六倍体小麦6A染色体稳产千粒重QTL的鉴定及独立验证(英文)小麦．）

背景

小麦的产量是一种多基因性状，在植物生长的各个阶段受到环境和遗传相互作用的影响。产量通常分为三个部分;每个区域的穗数，穗粒数和籽粒重(TGW)。在多倍体小麦中，研究已经确定了影响总重的数量性状位点(QTL)，但很少有利用独立种质进行验证和精细定位的，因此对育种的影响有限。

结果

在12个北欧环境中，我们在Spark x Rialto群体的6A染色体上发现了一个与总重、产量和绿冠期有关的主要QTL。利用BC形式的独立种质₂和公元前₄在近等基因系(NILs)中，我们验证了三种QTL在不同环境中的效应。在5个试验中，有4个试验的产量(5.5%)和总重(5.1%)有显著提高，形态计量学测量表明，粒重增加是晶粒变宽的结果。绿冠期延长与高产/TGW Rialto等位基因相关，由两个独立的效应组成;花期提前，终成熟推迟，且在5种环境中表达稳定。小麦同源物(TaGW2在QTL区间内定位了一个与总重和粒宽增加相关的水稻基因。然而，在父母之间的编码序列中没有发现多态性。

结论

通过近等基因系发现并验证影响六倍体小麦6A染色体产量、绿冠期、千粒重和粒宽的强效QTL，为进一步了解多倍体小麦籽粒大小和产量复杂调控过程的遗传机制提供了重要的第一步。

小麦(小麦)是世界上主要的主食作物之一，提供了全球总卡路里摄入量的大约20% [[]1]]。自从引入“绿色革命”基因以来，产量已经取得了相当大的进步。然而，对于英国、欧洲和世界其他国家来说，过去十年来遗传增益的速度有所下降，在某些环境下产量停滞不前[[]2]、[3.]]。此外，由于全球小麦需求的增长速度快于产量的提高速度，对粮食安全构成了真正的威胁。因此，发现、理解并最终整合有利于影响产量的基因和等位基因是全球育种计划的主要目标。

小麦和谷物的产量是一个多基因和高度复杂的性状，在植物生长的各个阶段受到环境和遗传相互作用的影响[[]4]]。为了便于研究，产量通常分为三个主要部分;每表面积的穗数，每穗的粒数和千粒重(TGW)。这些产量组成部分在生长周期中是顺序固定的，在遗传力方面有所不同，并不总是与产量呈正相关[[5]]。TGW通常是稳定遗传的[[6[]，并可进一步分解为单独的组成部分，包括物理参数(粒长、粒宽、粒面积)和粒灌浆特性，它们也受到独立的遗传控制[[7]]。这包括谷物灌浆过程的速度和持续时间[[8]]，后者通常表现为抽穗后的绿冠期[[9]]。

在过去的十年中，我们对二倍体水稻籽粒大小、形状和籽粒灌浆参数的遗传控制有了显著的进展。栽培稻;在[[10]、[11]])。通过图谱克隆已鉴定出几个影响较大的基因，支持籽粒长、粒宽和灌浆参数的独立遗传调控。这与我们对多倍体小麦的有限理解不同，在多倍体小麦中，一些研究已经确定了籽粒大小和形状的数量性状位点(QTL) []12] - [15]]，但目前还没有克隆出任何基因。此外，这些QTL中的许多位于相对较宽的基因组区域，尚未使用独立的种质资源进行验证和精细定位，因此对育种的影响有限。

在大米、OsGW2编码一种以前未知的ring型E3泛素连接酶，并作为颗粒宽度和重量的负调节因子[[]16]]。最近，一些研究调查了小麦同源物(TaGW2)对晶粒尺寸参数的影响，尽管报道的结果相互矛盾。两项研究表明，在中国种质中，起始密码子上游- 593位的SNP与更宽的籽粒和更高的总重显著相关[[]17]、[18]]。然而，结果是直接矛盾的，因为每项研究都发现与相反的SNP在确切的- 593位置呈正相关。尽管在这一位点存在其他等位基因，但两项研究都确定了TaGW2表达水平和颗粒宽度。Yang等。[[19[]识别出TaGW2在一个大粒品种中发生了移框突变，并将该突变等位基因与籽粒宽度和籽粒总重的增加联系起来_2:3人口。这个突变体模仿原来的水稻OsGW2截断等位基因[[16，这表明TaGW2和OsGW2共享一个保守机制(晶粒尺寸的负调节)。然而，下调TaGW2通过RNA干扰(RNAi)导致小麦籽粒大小和总重减小[[]20.，这表明TaGW2籽粒大小的正调节因子是否与水稻的正调节因子具有不同的功能OsGW2．综合考虑，很难得出……的确切效果TaGW2由于迄今为止发表的研究存在差异，因此对小麦籽粒大小和总重的影响不大。

