手指在单位面积上施加相同的力，我们可以对抗重力举起25-500公斤的重量!

入侵病原体施加的力取决于病原体细胞的膨压以及其细胞壁与下面的植物细胞接触的面积和特性。尽管施加在宿主细胞上的实际压力会因病原体壁的抵抗而降低，但膨胀压力提供了侵入力的基础[64]。力(μN)等于压力(MPa， μN μm)²)乘以接触面积(μm²）.因此，如果壁施加最小的屈服阻力，菌丝的横截面积为300 μm²(直径约为20 μm)和0.4 MPa的膨胀剂可产生120 μN [59]。在大多数情况下，已测得的力小于给定膨胀压力下最大可能的力，而且，至少对菌丝而言，菌丝壁的机械强度只导致真菌菌丝实际施加的可用力的约10% [59]。然而，这可能不是附着渗透钉的情况，如下文所述。

真菌和卵菌菌丝通常产生0.2-0.7兆帕的膨胀压力[59]。截面积为80 ~ 500 μm²，这些菌丝的接触面积可达附着菌产生的穿透钉的500倍炭疽菌graminicola或稻瘟病菌。因此，为了在上述范围内产生侵入力，这些真菌附着囊积聚高浓度的甘油，产生6-8兆帕的膨胀压力，比普通汽车轮胎的压力大30-40倍[64- - - - - -66]。有证据表明，穿透钉的屈服阈值是最小的，因此基本上所有的膨胀压力都应用于穿透钉产生的侵入力[62，64]。因此，入侵真菌和卵菌施加的局部力是巨大的，与研究中使用的机械刺激一样，可以被植物细胞检测到，并用于触发基础防御。

大量研究表明，在渗透栓被识别之前，菌丝下方或附着胞下方的植物细胞可以发生细胞质聚集和肌动蛋白重组，这表明，至少在某些情况下，植物细胞可以在入侵开始之前检测到菌丝或附着胞的存在[1，7，13，21，25]。然而，由于很难知道病原体在入侵过程中何时充分加强了对植物表面的附着以保持接触，附着孢何时充分膨胀或何时首次开始渗透，因此很难评估植物对病原体存在的反应有多快。除了证明用微针接触子叶表面诱导类似于在病原体感染期间观察到的亚细胞重组外，这种形式的机械刺激可以比在植物-病原体相互作用期间更精确地确定响应的动态。因此，虽然观察到细胞质聚集、肌动蛋白重排或微管解聚发生在接种后15分钟或可见穿透钉前20-30分钟[1，25]，这里报道的研究表明，这些亚细胞反应可以在刺激后3-4分钟内发生。触摸可在类似或更短的时间内诱导胞质钙的短暂增加[67，68]。对于叶绿体的力学反应的建议[69]，这些观察结果与植物质膜中的拉伸激活通道在识别病原体的存在和诱导涉及短暂钙升高的信号转导级联中的作用一致，该信号转导级联迅速导致在基础植物防御反应中采用的亚细胞重组。

结论

我们的研究表明，用玻璃针或钨针轻轻接触植物细胞表面所施加的机械刺激，可以诱导与广泛的植物物种接种不适应的、无毒的和毒力强的真菌或卵菌病原体所观察到的相同的亚细胞重组。肌动蛋白微丝和索集中在接触部位，ER和过氧化物酶体积聚在针尖下方。接触点周围的皮质微管亚群解聚，在一小块集中的gfp微管蛋白亚基周围产生微管耗尽区。所有四种细胞成分的重组在用针接触细胞表面后的3到5分钟内开始，显示了植物细胞对机械刺激的反应速度。我们的研究提供了强有力的证据，表明植物细胞可以检测真菌或卵菌细胞在试图入侵植物表皮时所施加的力量，从而触发基础防御反应，最终导致位点定向分泌和壁对应的发展，从而成功地抑制大多数潜在病原体的进入。

方法

植物

转基因答:芥GFP-TUA6 (α-微管蛋白)，由T. Hashimoto博士提供[70];GFP-PTS1(过氧化物酶体靶向序列)，由S. Mano博士提供[46];GFP-tm- kkxx(具有Cf-9跨膜结构域的GFP和具有c端双赖氨酸基序的细胞质尾，提供ER定位)[71];和GFP-hTalin [20.]。种子表面消毒，在25°C(每天光照16小时)条件下在营养琼脂板上生长，如前所述[20.]。

