的角色拟南芥WRKY3和WRKY4转录因子在植物对病原体反应中的作用

背景

植物WRKY dna结合转录因子参与植物对生物和非生物反应的响应。之前已经证明拟南芥WRKY3而且WRKY4其编码两个结构相似的WRKY转录因子，是由病原体感染和水杨酸(SA)诱导的。然而，这两个WRKY转录因子在植物抗病性中的作用尚未被直接分析。

结果

WRKY3和WRKY4都是核定位的，可以识别TTGACC W-box序列在体外．的表达WRKY3而且WRKY4由液体渗透或喷射产生的应力条件迅速诱发。应力诱导表达WRKY4经病原菌感染和SA处理后进一步升高。为了直接确定它们在植物抗病中的作用，我们分离了T-DNA插入突变体，并生成了转基因过表达系WRKY3而且WRKY4．研究了功能缺失突变体和转基因过表达系对生物营养性细菌病原体的反应两还有坏死性真菌病原体葡萄孢菌．的wrky3而且wrky4单突变体和双突变体比野生型植物表现出更严重的疾病症状和更高的真菌生长葡萄孢属感染。尽管WRKY3而且WRKY4对植物的反应没有重大影响p .两，过度表达WRKY4大大增强了植物对病原菌的敏感性，抑制了病原菌诱导PR1基因的表达。

结论

核定位和序列特异性dna结合活性支持了WRKY3和WRKY4作为转录因子的功能。基于T-DNA插入突变体和转基因过表达系的功能分析表明，WRKY3和WRKY4在植物对坏死性病原体的抗性中具有积极作用，WRKY4在植物对生物营养性病原体的抗性中具有消极作用。

在病原体感染时，病原体相关分子模式(pamp)，如细菌鞭毛蛋白和脂多糖被植物受体识别，通过丝裂原激活蛋白激酶信号级联激活pamp触发的免疫[1］．革兰氏阴性细菌病原体等两可以向植物细胞传递效应蛋白，以干扰pamp触发的抗性，从而促进病原体的毒性。因此，剩余的基础防御通常不足以遏制病原体，但可以限制它们在植物组织中的生长。通过共同进化，一些效应子可能被植物抗性(R)蛋白特异性识别，并激活强效应子触发免疫(ETI) [1］．R基因激活的ETI涉及一个复杂的防御程序，包括产生活性氧(ROS)和水杨酸(SA)，快速程序性细胞死亡(超敏反应，HR)和诱导大量宿主基因，包括与发病相关的(公关)基因[1］．在拟南芥， R基因和sa介导的防御机制在整个或部分感染周期内对以活宿主组织为食的生物营养性病原体有效[2，3.］．

坏死性病原体杀死宿主以获取营养。许多坏死性病原体产生毒素、细胞壁降解酶和ROS，以促进疾病和浸渍植物组织[4］．植物防御坏死性病原体的机制已被分析相对最近，似乎在重要方面不同于那些对抗生物营养性病原体。首先，基因间抗性对生物营养型病原体很常见，但对坏死型病原体不常见。其次，R基因介导的HR对生物营养性病原体有效，但不能阻止，在某些情况下反而促进了坏死性病原体的感染[5］．第三，虽然SA对生物营养性病原体的抵抗很重要，但它在防御坏死性病原体方面的作用是有限的。在拟南芥在美国，损害SA生物合成或信号转导的突变不影响对SA的抗性葡萄孢属［6，7］．废除转基因中SA的积累nahG植物导致的敏感性有限的增加葡萄孢属［6］．然而,转基因nahG植物具有不依赖于SA的非特异性表型(如还原的phytoalexin) [8，9以及对葡萄孢属观察到转基因nahG植物可能不是由SA缺乏引起的。

