牙髓发育中差异表达基因的鉴定与计算注释椰子L.抑制减法杂交

背景

椰子(椰子L.)是世界上用途最广泛、经济上最重要的热带作物之一。人们对椰子果肉(胚乳)发育的生理和分子基础知之甚少，公共数据库中只有少数椰子基因和基因产物序列。本研究通过生物信息学分析，识别了在椰子果肉发育过程中差异表达的基因，并对这些基因进行了功能注释。

结果

采集了三个不同发育阶段的椰子果肉。构建4个抑制减法杂交(SSH)文库(第1 - 2阶段之间的正向和反向文库A和B，第2 - 3阶段之间的反向和正向文库C和D)，并用Blast2GO软件对识别序列进行计算注释。从4个SSH文库中共获得1272个克隆进行分析，其中63%的克隆与已知蛋白相似。对B-D、A-C、B-C和A-D文库中阶段特异性基因本体id进行两两比较，发现32个基因持续上调，7个基因持续下调;28个基因瞬时上调，23个基因下调。KEGG(京都基因与基因组百科全书)分析显示1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、磷脂酶D、乙酰辅酶a羧化酶羧转移酶β亚基、3-羟基异丁基辅酶a类水解酶和丙酮酸脱氢酶E1 β亚基与脂肪酸的生物合成或代谢有关。磷酸三糖异构酶、纤维素合成酶和葡聚糖1,3-β-葡萄糖苷酶与碳水化合物代谢有关，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶与脂肪酸和碳水化合物代谢均有关。在737个unigenes中，103个编码酶参与了脂肪酸和碳水化合物的生物合成和代谢，并通过real-time PCR确认了多个转录因子和其他有阶段性表达的有趣基因，SSH结果的符合率高达66.6%。在气相色谱-质谱联用法测定椰子胚乳脂肪酸含量的基础上，筛选出脂肪酸合成代谢相关的候选基因进行进一步研究。

结论

通过对椰子果肉发育过程中差异表达基因的功能注释，确定了椰子胚乳发育的分子基础。SSH法鉴定了脂肪酸、碳水化合物和次生代谢物相关基因。研究结果对了解椰子果实的基因功能和调控网络具有重要意义。

椰子椰子属槟榔科，是本港唯一公认的椰子品种可可属。椰子是世界上用途最广泛的经济上最重要的热带作物之一，在热带和亚热带地区的商业和工业应用非常广泛，如食品和饮料，以及木材和手工艺品的来源[1］．椰子的果肉(胚乳)最初悬浮在椰子的水相中[2]，是一种液体胚乳。随着发育的继续，液体胚乳逐渐沉积到椰子内壁，成为可食用的椰子果肉(固体胚乳)。在成熟的椰子中，果肉(重量28%)被坚硬的保护壳(重量12%)包围，外壳被厚壳(重量35%)覆盖[3.］．

从椰子果肉中提取的油广泛应用于烹饪、肥皂和化妆品。椰子是少数在种子胚乳中储存中链长脂肪酸(MCFAs)作为能量储备的主要部分的植物之一。在成熟的椰子果实中，超过83.92%的油由多链脂肪酸和长链脂肪酸(C_12:0C_14:0C_16:0和C_18:0)，其中大部分是月桂酸(C_12:0)由47.48%至50.5%不等[4］．椰子也比大豆含有更多的MCFAs [5]、油棕和红花油，以及黄油、牛油、鱼油和猪油等动物脂肪[6] - [10］．椰子油的特殊化学成分使它在食用和非食用方面都很有用。此外，椰子油有独特的特性，如气味怡人、耐酸臭、融化温度范围窄及留沫能力强，可用于搅打配料[11］．椰子浆还含有纤维、淀粉、糖和糖醇，如蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、肌肌醇和锡基肌醇[12]，这对脂肪酸和糖的生物合成和代谢很重要。

椰子胚乳的组成已被广泛报道[12] - [14]，但分子基础尚不清楚，特别是阶段特异性基因的动态表达和胚乳发育。大多数研究都集中在利用微卫星标记评价遗传多样性[15] - [17］．近年来，为了研究椰子胚乳发育过程中的基因表达谱，构建了cDNA文库[18］．矛状叶、幼叶和果肉的转录组测序[19]及与椰子叶绿体的比较[20.]，分离固体胚乳发育过程中差异表达的miRNAs (microRNAs)预测了一些miRNAs的潜在功能[21］．许多基因已经被克隆和鉴定，包括foroleosin［22), 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate酰基转移酶(LPAAT) [23]，体细胞胚胎发生受体样激酶基因[24，周期蛋白依赖性激酶[25和基因CnFatB 1［26),CnFatB 2而且CnFatB 3［27］．以往对椰子胚乳成分的研究很少涉及分子分析。即使获得了大量的est，也很少有注释的，许多序列是多余的。没有发表的研究描述了阶段特异性基因的动态表达分析和椰子胚乳发育的相关机制。

