苹果浅表烫伤发生过程中靶代谢产物及基因转录谱分析(家蝇Borkh)

背景

由于经济原因，成熟过程产生的水果品质特征需要在整个储存过程中保存。然而，在此期间可能发生几种生理障碍，其中浅表烫伤是最重要的一种，因为水果表皮表面出现了大片棕色区域。

结果

本研究检测了苹果表面烫伤过程中多酚含量的变化，以及1-MCP的变化，1-MCP是一种与激素受体相互作用的乙烯竞争对手，已知会干扰这种病因。这些代谢物积累的变化与参与该途径的基因集以及两种特定的挥发性有机化合物α-法尼烯及其氧化形式6-甲基-5-庚烯-2- 1进一步相关。代谢物分析和qRT-PCR分析显示，这些挥发物更多地参与了信号系统，而褐变的颜色似乎更多地是由于绿原酸的特定积累(作为激活的结果)MdPAL和MdC3H)，并由多酚氧化酶基因(MdPPO）.在这种生理情况下，也有新的证据表明，抗凋亡调节机制参与了这种现象在皮肤上的区隔，这是假设的MdDAD1，MdDND1和MdLSD1基因。

结论

本研究结果为理解苹果表面烫伤的生理机制迈出了一步，揭示了特定生理级联的调控。

果实品质是由果实成熟和成熟过程中发生的一系列生理变化决定的，从果实发育的初始阶段开始。这些过程涉及细胞壁结构的改变、色素的积累、淀粉转化为糖、有机酸的减少和风味的形成，这些过程是基因协调的，以使果实对种子分散的生物体更美味，对人类的消费和饮食更有吸引力[[]1] - [3.]])。根据乙烯的水平，果实的成熟行为也可以分为两类(更年期和非更年期)。乙烯是一种植物激素，对触发和协调导致果实最终质量的过程至关重要。[]4]、[5]]。为了保证保持高质量标准，水果在低温或低氧浓度等条件下，在改变的气氛中长时间储存。这些是非生理条件干扰乙烯的生理性产生，从而干扰果实成熟和衰老的自然进程[[]6] - [8]]。然而，在采后贮藏过程中，许多与非生物胁迫有关的疾病可能由于冷害或缺氧而产生[[]9] - [14]]。

在采后可能发生的几种疾病中，浅表烫伤是最重要的一种。在苹果中，主要的烫伤症状表现为弥漫性褐变，通常局限于皮肤及其下的六细胞层[[]15]]。这种紊乱通常发生在冷藏两个月或更长时间(-1至4℃;［［16]])。果实表面烫伤是一种复杂的现象，受环境和遗传因素以及果实成熟阶段的影响。特定的苹果品种，如“史密斯奶奶”、“富士”、“克里普斯粉红”和“红美味”，确实比其他品种更容易受到影响。[]17]]。此外，成熟的水果比未成熟的水果更不易被烫伤。[[18[]，而苹果绿的一面通常比红的一面更容易出现烫伤症状[[19]]。尽管这种疾病具有危害性和扩散性，但其病因仍未完全阐明[[]20.]]。迄今为止，关于烫伤的发生，研究最多和被接受的假设与α-法尼烯的积累有关，α-法尼烯是一种酰基倍半萜，其浓度在储存过程中增加。由于其亲脂性，这种挥发物在皮肤中，特别是在外蜡层中积累显著[[]19]、[21]、[22]]。最近的研究将浅表烫伤的诱导与α-法尼烯自氧化产物的积累联系起来，如共轭三烯醇(cols)，主要是2,6,10-三甲基十二- 2,7e,9,11-四烯-6-醇[[]23]]。α-法尼烯的合成也被认为与乙烯的用量密切相关[[24，因为这种激素调节…的表达MdAFS1α-法尼烯合成酶1 (α-法尼烯合成酶1)是α-法尼烯生物合成途径的最后一个基因。乙烯的竞争对手1-甲基环丙烯(1-MCP)的作用也进一步证实了乙烯与α-法尼烯之间的密切联系，这导致α-法尼烯的积累减少。由于1-MCP在受体水平上对乙烯的竞争作用，已知它强烈影响更年期果实的正常成熟进程[[]25[]，正如对苹果、番茄和桃子进行的几项基因组调查所记录的那样，[[26] - [31]]。除此之外，1-MCP最近也被广泛应用于苹果表面烫伤的防治[[]32]]。尽管用1-MCP处理的样品显示表达减少，但这种化合物在防止烫伤中的完整作用模式尚不完全清楚MdAFS1［［19]、[33] - [35]]。最近的其他文献表明自由基氧化的启动是苹果烫伤发展的主要因素[[]36]]。在这种情况下，α-法尼烯的自氧化可能代表了一个更复杂和未完成的过程的副作用。除了α-法尼烯的作用外，还有另一种关于多酚类化合物氧化的假设，多酚类化合物被认为是皮肤褐变的基础。这些化合物在破坏细胞膜后，与叶绿体释放的多酚氧化酶(PPO)相互作用[[]37]]。PPO因此将多酚转化为氧化形式，如醌[]38] - [40]]。胺和巯基与醌反应，最终形成棕色色素。这个削减已经被老板提出了等．［［41[]，他观察到“史密斯奶奶”烫伤组织中多酚氧化酶转录物的上调，而Piretti等．［［42[]假设在烫伤过程中表现出的棕色色素沉着是低聚多酚氧化的最终结果。

