杂合葡萄“赤霞珠”的物理图谱可以绘制抗病候选基因

背景

全基因组物理图谱有助于基因组测序、序列组装、候选基因定位和靶向遗传标记的设计。一个自动协议被用来构造一个葡萄赤霞珠的物理地图。针对高杂合度对contig组装精度的影响，讨论了结果的质量。抗病基因是葡萄的一个重要特性，它对抗病基因全基因组图谱的有用性随后被评估。

结果

物理图谱包括29727个BAC克隆，组装成1770个contigs，跨度715684 kbp，对应的基因组大小为1.5倍。图膨胀是由于高杂合度，导致等位基因BACs在两个不同的contigs中分离，或在含有两个单倍型BACs的contigs中局部误组装。遗传标记在染色体上固定了395个contigs或255,476 kbp。通过对葡萄基因组序列的末端序列进行BAC-by-BAC爆破，验证了全自动组装和锚固程序，揭示了7.3%的嵌合contigs。然后研究了非寄主和寄主抗性候选基因的物理图的分布，以及防御信号通路。在424个contigs中发现了NBS-LRR和RLK抗宿主基因，其中133个(32%)分布在染色体上，染色体上的NBS-LRR和RLK基因多呈簇状排列。在99个contigs中发现了非宿主和防御信号基因，它们分散在整个基因组中，没有可识别的模式。

结论

尽管有一些限制干扰杂合子克隆到contigs的正确组装，“赤霞珠”物理图是遗传图和基因组序列之间有用和可靠的中间步骤。该工具已成功用于复杂基因家族的快速定位，并加强了先前主要NBS-LRR集群和抗病共定位的线索位点的小道消息。

由大插入BAC克隆构建并锚定在连锁图上的物理图有助于全基因组霰弹枪(WGS)测序项目中的序列组装[1]，可进行基因/ qtl的位置克隆及基因家族的结构研究[2，3.]，并有助于从杂合或多倍体模式植物中分离同源基因[4］．

在植物中，已经为拟南芥［5]，高粱[6]，大米[7]，大豆[8]，苹果[9]、黑杨木[10]和葡萄藤[11］．基于BAC指纹的策略检测BAC克隆之间的重叠，以开发物理地图。简单地说，BAC克隆用限制性内切酶消化，片段通过电泳分离，产生条带图案。相邻无性系之间的重叠是通过对波段剖面的比较和计算共享波段的比例来识别的[12］．生产BAC指纹图谱的技术已经迅速发展，从使用一种到五种限制性内切酶，从基于琼脂糖的凝胶到基于测序仪的电泳来生成图谱[13］．结合使用几种限制性内切酶和丙烯酰胺凝胶或测序仪的方法通常被称为高信息含量指纹(HICF)，因为它们可以显著提高该过程的灵敏度。由于所有这些方法都没有应用于相同的生物材料，其性能并不是均匀可比性的，关于不同方案的优缺点的争论仍然存在[14］．例如，[开发的五酶限制方案]13]导致每个指纹的错误率更高，但与基于两种或三种酶限制的替代技术相比，灵敏度最高[15］．在本工作中，由于其较高的灵敏度和通量，采用了五酶限制方案。

葡萄基因组最近揭示了两个特点:葡萄是高度杂合的，它们来自一个古老的六倍体祖先[1，16，17］．通过全蛋白质组比较揭示了葡萄基因组多倍体起源[1]但使用STS标记或核苷酸比对无法检测到。因此，同源区域预计不会阻碍葡萄基因组物理图谱的构建，因为它们各自的指纹有本质上的不同。反过来，杂合度可能会影响BAC指纹的正确组装，就像它在DNA组装中的作用一样Ciona savignyi［18］．在poplar中，[10]，但在小道消息中多少被忽略了[11]在apple中[9］．本文深入分析了杨树杂合度对物理图谱构建的影响，揭示了此前在杨树中未被描述过的contig特征。研究还表明，最终的图谱是绘制抗病等农艺性状候选基因的有效工具，也是开发新的遗传标记的有效工具。