抑制性减法杂交(SSH)是筛选减法cDNA的一种有效且流行的方法。在模型系统中，SSH可以通过>单轮减法杂交1000倍丰富稀有序列[28］．目前，转录组测序技术也可以获取转录本的信息，但繁琐且效率低，识别出的序列有很多冗余。由于大量的背景噪声，这使得转录组数据的分析变得复杂。SSH可以有效地获取平均长度为>500 bp的多个序列。因此，在识别疾病、发育或特定组织中差异表达的基因方面，SSH是分子遗传学和位置克隆的一种重要替代方法。

本文利用SSH对三个椰浆发育阶段的差异表达基因进行了表征。采用Blast2GO软件进行计算注释。通过实时荧光定量PCR和脂肪酸含量分析验证了SSH的有效性。

样品采集和脂肪酸分析

采集椰子三个不同发育阶段的果肉，提取总脂肪酸，采用气相色谱-质谱(GC-MS)三组并行实验进行分析。新鲜椰浆平均含油量占重量的比例在第1阶段为1.94%，第2阶段为8.73%，第3阶段为10.03%(图1)1A).这表明在椰子发育过程中油逐渐积累。在不同阶段检测到不同相对含量的脂肪酸。在第一阶段，不饱和脂肪酸C_18:2Δ^9、12主要脂肪酸为34.1%，其次为C_12:0(15.1%), C_14:0(12.0%), C_16:0(16.9%)和C_18:0(16.6%)(图1B)饱和脂肪酸_12:0C_14:0C_16:0和C_18:0第二阶段和第三阶段的主要脂肪酸。第二阶段，C_12:0代表42.2%,C_14:020.0%, C_16:011.8%, C_18:012.4%。在第三阶段，C_12:0代表46.9%,C_14:020.9%, C_16:011.2%, C_18:05.0%(图1B).测定了来自三个不同发育阶段的10克椰子果肉的脂肪酸含量(图1C)饱和脂肪酸_12:0C_14:0C_16:0和C_18:0从第1阶段到第3阶段，椰浆发育迅速增加。相应脂肪酸的统计分析表明，第2阶段与第1阶段各脂肪酸含量差异均显著(P≤0.01) except that_18:2Δ^9、12在0.01≤P≤0.05。在阶段3和阶段2之间，C_10:0和C_12:0脂肪酸有显著差异(P≤0.01)，C_8:0和C_14:0(0.01≤P≤0.05)。其他脂肪酸含量差异不显著(P> 0.05)。在三个发展阶段中，C_8:0C_10:0C_12:0和C_14:0逐渐积累而C_18:2Δ^9、12逐渐减少。

构建和描述SSH库

四个SSH库(A, B, C和D)在三个不同的发育阶段(即1-3)从椰子果肉中生成。对第1 - 2阶段(库A和B)和第2 - 3阶段(库C和D)的文库进行正反相减。共对1272个克隆进行测序，得到1230个高质量EST序列，去除空向量后平均插入长度为500碱基。所有ESTs的长度均大于截断值100 bp(表1)1)．每个文库随机抽取差异表达序列248-366条，其中A文库低质量序列11条(插入< 100 bp)， B文库9条，C文库8条，D文库4条;A库插入长度为123 ~ 900bp, B库插入长度为141 ~ 862 bp, C库插入长度为110 ~ 838 bp, d库插入长度为106 ~ 825 bp。每个库插入长度平均为487 ~ 512 bp。低质量序列，矢量序列和poly(A)端从使用的每个文库中删除phr和试验软件。初步分析使用Phrap程序隔离单例并将重叠序列组装成contigs。在整个库中，单链的数量在70-226之间变化，平均长度为484-522 bp。contigs数量为25 ~ 53个，平均长度为629 ~ 726 bp。unigenes (singlets和contigs)数量为112 ~ 251个，平均长度为503 ~ 574 bp。每个库的单序列高重复冗余度在2.6 ~ 7.4%之间。克隆、singlet、contigs、unigenes和冗余的大小范围和统计值在表中1．本研究中获得的序列已存入GenBank数据库，并可在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，注册编号为JZ533438至JZ534322。

SSH EST BLAST top hits的种类分布

从NCBI数据库中检索的四个SSH库中，BLAST序列的最高点击率显示只有19个与椰子序列相似的最高点击率。椰子果肉发育阶段SSH EST序列中约40%的顶级命中与油棕、葡萄或水稻的编码序列同源，每个物种有>120个顶级命中(图2)．超过60%的BLAST命中与水稻、葡萄、杨树trichocarpa玉米或大豆编码序列(附加文件1)，只有19个与椰子序列相似。