科学界对苹果表面烫伤的研究，除了了解控制这一现象的基本生理机制外，主要集中在研究避免这种疾病的策略[[]43] - [45]]。烫过的水果确实有明显的美学缺陷，会严重影响水果的销路。为了解决这个问题，已经采用了几种技术应用，例如强制通风，皮肤涂层，热冲击和化学处理，特别是DPA(二苯胺)[[]46]])。然而，尽管这种氨基抗氧化剂至今仍被广泛应用[[]47]]，由于该化合物可能存在风险，目前正在对其应用进行认真审查。作为一种替代分子，采后管理利用了1-MCP，一种广泛采用的乙烯抑制剂来延长更年期肉质水果的储存能力[[]48]、[49]]。然而，迄今为止在科学文献中提出的大多数工作主要是基于酶测定和与这种现象有关的一组有限基因的表达谱，例如AFS和PPO．

在这项工作中，我们利用候选基因qRT-PCR方法，结合靶向代谢谱，研究了苹果烫伤发育过程中多酚级联的变化。最后，基于不同组织的特异性表达谱提出了一个有趣的证据，即程序性细胞死亡(PCD)过程的参与，作为一种可能的自然防御机制，由果实发挥作用，以防止苹果采后疾病的扩大。本研究描述和讨论的结果揭示了这种失调的具体方面，有助于更好地阐明苹果果实收获后发生的生理机制。

植物材料和实验设计

从种植在法恩扎(意大利艾米利亚-罗马涅地区)的“史密斯奶奶”苹果树上采集的果实，在矿物施肥、果实稀疏、树冠修剪和疾病控制方面遵循标准的农艺做法。苹果是在商业收获阶段采摘的，在I_广告取值为1.8-2。我的_广告果实成熟的非破坏性指标是否由叶绿素a吸收峰附近两个波长(670 nm和720 nm;［［50]、[51]])。在收获后(T0)立即取样均匀的果实(成熟阶段和形状)，并立即分成两批。第一组用1ppm的1-甲基-环丙烯(1- mcp)处理24小时，而第二组保持作为对照。两批样品在0.5°C、95%相对湿度的正常常压条件下的冷藏室中保存。两批样品分别在冷藏1个月(T1)和2个月(T2)后从冷藏室中取出。为了进一步促进烫伤的发展，在每个冷藏期间，分别在1(+1)、4(+4)和8(+8)天的货架期(室温约20°C;额外的文件1:图S1)。为了研究整个果皮的症状发展，对每个样品评估了三种类型的组织:皮肤(S，果皮和下层受影响的果肉)，下皮(U，皮肤以下几毫米的果肉)和内果肉(P)。