本研究的目的是评估一个双单倍体种群在北欧环境中的千粒重、产量和其他形态和发育性状。我们在小麦6A染色体上发现了一个与总重、产量和绿冠期有关的meta-QTL。我们开发了近等基因系(near isogenic lines, NILs)来验证6A QTL在不同环境下的效应，并进行了形态计量学晶粒分析，以确定受该QTL影响的特定晶粒大小成分。

遗传图谱及QTL分析

Spark x Rialto DH连锁图谱使用263个标记，包括170个SSRs, 89个DArT, 2个蛋白标记Rht-D1b完美标记，以及形态学GA测试。该图谱的总长度为1,471 cM，包含30个连锁组，这些连锁组使用已发表的共识图谱分配给特定的染色体[[]21]]。7条染色体包括至少两个连锁群(1A、2D、3B、3D、5A、5B、5D)，分别进行QTL分析。在不同的地点，里亚托有显著的(P< 0.001)，千粒重(49.1)大于Spark(40.9)，这在多年间是一致的(P= 0.49;父母*年交互)。在DH群体中，5个与籽粒大小有关的QTL在1B、2A、2D、4D和6A染色体上至少5个位置一致地被鉴定出来(图1)1、附加文件1)。Rialto等位基因在4个QTL (1B、2A、2D和6A)上增加了晶粒大小，而Spark等位基因在4D染色体上增加了晶粒大小。

在4D和6A染色体上发现了两个与产量有关的QTL，它们都与先前鉴定的千粒重QTL共定位(图2)1、附加文件1)。4D产量和TGW QTL峰与Rht-D1多效性矮化基因对产量和产量成分的影响已被全面报道[[]22]、[23]]。在标记间检测6A染色体上的产量和TGW QTLXgdm36和Xgwm570Rialto为这两个性状提供了增加等位基因。这个染色体区域是唯一的一个分开Rht-D1显著影响Spark × Rialto DH群体的产量和粒重。因此，选择6A染色体上的籽粒大小和产量QTL作进一步研究，命名为Qtgw-jic.6A和Qyld-jic.6A,分别。

进行因子方差分析，包括环境和所有双向相互作用，以评估个体QTL效应和上位性相互作用Rht-D1和Qtgw-jic.6A / Qyld-jic.6A．有一个显著的效果Rht-D1以及TGW (P< 0.001)和产率(P< 0.001)，两个性状的QTL与环境之间存在较强的相互作用(P< 0.01)。然而，两株间没有显著的遗传互作Rht-D1和Qtgw-jic.6A / Qyld-jic.6A（P= 0.13和P= 0.17)。

DH系纯合子为6A Rialto区之间Xgdm36和Xgwm570与Spark等位基因固定的DH相比，在不同环境下的产量显著提高了3.82±0.5% (P< 0.001，图1插入，附加文件2)。这些增长从0.9%(2002年的德国)到7.4%(2003年的苏格兰)不等。总热量的增加变化较大，平均为4.47±0.8%，从0.7%(法国2002年)到9.2%(德国2003年)不等(图2)1插入，附加文件2)。所选DH系在各环境下的平均产量与总重呈显著正相关(r= 0.51)，尽管这并不显著(P= 0.09)，这是由于不同环境的不同影响。例如，DH线固定为Qyld-jic.6ARialto部分在苏格兰的产量提高了7.4%(2003年)，但该地点的总水量仅增加了3.5% (r= 0.09;P= 0.42)，而在其他环境下(Church Farm 2001年和2002年，Sandringham 2003年，德国2002年，法国2003年)，TGW与产量显著相关(r> 0.23;P< 0.05)。这些结果表明，TGW是水稻产量的重要组成部分Qyld-jic.6A然而，不同环境下，总灌水量增加对产量的相对贡献是不同的。

除总重和产量效应外，还鉴定出了抽穗后绿冠期(从抽穗到冠层衰老的时间)的QTLXgdm36和Xgwm570和指定的Qgcd-jic.6A．类似于Qtgw-jic.6A和Qyld-jic.6A， Rialto等位基因显著延长绿冠期2.0±0.3 d (P< 0.001;从1.2天到2.5天不等)，与Spark等位基因相比，在所有四种分析环境中。绿冠持续时间(P= 0.04)与四个地点的产量呈负相关(r= - 0.12)，尽管在四种环境中的三种中相关性不显著。两者无显著相关(P= 0.42)，绿冠期与总重(r=−0.04)。6A染色体对植物生物量、收获指数、种子/穗数和种子/小穗数没有影响。

多性状多环境QTL分析

通过添加19个基于snp的标记，6A染色体上的标记分辨率提高了(图2)2)。改进后的6A基因图谱覆盖了66 cM的遗传距离，范围从Xgwm334在短臂的末端，到Xgwm570它沿着长臂的中间绘制(bin地图位置6AL8-0.90-1.00 [[]24]])。