SSH EST序列的功能分类与基因本体分析

去除矢量、短序列、聚(A)端等序列杂质后，用Blast2GO软件对所有序列进行分析，并用BLASTX和GenBank非冗余数据库进行比对。基因本体(GO)映射返回了许多术语。对于63.1%(776)的所有SSH est, GO注释至少分配了一个GO术语。GO注释之间并没有完全不同，许多est涉及不同的函数类，注释了多个GO术语;类似地，一个GO术语有时被发现可以注释几个est。一般来说，没有BLAST命中(113)的序列不能被注释。BLAST命中的SSH ESTs(341个)不能用GO术语注释的被归类为假设或未知蛋白质[29］．

氧化石墨烯分析描述了几种植物和动物基因组的生物过程、细胞成分和分子功能[30.］．在所有SSH EST椰子序列的完整GO术语中，839个GO术语位于生物过程中(图3.A)， 1023细胞成分(图3.B)和547分子函数(图3.C). GO术语和GO id显示在附加文件中2．在生物过程中，最具代表性的类别是应激反应(GO:0006950, 14.8%)、分解代谢过程(GO:0009056, 12.8%)和碳水化合物代谢过程(GO:0005975, 12.3%)。尽管数量较少，但也发现了与次生代谢过程(GO:0019748, 3.8%)、脂质代谢过程(GO:0006629, 5.8%)和离子运输(GO:0006811, 2.4%)相关的术语。在细胞成分中，最具代表性的类别是胞质膜囊泡(GO:0016023, 22.3%)、质膜(GO:0005886, 13.4%)和质体(GO:0009536, 11.1%)。胞浆(GO:0005829, 4.1%)和液泡(GO:0005773, 4.3%)也有代表。脂质颗粒注释较少(GO:0016023, 0.1%)。在分子功能中，功能分配est所占比例最大的是营养库活性(GO:0045735, 40.6%)、核苷酸结合活性(GO:0000166, 26.5%)和结构分子活性(GO:0005198, 6.4%);前两类占可分配围棋术语的67.1%。

从理论上讲，SSH可以获得所有阶段特异性(或阶段相关)基因的est。我们发现EST序列包含许多差异表达基因，但很少有阶段特异性基因。为了进一步分析阶段特异性基因，我们比较了文库A和B中的GO id，以及文库C和D中的GO id4和额外的文件3.)．文库A的330个GO词条和文库B的311个GO词条中，203个与下调基因相关，184个与上调基因相关。在A文库(阶段1)中，最显著的阶段特异性氧化石墨烯术语是细胞分裂(GO:0051301)、过氧化物酶反应(GO:0006804)、细胞生长调节(GO:0001558)、血红素结合(GO:0020037)、丝氨酸家族氨基酸代谢过程(GO:0009069)和氧化应激反应(GO:0006979)。在C文库和D文库中，分别检索到360和251个GO词条，其中下调基因229个，上调基因120个。库B和库C(阶段2)的氧化石墨烯项主要为营养库活性(氧化石墨烯:0045735)、酰基载体-蛋白质生物合成(氧化石墨烯:0042967)、脂肪酸合成酶复合体(氧化石墨烯:0005835)、热响应(氧化石墨烯:0009408)、纤维素合成酶(氧化石墨烯:0016761)、原代细胞壁(氧化石墨烯:0009833)和碳水化合物代谢(氧化石墨烯:0006011，蔗糖氧化石墨烯:0005985，淀粉氧化石墨烯:0005982)。在D文库(stage 3)中，氧化石墨烯术语与细胞外围合成(GO:0071944)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)转运(GO:0043132, GO:0051724)、糖基键水解酶活性(GO:0016798, GO:0004553)、防御反应(GO:0006952, GO:0051707)和对非生物刺激的反应(GO:0009628)有关。