WRKY转录因子虽然发现时间较晚，但已成为植物转录因子中最具特征的一类，并处于植物防御反应研究的前沿[10］．病原菌侵染或用病原菌激发子或SA处理可诱导植物WRKY基因快速表达。我们已经展示过了拟南芥例如，72个检测到的WRKY基因中有49个在病原体感染或SA处理后表达被差异调节[11］．此外，大量的防御或与防御相关的基因，包括研究得很透彻公关基因和调控NPR1基因的启动子中含有W-box元件，这些元件可被WRKY蛋白特异性识别，是其诱导表达所必需的[12- - - - - -18］．最近的研究为特定WRKY蛋白参与植物防御反应提供了直接证据。例如，突变拟南芥WRKY70增强植物对包括细菌病原体在内的生物营养性和坏死性病原体的敏感性Erwinia carotovora还有真菌病原体白粉菌属cichoracearum而且葡萄孢属［19- - - - - -21］．此外,wrky70突变体在基础基因和r基因(RPP4)介导的对卵菌的抗性Hyaloperonospora parasitica［22］．拟南芥wrky33突变体对坏死性病原体高度敏感，但对生物营养性病原体反应正常[23］．这些结果表明，WRKY33在植物对坏死性病原体的抗性中起着重要而特异的作用。其他WRKY蛋白可作为植物抗病负调控蛋白。例如，突变拟南芥WRKY7，WRKY11而且WRKY17增强植物对毒力的抵抗力p .两压力(24- - - - - -26]和基因突变拟南芥WRKY25增强对p .两［27］．结构相关的WRKY18、WRKY40和WRKY60在植物抗性中充当负调控因子p .两而且大肠orontii［28，29］．它们的大麦同源物HvWRKY1和HvWRKY2也作为基础防御的抑制因子发挥作用[29］．WRKY蛋白的多种作用可能反映了植物防御的复杂信号和转录网络，需要严格的调控和微调。

我们之前已经证明了一种无毒的感染p .两菌株或SA处理诱导拟南芥WRKY3而且WRKY4，编码两种结构密切相关的WRKY蛋白[11］．在目前的研究中，我们已经证明WRKY3和WRKY4都是核定位的序列特异性dna结合蛋白。我们还证明了诱导表达WRKY3而且WRKY4病原菌感染或SA处理后主要是由于植物胁迫引起的病原菌悬浮液或SA溶液的渗透和喷洒。功能缺失的T-DNA插入突变体和转基因过表达系WRKY3而且WRKY4是否产生并检查了对生物营养性细菌病原体的反应p .两还有坏死性真菌病原体b .灰质．这些研究有力地表明，WRKY3和WRKY4在植物对坏死性病原体的抗性中起积极作用，而在对生物营养性病原体的抗性中起消极作用。

结构，DNA结合和亚细胞定位

根据WRKY锌指的数量和结构，WRKY蛋白可分为三类[30.］．第一组包含两个锌指母题，而第二组和第三组只包含一个锌指母题。半胱氨酸的₂第三组WRKY蛋白中的HisCys锌指与更常见的Cys略有不同₂他的₂在第一组和第二组WRKY蛋白中发现锌指蛋白。WRKY3和WRKY4属于I族WRKY蛋白，各有两个Cys₂他的₂图案(图1)．对于I组WRKY蛋白，c端WRKY锌指负责序列特异性DNA结合[31，32］．核磁共振溶液结构的c端dna结合WRKY锌指拟南芥WRKY4蛋白由一个四链的β-薄片和一个由保守的Cys形成的锌结合袋组成₂他的₂位于β-片一端的残基形成新的锌和DNA结合结构[33］．除了保守的WRKY结构域外，WRKY3和WRKY4在整个蛋白质序列中具有高度的相似性(图2)1)．