增强抗病能力是葡萄育种的主要目标之一[19］．根据寄主范围的宽度，植物可以分为两种防御类型。非寄主抗性在整个植物中是有效的分类单元对抗病原体的所有分离物。宿主抗性是第二种类型的抗性，在基因型到基因型水平上发挥作用:只有植物的某些基因型分类单元病原体所适应的对任何或所有致病菌株都有抗性。这种分类与基于相关机制和基因类型的分类是一致的。病原体相关分子模式(pamp)触发的入侵前屏障和反应，称为pamp触发免疫(PTI)，破坏病原体攻击植物的潜在能力。总的来说，非寄主抗性和PTI的概念是重叠的。宿主抗性是针对已获得抑制基础或pamp触发抗性能力的病原体的第二道防线。宿主抗性可以是完全的，也可以是部分的。在许多类型的植物中，完全抗性的机制是相似的。完全的宿主抗性由识别病原体效应物/抑制物或其细胞靶标修饰的R蛋白(效应物触发免疫，ETI)授予。R基因大多以簇的形式排列，这种物理组织产生新变异的速度比任何其他类型的基因都要快。20.，21］．ETI、PTI、完全宿主和非宿主抗性之间的联系由[22］．PTI和ETI都首先依赖于由受体进行的病原体识别，这些受体由PTI的跨膜蛋白组成[23，24]，以及具有核苷酸结合位点和富含亮氨酸重复结构域(NBS-LRR)或受体样激酶(RLK)的细胞质蛋白用于ETI [25］．免疫系统的这两个方面由下游信号通路的蛋白质连接，如SGT1和RAR1 [26- - - - - -28]，并通过水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)和MAPK级联通路的基因产物[29］．

非宿主抗性是一组异质基因及其指定的蛋白质的结果，涉及病原体的可及性/不可及性(即．lipase-likeEDS1, synthaxin-likePEN1，等)、细胞骨架重排及蛋白质周转(例如SGT1)、pamp引发的反应，以及毒性代谢物的合成[30.- - - - - -32］．最近，利用来自葡萄基因组序列的信息，确定了它们在葡萄基因组中的同源物位置[1，17]，这在研究开始时是未知的。相比之下，触发完全宿主抗性的基因都符合少数一类功能相似的受体编码基因。基因图谱数据为葡萄R基因家族的大小和基因组组织提供了线索[2，33，34]以及通过对基因组序列草图的调查[17］．

在本文中，我们提出(1)基于限制性内切酶BAC指纹的赤霞珠物理图谱的组装，(2)物理contigs在减数分裂连锁图谱上的固定，(3)使用该图谱来放置抗病候选基因，以及(4)抗性基因类似物的物理位置与表型之间的对齐位点基于桥接标记的病原体耐药性。本文还详细研究了赤霞珠基因组的高杂合度如何塑造了物理图谱的某些特征。

“赤霞珠”物理地图的构建

赤霞珠BAC文库的44,544个BAC克隆，约代表12.3个基因组当量[35]，使用[所述方法提取指纹11］．原始数据被修剪为背景信号、载体峰值、叶绿体克隆、板内污染和嵌合克隆。使用FPC 8.2并遵循[提出的迭代方法]，总共使用30,828个高质量指纹(70%)来组装地图。36］．在地图的最终版本中，29727个克隆被排序为contigs，而1111个克隆(3.6%)仍然是单克隆[见表]1］．物理图谱包括1,770个contigs，由650,622个独特条带组成，物理长度为715,684 kbp，比实际基因组大小大1.5倍。这些contigs平均由17.4个克隆组成，平均物理大小为404 kbp。该装配包括2982个(10%)可疑克隆(Qs)，这些克隆的位置不确定。这些克隆在577个(32.6%)可疑contigs中被发现。

物理图和遗传图的整合和物理图质量的评估

物理图谱和连锁图谱之间的比对是使用由[37]，并由[初步报告]38］．引物对PCR筛选18432个BAC克隆，对应6个基因组等价物，共鉴定出1833个BAC阳性克隆，平均每个标记对应5个克隆。在368个初始标记中，24个对整合无效，因为它们定位在没有产生有用指纹的BAC克隆上(15例)或在单胞胎克隆上(9例)。其余344个SSR标记固定在335个contigs上，覆盖220.2 Mbp，对应物理地图总大小的30.8%[见附加文件]1］．在这335个contigs中，一个独特的遗传位置可以分配给312个contigs，对应190 Mbp[见附加文件]2，黄盒子里的contigs]。其他contig的位置仍然不明确，因为物理定位在一个给定contig上的标记在遗传上被分配到不止一个连锁组[见附加文件]2，灰色盒子里的contigs]。在312个基因锚定的contigs中，82个(26.3%)被2个或2个以上的标记所锚定，覆盖面积64.1 Mbp，其余230个只被1个标记所锚定，覆盖面积127.7 Mbp。锚定的contigs平均大小为656.7 kbp，而非锚定的contigs平均大小为344.3 kbp。该地图可于[39］．

含有与本工作相关的基因且未被参考文献标记的Contigs葡萄属由定位于其他遗传图谱中的SSR标记固定[34]，利用新开发的SSR标记和SSCP标记[见附加文件]1］．这些标记被投射到参考上葡萄属地图与公共标记的地图对齐，并报告下划线和斜体[见附加文件2］．他们允许锚定额外的60个contig，将锚定映射的大小扩展到255 Mbp。这相当于总地图大小的35.7%[见表]2］．