RNA分离及qRT-PCR分析

每个水果分别收集三种组织(果皮、皮下果肉和果肉)，切成小块，立即在液氮中冷冻，磨成细粉，在-80°C保存，直到最后加工。RNA提取使用Spectrum Plant total RNA kit (Sigma-Aldrich Co.， St . Luis, MO, USA)。RNA使用NanoDrop ND-8000分光光度计(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)进行定量，其纯度和完整性使用2100生物分析仪(Agilent, Santa Clara, CA, USA)进行评估。然后使用“SuperScript VILO cDNA合成试剂盒”(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)将分离的RNA转化为cDNA。在此之前，从每个样品中提取2 μg的总RNA，用2单位的Ambion rDNAse I (DNA free kit, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)处理，作为起始模板。转录本定量使用ViiA7™仪器(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)，使用FAST SYBR GREEN MASTER MIX (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)进行。PCR热条件为:95°C孵育20秒，95°C 1秒和60°C 20秒孵育40个循环。最后，95°C孵育15秒，60°C孵育1分钟，95°C孵育15秒，测定熔融曲线。Ct结果通过对每个样品取两个独立的归一化表达值的平均值得到，使用仪器附带的ViiA™7软件(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)进行计算。使用Delta-Delta CT方法将相对基因表达量绘制为归一化表达值的平均值[[]52[]和Md8283作为持家基因[[53]、[54]]。

基因鉴定及引物设计

本次调查研究的基因集是根据Kirk等人描述的多酚途径选择的[[]55]]。由于已经观察到多酚类化合物的代谢与苹果的类似表型(果肉变褐)之间存在很强的相关性[[40]])，我们将重点放在理解多酚通路的调控上。基因ID是从已经发表的研究中检索的[[56] - [62[]对负责这一生理生物合成途径的每个成员进行分析，而cDNA序列则从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）.从每个序列定义ORF部分，以便在可能的情况下从UTR部分表征CDS。为了找到对应的特定苹果元素，将每个单独的CDS序列在Rosaceae数据库(www.rosaceae.org）.选择e值和得分最高的基因id作为候选基因id。对于每个基因，在每个MDP的侧翼区域设计特定的引物对，通过对cDNA序列上的UTR进行分离，以确定每个多酚生物合成基因的独特靶元件。除此之外，还评估了其他五个基因的表达谱。多酚氧化酶基因MdPPO(MDP0000699845)由Di Guardo等人检索。[[]40]],而MdAFS1该基因参与α-法尼烯的生物合成途径，通过爆破Lurie等人设计的cDNA序列获得[[]33[]在苹果基因组上按照先前描述的程序。最后，三个基因(MdDAD1，MdDND1和MdLSD1)参与抗细胞凋亡机制。的cDNA序列MdDAD1的数据来自Dong等人。[[63]]并使用BLAST查询来识别上述基因集中相应的MDP。DND1［［64]]和LSD1［［65[]被选为候选抗凋亡基因，因为之前在拟南芥．这些元件的cDNA序列最初是从拟南芥数据库(www.arabidopsis.org)，并进一步在苹果基因集(附加文件2:图S2)。选择e值和得分最高的基因预测作为苹果候选同源物。