大多数WRKY转录因子识别TTGACC/T W-box序列[12，15，34］．为了检测WRKY3和WRKY4的dna结合活性，我们在大肠杆菌，纯化重组蛋白，并检测其与含有两个直接TTGACC W-box重复序列(Pchn0;数字2)使用电泳迁移率变化分析(EMSA)。当纯化的重组WRKY3或WRKY4蛋白用Pchn0探针孵育时，检测到流动性降低的蛋白/DNA复合物(图2)2 b)．WRKY3无法检测到TTGACC序列被改变为TTGAAC后与突变探针(mPchn0)的结合，而WRKY4的结合则大大降低(图2)2 b)．因此，WRKY3和WRKY4与TTGACC W-box序列的结合是高度特异性的。

为了确定WRKY3和WRKY4的亚细胞位置，我们在C端构建了两个WRKY蛋白的GFP蛋白融合体。融合构造，由CaMV 35 s启动子，被直接轰击成洋葱(洋葱)表皮细胞。瞬时表达的WRKY3-GFP和WRKY4-GFP融合蛋白仅定位于细胞核(图2)3.)．相比之下，在细胞核和细胞质中都发现了GFP(图3.)．

表达式

为了分析WRKY3和WRKY4在植物防御中的作用，我们分析了它们在病原体感染后的表达情况。都是mock(仅含1%麦芽糖)和葡萄孢属感染后，血清的水平显著升高WRKY3成绩单(图4)．我们还用对照MgCl浸润后研究了其表达₂溶液(模拟接种)或毒液p .两pv。番茄应变DC3000 (太平洋标准时间DC3000)。如图所示4，在被MgCl渗透的植物中₂或者细菌悬浮液的含量WRKY3与浸润后0 hpi相比，转录本在浸润后2、4、8和24小时(在较小程度上)均升高(图4)．WRKY3喷施H后，转录本也迅速升高至相似水平₂O，防御诱导分子SA，甲基茉莉酸(JA)或1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)，乙烯(ET)生物合成的直接前体(图4 b)．因此WRKY3对液体渗透或喷射产生的压力条件反应迅速。

的表达式WRKY4对嘲弄和葡萄孢属感染，但在48，特别是72 hpi，水平WRKY4转录率更高葡萄孢属与模拟感染植株相比(图4 b)．WRKY4也可通过MgCl₂溶液或细菌悬浮液。然而，在进行的三个RNA印迹实验中，WRKY4在病原体浸润的植物中，转录本始终高于MgCl₂-渗透植物(图4 b)．此外，转录水平WRKY4与H₂O- JA或acc喷洒植物。因此，应力诱导表达WRKY4经病原菌感染和SA处理后进一步升高。

T-DNA插入突变体对病原体的反应

确定…的作用WRKY3而且WRKY4直接地，我们发现了两个独立的T-DNA插入突变体WRKY3而且WRKY4．的wrky3-1突变体(Salk_107019)在第二外显子中含有T-DNA插入wrky3-2(Salk_119051)的第一个外显子中含有一个T-DNA插入WRKY3基因(图5)．的wrky4-1(Salk_082016)和wrky4-2(Salk_073118)突变体的第一个外显子都含有T-DNA插入WRKY4基因(图5)．用PCR方法鉴定纯合突变株WRKY3——或者WRKY4特殊引物。Northern blotting分析表明WRKY3或WRKY4SA处理后，各纯合突变体的转录本显著减少(图5 b)．为了确定可能的功能冗余，我们还生成了wrky3-1 / wrky4-1而且wrky3-2 / wrky4-2通过基因杂交获得双突变体。的wrky3而且wrky4单突变体和双突变体在生长、发育和形态上与野生型植物无差异。的wrky3而且wrky4单突变体和双突变体也对毒性反应正常太平洋标准时间DC3000菌株基于病原菌的生长。然而，在四个实验中的两个，wrky4单突变体和wrky3/wrky4双突变株与野生株相比，发生绿变病症状明显减少太平洋标准时间提示WRKY4可能在植物对细菌病原体的耐受中起负向作用。