利用改进的6A染色体遗传图谱，使用多性状多环境(MTME)分析对原始表型数据进行重新分析，以便在所有环境中更精确地定位QTL [[]25]]。产量,Qyld-jic.6A在区间内的显著性Xgdm36(22.7厘米)至Xgwm570(66.3 cM)，峰值在wpt - 7063(43.1 cM)(图3.)。在12个环境中的9个环境中鉴定出该区域内的显著标记，均以Rialto为有益等位基因(附加文件3.)。为Qtgw-jic.6AQTL包括整个连锁组，所有标记均显示显著性，Rialto在所有病例中提供阳性等位基因。QTL的显著性在wpt - 7063(43.1 cM)至Xgwm256(51 cM)，峰值在BE497701(47厘米)。2002年，除法国和德国外，在所有环境中都观察到显著的标记(附加文件)3.)。Qgcd-jic.6A横跨区域从BE517858(32厘米)至BE403154(58.8 cM)，在Xgwm256(51 cM)，并且在所有四个环境中都很重要(附加文件3.)。MTME分析表明，产量、总重和冠层持续时间效应都集中在8 cM范围内wpt - 7063(43.1 cM)至Xgwm256(51厘米)，这些影响在不同的北欧环境中是稳定的。除这些主要效应外，还鉴定出一个与分蘖数有关的次要QTLBQ159493(31.8 cM)在五个环境中的三个(附加文件3.)，映射远端到的位置Qyld-jic.6A，Qtgw-jic.6A和Qgcd-jic.6A．然而，在这种情况下，Spark提供了积极作用的等位基因。

的验证Qtgw-jic.6A和Qyld-jic.6A利用近等基因系(NILs)

为了独立验证这些多重效应，BC₂和公元前₄QTL片段的NILs分离(BQ195493来Xgwm570)被开发出来。在五种环境下，分别在英国(2010-2013)和德国(2012G)评估了NILs的产量、总重和粒度参数(表2)1)。总体而言，Rialto 6A NIL显著提高了产量(P< 0.001)，尽管与环境有很强的相互作用(P< 0.001)。在5个试验中，有4个试验观察到Rialto NILs的产量增加(每个地块3.2%至9.8%不等)，其中3个效果显著，1个效果不显著(P= 0.08;2011)。然而，2012年在英国观察到地块产量显著下降，其中Rialto NILs产量下降6.3% (P< 0.001)。对于TGW, Rialto NILs在各个地点观察到显着增加(P< 0.001)，尽管再次与环境有显著的相互作用(P< 0.001)(表1)。与地块产量相似，Rialto在四种环境下(从2.3%到8.8%)增加了TGW，其中三种显著，一种边缘不显著(P= 0.06, 2010)。2012年未观察到对TGW的影响。6A型NILs小区产量与总重呈显著正相关(r= 0.21,P< 0.001)。与DH群体相似，NILs在植物生物量、收获指数、穗长、小穗数、穗产量、种子/穗和种子/小穗方面没有一致的差异4)。

对晶粒的形态测量进行了分析，以评估TGW增加的来源(图2)4)。五种环境中有四种环境的总粮食面积显著增加，其程度与三峡库区结果相当。这是意料之中的，因为这两项指标之间存在高度正相关(r= 0.86;P< 0.001)。晶粒尺寸和重量的增加主要是由于Rialto NILs中晶粒明显变宽。Rialto NILs的籽粒比Spark NILs的籽粒平均宽2.0%(范围从0.4%到4.2%)，这在5个测试环境中的4个中非常显著。不同地点的NILs在晶粒长度上没有显著影响，除了2013年Rialto NILs的晶粒明显长于Spark NILs(1.1%)。P< 0.01)。等值BC系的20个晶粒的排列说明了BC之间晶粒宽度的差异₂和公元前₄NILs和不同环境下晶粒尺寸的变化(图2)5)。

利用NILs验证发育性状

在4年多的时间里，利用BC对英国环境下的抽穗日期、生理成熟度和绿冠期计算等发育特征进行了评价₂(2010-2012)和BC₄尼尔斯(2013)。尽管在此期间生长条件发生了极端变化，但在所有三个性状中都观察到强劲的显著影响(表2)2)。就抽穗日期而言，含有Rialto渗入的NILs提早0.89±0.06天开花(P< 0.001;范围为0.73至1天)。与Spark相比，Rialto NILs在四个季节中达到生理成熟的时间也明显晚了1.59±0.4天(P< 0.001;范围为0.73至2.58天)。这两种效应的结合显著延长了里亚托省NILs的绿冠持续时间，在不同环境下平均延长了2.48±0.37天(P< 0.001;1.73至3.44天不等)。非显著的相互作用(P= 0.18)，突出了Rialto等位基因在不同生长季节的一致性作用，尽管年平均冠层持续时间(从2010年的44天到2011年的75天)变化很大。这些结果提示原始绿冠期QTLQgcd-jic.6A实际上是两种不同效应的结合，即开花时间提前和最终成熟时间推迟，这两种效应都共同定位于6A区域，并在各种环境中稳定表达。