多酚类化合物的提取与分离

按照Theodoridis等人报道的程序，从“史密斯奶奶”苹果的碾碎组织中提取并分析了酚类物质。[[66[]和Di Guardo等。[[40]]。每个样本由三个生物重复代表。用4 mL水/甲醇/氯仿溶液(20:40:40)在密封玻璃瓶中提取2 g粉末状组织。涡旋1 min后，在室温下用轨道振动器混合15 min，然后在1000 g(4°C)下离心10 min，收集由甲醇水溶液萃取物组成的上相。再加入2.4 mL水/甲醇(1:2)到颗粒和氯仿馏分中重复提取。最后离心后，将两种萃取物的上相结合，使其体积为10 mL，用0.2 μm PTFE过滤器过滤，然后进行液相色谱-质谱分析。采用Waters Acquity UPLC系统(Milford, MA, USA)和Waters Xevo TQMS (Milford, MA, USA)在ESI电离模式下进行高效液相色谱分析[[]67]]。酚类化合物在Waters Acquity HSS T3色谱柱1.8 μm, 100 mm × 2.1 mm (Milford, MA, USA)上分离，保持在40°C，两种溶剂:a(含0.1%甲酸的水)和B(含0.1%甲酸的乙腈)。流速为0.4 mL/min，梯度剖面为0 min, 5% B;从0 ~ 3min，线性梯度至20% B;3 ~ 4.3 min，等温20% B;从4.3 ~ 9 min，线性梯度至45% B;9 ~ 11 min，线性梯度至100% B;11 - 13分钟，100% B洗涤;在13.01 ~ 15 min内，将标准溶液和样品各取2 μL的体积，分别用600 μL弱洗涤液(水/甲醇，90:10)和200 μL强洗涤液(甲醇/水，90:10)冲洗针头。在质谱检测期间，样品保存在6°C，使用Waters Xevo TQMS (Milford, MA, USA)仪器进行，配备电喷雾(ESI)源。 Capillary voltage was 3.5 kV in positive mode and −2.5 kV in negative mode; the source was kept at 150°C; desolvation temperature was 500°C; cone gas flow, 50 L/h; and desolvation gas flow, 800 L/h. Unit resolution was applied to each quadrupole. Data were processed using Waters MassLynx 4.1 and TargetLynx software.

最初选择135种酚类化合物进行定量测定试验[[67]]。代谢物的选择主要基于其对食品质量的重要性和/或相关性，涵盖了主要类别。特别地，包括苯甲酸盐、苯丙素、香豆素、二苯乙烯、二氢查尔酮和类黄酮，以及植物中常见的单一物种或科的代谢物。每个单独标准溶液的原液在纯甲醇中制备。这些起始溶液用于制备16种标准混合物，每种混合物包括6 - 10种化合物。连续稀释得到24个较低浓度(稀释系数为1 - 60000)，用于线性动态范围评估。

使用PTR-ToF-MS表征VOC

苹果组织中挥发性有机化合物的测量方法如下:将2.5 g粉末状冷冻组织立即插入装有PTFE/硅胶隔片(Agilent, Santa Clara, CA, USA)的20 mL玻璃小瓶中，与2.5 mL去离子水、1g氯化钠、12.5 mg抗坏血酸和12.5 mg柠檬酸混合，然后在4°C保存直至评估。使用商用PTR-ToF-MS 8000仪器(Ionicon Analytik GmbH, Innsbruck, Austria)对三个重复进行分析。漂移管内的条件为:漂移管温度110℃，漂移压力2.25 mbar，漂移电压550 V。这导致E/N比约为140汤森(Td)，其中E对应于电场强度，N对应于气体数密度(1 Td = 10−17 Vcm2)。ToF采集的每通道采样时间为0.1 ns，在高达m/z = 400的质谱范围内，总共有350,000个通道。样品在40°C下孵育20分钟后，使用合适的气相色谱自动进样器(MPS Multipurpose Sampler, GERSTEL)自动进行每次测量，持续约2分钟。在测量期间，100 sccm的零空气通过加热到40°C的针头连续注入瓶中;流出液通过Teflon配件通过第二根加热针(40°C)输送到PTR-Tof-MS。PTR-ToF-MS光谱数据分析如下: Count losses due to the ion detector dead time were corrected off-line through a Poisson statistics based method [[68]]，同时按照Cappellin等人所描述的程序进行内部校准。[[69]]。这种方法可以达到高于0.001 Th的质量精度，这足以在我们的情况下确定和公式。将光谱与复方标准品的碎片化数据进行对比，进行复方标注。利用改进的高斯函数拟合峰值，进行降噪、基线去除和峰值强度提取。绝对顶空VOC浓度以ppbv(十亿分之一体积)表示，根据Lindinger等人描述的公式从峰值强度计算[[]70]]。在计算中使用了2∙10-9 cm3/s的恒定反应速率系数，如果该系数已知，则引入了高达30%的系统误差，可以解释实际速率[[]71]]。