显微镜

拟南芥表达gfp标记成分的子叶被正面朝上放置在显微镜载玻片上的凡士林涂片上，并通过用覆盖物部分覆盖子叶来固定。在TCS SP2共聚焦显微镜(Leica，德国)上使用63× NA 0.9倾斜物镜观察子叶的暴露部分。用氩离子激光在488 nm激发GFP荧光，并在495 - 520 nm捕获表皮细胞中发射GFP标记的成分。大多数图中显示的图像是z系列光学切片通过外表皮细胞壁下皮层细胞质的最大投影。图像使用Leica Lite软件生成，存储为TIF文件，并使用Adobe Photoshop 7.0软件(Adobe Systems Inc.， USA)处理。

通过使用液压微操作器(日本Narashige)将细玻璃(1.0 mm直径玻璃毛细血管，尖端直径1-5 μm)或钨(0.25 mm直径钨解剖探针，World Precision Instruments Inc.，美国，尖端直径1-2 μm)微针接触子叶表面，对外表皮细胞壁施加轻微的机械压力。通过比较皮质细胞质中gfp标记成分的焦平面与针尖的焦平面，确定针尖到子叶表面的距离。

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PubMed 公共医学中心文章谷歌学者

下载参考

确认

我们感谢T. Hashimoto博士、S. Mano博士和D.A. Jones博士为GFP-TUA6、PTS-GFP和KKXX-GFP提供种子拟南芥B.E.S. Gunning教授在电影文件转换方面提供帮助，J.D. Gates博士在力和压力的生物力学方面进行了有益的讨论。

作者信息

从属关系

澳大利亚国立大学生物科学研究学院植物细胞生物学组，堪培拉，ACT, 2601，澳大利亚
Adrienne R Hardham和Daigo Takemoto
名古屋大学生物农业科学研究生院植物病理学实验室，千古萨，名古屋，464-8601，日本
Daigo Takemoto
植物工业分部，C.S.I.R.O，堪培拉，ACT, 2601，澳大利亚
迷迭香G白

作者

埃德里安娜·R·哈德汉姆

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相应的作者

对应到埃德里安娜·R·哈德汉姆。

额外的信息

作者的贡献

ARH构思了这项研究，参与了设计和执行，并起草了手稿;DT对研究的构思和规划做出了贡献;RW参与了研究的设计，并进行了显微操作和显微镜检查。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

电子辅助材料

接触部位肌动蛋白微丝快速发育

附加文件1:。影片由94幅图像组成，肌动蛋白阵列下方与玻璃微针接触答:芥表达hTalin-GFP。电影中的每个图像都是通过外表皮细胞壁下皮层细胞质的六个光学切片的投影。影片从针头接触细胞表面开始，1小时5分钟后结束。大多数图像之间的时间间隔约为40秒。从电影中选取的图像如图所示。1。这部电影以大约200倍的实时播放。(mov 6 mb)

接触部位肌动蛋白斑块的形成、扩散和重新形成

附加文件2:。牛子叶外表皮细胞壁下皮层细胞质中可见肌动蛋白微丝答:芥表达hTalin-GFP。在a中星号所示的部位用玻璃微针触摸表皮细胞表面，以分和秒为单位的时间显示在a中图像后经过的时间。图像a - c显示在触摸细胞表面约6分钟后形成一小块肌动蛋白微丝。A中图像拍摄后约10分钟针接触。图D-F显示针从子叶上拔出后肌动蛋白斑块的扩散。G-I图显示当针再次接触同一位置的细胞时，肌动蛋白斑块发生了重组。G中的图像是在重新定位针再次接触表面1分钟后拍摄的。图像是7 (B, G-I)， 8 (C, E)， 9 (D)， 12 (F)或13 (A)光学切片的投影。Bar = 10 μm。(tiff格式4mb)

肌动蛋白索聚焦于接触部位

附加文件3:。影片由53个图像组成，肌动蛋白阵列下方与钨微针接触答:芥表达hTalin-GFP。电影中的每个图像都是通过外表皮细胞壁下皮层细胞质的六个光学切片的投影。针尖的位置由反射光的垂直线表示。影片开始于用针头接触细胞表面之前，28分钟后结束。大多数图像之间的时间间隔是20-25秒。在电影的后半段，肌动蛋白电缆集中在接触部位。这部电影以大约150倍的实时播放。从序列中选择的图像如图所示。2。(mov 5 mb)