对BC的旗叶进行了SPAD定量测定₂2010年和2011年的NILs，以确认定性地块评估并测量衰老率(图2)6)。在两年中，花后20-25天的相对叶绿素含量无显著差异。然而，2010年在33 DAA处发现了显著差异(P< 0.01)和2011年的62 DAA (P< 0.001)，与Rialto NILs相比，Spark NILs在旗叶中的相对叶绿素含量显著降低。分蘖数从2011年到2013年进行了评估，再次强调了生长季节的巨大变化，分蘖数从2011年的平均每米行76.5个到2012年的171.1个不等(表1)2)。高产的Rialto NILs在2012年(P< 0.05)， 2013年(P= 0.01)，但不是2011年。分蘖数、产量和总重在3年内均无显著相关。

序列分析TaGW2

在水稻中，ring型E3泛素连接酶OsGW2已被证明会对晶粒宽度产生负面影响。小麦同源物TaGW2已被定位到6A染色体[[17因此，被认为是潜在的候选基因Qtgw-jic.6A(和Qyld-jic.6A)。在- 593启动子SNP处发现了G等位基因，结果表明，籽粒更宽，总重和产量更高。使用这种多态性，TaGW2在Spark x Rialto DH群体中定位到染色体6A与标记BS000072146，BS000105973和CA643341在46.8 cM处(图2)，在MTME确定的8 cM峰间隔内(43 ~ 51 cM)。测序的TaGW2gDNA显示，在Spark和Rialto之间起始密码子上游1244 bp的- 593位置只有一个SNP。在a基因组编码序列和Spark与Rialto之间的剪接位点均未检测到额外的多态性。同样，从Spark和Rialto的cDNA样本中，没有发现a基因组的snp或选择性剪接变异。

总重/产量/绿冠期的相互作用

对Spark x Rialto DH群体的QTL分析表明，在6A染色体8 cM区间内，决定绿冠期、籽粒大小和籽粒产量的QTL共定位。随着Rialto地区独立NILs在Spark背景中的发展和评估，这些影响得到了证实。结果表明，绿树冠期的延长是有效的Qgcd-jic.6A由两个独立的性状组成，即开花较早和最终衰老较晚，这导致了绿冠期的显着延长。这两个组成性状均与Rialto 6A基因渗入有关，但无法与本研究使用的种质建立遗传关系(多效性或连锁)。

抽穗后的绿冠期通常被错误地与延长灌浆期交替使用。这一普遍的概括导致许多研究得出结论，延长绿冠期导致延长籽粒灌浆期，从而导致籽粒增大和产量增加[[26]、[27]]。然而，我们已经表明，这不是在所有情况下的直接/因果关系。在解释叶片和植物延迟衰老的结果时应谨慎，特别是在没有直接测量谷物含水量和成熟度的情况下。例如，RNAi线GPC基因赋予延长的绿冠期>25天[[]28]]，但这并不伴随着灌浆时间的延长本身(Borrill和uway，未发表的结果)。我们目前的研究结果也表明，这种机制并不是Rialto 6A产量效应背后的主要驱动因素。Qgcd-jic.6A与DH群体的产量或总重没有相关性，尽管2012年NILs之间的GCD有显著差异(3.4天)，但没有观察到产量或籽粒大小的好处。这表明Qgcd-jic.6A很可能是在渐渗区域内的一个独立的遗传位点(而不是产量和TGW QTL的多效效应)，并且延长的GCD不是在DH群体和NILs中观察到的生产力增加背后的主要决定因素。

尽管籽粒大小和产量之间的相对影响程度并不总是一致的，但在不同的环境中，这两个性状之间存在显著的正相关关系，表明籽粒重很可能是水稻产量的主要组成部分Qyld-jic.6A．在5个NIL验证实验中的4个中，Rialto基因渗入显著提高了产量(5.5±1.5%)和总重(5.1±1.6%)，形态计量学测量表明，籽粒重量的增加主要是晶粒变宽的结果。一旦每个表面积的穗数和每穗的粒数已经确定，单粒的最终重量是最后确定的产量组成部分[[]4]]。与操纵其他产量组成部分相比，粮食重量和产量之间的这种密切关系提供了一种可以被视为提高产量的更精确的途径，因为它是稳定遗传的[[]6和补偿作用是有限的。考虑到目前六倍体小麦育种的遗传增益率，>5%的产量效应相当于~10年的育种，而不考虑6A QTL同源位点上可能鉴定的额外表型变异。最终，通过重组自交系进行精细定位将有助于确定本文所讨论的性状的精确位置，并确定产量效应是否对粒重(和/或绿冠期)具有多效性。