识别连续或短暂下调或上调的基因

通过比较两个SSH文库，获得了三个发育阶段中连续或短暂下调或上调的基因。比较每个双向正向和反向SSH库的GO id，以获得非冗余的特定于阶段的GO id4)得到A库203个(共330个GO id)， B库184个(共311个)，C库229个(共360个)，D库120个(共251个)。对非冗余的特定于阶段的GO id进行两两比较，得出32个特定于阶段的重复GO id4) A-C(连续调低)，28(附加文件4)为B-C(瞬时上调)，7(附加文件4)用于B-D(连续上调)和23(附加文件4)为A-D(暂态下调节);A-C、B-C、B-D和A-D的总GO id分别为148、152、116和1245)．在A-C文库中，特异性下调的基因主要为3-羟基异丁基-辅酶a水解酶样蛋白、酸性磷酸酶、adp核糖基化因子、14-3-3-like蛋白、2,3-二磷酸甘油酸独立磷酸甘油酸酯酶、肌氨酸氧化酶、丝氨酸羟甲基转移酶、多核苷酸酰基转移酶、耐多药蛋白atp结合盒转运蛋白和谷胱甘肽-s转移酶cla47。在B-D文库中，阶段性上调的基因为α -微管蛋白、球蛋白前体、7- α -羟基甾体脱氢酶、LPAAT7S球蛋白和磷酸三糖异构酶胞质异构体。在这些基因中,LPAAT与脂肪酸生物合成有关;7S球蛋白、磷酸三糖异构酶胞质异构体、α -微管蛋白、球蛋白前体和7- α -羟基甾体脱氢酶与糖代谢有关。在B-C文库中，阶段性短暂上调或下调的基因主要为寡肽转运蛋白、磷酸烯醇化丙酮酸羧化酶(PEPC)、adp核糖基化因子、烯酰基酰基载体蛋白(ACP)还原酶蛋白、乙酰辅酶a羧化酶羧转移酶β亚基、核苷二磷酸激酶、纤维素合成酶BoCesA6、戊二酰辅酶a脱氢酶、甘露糖-1-磷酸鸟酰基转移酶3-like、胆油酸钠⁺转运蛋白家族，甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶1样，蔗糖合酶1和utp -葡萄糖-1磷酸尿苷转移酶。在A-D文库中，阶段性瞬时上调或下调的基因为-1,3-葡聚糖酶、丙酮酸脱氢酶E1 β亚基、转运抑制剂响应1、v型质子atp酶催化亚基A、电压依赖性阴离子通道蛋白、真核启动因子iso4 F亚基、酪蛋白激酶i样、磷脂酶D α 1和未特征性蛋白LOC100820966。

实时PCR和聚类图谱

选择用于聚类的序列(图6)为连续或瞬时上调或下调的基因和脂肪酸合成酶、转录因子等基因。采用实时定量PCR (qRT-PCR)相对表达值进行聚类。结果显示，103个ungenes中有33个在第2期较第1期上调，103个ungenes中有58个在第3期较第2期上调，103个ungenes中有18个在第1 - 3期上调，包括acp硫酯酶FatB2、长链酰基辅酶a合成酶4、MADS-box (GenBank:KF574389)等基因5)．103个unigenes中，有30个从第1阶段下调到第3阶段，包括乙酰辅酶a羧化酶、果糖-1,6-二磷酸和磷酸甘油变酶等基因5)．

KEGG途径用于脂肪酸的生物合成和代谢以及淀粉、蔗糖和甲烷的代谢

许多酶与碳水化合物、脂肪酸或次生代谢物的特定代谢或生物合成途径有关。最具代表性的京都基因和基因组百科(KEGG)地图，与脂肪酸或碳水化合物的生物合成或代谢相关，被组织成一个简单的网络(附加文件6和额外的文件7)，几种酶在椰子胚乳发育过程中被上调或下调。光合生物中碳固定的几个成分(图:00710)在胚乳发育早期(开花后7-9个月[MAF])表达受到调控，淀粉和蔗糖代谢的几个成分(图:00500)在后期(9-11 MAF)表达受到调控。KEGG图谱分析还表明，在光合生物的固碳(图:00710)、糖酵解和糖异生(图:00010)以及淀粉和蔗糖代谢中，大多数酶都有强烈的上调7和表2)．参与β- d -果糖-6- p合成丙酮酸的酶如6-磷酸果糖激酶(EC:2.7.1.11)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC:1.2.1.12)和磷酸甘油酸激酶(EC:2.7.2.3)转录本在7-9 MAF时上调，并在9-11 MAF时保持水平(表2)2)．编码二氧化碳碳固定相关酶的转录本，如天门冬氨酸转氨酶(EC:2.6.1.1)、磷酸甘油酸激酶(EC:2.7.2.3)和PEPC (EC:4.1.1.31)在7-9 MAF时上调(表2)．与石油的聚集一致(图1A)在椰子胚乳中，在第1至2阶段迅速增加，在第2至3阶段增长较慢，从甘油磷脂代谢(图:00564)到丙酮酸代谢(图:00620)和柠檬酸循环(图:00020)的脂肪酸生物合成(图:00061)的几个转录本被上调(表:00020)3.)．