《史密斯奶奶》中浅表烫伤的发展和多酚途径

为了研究浅表烫伤的积累和发展，将“史密斯奶奶”苹果品种的果实在收获后立即分为两组，一组作为对照，另一组用乙烯竞争对手1-MCP处理[[]72[]已知与苹果的烫伤发展相互作用[[73]]。如附加文件所示，通过在两个贮存期(分别为一个月和两个月)和在8天的保质期内三次取样苹果来监测这种疾病的生理进展1:图S1目视检查后发现，烫伤苹果的褐变只发生在T2期对照样品的表皮上，并且在保质期的一周内，褐变的幅度越来越大(附加文件)3.:图S3)。对于本实验设计中的每个样本，分别分离出果皮、下皮和果肉(果肉)三个组织，以验证果实在基因表达和次生代谢物变异方面对这一现象的空间响应。本文研究的途径考虑了苯胺的生化级联，导致绿原酸、黄酮醇、黄烷-3-醇(儿茶素和表儿茶素)等多酚类物质的合成，如图所示1．11个结构基因的表达(附加文件)4表S1)沿着这条通路定位并分析。这六个(MdPAL，MdCHS，MdCHI，MdF3H，MdDFR和MdANS)被指定为中央主要梯级。此外,MdC3H，MdFLS，MdLAR和MdANR选择它们是因为它们在绿原酸、黄酮醇、表儿茶素和儿茶素四大类多酚化合物的形成中起重要作用。此外，一个成员PPO还研究了一个家族(MDP0000699845)，该家族负责将多酚化合物转化为氧化的棕色形式。

候选基因表达谱和多酚定量分析表明绿原酸是浅表烫伤发育的主要决定因素

对所有样品的多酚含量进行了定量分析，确定了绿原酸、苯根苷、黄酮醇、儿茶素和表儿茶素5种主要化合物的含量。总的来说，总多酚积累(附加文件)5:图S4和附加文件6表S2)在皮肤中的含量明显高于其他两个组织(皮下和牙髓)，变化约为5倍。这一趋势也证实了在不同积累的根际素，黄酮醇和表儿茶素，但没有儿茶素。根据以往的研究[[74] - [76[]“史密斯奶奶”水果的儿茶素含量通常低于表儿茶素，尤其是在皮肤中，表儿茶素的含量大约是皮肤的两倍。

检查每个类别，还观察到存储期间的特定规则。以根霉素为例，贮藏2个月(T2)后的积累量低于贮藏1个月(T1)后的积累量，而黄酮醇的积累量则相反(另附文件)5:图S4)。除此之外，对于一些化合物(如在T1采集的皮下和果肉中评估的phenlorizin，以及在T1和T2采集的黄酮醇)_{S + 1}在皮肤和皮下)，1-MCP治疗后也检测到积累减少。这种普遍的多酚积累(图2)2将B)与代表这些代谢物生物合成途径的11个基因的转录谱进行比较(图2)2A).从总体热图来看，说明了表达谱和皮肤中多酚的积累(与浅表烫伤有关的组织)，值得注意的是对照和处理样本中不同的转录组图。治疗后的这种特殊反应突出了1-MCP如何用于关闭参与成熟途径的基本基因，修改基因表达并检测三种主要的转录组动力学。第一组有三个基因，MdPAL，MdPPO和MdC3H，在T2特异表达_{S + 4}阶段(与烫伤发展相一致)，1-MCP完全下调，提示乙烯可能正调控。在最后一个基因的具体案例中，MdC3H1-MCP的作用是控制绿原酸的最终合成，在T2到T1阶段，1-MCP的应用略微提前了其mRNA的积累。第二组，由三个基因(MdCHS，MdCHI和MdF3H)涉及的级联从p-香豆酸到二氢黄酮醇(分支到黄酮醇之前的步骤)，连同MdANR(参与花青素最终转化黄烷-3-醇)，在施用乙烯竞争对手1-MCP后转录物积累减少。最后一组基因的表达量(MdDFR，MdANS，MdFLS和MdLAR位于多酚途径下游的1-MCP反而略有增强(图2)2和附加文件7:图5)。