物理图谱的质量使用两种检查方法进行测试:首先，对嵌合contigs的百分比进行估计，即来自不同基因组区域的BAC克隆虚假地组装在同一个contig中;其次，对物理contigs中BAC克隆顺序的可靠性进行分析。

两项独立试验用于估计嵌合contigs的百分比。第一个测试检测了118个有两个或两个以上基因标记定位的contigs。在28个(23.7%)contigs中，标记的遗传位置和物理位置不一致。分离独立的标记被发现在同一contig中物理连接。为了确定它是源于错误的遗传数据还是源于内在的基因组复杂性，即在contig组装中混合了BACs，对这28个contig进行了进一步检查。对于每个标记，使用PN40024基因组序列验证和确认相应引物对的基因组位置和唯一退火位点的存在[1］．因此，嵌合体不是由标记重复或错误放置引起的。几乎没有证据表明这可能是由于同源;只有contig 1769含有两个标记，指向葡萄基因组的两个同源区域。在第二次测试中，BAC克隆通过其独特的BAC末端序列(BES)与PN40024基因组序列进行比对。在由至少两个BACs组成的846个contigs中，有61个(7.3%)似乎是潜在的嵌合体。由于这一嵌合值远低于使用分子标记预测的值，因此对28个标记嵌合contigs的基因组序列进行了详细的BAC比对。在17个(61%)contigs中，这种不一致是由于单个BAC克隆与一个分子标记相匹配，在这17个案例中，有10个相同的分子标记也与其他contigs的BAC克隆相匹配。因此，在这17例病例中，除了局部误插入一个异体BAC外，contig的整体构建是正确的。在另外11例病例中，分子标记预测的嵌合体被BES在基因组序列上的位置所证实。 Some automatic steps of the assembling procedure were reconsidered. The BAC clones to which the questionable molecular markers belong were not joined to the contig by the merging steps during the iterative assembly [15]，但在之前的自动组装和第一个DQing步骤中，它们混淆了。事实上，在这11个contigs中，有10个显示出可疑的高Q克隆比例(20%至67%)，而平均值为9.8%。这11个连续体是用萨尔斯顿的1e-60分值重建的。11例中只有2例(18%)嵌合contig的物理连接可能断裂。可以说，这些类型的contigs隐藏着一种生物复杂性，无法使用自动程序正确处理。

第二项评估物理图谱质量的研究包括详细分析BAC克隆如何在两个任意选择的基因组区域内的contigs中彼此相对有序。第一个区域位于LG 5的顶部，位于标记VVMD27和UDV-060之间，并被两个物理contigs覆盖。第2区位于LG 17标记VMC9G4和VVIB09之间的3个片段。在相应区域的所有BAC无性系上重新标记SSR标记[见附加文件]3.］．BAC克隆随后使用其BES与PN40024基因组序列进行比对。

观察到两个主要问题。第一个问题是一个contig内BAC克隆的顺序不正确，产生了明显的重复位点在物理地图中。contig 207显示了这种效果的一个示例[参见图]1］．VVMD27基因标记被物理定位在两组独立的BAC克隆上，就好像它们属于一个重复的区域。VVMD27引物对在基因组组装上排列在唯一的位置，携带VVMD27的BAC克隆的末端序列也排列在相同的单个基因组区域[见图]1 b]，表明物理contig中明显的重复对应于单个轨迹在基因组序列中。vvi52和UDV-060也可以以不太明显的方式看到相同的明显的contig内重复模式[见图]1］．杂合度的第二个效应是将两个不同单倍型的BAC克隆组装成独立的contigs，这在lg17中得到了明显的体现。在本例中，未观察到人为的contig内重复，但鉴定出两个包含标记VVIB09等位基因BAC克隆的独立contig[见附加文件]3.］．最大的一个(contig 1676)由32个BAC克隆组成，而另一个(contig 2388)仅由3个BAC克隆组成，对应于VVIB09在contig 1676中靶区的交替单倍型。VVIB09引物对及其所有BAC克隆在PN40024基因组序列上的唯一匹配证实contig 1676和contig 2388为等位基因。这两种效应都导致了物理图谱的膨胀，并可能解释为什么“赤霞珠”物理图谱的总长度是葡萄基因组的1.5倍。

BAC克隆中抗病基因同源物的鉴定

通过PCR筛选18,432个BAC克隆，筛选出三种不同类型的抗性基因(非寄主、寄主和信号相关抗性基因)在网上77,237个BAC-end序列的筛选[见表]3.］．