在接触点的明亮的肌动蛋白云的动态

附加文件4:。影片由73幅图像组成，肌动蛋白阵列下方与钨微针接触答:芥表达hTalin-GFP。电影中的每个图像都是通过外表皮细胞壁下皮层细胞质的五个光学切片的投影。针的位置由v形阴影表示。影片开始于用针头接触细胞表面之前，28分钟后结束。大多数图像之间的时间间隔大约是20秒。接触点以下肌动蛋白的积累形成一个明亮的荧光斑块，似乎在针尖周围旋转。这部电影以大约150倍的实时播放。(mov 3 mb)

接触点下方微管阵列的变化

附加文件5:。影片由115幅图像组成，微管阵列下方与钨针接触答:芥表达TUA6-GFP [70]。电影中的每个图像都是通过外表皮细胞壁下皮层细胞质的五个光学切片的投影。针的位置由v形阴影(顶部中心)表示。影片开始于用针头接触细胞表面之前，1小时17分钟后结束。大多数图像之间的时间间隔大约是30-40秒。在用针接触细胞约4分钟后，明亮弥漫的gfp微管蛋白云开始在接触点积聚。弥散荧光的线性阵列似乎扫过皮层微管阵列的下方。这部电影以大约200倍的实时播放。(mov 13 mb)

微管阵列在接触点穿过细胞壁时的动态变化

附加文件6:。影片由95张图像组成，微管阵列下方与钨针接触答:芥表达TUA6-GFP。电影中的每个图像都是通过外表皮细胞壁下皮层细胞质的五个光学切片的投影。针的位置由v形阴影(顶部中心)表示。影片开始于用针头接触细胞表面之前，1小时11分钟后结束。大多数图像之间的时间间隔大约是30-40秒。在用针接触细胞约3.5分钟后，一团明亮的弥漫gfp微管蛋白云开始在接触点聚集。当针在子叶表面漂移时，聚集的gfp微管蛋白云也随之移动，保持在接触点的下方。当针尖从一个细胞移动到相邻的细胞时，荧光云在第一细胞中消散并在第二细胞中形成。这部电影以大约200倍的实时播放。(mov 11 mb)

对照子叶微管阵列的动态

附加文件7:。影片由100张图像组成，微管阵列下方与钨针接触答:芥表达TUA6-GFP。电影中的所有图像都是同一焦平面上的单个光学切片，每隔3-4秒拍摄一次，时长6分钟。在细胞壁下方的细胞皮层中，稳定的微管框架下，可移动的线性漫射荧光束在皮层阵列下扫过细胞。这部电影以大约18倍的实时播放。(mov 9 mb)

对照子叶表皮细胞内质网的动态变化

附加文件8:。叶子叶外表皮细胞壁下皮层细胞质中的内质网拟南芥表示GFP-KKXX [71]。子叶已被安装在显微镜载玻片上，但还没有用微探针接触过。总的来说，ER的网络是稳定的，其组织在观察期间没有变化。然而，在前三张图像(箭头)中，细胞的右上角出现了一些短暂的弥散荧光束，在4分18秒和5分12秒拍摄的图像中，细胞的左侧附近出现了一些弥散荧光束(箭头)。Bar = 10 μm。(tiff 7mb)

接触部位下方皮质内质网组织的动态变化

附加文件9:。电影由77个图像组成的ER在一个表皮细胞接触钨针答:芥表达GFP-KKXX。电影中的每个图像都是五个光学部分的投影;每个z系列之间的间隔约为35秒。当用针头触摸细胞时，电影开始，并显示在接下来52分钟内收集的图像。明亮的荧光表明聚集的ER积聚在接触部位下方。这部电影以大约200倍的实时播放。(mov 10mb)

过氧化物酶体在微针接触部位聚集

附加文件10:。电影组成的43图像过氧化物酶体在一个表皮细胞接触钨针答:芥表达PTS-GFP [46]。电影中的每个图像都是三个光学部分的投影，每个z系列之间的间隔约为15秒。当用针头触摸细胞时，电影开始，并显示在接下来的14分钟内收集的图像。接触子叶约5分钟后，过氧化物酶体开始聚集在针尖下方。从前8分钟观测中选取的图像如图所示。6。这部电影以大约100倍的实时播放。从该序列中选取的图像如图所示。7。(mov 2 mb)