从第1阶段到第2阶段，一系列酶的基因上调，此时脂质积累呈增加的趋势。对于脂肪酸生物合成途径的几个组分，如硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶(EC:1.14.19.2)和酰基- acp硫酯酶FatB3 (EC:3.1.2.14)，也记录了类似的特异性转录本积累动态。LPAAT (EC:2.3.1.51)积极参与甘油磷脂和甘油脂的代谢;PEPC (EC:4.1.1.31)参与丙酮酸代谢，异柠檬酸脱氢酶(EC:1.1.1.41)与柠檬酸循环有关;戊二酰脱氢酶(EC:1.3.3.6)与脂肪酸代谢相关(表2)3.)．先前的研究表明，椰子汁中的糖浓度从成熟早期的1.5%稳步上升到约5.0-5.5% (8-9 MAF)，然后在果实完全成熟时缓慢下降到约2% [14］．在椰子水发育过程中，碳水化合物的积累从第1阶段到第2阶段明显增加，从第2阶段到第3阶段逐渐减少，与此一致，从第1阶段到第2阶段，几个转录本编码酶上调(表2)2)，包括淀粉和蔗糖代谢中的酶(图:00500)、甘露糖代谢(图:00051)、抗坏血酸盐和醛酸盐代谢(图:00053)以及氨基糖和核苷酸糖代谢(图:00520)。在果糖和甘露糖代谢中，记录了一些酶如6-磷酸果糖激酶3-like (EC:2.7.1.11)和gdp -甘露糖焦磷酸化酶(EC:2.7.7.13和EC:2.7.7.22)的特异性转录本积累的类似动态;酶udp -葡萄糖焦磷酸化酶(EC:2.7.7.9)，参与氨基糖和核苷酸糖的代谢;淀粉和蔗糖催化代谢中的酶，如纤维素合成酶(EC:2.4.1.12)和葡聚糖1,3- β -葡萄糖苷酶(EC:3.2.1.58);以及参与光合生物固碳的酶，如天门冬氨酸转氨酶(EC:2.6.1.1)、磷酸甘油酸激酶(EC:2.7.2.3)和PEPC (EC:4.1.1.31)(见表2)．

这项研究发现了737个unigenes。然而，只有19个BLAST命中了椰子(图2)．这些结果表明NCBI数据库中有关椰子的分子信息不足。考虑到椰子对热带地区的重要性以及全球对椰子产品日益增长的商业兴趣，关于椰子基因组特征的信息的缺乏是进一步研究的障碍。需要深入了解控制椰子发育和成熟的遗传和分子特征，以及油和糖代谢的代谢途径。我们构建了四个SSH库，并在三个椰子浆开发阶段识别了737个非冗余的特定序列。这些信息丰富了公共椰子基因数据库，为基因克隆和分析油、糖和其他代谢途径提供了基础的分子生物学信息。

在两个反向SSH库中，一个agamouss -like (AGL) MADS-box转录因子基因(GenBank:KF574389)(图5)7)持续上调，第2期比第1期高22倍以上;该基因的表达在成熟过程中也增加了2.5倍(图8)．MADS-box基因参与控制植物发育的所有主要方面，包括雄性和雌性配子体、胚胎、种子、根、花和果实的发育[31]、[32］．我们鉴定的椰子MADS-box基因来自椰子胚乳，在成熟过程中不断上调。这种表达模式提示MADS-box基因与胚乳代谢有关。然而，一旦花器官在椰子胚乳中完成发育，只有少量的游离胚乳层沿椰子壁沉积，而可食用的胚乳会积累其他成分，如碳水化合物、蛋白质和油。据我们所知，目前还没有关于单子叶植物胚乳发育过程中agl样基因的研究。这些基因可能在不影响种子发育的情况下提高单子叶种子的胚乳质量。我们的数据表明，在椰子胚乳发育的三个阶段发现的MADS-box基因参与了胚乳的发育或涉及椰子果肉成分的代谢途径。对该基因的功能分析可能为通过增加椰子果肉重量来提高椰子油产量提供一种新策略。