在检测nbs - lrr的66对引物中，有61对鉴定出234个非冗余BAC克隆，其中26个引物对2 ~ 3个不同引物对呈阳性。182个与nbs - lrr相似的葡萄ESTs在tBlastX搜索中匹配985个BES。相应的BAC克隆与PCR鉴定的克隆进行冗余检查:962个BAC克隆是唯一的，使含有NBS-LRRs的BAC克隆数量增加到1196个。这些新的BAC克隆大多是通过横跨LRR区域的EST查询识别出来的(791)，而横跨NBS区域的查询大多是从PCR筛选的6×子文库中不包括的一半文库中识别出来的(171)。4对针对RLK基因家族的引物鉴定出14个BAC克隆。使用27个RLK基因片段对BES进行查询，从而鉴定出356个额外的BAC克隆，使总数增加到370个。

30个引物对靶向涉及非宿主抗性和信号通路的基因[见附加文件]4]可鉴定出144个BAC克隆，平均每个引物对有4.8个BAC克隆。只有引物对靶向SGT1没有扩增任何BAC克隆。用于引物设计的葡萄est也用于BES blast搜索，获得112个BAC克隆。结合PCR筛选和在网上结果表明，含有非寄主抗性和防御信号基因同源基因的非冗余BAC克隆数量增加到249个。

NBS-LRR和RLK基因对宿主抗性的物理组织

在包含宿主抗性基因的1527个BAC克隆中，1097个BAC克隆(72%)被组装成424个contigs，其中346个(占物理图谱所有contigs的17%)包含NBS-LRR序列。其中94个被[的参考标记标记分配到连锁群中37］．新增21个contigs被其他SSRs锚定，使总数增加到115个，对应27%[见图]2和附加文件2，红框]。高达16%的含有宿主抗性基因类似物的contigs对NBS-LRR和RLK类均呈阳性。特别是，47%的病例在含有NBS-LRRs的contigs中发现了RLKs[见表]3.］．

含有NBS-LRRs的contigs存在于所有染色体上，且在每条染色体内分布偏斜，而含有RLKs的contigs则更均匀地分布在整个基因组中[见图]2和附加文件2，绿色盒子]。LGs 12、13、18在nbs - lrr中数量最多，lg14含有RLKs的contigs数量最多[见图]3.］．

SA、JA、ET和MAPK级联信号通路的非宿主抗性基因同源物和基因的物理定位

在249个含有非寄主抗性和信号基因的BAC克隆中，167个(67%)被组装成99个contigs。其中38个由[37]和新开发的SSRs的19个，将该类别的锚定contigs总数提高到57个[参见附加文件]2，蓝盒子]。含有非寄主抗性和信号通路基因的Contigs均匀分布在整个基因组中，尽管含有与信号通路基因同源序列的Contigs更常在lg14、15和19上发现[见图]2］．在39%的病例中，这类基因阳性的Contigs含有宿主抗性基因类似物。

当基因组调查限制在144个BAC克隆上，这些克隆通过PCR鉴定出非寄主基因和信号基因的同源物时，这些BAC克隆被组装成45个contigs，平均每个基因对应1.5个contigs[见附加文件]5］．在被研究的30个基因中，每个基因至少有一个副本，除了SGT1，在45个contigs中均有代表。在10个基因中，每个基因发现2个contigs，可能对应等位contigs。这一假设被观察到对应的引物对匹配一个单一的现象所证实轨迹在PN40024基因组序列中。对这些基因发现了三到四个contigsMPK4，PBS1，ACD11,RACB．

将11个基因分配到一个物理contig上，该contig由参考标记[37］．SSR标记与19个未分配的基因相连，是新开发的[见附加文件]5］．对于两个基因，可以使用物理组装来开发微型卫星。在这些情况下，在来自同一contig的另一个BAC的BES中发现了微卫星。对于17个基因，使用PN40024基因组序列开发了微卫星。该基因的引物对，以前用于物理定位BAC克隆中的基因，被用于基因组序列的BlastN搜索。当找到完美匹配的引物位点时，在基因周围40 kbp的区间内对组装序列中的微卫星进行搜索。这些新标记是使用[中报道的两个映射群体中的任意一个进行映射的。34]，并投射到[37］．

四个基因(一半，NHO1，RIN4,ACD11)在物理上被分配到contigs中，但相应的contigs不能被任何可用的标记在遗传上锚定。两个基因,JAR1而且ACD11，但每个基因的引物对在分别属于LG 15和LG 10的基因组序列的两个支架上都有完美的匹配。SGT1该基因没有被物理上分配到任何BAC克隆上，但在基因组组装上发现了一个独特的基因序列，并且在该基因周围3 kbp的间隔内发现了一个新的SSR标记(SGT1_SSR)被定位到lg16。

因此，在最初在BAC文库中搜索的30个非寄主和抗性信号基因中，最高相同类似物的基因组位置可以被分配到27个[见附加文件]2］．每个基因的位置通过PN40024基因组序列固定支架上对应引物对的完美匹配来验证。