为了确定WRKY3和WRKY4在植物对一种坏死性病原体的抗性中的作用，我们分析了由WRKY3和WRKY4感染引起的疾病发展b .灰质在wrky3而且wrky4并与野生型植物进行了比较。如图所示6,wrky3而且wrky4单突变和双突变植株比野生型植株表现出更严重的疾病症状。为了量化真菌在这些植物中的生长，我们使用肌动蛋白基因从这些植物中分离出的总RNA进行北方印迹b .灰质作为探针。与疾病症状一样，真菌基因转录物的积累在不同程度上显著增加wrky3而且wrky4单突变和双突变植株(图6 b)．这些结果表明WRKY3和WRKY4在这一过程中起着积极的作用拟南芥对坏死性真菌病原体的抵抗力。

转基因过表达系对病原体的反应

为了进一步研究WRKY3和WRKY4的作用，我们生成了转基因拟南芥过度表达WRKY基因的植物。构造包含完整长度的WRKY3或WRKY4cDNA由CaMV 35 s启动子生成并转化为拟南芥(Col-0生态型)。Northern blotting鉴定出几种转基因植物含有高水平的WRKY3即使在没有SA处理的情况下(图3)．然而,WRKY3转基因植物中的转录本在RNA印迹上表现出涂抹模式(图5度)，这可能是由于转录的过早终止、选择性剪接和/或降解WRKY3记录。转基因WRKY4-过表达系也被识别，和WRKY4在RNA印迹上，过表达系的转录本主要在一个预期大小的条带上(图5度)．WRKY3和WRKY4转基因过表达系与野生型植物相比，在生长、发育或形态上没有明显变化。

为了确定过表达系在植物抗病性中可能发生的变化，我们首先研究了它们对植物抗病性的反应b .灰质但与野生型植物相比，发现其对真菌病原体的抗性没有显著差异(数据未显示)。然后我们给它们接种太平洋标准时间并监测细菌生长和疾病症状的发展。两组间无显著性差异WRKY3-过表达系和野生型植物在疾病症状发展和细菌病原体生长方面均有显著差异。但是，以后接种用太平洋标准时间DC3000，转基因WRKY4过表达系显示出比野生型植物约25-30倍的细菌生长(图7一个)．接种过的叶子WRKY4-过表达植物在感染后也比野生型植物表现出更严重的疾病症状(图7 b)．因此过度表达WRKY4大大增强了植物对细菌病原体的敏感性。

sa介导的防御在植物防御中起着至关重要的作用p .两［35，36］．sa介导的防御机制与公关基因包括PR1常被用作sa依赖性全身获得性耐药性的可靠分子标记[35］．自WRKY4-过表达植物比野生型植物对p .两，我们将转基因植物与野生型植物进行病原诱导表达的比较PR1．这些分析显示没有显著性PR1转录本积累在缓冲处理的野生型或WRKY4-过度表达的植物(图7 c)．PR1野生型植株在接种后第2天和第3天转录本积累到较高水平(dpi)(图7 c)．在WRKY4-过表达植物，然而，积累PR1与野生型植物相比，转录本在2和3 dpi时显著减少(图7 c)．减少PR1表达式WRKY4-过表达植物与过表达植物对细菌病原体的抗性降低相一致。