相对于对小麦产量和其他复杂性状的大量QTL研究，对单个籽粒形态计量组分的研究相对较少。Ramya等。[[29[]在大DH群体中发现了几个独立的TGW和籽粒长度和宽度遗传位点，其中4个QTL被认为是TGW和长/宽参数的多效性遗传位点。在目前的研究中，我们没有评估原始DH种群的谷物形态测量参数，因为在进行原始田间试验时(使用手持卡尺)，这项任务很费力。然而，随着高通量表型设备(如Marvin Grain Analyzer)的发展，我们能够更详细地评估NILs，并确定TGW增加背后最可能的影响。这些新的表型分析工具将极大地促进未来小麦粒度参数的遗传剖析。

2012年不存在产量和TGW效应

在2012年英国的生长环境中，TGW没有受到任何影响，而Rialto NILs对产量的负面反应是观察到的，尽管在其他四个环境中有一致的积极影响。这种不一致的结果的一个可能的解释是，在Rialto渗入区域内，分蘖数存在一个不受欢迎的次要QTL，该QTL远高于晶粒大小和产量效应。我们在五个测试环境中的三个环境中使用MTME分析检测到DH系中的一个次要QTL，尽管这种影响是临界显著的(LOD = 2.3，参见附加文件)3.)。2012年和2013年，里亚托省NILs的低分蘖数效果相似;但在2012年仅影响6A产量和TGW效应的表达。由于极端的天气对比，这个生长季节在英国是不寻常的。与英国历史平均水平相比，2011年冬季和2012年春季相对温暖和干燥，导致分蘖产量较高;然而，随之而来的是从4月到夏季大部分时间的异常湿润期。特别是对于6A NILs，我们观察到分蘖数比2011年和2013年的平均值增加了两倍。2012年较高的分蘖数可能导致NILs中额外的遗传x环境相互作用和补偿效应，从而影响6A TGW和产量QTL的表达。

TaGW2作为潜在的候选基因Qyld-jic.6A和Qtgw-jic.6A

MTME QTL分析定义了一个8 cM的区域wpt - 7063(43.1 cM)Xgwm256(51厘米)，其中两者Qyld-jic.6A和Qtgw-jic.6Aco-localised。在这个区域内我们绘制了地图TaGW2的小麦同源物OsGW2．的功能丧失OsGW2在水稻中，导致小穗外壳(外稃和外稃)细胞数量增加，导致籽粒变宽，间接影响籽粒灌浆速率[[]16]]。这些综合效应导致NILs的TGW增加50%，同时功能丧失OsGW2等位基因和其他多种多效效应。在第一个例子中，效果的相似性Qyld-jic.6A/Qtgw-jic.6A和OsGW2小麦和水稻的总重和粒宽，以及它们的同工位置TaGW2一个令人信服的候选基因是什么Qyld-jic.6A/Qtgw-jic.6A．

然而，有几个结果表明，在评估……的可能作用时，需要采取谨慎的方法TaGW2作为Qyld-jic.6A/Qtgw-jic.6A．第一，效果Qtgw-jic.6A与水稻(50%)相比，对TGW的影响相对较小，NILs携带的正效应QTL区间显示的TGW高2%至9%。这可能部分是由于六倍体小麦的多倍体性质，加上额外的同源物导致剂量效应，导致表型变异更加微妙。二是直接影响OsGW2是对古壁和外稃细胞数量的影响，这与小麦的情况不太相关，因为这些结构对谷物宽度和大小的影响很小。第三，在序列水平上，Spark和Rialto亲本之间的等位基因变异仅限于启动子区域的一个单一SNP，该SNP与TGW和宽度有松散的关联，尽管结果相互矛盾[[]17]、[18]]。也许最好的证据是TaGW2确实影响多倍体小麦的总重和粒宽，来自Yang等[[]19[]和Bednarek等人。[[20.他们分别通过帧移突变和RNAi展示了这种效应。然而，他们的研究结果指向了相反的效果TaGW2．现在下结论是否会发生以及如何发生还为时过早TaGW2影响Spark x Rialto群体的粒宽和TGW，但一些额外的实验包括详细的表达分析和精细的定位Qyld-jic.6A/Qtgw-jic.6A关于TaGW2将有助于阐明这种关系。