干扰生物营养体穿透细胞壁的基因，比如PEN1而且枣疯病在拟南芥大麦[32，40]，可以抵抗白粉病，一种对葡萄也很重要的疾病。葡萄的同源物PEN1位于lg8上，与广谱抗性基因同源枣疯病位于lg5。各种植物基因，比如脂肪酶EDS1，甘油激酶NHO1，以及泛素连接酶相关蛋白SGT1，可在非宿主病原体渗透后停止感染[41- - - - - -43］．葡萄的同源物EDS1而且SGT1分别定位于lg17和lg16，而NHO1无法使用此方法进行本地化。SA、JA/ET和MAPK级联是信号网络的组成部分，需要通过特定的路由到非宿主和宿主防御来安装诱导防御。我们定位了葡萄SA合成和信号基因的同源体，如SID2(LG17),NDR1(LG19),EDS1(LG17),NPR1(LG11);JA的合成和信号传递，如先进的(LG18),COI1(LG13),JAR1(LG15);ET-insensitiveETR1(LG19);和MAP激酶，如SIPK(LG5),WIPK(LG 6),EDR1(LG14),MPK4(LG15)。由许多R基因触发的完全抗性还需要相互作用的蛋白质RAR1(在LG16上)和SGT1，也在LG16上发现[27，43］．在参与HR激活的其他基因中，环核苷酸门控离子通道基因的同源物DND1，与宿主抵抗有关，与细胞死亡无关拟南芥，位于葡萄基因组LG14的底部。RACB，葡萄的同系物OsRac1它是水稻程序性细胞死亡(PCD)途径的一个组成部分，位于LG18上。加速细胞死亡11 (ACD11)的同源物位于LG10。

这里描述的“赤霞珠”物理图谱是为一个高度杂合子葡萄品种构建的第二个物理图谱，而第一个物理图谱是基于“黑比诺”[11，44］．它们都是用相同的指纹识别方法组装的。这两幅图谱的一个共同特征是，contigs的总长度远远大于葡萄基因组的估计大小(1.5-1.6倍)。在“赤霞珠”图谱中，这种扩张主要归因于杂合性的影响。“赤霞珠”是“品丽珠”和“长相思”杂交的产物。45］．SSR标记的基因分型显示该品种具有较高的杂合度[46］．在“黑比诺”中，最近的研究表明，序列变化的重要部分是由于插入/删除事件，并且SNPs的频率是不均匀的。17］．在一项初步实验中观察到相同的特征，该实验比较了“赤霞珠”两个不同基因组区域的两个单倍型序列，范围为182 kbp(未发表数据)。这些特征影响了从两个等位基因区域产生的指纹的条带模式，因此预计会阻碍相应BAC克隆的正确组装。使用一组在参考基因组序列上具有独特位置的BAC分子标记，并使用BAC克隆在同一基因组序列上的BES对其进行比对，证明杂合性可能导致一个contig内杂合子克隆的斑块状排列，或导致两个独立contig中的“等位”克隆分离。这两种现象都解释了观测到的物理地图膨胀了1.5倍。事实上，虽然55%的单位点标记是在属于同一contig的等位基因BAC克隆上发现的，但剩余的45%锚定了两个或更多的contig。

这些限制导致BAC克隆的正确组装困难，是杂合种基因组物理图谱的共同特征。截至目前，除葡萄外，基于指纹图谱的杂合子植物物理图谱仅完成了3个:李属［47]，苹果[9]、黑杨木[10］．桃图是使用与葡萄藤图相同的指纹识别方法构建的，但其他差异损害了两个组件的比较。首先，桃的基因定位仍在进行中，目前鉴定的克隆指纹为4.3×基因组当量，偏向于基因组的表达区域[48］．其次，采用两个BAC文库，一个来自二倍体基因型，另一个来自单倍体基因型，可以减弱杂合度的影响。黑杨木和苹果图谱显示基因组大小扩大了1.2倍[9，10］．这个值比在葡萄藤中发现的值要低，这可能在某种程度上解释了使用琼脂糖指纹来制作黑棉白杨和苹果地图。根据[36]，与基于测序仪的方法相比，琼脂糖指纹识别中与受限重复元素对应的条带的混淆效应以及由少数碱基插入/删除引起的片段大小差异可能更为中性，因为分析的片段尺寸更大。在杨树中，当将BES与基因组序列进行比对时，观察到两个物理contigs经常停留在序列上的相同间隔[10]，这表明等位基因contigs的分离发生在葡萄藤物理图中。如果对序列上共对齐的每个contig对都计算单个单倍型，那么对物理映射大小的总体估计几乎没有扩展[10］．最后，黑杨木图谱表明，在水杨科谱系中发生的全基因组复制对物理图谱的影响远小于杂合度[10］．如果这适用于最近的基因组翻倍，那么在葡萄藤和其他拥有古老六倍体起源的真核植物中，同源性的影响应该更可以忽略不计。