在四个SSH库中，CnFatB3(GenBank:JF338905)基因是唯一鉴定到的ACP硫酯酶基因。植物有两类脂肪基因，法达而且FatB，它们在序列一致性和酰基acp底物特异性上存在差异[33］．此前，FatA酶被发现主要水解18:1-ACP，对18:0-ACP和16:0-ACP的水解活性较小。脂肪b酶通常水解饱和的C_8:0- c_18:0机场核心计划,优先16:0-ACP;然而，它们也水解18:1-ACP [34］．迄今为止，在椰子果肉中发现了三种fatb型脂肪酰acp硫酯酶:CnFatB 1(基因库:JF338903),CnFatB 2(基因库:JF338904)CnFatB 3(基因库:JF338905)。QRT-PCR分析显示CnFatB 1持续下调，在椰子果肉成熟过程中，CnFatB 2表达增加了1.4倍和和CnFatB 3增加了11.5倍。三种酶的水解特异性FatB椰子胚乳的基因(CnFatB 1，CnFatB 2而且CnFatB 3)和源自oil palm (EgFatB 1)已被描述为使用在体外表达大肠杆菌K27。cnfatb1、cnfatb2和egfatb1酶对14:0和16:1的特异性最强，而cnfatb3酶对12:0和14:1的特异性最强[26］．在我们之前的研究中，异质表达CnFatB 1表现出额外的特异性，主要针对转基因烟草种子中的18:0-ACP和16:0-ACP [25］．我们目前的研究结果在一定程度上与早期的观察结果一致，表明椰子浆中约50%的脂肪酸是饱和月桂酸盐(C_12:0),CnFatB 3C_12:0脂肪酸积累(图8)．

在阶段1到阶段2的SSH正向文库中，丙酮酸激酶(PK)基因在早期椰子胚乳(阶段1)中表现出高表达，但在阶段2和阶段3中表现出显著下降(图)8)，在成熟的胚乳中几乎检测不到。PK基因在第3期的表达量较第2期高10倍。PK的蛋白质系统发育显示PK分为胞质PK (PKc)和质体PK (PKp)(图)9)．我们鉴定的PK与PKc比PKp更相似。PKc存在于所有真核生物中;然而，PKp也存在于植物中[35］．物理、免疫和动力学分析表明，维管植物和绿藻的两种PK同工酶(PKp和PKc)具有明显不同的特征[36]、[37］．PKc可控制植物胞浆中糖酵解产生丙酮酸[38或为生物合成途径或线粒体生成前体丙酮酸[39］．烟草植物(烟草)对叶片中缺乏PKc的生长、光合作用和呼吸进行了分析，并显示出许多条件生长缺陷，主要来自于由于PKc的丢失而改变的sink-source代谢调节，特别是在叶片中[40］．马铃薯块茎中PKc表达的降低表明PKc在异养植物组织中调节丙酮酸和相关氧化酶水平的重要性[41］．T-DNA在水稻中插入PKc下调导致矮化和穗包，提示PKc影响糖酵解途径，改变水稻单糖代谢和糖运输[42］．椰子的果肉(固体胚乳)是由椰子水(液体胚乳)沉积而成的，椰子水中糖含量的变化可能与胚乳的变化一致。在以往的研究中，椰子胚乳的糖浓度从封闭水腔的内部区域，通过中间和外部区域，到种皮呈梯度下降[43]、[44］．这一结果表明，糖在发育中的椰子的前9个MAF积累，在9 - 12个MAF时，糖从椰子汁转移到固体胚乳或被分解。正如预期的那样，从椰子胚乳中分离出的PKc的表达与椰子水的糖浓度形成对比，这可以解释为PKc以糖为底物，进一步暗示PKc与糖代谢密切相关。然而，关于PKc在单子叶植物胚乳中过表达的影响，尤其是在缺氧和液体环境中，如椰子胚乳，目前还没有相关的信息。因此，未来对椰子胚乳的研究可能为了解PKc同工酶在植物中的具体作用提供新的认识，补充前人的研究。对于其他植物PK同工酶的功能还需要进一步的研究。

去分类(图3.)的差异表达ESTs中，44.0%位于与应激反应(14.8%)、非生物/生物刺激(11.6/4.8%)和分解代谢(12.8%)有关的生物过程中。此外，在细胞成分中，46.8%的ESTs涉及细胞质膜结合的囊泡(22.3%)、质膜(13.4%)和质体(11.1%)。在分子功能中，73.5%的功能分配ESTs涉及营养库活性(40.6%)、核苷酸结合活性(26.5%)或结构分子活性(6.4%)。结合GO的三个主要亚类，特异性表达序列主要涉及营养库的应激反应和非生物/生物刺激。阶段特异性基因的结果(图4和额外的文件3.)表明，在第1阶段，这些基因主要影响细胞生长和细胞分裂的调节，以及对氧化应激和生物或非生物刺激的反应。第2阶段，植株主要合成脂肪酸合成酶、纤维素合成酶和碳水化合物代谢基因，响应热胁迫、铵离子胁迫和茉莉酸刺激。第3阶段主要发生在防御反应、细胞外围合成和糖基键水解酶活性。在所有的过程和功能中，压力反应是突出的。