小麦数量性状的遗传结构

在水稻中，从双亲本定位群体中鉴定出的籽粒大小QTL对总重和产量的影响相对较大，而在小麦中，大多数研究鉴定出的QTL对籽粒大小(和产量)的加性影响相对较小。这些差异可能是由以下几个原因造成的。首先，决定籽粒大小和产量的生物学机制可能在不同物种之间有所不同。例如，一些水稻QTL通过调节小穗壳和颖片大小间接影响籽粒大小[[]16]、[30.] - [32]]。这些间接影响可能是种特异性的，因为在小麦中，古皮和外稃(相当于稻壳)不那么牢固地附着在谷物上，很可能不像在水稻中那样决定其生长。其次，小麦的多倍体特性意味着，在许多情况下，单个同源基因的突变可以通过与其他基因组中存在的同源基因的功能互补来掩盖。这种冗余表明，对于小麦中的许多基因来说，只有当所有两个/三个同源物同时发生突变时，它们的全部影响才能量化。这个问题进一步混淆了数量性状，其中多个基因有助于一个特定的表型。

小麦籽粒蛋白质含量的克隆QTL (GPC-B1)举例说明多倍体对数量性状相对大小的影响。QTL的原始定位鉴定出NILs之间籽粒蛋白质含量的表型差异约为10% [[]33]]。该基因的克隆，允许使用RNAi同时下调不同同源物，并揭示了比单独的b基因组同源物对谷物蛋白质含量的影响要大得多(减少30%)[[]28]]。最近，这种剂量效应已在A和D基因组同源物的纯合ems突变体中得到证实。个体基因敲除GPC-A1和GPC-D1同源基因对籽粒蛋白质含量的影响相对较小(分别为4%和7%)，而双突变体对籽粒蛋白质含量的影响要大得多，降低了17% [[]34]]。

未来的发展方向

利用NILs对这些QTL进行验证，为进一步利用一系列纯合子重组系对这两个性状进行精细定位提供了关键的第一步。小麦和小麦的最新进展Triticeae基因组学提供了一个强大的框架，从中识别额外的标记和候选基因来帮助这一过程。这些进展包括国际小麦基因组测序联盟(IWGSC)公开发布小麦染色体臂调查序列，开发高通量SNP检测[[]35] - [37[]， TILLING种群外显子组测序[[]38]、[39[]，以及个体染色体臂物理图谱的持续进展[[40]、[41]]。然而，为了充分利用这些基因组的进步，最终需要从定量遗传位点转向定性遗传位点，以分离出这些颗粒大小和产量影响的基因。

在本研究中，我们在北欧环境中鉴定了多倍体小麦产量、粒重和绿冠期的主要稳定QTL。这些效果通过一系列NILs进行了验证，结果显示，在5个测试环境中的4个环境中，产量和总重平均提高了5%以上。我们的结果表明，产量效应主要是由晶粒变宽导致的粒重增加所驱动的。绿冠期延长与产量/总重之间缺乏相关性，这与所研究的种质资源中这些性状之间存在直接或因果关系存在矛盾。使用启动子多态性，我们映射了TaGW2候选基因在QTL区间内，尽管确定该基因对QTL效应的具体贡献还为时过早。该QTL的验证为进一步了解多倍体小麦籽粒大小和产量复杂调控过程的遗传机制提供了重要的第一步。

植物材料

以两个英国六倍体冬小麦品种(小麦L.)、Spark和Rialto。选择该杂交品种的目的是在面包生产背景和独立育种计划中发现控制产量变异的QTL。1993年由Nickersons Seeds(现在的Limagrain)发布的Spark是第一组优质面包品种，而1991年由PBIC(现在的RAGT)发布的Rialto是第二组面包品种，在nabim小麦指南中分类[[]42]]。这个群体是用标准的小麦x玉米技术从F₁植物[[43]]。

为了独立验证6A染色体上的多个QTL效应，我们利用标记开发了一组近等基因系(NILs)Xwmc32，Xpsp3071和Xgwm570用于标记辅助回交。这是通过回交Rialto位点的两个DH系(56和136)来完成的Xwmc32-Xgwm570间隔，到周期性的母星火。战线推进到不列颠哥伦比亚省₂(然后继续到BC₄)，通过微卫星标记杂交每一代选择的杂合植株Xwmc32，Xpsp3071和Xgwm570．最后回交后，选择的杂合子自花授粉，NILs为纯合子Xwmc32-Xgwm570区间从所得BC中提取₂F₂和公元前₄F₂植物。我们总共产生了10个纯合子BC₂NILs(6个Spark和4个Rialto渗入)和8个BC₄NILs(四个Spark和四个Rialto)。

遗传图谱构建及QTL分析

植物核DNA分离采用已发表的方案[[]2]]。先前已描述了所使用的基因分型程序;PCR和PAGE [[44[]，单链构象多态性(SSCP) [[45]]和KASPar [[46]]。SSR标记的扩增条件可在GrainGenes网站获得[[47]]。