基于来自遗传标记和PN40024基因组序列的独立控制，我们对“赤霞珠”图谱的contig组装进行了验证，使我们估计FPC构建的contig中有7.3%至9.3%是嵌合体。到目前为止，仅在少数情况下估计了物理图中嵌合contigs的百分比。在channel catfish物理图中报告了5%的contig组装错误[49]，也使用[13)方法。用三色HICF方法构建的玉米图显示了4%的假连接[50］．在本研究中观察到的嵌合体的百分比接近这一范围。物理嵌合可能来自于相同的指纹带，这些指纹带对应于物理上不相连的BAC克隆所共享的重复序列或大规模重复。在水稻中，转座因子可能干扰WGS组装的方式被认为是[51]，同样的论点也可能适用于BAC克隆在葡萄物理图谱的物理contigs中的错位。

了解了所有这些局限性，我们证明了物理图谱可以作为遗传图谱的有用补充，以定位一组农艺性状的候选基因。物理图谱已被用于生成基因目录，这些基因被固定在染色体上，可能与抵抗病原体有关。给出了不同类别基因阳性的物理contigs基因组分布的概述[见图]2和图3.］．这张图非常接近基于‘Pinot Noir’序列草稿对相同基因家族的分析[17]，证实了物理映射方法的可靠性。

基于发现的非宿主抗性或信号通路同源物的位置，没有一个显示出与已知的抗病QTL相对应的位置候选[2，52- - - - - -54］．相比之下，一些含有NBS-LRR基因的物理contigs被文献中报道的与主要qtl或抗病基因相关的标记所标记[2，34，52- - - - - -54］．在大多数情况下，耐药的分离表明几种位点可能对特质有帮助，但是位点由标记物标记，现在对应于富含NBS-LRRs的contigs，占最大的影响[53］．由于在受控环境下对葡萄等多年生木本植物进行定量性状研究的困难，大多数实验都是在小的分离群体中进行的，因此只能可靠地检测出一个或几个效果最强的qtl。提高QTL分析的灵敏度和分辨率可以提供更多关于附加位置的信息位点这就导致了表型变异的其余部分。我们的工作还提供了一些标记，可以提高这些区域遗传图谱的标记密度，并可用于育种项目中的标记辅助选择。

一个葡萄我们构建了“赤霞珠”的物理图谱，并将大量病原体抗性候选基因固定在其上。讨论了可能对基因组学领域的进一步项目有用的两个主要方面。

首先，本文重点研究了高杂合度对基于指纹的物理图谱的影响。研究表明，适当的自动化协议可以通过减少这一潜在阻碍因素的影响来产生适当的装配。

其次，该图谱似乎是遗传图谱和基因组序列之间有用且可靠的中间步骤，用于定位候选基因。它允许对复杂基因家族进行快速定位，并加强了先前主要NBS-LRR群集和抗病性共定位的线索位点．

基于BAC指纹的物理地图组装

一个BAC库葡萄“赤霞珠”被用于物理地图的构建。它包含44,544个克隆，平均插入大小为142 kbp，约为12.3个基因组当量[35，38］．对44,544个BAC克隆的两端测序，共获得77,237条BAC末端序列(BES)，平均大小为671 bp，经质量检查保留[38］．这些序列随机覆盖了大约0.1倍的葡萄基因组。该文库已被国际葡萄基因组计划网络作为参考基因组资源之一[55]和BAC的克隆版本可按要求免费提供[56］．

BAC克隆按照[13]，根据[初步报告]，适于葡萄。11］．简单地说，从每个BAC克隆中分离出DNA，用四种罕见的切刀内切酶(生态RI,Bam你好,濒死经历我和XbaI)和经常切割(有III)。用SNaPshot标签试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)标记片段，用genCLEAN板(Genetix, St James, NY, USA)纯化，并在甲酰胺中重新悬浮。片段在ABI3730自动测序仪(Applied Biosystems, Foster City, CA)上通过毛细管电泳分离，并使用Genescan LIZ-500内部尺寸标准进行大小测定。使用GeneMapper 3.5 (Applied Biosystems, Foster City, CA)分析电色谱图。使用自制perl脚本生成并编辑包含每个峰的面积、高度和大小数据的输出文本文件。去除与背景对应的、与矢量对应的、短于75 bp或长于500 bp的峰。板内污染和可能的嵌合体经过三次检查并丢弃。第一组病例是用基因分析器包鉴定的[57］．其次，去除平均插入尺寸分别为120、140和160 kbp的所有克隆，其峰值分别超过210、230和250个。第三，比较相邻无性系的BES。如果两个或多个相邻克隆对两个BES都具有较高的同一性(在成对对齐中，>的95%同一性超过最短BES长度的>的95%)，则使用自制perl脚本删除包含冗余BES的BAC克隆。当一个给定的BAC克隆只有一个可用的BES，并且这个BES与相邻克隆的BES高度相似时，将检查物理地图，以检查这两个克隆是否被埋没。如果是这种情况，则删除只有一个可用BES的克隆。