椰子胚乳暴露在一种特殊的营养-水环境中，因此胁迫主要是非生物的。椰汁含盐量高，钾、苹果酸盐和氯化物含量特别高。因此，椰子胚乳生长发生在高盐度，缺氧和水，高渗透胁迫下。生长也可能发生在高温环境中。在我们的SSH文库中发现了几个与生物胁迫(40)、非生物胁迫(97)或内源性刺激(117)和营养库活性(222)有关的基因。已经确定了几个与胁迫有关的重要基因，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶，它对热有反应，并介导植物中的活性氧[45］．核苷二磷酸激酶对干旱的响应[46),冷(47和盐胁迫[48］．谷胱甘肽- s -转移酶对盐和渗透胁迫的反应[49]、[50]，并具有抗氧化能力[50]、[51］．烯醇化酶对盐和高渗胁迫的响应[52];β-1,3-葡聚糖酶在香蕉果实成熟过程中对脱落酸、低温、生长素、乙烯、损伤和光暗循环的响应[53］．果糖双磷酸醛缩酶对缺氧环境的反应[54];温度诱导的脂钙素对热应激的响应[55]、[56];热休克蛋白对一系列环境压力有反应，包括氧化[57]、盐和渗透应力[49］．空泡的H⁺- atp酶催化亚基对盐和渗透胁迫的响应[58]、[59和1-cys过氧还蛋白对过氧化有反应[60和未知的蛋白质。

对这些基因在椰子胚乳发育过程中的作用进行表征，将提高我们对椰子适应性胁迫机制的理解，并增强我们控制非生物损害的能力，如洪水、干旱、高盐度和高温等，这些都是造成全球作物重大损失的因素[61］．椰子胚乳中的胁迫响应基因主要参与高盐、缺氧、高温和高渗胁迫等非生物刺激。由于椰子生长环境的特殊性，我们对非生物胁迫响应机制的准确信息基因和未知的胁迫基因进行了鉴定。这些基因可以通过传统育种和分子育种相结合应用于其他作物的遗传改良。

在本项目中，利用SSH技术鉴定了在椰子果肉三个发育阶段差异表达的737个unigenes。所有基因用Blast2GO注释，RT-PCR验证。根据Blast2GO分析，几种酶被认为与脂肪酸、碳水化合物、转录因子、应激反应和次生代谢产物有关。通过对这些阶段特异性GO id的两两比较，对许多持续或短暂上调或下调的基因进行了表征。综合分析结果表明，许多基因在椰子果肉发育过程中起关键作用。

将不同阶段的GO id与椰浆发育过程中差异表达基因的功能注释进行比较，有助于识别关键基因，并确定椰浆发育的分子基础。本研究对了解椰子果实的基因功能和调控网络具有重要意义。

植物材料

c .椰子L. L.果肉来自于中国海南中国热带作物农业研究院椰子研究所田间生长的植物。施肥后收集纸浆，大约7 MAF(第1阶段，纸浆嫩薄)，9 MAF(第2阶段，纸浆硬化增厚)，11 MAF(第3阶段，纸浆完全硬化，几乎没有液体存在)。采集后，纸浆用铝箔包裹，立即在液氮中冷冻，然后在−70℃保存。

RNA提取

RNA提取所用的仪器和试剂用0.1%的焦碳酸二乙酯处理。根据Li和Fan的研究，采用十六烷基三甲基溴化铵-氯化锂(CTAB-LiCl)方法从椰子果肉中提取总RNA [62］．用紫外分光光度法和凝胶电泳法测定甲醛变性琼脂糖凝胶的总RNA质量。

cDNA合成与SSH文库构建

对于所有样本，使用SMARTer PCR cDNA合成试剂盒(Clontech, Palo Alto, CA)从1 μg总RNA合成双链cDNA。利用PCR-Select cDNA Subtraction kits (Clontech)构建4个减法杂交文库。在第1和第2阶段(文库A和B)和第2和第3阶段(文库C和D)之间进行文库的正反转。将缺失的cDNA克隆到PMD19-T简单载体(TaKaRa)中，用于转化Trans1-T1耐噬菌体化学感受态细胞(Trans)。质粒DNA通过Axyprep质粒迷你试剂盒(AXYGEN)获得。