Spark x Rialto的遗传图谱最初是使用公开的简单序列重复(SSR)标记开发的。共285组引物来自JIC/psp[[44]、[48[k] Gatersleben/分组/ gdm[[49]、[50小麦微卫星联盟wmc[[51，贝尔茨维尔农业研究站巴克[[52]]和INRA/cfa / cfd[[53集合在Spark和Rialto之间是多态的。为了确保最大的基因组覆盖率，使用已发表的共识图选择164个标记进行群体定位[[]21在可能的情况下，目标是每20厘米一个标记密度。Rht-D1等位基因在该杂交中分离，并使用“完美”标记进行定位[[]54或者进行GA幼苗试验。为了提高地图密度，将种群DNA发送给澳大利亚的Triticarte Pty Ltd [[]55[]用于多样性阵列技术(DArT)基因组分析[[56[](完整的基因型见附加文件5)。

使用JoinMap®3.0版本进行连锁分析和遗传图谱构建[[]57]]，使用默认设置。连锁群采用3.0的分歧对数(LOD)阈值确定，遗传距离采用Kosambi回归计算。

为了提高6A QTL区间的标记分辨率，从表达序列标签(EST)中获得了另外9个单核苷酸多态性(SNP)标记[[]58[])通过SSCP进行映射。另外19个KASPar SNP标记[[]59]]先前分配给6A染色体[[35]、[60] - [62[]也被筛选并添加到基因图谱中。TaGW2使用先前描述的裂解扩增多态性序列(CAPS)标记(Hap-6A-P1和Hap-6A-P2)进行定位[[]17]]。另外33个KASPar SNP标记预计在远端Xgwm570[[59[]在Spark和Rialto之间是单态的。

QTL Cartographer v2.5 []63[]用于QTL检测，并利用单标记分析和复合区间映射(CIM)函数估计QTL效应。采用5个对照标记，窗口大小为10 cM，采用反向回归方法选择CIM模型6。采用LOD显著性阈值2.5，行走速度为1 cM，排列数为500，显著性水平为0.05。利用多区间作图(multiple interval mapping, MIM)计算已鉴定QTL的加性效应和总变异百分比。多性状多环境(MTME)分析对此进行了补充[[]25]]用于Genstat 15中的QTL检测^th版(VSN International)。检测最合适的方差-协方差结构(因子分析阶数为1)，并计算步长为4 cM的遗传预测因子。显著性水平和QTL效应通过最后的反向选择步骤确定，显著性水平为0.05。

现场评价和表型分析

DH群体采用随机完全区组设计，在5个地点进行3个重复(英格兰诺维奇(52°37′39.9”N, 1°10′45.9”E);英格兰桑德林汉姆(北纬52°50′02.1”，东经0°25′48.9”);苏格兰巴尔蒙斯(北纬56°15 ' 02.3 "，西经2°44 ' 31.5 ");德国Bohnshausen(北纬51°51′31.8”，东经10°57′38.5”);法国弗鲁瓦西(北纬49°34′07.6”，东经2°13′11.6”)。这些实验在诺维奇和桑德林厄姆进行了三年(2001-2003)，在其他三个地方进行了两年(2002-2003)。试验在大规模生产地块(1.1 × 6 m)上播种，并进行了标准的农业农药和化肥施用，以复制商业实践。试验按粒数播种，以确保每个地块的植物密度相当，目标种群为275粒/ m⁻²．

在校正地块大小后，记录了所有站点的最终地块产量，并对诺里奇和桑德林汉姆的发育性状和产量成分进行了额外的表型评估。其中包括Zadoks生长阶段57的抽穗日期[[64生理成熟度(GS91;测量为50%的花梗失去绿色)(Norwich 2001 - 2003和Sandringham 2001)。抽穗后绿冠期由抽穗至生理成熟的天数减去抽穗至生理成熟的天数计算。分蘖数是通过计算1米行内可蘖数来评估的(每块2次测量)(Norwich 2001-2003年和Sandringham 2002-2003年)。收获前，从每个地块取样10个主要分蘖(来自10个不同的植物)，评估产量成分，包括植物生物量、收获指数、种子/穗、种子/小穗和TGW (DH群体的完整表型评分见附加文件)6)。

NILs于2010-2012年(公元前10年)在诺里奇种植₂和2013年(公元前8年)₄2012年(公元前10年)在德国的Wohlde(北纬52°48 ' 28.5 "，东经9°59 ' 54.8 ")₂尼尔斯·)。试验采用与DH群体相同的试验方法进行播种，只是重复次数不同(Norwich 5-10次，Wohlde 3次)。现场表型分型与DH人群(前文所述)的方式相同，但有以下例外:诺里奇的生物量和收获指数仅在2011年测量，分蘖数、种子/穗数和种子/小穗数仅在2011 - 2013年测量。使用MARVIN谷物分析仪(德国GTA Sensorik GmbH)记录每个样品300-400粒的形态测量(晶粒宽度、长度、面积和千粒重)。此外，用DNA标记对田间种植的NILs进行了检查，以确认其在地下和收获后的身份。