WRKY3而且WRKY4编码两种结构相似的WRKY蛋白(图4)，它们的表达对应激条件都有反应(图4)．应力诱导表达WRKY4但不是WRKY3通过病原体感染或SA处理进一步增强(图4)．独立的T-DNA插入突变体WRKY3而且WRKY4经坏死性真菌病原体感染后，其病状明显加重，真菌生长速度明显高于野生型b .灰质(图6)．尽管这两种WRKY蛋白的结构相似，但我们没有观察到它们对真菌病原体的敏感性有显著增强wrky3/wrky4双突变植物相对wrky3而且wrky4单突变体(图6)．因此，两种结构相似的WRKY蛋白在植物抗病性中几乎没有功能冗余b .灰质．我们没有观察到大的变化wrky3而且wrky4单和双突变体都有毒性p .两应变(图7)，但观察到疾病症状的发展有轻微的减少wrky4一些实验中的突变体。另一方面，过度表达WRKY4基于细菌生长和疾病症状发展的强烈增强，大大降低了对细菌病原体的敏感性(图7)．在转基因中没有观察到这种对细菌病原体易感性的增强WRKY3-overexpressing线。尽管两种WRKY蛋白的氨基酸序列相似，但它们的作用却截然不同，这可能是导致转基因过表达系表型不同的原因。另外,WRKY3转基因过表达系中的转录本可能不是全长的，因此不能产生活性WRKY3蛋白。尽管增强了易感性wrky3而且wrky4突变体,b .灰质，我们观察到两者对坏死性真菌病原体的耐药性均未增加WRKY3——或者WRKY4-overexpressing线。这可能是由于产生转基因过表达系的Col-0野生型接入已经具有相当的抗性b .灰质(图6)．这些结果表明WRKY3和WRKY4在植物抗病性中起着积极的作用葡萄孢属而WRKY4过表达对植物抗病性有很强的负面影响p .两．

sa介导的信号通路对疾病抗性是重要的p .两是一种生物营养性或更准确地说是半营养性病原体，在感染的早期阶段依赖于活的植物组织[35，36］．另一方面，JA/ et介导的防御对于植物抗性坏死性病原体如葡萄孢属［35］．SA和ET/JA信号通路相互拮抗[36］．因此，JA信号调控因子如COI1和MPK4的突变可以增强病原体感染植物中SA的积累和信号传递，从而提高对生物营养型和半生物营养型病原体的抗性。同样，阻断SA的积累可以促进ja调控基因在拟南芥侵染后的植物p .两［37］．WRKY4的过表达增强了植物对p .两sa调节的表达降低PR1基因表达(图7)．因此WRKY4对sa介导的信号通路有负面影响。另一方面，WRKY3和WRKY4在JA/ et调控的坏死性病原体抗性中发挥积极作用葡萄孢属(图6)．这些结果有力地表明，WRKY4和WRKY3也可能调节SA-和JA/ et介导的信号通路之间的串音，因此，在抵抗两种不同类型的微生物病原体方面发挥相反的作用。

许多WRKY转录因子的早期研究表明它们在sa调控的防御反应中起作用。许多植物WRKY基因是由包括无毒病原体在内的生物营养性病原体诱导的p .两在拟南芥和烟草花叶病毒(TMV)，已知可诱导sa依赖的SAR [11，34］．一项报道的微阵列实验显示，在SAR的发展过程中，基因启动子与PR1共诱导拟南芥在W盒中富集，提示WRKY转录因子在诱导sar相关基因中起关键作用[38］．我们之前已经证明了在基因启动子中的W盒序列NPR1SA信号所需的调控基因对其表达很重要[15］．有趣的是，到目前为止，对单个WRKY基因的功能分析揭示了WRKY蛋白在sa介导的防御生物营养病原体中的作用。拟南芥wrky7，wrky11而且wrky17突变体更容易产生毒性p .两菌株比野生型植物[24- - - - - -26]和基因突变拟南芥WRKY25增强对p .两［27］．拟南芥WRKY18、WRKY40和WRKY60作为负调控因子在植物抗性中发挥部分冗余作用p .两而且大肠orontii［28，29］．它们的大麦同源物HvWRKY1和HvWRKY2也抑制了基底防御[29］．我们之前也证明过超表达的拟南芥WRKY25而且WRKY33增强植物对p .两并抑制病原体诱导公关基因表达[23，27］．因此，这些特征的WRKY蛋白在sa介导的防御中起负调控作用。有趣的是，其中一些WRKY蛋白如WRKY4、WRKY33和多余的WRKY18、WRKY40和WRKY60在植物抵抗坏死性病原体中起着积极作用[23，28］．一个例外是拟南芥WRKY70，通过激活SA信号但抑制ja介导的信号来调节串扰[19，20.］．有趣的是,wrky70突变体，预计在SA信号通路受损和JA信号通路活跃，对正常反应p .两但表现出增强的敏感性葡萄孢属［19- - - - - -21］．因此，WRKY70在植物防御信号通路中的作用可能是复杂的。