使用FPC 8.2软件对修剪后的数据进行组装[58］．公差设置为0.4，第一次自动装配是在非常严格的条件下进行的，Sulston评分为1e-40。使用DQing方法对含有10%以上Q克隆的contigs进行分离，在1e-45、1e-50和1e-55的临界值逐渐降低的情况下进行三轮分析。然后在1e-35的截止点处末端合并。随后，按照迭代策略进行装配[50]，使用交替的end- merge和DQing步骤，对1e-30、1e-25和1e-20的end- merge使用逐渐不严格的截止。在最后一次合并之后，使用1e-30的截断将单例插入到contigs中。

根据放置在每个contig上的分子标记信息对BAC组装进行验证，并分三步手动编辑。首先，每个包含无连锁遗传标记的BAC克隆的contig都在更严格的截止点进行重新组装，以试试性地断开。其次，如果该contig在最严格的截断值1e-30处仍保持嵌合，则标记物的引物对与参考基因组8.4× assembly进行轰击诉酿酒用葡萄“PN40024”(1]以评估可能的退火位点的数量并确认染色体位置。当单个复制标记的遗传图和物理图之间的差异被证实时，相应的物理contig被认为是嵌合的。最后，对含有与遗传连锁标记相关的BAC克隆的contigs进行了不太严格的1e-15的合并测试。

bac端序列分析

利用全叶绿体基因组对文库的叶绿体污染进行了评估葡萄(Embl登记编号DQ424856， [59])作为BlastN搜索的查询。当BlastN在> 100 bp上发现> 95%的同源性时，或者当tBlastX在33-133个氨基酸上发现> 95%的同源性时，>在> 133个氨基酸上发现> 80%的同源性时，BES被认为是一个叶绿体序列。

如文献[1，补充数据]所述，通过Blat分析(90%的同源性与80%的长度，小于5次命中)将重复元素屏蔽，然后与PN40024基因组序列进行比对。然后使用自制perl脚本对结果进行筛选，只有当配对两端匹配距离小于300kbp且方向一致时，才认为BAC克隆与基因组序列对齐[1，补充数据]。对物理contigs进行筛选，并使用满足以下要求的子集进行验证。首先，所有由小于3个bac组成的contig都被丢弃。其次，由3个BACs组成的连接到2或3个不同的链接组的contigs也被丢弃。总共有846个实体contig通过了这两个修剪步骤。然后，如果至少有两个BACs锚定在一个连锁基团上，并且至少有两个其他BACs锚定在另一个连锁基团上，则认为一个contig是嵌合的。

BAC克隆上标记物和基因的物理定位

基因图谱中存在的微卫星标记引物对37]和与本研究相关的基因根据[描述的方案在BAC池上进行评分。38］．在参考遗传图谱中存在的微卫星标记被用于整合物理图谱和遗传图谱，随机跨越基因组。

用于BAC文库非宿主、宿主和信号抗性基因PCR筛选的引物在[附加文件]中描述5]，并发展如下。我们首先从拟南芥而且烟草benthamiana从NCBI下载了30个在上述类别中功能被证实的基因，以及相应的蛋白质[见附加文件]5］．这些氨基酸序列用于2006年9月1日在TIGR和NCBI数据库中对葡萄ESTs进行tBLASTn检索。在所有基因中都发现了葡萄的EST，且与相应基因同源性最高的EST被保留下来。选取的ESTs通过BLASTn与当时可用的PN40024的6×基因组组装进行比较，推导出相应的基因模型。PCR引物优先设计在单个外显子上，并且在EST和PN40024序列之间没有snp的两个序列阵列上[见附加文件]5］．此外，在BES上进行了tBlastN分析，结果解析如下:除了那些对应于大型多基因家族的查询外，所有查询的E值< 1e-04EDR1，MPK4，SIPK,WIPK，其中E值< 1e-20，和PBS1其中E值< 1e-50。

用于筛选NBS-LRR和RLK基因BAC文库的引物描述在[34]: 33个引物(rgVamu系列和rgVrip系列)最初是由葡萄属amurensis而且葡萄属锐利设计了26条引物(GLP系列和MHD系列)Muscadinia rotundifolia×葡萄7条引物(rgVvin系列和UDV-系列)葡萄在与赤霞珠相似度最高的葡萄序列上设计了4个引物美国专利商标局(番茄)和Xa21(水稻)抗性基因(stkVa008, stkVa036, stkVa043, stkVr011)。