此外，在2010年和2011年，利用英国柯尼卡美能达公司的SPAD 502-Plus测量了叶绿素的相对含量。SPAD测量在花后的几个时间点进行，目的是在NILs之间没有明显差异时进行初始读数，然后随着衰老的进展在合适的时间点进行测量。每亩10个主要分蘖在开花时被标记，并用于整个灌浆过程的测量。对旗叶(基部，中部和尖端)进行了三次测量，并为每个标记的分蘖获得了平均值。

统计分析

根据基因型对DH系进行分类Xgdm36来Xgwm570遗传间隔(Rialto为35个纯合子，Spark为49个纯合子)。在此基础上，对多个性状进行一般单因素方差分析(ANOVA)，并计算所选性状之间的Pearson相关系数。NILs使用双向方差分析进行评估，其中环境与6A区间之间的相互作用包括在模型中。使用GenStat 15进行方差分析和相关性分析^th版(VSN International)。

TaGW2测序

gDNA

引物用于扩增a基因组同源物的基因组DNATaGW2基于国际小麦基因组测序联盟(IWGSC)中国春季染色体臂调查序列设计的[[]65]]。Contigs 6AS_4408273和6AS_4409759(分别对应上游序列和外显子1 ~ 6，外显子7、8)根据已发表的内容进行标注TaGW2cDNA序列[[20.]]。设计了四个同源特异性引物对，用于扩增ATG起始密码子上游1,244 bp的基因组DNA，外显子1，外显子2至6，外显子7和8(附加文件)7)。采用触地PCR程序扩增Spark和Rialto的基因组DNA, PCR产物使用BigDye Terminator v3.1试剂盒(Invitrogen)直接测序。产物电泳和荧光痕量数据生成由诺维奇基因组分析中心(TGAC)进行。

互补脱氧核糖核酸

使用Tri-Reagent (Sigma, St. Louis, USA)从Spark和Rialto各1个4叶幼苗的叶片切片中提取总RNA，并使用MMLV-RT (Invitrogen, Carlsbad, USA)按照制造商的协议合成cDNA。来自中国春季六倍体小麦454 5x原始数据的小麦est和定制程序[j]59的非翻译区(UTR)设计引物TaGW2．设计引物扩增三个同源基因组。利用这些引物和Spark和Rialto的cdna进行RT-PCR扩增TaGW2两个品种(全部三个基因组)的CDS。纯化的RT-PCR产物在72°C下，用10 mM dATP和1u Taq聚合酶(Promega, Madison, USA)在1倍制造商缓冲液中孵育10分钟，用a悬液修饰。然后按照制造商的说明使用pgem - easy试剂盒(Promega)直接克隆它们。使用M13引物对克隆的Miniprep DNA进行插入测序，并用TGAC进行测序。利用流动排序的染色体臂DNA序列对序列reads进行对齐并分配到A基因组[[]66]]和IWGSC的调查序列，这些序列后来公开发布[[67]]。

支持数据的可用性

支持本文结果的数据集包含在本文及其附加文件中。

这项工作得到了英国生物技术和生物科学研究委员会(BBSRC)的BB/J004588/1和BB/J004596/1基金的支持。作者要感谢先正达和Advanta Seeds(现为Limagrain)对产量QTL项目的贡献，以及RAGT Seeds对BC进行初步试验的贡献₂NILs, Hana Simkova和Jaroslav Dolezel(捷克共和国实验生物学研究所，Olomouc)提供了流动排序的染色体臂DNA, IWGSC提供了小麦染色体臂调查序列的出版前访问。我们也要感谢JIC田间试验园艺服务部为温室和田间试验提供的技术支持。

从属关系

1. 约翰英尼斯中心，诺里奇研究园，诺里奇，nr47uh，英国

   詹姆斯·西蒙兹、彼得·斯科特、米歇尔·莱弗灵顿-韦特、阿德里安·S·特纳、杰迈玛·布林顿、约翰·斯内普和克里斯托瓦尔·韦

2. KWS Lochow GMBH, Ferdinand-von-Lochow-Str。5, Bergen-Wohlde，德国29303

   维克多•尊

3. 英国剑桥市亨廷顿路国家农业植物学研究所，cb30le

   克里斯托瓦尔Uauy

相应的作者

对应到克里斯托瓦尔Uauy．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

JSi开发了本研究使用的种质资源，并进行了制图，协调了所有的田间评价和统计分析，撰写了稿件。PS在表型评估、田间试验准备和温室栽培方面提供了帮助。MLW领导了原始Spark x Rialto DH种群的绘制，并协助进行了种群的表型评估。AT和JB进行了测序TaGW2．VK在德国协调了田间试验。JSn协调并构思了DH群体田间试验。CU构思了NIL验证实验，分析了数据，并撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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