防御信号通路之间的串扰是调节针对不同类型微生物病原体的防御机制的重要机制。虽然已经报道了调节相声的基因，但其潜在机制尚不清楚。WRKY转录因子的鉴定表明，这些防御信号通路之间的串音调控发生在转录水平上，这些转录因子以相反的方式影响植物对不同类型微生物病原体的抗性。例如，其中一些WRKY转录因子可能通过激活JA/ et调控基因的表达而抑制sa调控基因的表达来调控串扰。这种在基因表达调控中的直接和相反的作用需要这些WRKY转录因子以基因特异性的方式充当转录激活剂或抑制剂。另外，WRKY转录因子通过激活JA/ et介导的信号通路相关基因的表达来调节串扰，包括一些抑制sa调控基因表达的编码转录抑制因子。进一步研究WRKY蛋白的转录激活/抑制活性和直接转录靶点，可以深入了解植物对不同类型微生物病原体的复杂防御反应的分子网络。

材料

³²P-dATP (>3000 Ci/mmol)来自DuPont-New England Nuclear公司;其他常用化学品从Sigma购买。拟南芥在温度为100 μE·m、温度为24℃的生长室中进行^－2·秒^－1光周期为12小时亮/12小时暗。太平洋标准时间DC3000在含100 μg/ml利福平和50 μg/ml卡那霉素的King’s B培养基上维持。的孢子孢子b . cineria分离株B5-10取自在v8 -琼脂培养基上生长10天的菌丝体，并悬浮于1%麦芽糖中，如前所述接种[23］．

重组蛋白和dna结合

全长cdnaWRKY3而且WRKY4从一个拟南芥sa处理后构建cDNA文库拟南芥上文所述植物[39］．用于生产重组WRKY3和WRKY4蛋白，全长WRKY3而且WRKY4用基因特异性引物(5'- atcgaattcatggcggagaaggaaaaaag -3'和5'-ATCCTCGAGCTAAGCCATGGTGATTTGCTCTTCTTTAAGCCT-3'进行PCR扩增WRKY35'-ATCGAATTCATGTCGGAAAAGGAAGAAGCTC-3'和5'-ATCCTCGAGCTAAGCCATGGTTGTTTGCTCTTCTTTAAGCCT-3'WRKY4)．扩增后的PCR片段用EcoRI而且XhoI并克隆到pET-32a的相同位点大肠杆菌表达载体。重组蛋白的制备和dna结合试验如前所述[15］．

亚细胞定位

全身的WRKY3而且WRKY4用同样的基因特异性引物对编码序列进行PCR扩增大肠杆菌如上所述。扩增后的PCR片段用EcoRI而且NcoI并如前所述克隆到GFP融合表达载体的相同位点[23，25］．剥去洋葱表皮细胞层，并将其置于质谱板上。利用气动粒子枪(PDS 1000, Du Pont)将适当融合基因(0.5 μg)的质粒dna导入洋葱细胞。轰击的条件是真空28英寸汞柱，氦气压力1100或1300 psi，使用1.1 μm的钨微载体，靶距6厘米。轰击后，组织在22°C的MS板上孵育24小时。样品直接观察或转移到玻片上。