我们还使用了2004年10月NCBI提供的182条NBS-LRR蛋白的葡萄藤序列作为BES的tBLASTx查询。其中，131个查询是横跨NBS域的基因片段，并已在[34] GenBank加入号AY427077-AY427135、AY427152-AY427194、AF369813-AF369837、AF365879-AF365881、、和AF365851是主要覆盖LRR结构域3'端的ESTs。利用27个RLK基因片段(AY427136-AY427151和AY427195-AY427205)进行BES查询。

在可能涉及抗病的基因组区域开发额外的SSR标记

一些含有抗病候选基因的contigs被参考遗传图谱的SSR标记标记到染色体上。在这些未分配的contigs中包含的所有BAC克隆的BES中搜索微型卫星[Sputnik的修改版本]60]，并用于contig特异性SSR标记的设计。当在邻近的BES中没有发现有用的SSR时，使用先前用于物理定位BAC克隆中的基因的引物对在PN40024的6×组装中进行BlastN搜索。如果从BAC克隆中获得的扩增子大小与引物位点之间的距离一致，发现唯一且完美的匹配，则在PN40024的序列contigs中以40 kbp的间隔在基因周围搜索其他SSRs[见附加文件]5］．新标记被定位在“霞多丽”ד比安卡”和“赤霞珠”×杂种“20/3”中。34］．隔离数据被添加到先前的数据集，如[34］．标记位置被投影在葡萄属参考地图的地图对齐使用共同标记。

BAC:

细菌人工染色体

贝斯:

BAC结束序列

指数:

效应器触发免疫

HICF:

高信息含量指纹识别

是:

茉莉酸

MAPK:

丝裂原活化蛋白激酶

国家统计局/远程雷达:

核苷酸结合位点/富亮氨酸重复序列

PAMP时:

病原体相关分子模式

PTI:

病原体触发免疫

QTL:

数量性状位点

RLK:

受体样激酶

山:

salicilic酸。

作者感谢Pascal Audigier的技术工作，Philippe Grevet和Sebastien Reboux对信息系统的关注，Antonella Pfeiffer对SSR标记的遗传图谱进行了开发，这些标记用于固定含有非宿主抗性基因的物理contigs，这些非宿主抗性基因之前没有被Doligez的标记整合，Courtney Coleman校对了手稿。

作者指出

从属关系

1. UMR de Génomique Végétale, INRA-CNRS-UEVE, 2, Rue Gaston Crémieux, Evry Cedex, CP5708 91057，法国

   Marco Moroldo, Sophie Paillard, Aurelie Canaguier, Cecile Guichard, Veronique Brunaud, Isabelle Le Clainche和Anne-Francoise Adam-Blondon

2. UMR118, INRA-Agrocampus，雷恩大学，Amélioration des Plantes et Biotechnologies Végétales, Le Rheu, F-35650，法国

   苏菲的主料

3. 乌迪内农业环境科学学院，乌迪内科学208街，乌迪内，33100，意大利

   Raffaella Marconi, Raffaele Testolin, Gabriele Di Gaspero和Michele Morgante

4. Unité de Recherche Génomique-Info, URGI, Tour Evry 2 523, Place des Terrasses de l'Agora, Evry Cedex, 91034，法国

   Legeai法布里斯

5. Gnoscope, 2, rue Gaston Crémieux, Evry Cedex, CP5706 91057，法国

   科琳娜·克劳德和维罗妮克·德·贝拉尔迪尼斯

6. 乌迪内大学，意大利乌迪内，33100，经由delle Scienze 208

   西蒙Scalabrin

7. 应用基因组研究所，路易吉·达涅利科学技术公园，Jacopo Linussio 51，乌迪内，33100，意大利

   Simone Scalabrin, Raffaele Testolin, Gabriele Di Gaspero和Michele Morgante

相应的作者

对应到Anne-Francoise Adam-Blondon．

作者的贡献

MaM物理定位了非宿主和防御信号基因，并开发了新的SSR标记用于contig锚固，整合了所有贡献者的结果，并起草了手稿。SP借助ILC、AC、CC、VDB构建了物理图，利用LF实现了BES的初步分析，并参与了文稿的起草。RM筛选BAC文库中的宿主抗性基因。AC和ILC对BAC文库进行SSR标记筛选。LF编写了用于BES分析和地图可视化的perl脚本。用CG和VB开发了实验跟踪和结果存储的数据库。GDG和RT使用新的标记实现了遗传图谱，参与了结果的解释和手稿的起草。SS和MiM对地图组装做出了贡献。A-FA-B构思了这项研究，协调了物理地图的构建并完成了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

Marco Moroldo和Sophie Paillard对这项工作做出了同样的贡献。

开放获取本文由BioMed Central Ltd授权发布。这是一篇开放获取文章，根据创作共用归属许可协议(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是正确地引用原始作品。

转载及权限