虽然表面烫伤是一种主要涉及水果表皮的现象，但对内部组织可能进展的进一步调查进行了评估。特别是，我们旨在揭示限制褐变进展的反应机制。不同种类的多酚类化合物在这里计划的实验设计中定义的样品中积累的方式不同。特别是，在整个储存和保质期内，根霉素、儿茶素和表儿茶素不断减少，而黄酮醇表现出相反的动态，因为它们反而积累(附加文件)5:图S4)。最有趣的是绿原酸的分布，从T1到T2，绿原酸在皮肤组织中积累(以及在货架期的进展)，而在皮下和牙髓组织中，绿原酸在不同阶段呈下降趋势。绿原酸的积累较高(图2)3.A)与T2发生的烫伤破裂同时发生_{S + 4}阶段，这个阶段也是绿原酸途径相关基因表达水平最高的阶段，即MdPAL，MdC3H和MdPPO(图3.B, C和D).在烫伤过程中绿原酸的产量增加，伴随着活化朋友和摘要:，可以被认为是水果在储存过程中激活的抗氧化保护系统。“史密斯奶奶”苹果表面烫伤的出现确实经常与受损组织中活性氧的积累呈正相关[[]36]、[77]]，可能是由于冷藏对细胞膜流动性和完整性的负面影响[[78]]，导致离子泄漏和全面解体。这种与冷害有关的现象已经在苹果和其他水果物种中观察到[[]10]、[79]]。

在这种情况下，褐变可能是对激活的响应MdPPO(以绿原酸为主要底物)，以维持系统处于生理平衡状态，正如在内部褐变的情况下所观察到的那样[[40，类似的过程导致的诱导MdPAL和MdPPO．与内部褐变相比，浅表烫伤更局限于皮肤层的细胞。多酚分析已经强调了这种组织特异性，它也得到了特定基因表达的支持。MdPAL、MdC3H和MdPPO与参与多酚途径的其他基因相比，确实主要在皮肤中表达，而不是在皮下和果肉中表达(图3.和附加文件7:图5)。绿原酸和相关基因转录本的特异性积累表明，这种化合物和随后的激活MdPPO基因是该疾病发展的主要因素。通过与1-MCP处理的样品进行比较，实验也支持了这一假设。这种化合物，已知会在收获后储存期间干扰烫伤的发展[[]80]]，有效阻断了皮肤中绿原酸的合成(图3.A).同时，1-MCP强烈特异性下调MdPAL，MdC3H和MdPPO(图3.B, C和D)。乙烯竞争对手的应用对位于多酚途径的其他基因并不同样有效(附加文件7:图S5)支持绿原酸在褐变过程中作为基本生理途径的作用。同样有趣的是，1-MCP的作用，特别是在T2期(受皮肤褐变发生率的影响)，在内部组织(皮下和牙髓)中的作用不太明显。的表达水平MdC3H在皮下和牙髓组织中基本不变(图3.C)，这表明苹果的烫伤主要发生在皮肤上，因为不同水果组织中这些次生代谢物的代谢调节是对局部冷害的反应。同样值得注意的是，在基因表达水平和代谢物积累之间观察到两个不一致之处。第一个以表达的高峰为代表MdPALT2_{U + 4}，这与绿原酸的不变积累无关。然而，这一趋势可以用低表达来解释MdC3H，表明绿原酸的生物合成不完全，这个基因代表这个基因在这个级联的最后一步。另一个不一致之处是，尽管T1期基因活性较低，但这种化合物在牙髓中的积累却很高。这种情况可以解释为绿原酸在冷藏的第一个月积累，之后绿原酸表现出连续的线性降解，因此不需要激活这条生物合成途径来合成新的绿原酸。