wrky3和wrky4 T-DNA插入突变体的鉴定

的wrky3-1突变体(Salk_107019)在第二外显子中含有T-DNA插入wrky3-2(Salk_119051)在dna的第一个外显子中包含一个T-DNAinsertionWRKY3基因(图5)．的wrky4-1(Salk_082016)和wrky4-2(Salk_073118)突变体的第一个外显子都含有T-DNA插入WRKY4基因。使用T-DNA边界引物(5'- gcttgctgcaactctctcac -3')和基因特异性引物(5'-GCTTCATTGACTGAGATTCCATC-3'， 5'-CCCGGTGGTTGAGTTATCAT-3'， 5'-TCATCGGAATCAGGGAACAT-3'和5'-TCATCGGAATCAGGGAACAT-3'组合进行PCR确认T-DNA插入wrky3-1，wrky3-2，wrky4-1,wrky4-2分别)。通过PCR产物测序，确定了T-DNA插入的性质和位置。纯合子T-DNA突变株采用T-DNA插入位点两侧序列对应的引物(上述4个基因特异性引物与5'-ATTCCCAACCTCCTCGCTAT-3'配对)进行PCR鉴定wrky3-1， 5'-GAGAAACACGACACGAATTTTG-3'为wrky3-2， 5'-AAACACGACACGGATTCACA-3'为wrky4-1而且wrky4-2分别)。为了从突变体中去除额外的T-DNA位点或突变，我们将它们回交到野生型植物中，并鉴定纯合子的植物进行T-DNA插入。

WRKY3和WRKY4转基因过表达植物的产生

全身的WRKY3而且WRKY4用BamHI和XhoI从克隆载体中分离cdna，亚克隆到BamHI而且萨利·背后的网站CaMV 35 spOCA30启动子[23，25］．拟南芥转化由flora-dip程序进行[40并通过卡那霉素耐药筛选鉴定转化子。从转化体中分离出T-DNA插入单拷贝的转基因植株(基于T2代抗生素耐药性的3:1分离)，并在T3代根据抗生素耐药性的分离进一步鉴定纯合子转基因植株。

RNA凝胶印迹

RNA凝胶印迹分析，用Trizol试剂(Invitrogen)从叶片组织中提取总RNA，用1.2%琼脂糖-甲醛凝胶分离，按标准程序吸附到尼龙膜上。印迹与-杂交³²p - datp标记的基因特异性探针。如前所述，在68°C的PerfectHyb™Plus杂交缓冲液(Sigma)中进行杂交，随后进行膜洗涤。用全长cdna作为探针进行Northern blotting检测WRKY3而且WRKY4记录。拟南芥PR1基因探针是由一个PR1用PCR扩增DNA片段PR1-特异性引物(5'-TTCTTCCCTCGAAAGCTCAA-3'和5'-CGTTCACATAATTCCCACGA-3')。的B. cinerea acina基因探针[41]被放大了b .灰质引物5'-ACTCATATGTTGGAGATGAAGCGCA-3'和5'-TGTTACCATACAAATCCTTACGGACA-3'。

病原体接种与疾病发展

为了抵抗疾病p .两在每株5周龄植株的3片成熟叶片上，用毒力菌株(OD₆₀₀= 0.0001 10mm MgCl₂)．分别于接种后即刻或接种后3 d测定细菌滴度，进行细菌生长分析。为了抵抗疾病b . cineria，真菌孢子(5 × 10⁵孢子/ml)均匀喷洒于35日龄植株上。植物被透明的塑料圆顶覆盖以保持高湿度，5天后评估疾病发展。

我们感谢俄亥俄州立大学(哥伦布，OH)的ABRC拟南芥突变体。本工作由国家科学基金会MCB-0209819资助。这是普渡大学农业研究项目的期刊论文2008-18311。

作者指出

从属关系

1. 普渡大学植物学和植物病理学系，915w。州街，西拉斐特，IN, 47907-2054，美国

   赖志兵，KM Vinod，郑祖玉，范保芳，陈志祥

相应的作者

对应到Zhixiang陈．

作者的贡献

ZL对WRKY基因进行表达分析，对突变体和过表达系进行分析。KMV进行了DNA结合测定，亚细胞定位，突变体和转基因过表达系的分离，生成和表征。ZZ执行葡萄孢属测试。BF进行了cDNA克隆的分离。ZC构思了这项研究，参与了设计，并帮助起草和编辑了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

Zhibing Lai, KM Vinod对这项工作做出了同样的贡献。

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