α-法尼烯和cols在苹果烫伤发育中的作用

除了多酚类表征外，还对α-法尼烯及其氧化产物6M5H2one(6-甲基-5-庚烯-2-one)的作用进行了进一步的研究。迄今为止，α-法尼烯已被证明是参与烫伤发展的主要化合物[[]81]]。特别是α-法尼烯的氧化产物被认为是这种疾病的诱因，因为将cols外敷在“史密斯奶奶”苹果的皮肤上会诱发类似烫伤的症状[[]23]]。为了验证α-法尼烯和6M5H2one在这一过程中的作用，我们使用基于质子转移反应的新型质谱仪PTR-ToF-MS对这两种挥发性有机化合物(VOCs)进行了测量[[]82]]。

根据其他参考文献[[16]、[19]、[20.]、[33[] α-法尼烯在冷藏第一个月后呈线性积累，特别是在室温贮藏期的第一个时期，从T1开始明显增加_{+ 1}对T1_{+ 8}之后，在T2保质期内观察到更恒定的剖面(图2)4B).该挥发物的爆发与基因的激活和转录动力学呈正相关MdAFS1α-法尼烯合成最后一步的编码基因(图2)4一个)。MdAFS1mRNA水平较T1升高_{S + 1}对T1_{S + 8}，然后在T2阶段下降。挥发性浓度和MdAFS1表达受1-MCP的显著影响，因为它的应用降低了VOCs和MdAFS1几乎完全积累(图1)4除了α-法尼烯外，PTR-ToF-MS还有效检测到α-法尼烯氧化产生的挥发性酮6M5H2one。Rowan等。[[23[]表明，α-法尼烯自氧化产生的6M5H2one浓度可以被认为是苹果皮氧化的可靠指标，因为α-法尼烯的自氧化表明自由基介导的反应，参与了cols的产生[[]20.]、[83]]。

有趣的是，6M5H2one的积累发生在其前体之后。6M5H2one在整个T1期与收获期相比确实保持在基础浓度，之后在T2期其积累量显著增加(图2)4C)，与烫伤症状的发展相吻合。α-法尼烯和6M5H2one对这两种挥发性有机化合物的时间调控表明，α-法尼烯和6M5H2one对烫伤的调控作用大于α-法尼烯。在这种情况下，我们可以推测α-法尼烯是在苹果果皮采后储存过程中积累的。然后，作为对氧化应激(刺激烫伤发展的可能原因之一)的反应，α-法尼烯可能在cols中自动氧化，然后作为信号分子，触发基于抗氧化保护的防御机制，通过增加多酚化合物的积累，特别是绿原酸。为了维持系统的反馈调节，多余的绿原酸随后被多酚氧化酶氧化，产生随之而来的棕色。

抗凋亡系统可以激活苹果对烫伤进展的防御机制

除了参与多酚级联反应的基因外，我们还研究了参与细胞凋亡机制的三个因素，即MdDAD1，MdDND1和MdLSD1．

最近有人提出程序性细胞死亡(PCD)活性参与苹果收获后疾病的进展[[]84[]，假设PCD可能与氧化应激和乙烯协同作用，作为一系列过程的一部分，导致表面烫伤、内部褐变和苦坑症状。据我们所知，到目前为止，关于苹果PCD的数据很少，大多数情况下与细胞培养悬浮中的应激反应有关[[]85]、[86]]。迄今为止，关于苹果储存过程中PCD机制存在的唯一明确证据是DAD1．Dong等人报道[[]63]],MdDAD1苹果元件是否编码哺乳动物低聚糖转移酶同源物的亚基(抵抗细胞死亡的防御者)1 -DAD1)，其表达量在室温成熟过程中逐渐上升。DND1在拟南芥中，AT5G15410编码了一个功能性的环核苷酸门控阳离子通道，直接参与了病原体诱导的Ca^{2 +}涌入(CNGC2)在超敏反应中被激活[[64]]。有趣的是，高Ca^{2 +}果实中的浓度是减少表面烫伤发生率的重要采收前参数[[]87]、[88[]，以及在非生物抗逆性中普遍存在的信号，如抗寒性[[89]]和PCD [[84]、[90]]。最后,AtLSD1(AT4G20380)编码C₂H₂锌指转录因子监测超氧依赖信号，负调控植物PCD [j]65]]。该基因确实代表了ros相关信号，低温依赖性PCD和冷胁迫耐受性之间的有趣联系[[]91[]，并且被认为通过上调cu - zn -超氧化物歧化酶来限制细胞死亡，该酶在低温损伤中起保护作用，防止不受控制的氧化过程[[92]]。

从三个苹果同源基因的转录组学分析(图2)5A, B和C)，很明显，从重新建立室温开始，仅在冷藏两个月后，果皮中的mRNA积累量低于果皮和果肉。在T1期没有观察到这种调节，这表明这种差异是由浅表烫伤障碍的发生适当调节的。与皮肤相比，未受棕色影响的两个组织中的高基因表达也被1-MCP处理放大(图2)5D)，提示抗凋亡机制作为一种保护系统参与了烫伤。因此，抗凋亡系统可能与绿原酸的氧化有关，作为一种自我防御机制。随着α-法尼烯氧化释放的信号和多酚类化合物的大量积累，这些基因的激活可能会启动对底层组织的进一步保护，这只有助于隔离苹果表皮的烫伤进展。有趣的是，在核桃转基因品系中也观察到类似的机制[[]93]]。沉默PPO导致酪胺和多酚底物的过度积累，其反应产物相应减少，潜在的可能联系PPO多酚代谢和PCD事件

本研究的结果揭示了导致苹果烫伤发育的生理过程，这是一种影响特定苹果品种适销性的有害采后疾病。对主要多酚级联的分析强调了绿原酸及其随后被多酚氧化酶氧化的途径是造成烫伤症状的主要因素。除此之外，我们还提出了α-法尼烯及其氧化产物(cols)作为褐变触发信号的新作用。最后，我们还推测了一种抗凋亡调控的参与，以防止这种疾病在苹果内部组织的扩散。

朋友：

苯丙氨酸解氨酶

CHS：

查耳酮合酶

气：

查耳酮异构酶

MdF3H：

黄酮3-hydroxylase

DFR：

Dihydroflavonol 4-reductase

答：

花青素合成酶

摘要:：

p-coumarate 3-hydroxylase

FLS的：

黄酮醇合成酶

守护神：

Leucoanthocyandin还原酶

ANR：

花青素还原酶

PPO：

多酚氧化酶

AFS1：

α金合欢烯合酶

DAD1：

抵抗细胞死亡的卫士

DND1：

防御没有死亡1

LSD1：

病变模拟抗病

1-MCP:

1-methyl-cyclopropene

ctol:

共轭trienols

6 m5h2one:

6-methyl-5-hepten-2-one

纤毛运动:

程序性细胞死亡马吕斯有明显

:

拟南芥

作者感谢芭芭拉·诺瓦克在该领域的样本收集。本研究由Agroalimentare研究AGER项目(批准号:2010 - 2119)。

从属关系

1. 博洛尼亚大学农业科学系，意大利博洛尼亚，40127

   Nicola Busatto, Brian Farneti和Guglielmo Costa

2. 研究与创新中心，埃德蒙·马赫基金会，Via Mach 1，圣米歇尔，特伦托，38010，意大利

   Alice Tadiello, Urska Vrhovsek, Luca Cappellin, Franco Biasioli, Riccardo Velasco和Fabrizio Costa

相应的作者

对应到法布里奇奥哥．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

NB进行基因表达分析并起草稿件，AT支持分子工作，BF进行代谢物和VOC分析并参与起草稿件，UV解释代谢物数据，LC和FB解释PTR-ToF-MS数据，RV和GC支持项目，FC设计实验，协调工作并完成稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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