测序和生物信息学分析

从每个SSH文库中随机选择248-366个cDNA克隆，1230个重组菌落置于96孔板中，孔中含有1 mL含60 μg/mL氨苄青霉素的LB肉液，37°C培养过夜。所有克隆产物在ABI 3730XI DNA分析仪中使用测序引物M13F (TGTAAAACGACGGCCAGT)进行测序。SSH检索到的所有核苷酸序列都有低质量区域(测序结果痕迹的错误率>0.05)被删除，并使用自动测序仪痕迹的碱基调用phr［63)(http://www.phrap.org/consed/consed.html#howToGet)．交叉匹配(版本0.990329)(与phr)软件去除短序列(插入序列长度<100 bp)和聚(A)端，筛选载体污染和去除载体序列，在任意一个150碱基的窗口中，以与GenBank数据库中载体序列的序列相似性≥96%进行分组。Phrap(版本1.080812)(网站如phr)被用来组装干净的est以获得单基因序列。Unigene ORF搜索使用GETORF软件(http://embossgui.sourceforge.net/demo/getorf.html)．使用来自美国国家生物技术信息中心非冗余蛋白数据库(NCBI nr)的BLASTX算法进行多序列比对。unigenes的GO注释使用Blast2GO [64](版本2.6.4)(http://www.blast2go.de)．序列使用BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM)在GenBank NCBI nr数据库中搜索。BLASTX的e值截止值为1e⁻⁶最小相似度为55%的注释使用了GO术语。我们还使用了NCBI nr/nt (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/FASTA/；20111209)和Swissport数据库(http://www.uniprot.org/downloads；发布2011_12)从SSH对齐unigenes;和KEGG (ftp://ftp.genome.jp/pub/kegg/；Release 59.0)数据库，根据对齐结果对数据进行排序和映射，并制作路径图。

脂肪酸提取及GC-MS分析

采用氯仿-甲醇(体积2:1)萃取溶剂体系，对Folch [65],布莱[66和艾弗森[67)方法。甲基酯化是加入1毫升14%的BF_3.-甲醇溶剂，80°C孵卵15分钟。干燥的样品溶解在1ml正己烷中。脂肪酸甲酯的GC-MS分析采用惠普Ultra-GC仪。采用HP-FFAP毛细管柱(30 m × 0.25 mm，膜厚0.25 μm)分离脂肪酸甲酯。烘箱温度最初保持在150℃，持续1 min，然后以8℃/min的速度增加到250℃，再增加到250℃，持续5 min。裂解比为1:30，恒流模式下载气为氦气，流速为1.0 mL/min。注入器温度为250°C，检测器温度为230°C。MS在扫描范围为10-500欧姆的70 eV电子冲击模式下工作。进样量为1.0 μL。

实时聚合酶链反应分析

用QRT-PCR方法对SSH分离并经Blast2GO鉴定的基因进行表达谱分析。从整个非冗余序列数据集中，103个基因序列编码与脂肪酸和碳水化合物生物合成和代谢相关的酶，转录因子和其他阶段特异性基因。根据基因长度(>100 bp)和e值(>1e)选择基因⁻⁶)．从三个发育阶段(7,9,11 MAF)的椰浆中收集1 μg总RNA，使用FastQuantRT试剂盒(含DNase) (Tiangen, Beijing, China)构建SSH文库，从中提取1 μg总RNA合成cdna。

对于选定的基因序列，特定的引物对(附加文件8)由Primer Premier (http://www.premierbiosoft.com；版本5.00)，并在60°C下用常规PCR检测其活性。用ABI 7500 Real-Time系统(Applied Biosystems)对每个cDNA样本的每个基因进行3个重复的QRT-PCR，并对所得数据取平均值。使用比较阈值循环(Ct)方法量化相对表达(2^——ΔΔCt方法)(68］．三个发育阶段的表达量通过比较第1期和第2期、第2期和第3期来确定。使用Cluster 3.0软件(适用于Windows;http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm#ctv) [69］．所有数据通过对数变换进行调整，然后采用平均连锁法进行分层聚类。

系统发育分析

在MEGA4中使用邻居连接方法构建系统发育树[70］．采用1000次重复的Bootstrap方法建立树枝的置信极限。使用默认的程序参数。

支持本文结果的数据集包含在本文及其附加文件中。

CnFatB椰子：

酰基- acp硫酯酶B型

CTAB-LiCl:

十六烷基三甲基溴化铵-氯化锂

气相:

气相色谱分析-质谱法

走:

基因本体论

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

LPAAT：

1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate酰基转移酶

加:

个月后开花

MCFAs:

中链长脂肪酸

microrna:

小分子核糖核酸

NAD:

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

PEPC:

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶

PK:

丙酮酸激酶

SSH:

差减杂交

本研究得到国家自然科学基金项目(No. 31060259, 31160171和31360476)和海南大学植物学国家重点学科(No. 071001)的部分资助。

从属关系

1. 海南大学材料与化学工程学院生物技术系，海南海口570228

   梁元雪，袁义军，毛伟，郑玉生，李东东

2. 安诺优德基因科技有限公司，北京100176

   刘涛

3. 海南大学海南省热带生物资源可持续利用重点实验室，海南海口570228

   东东李

相应的作者

对应到东东李．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

DL对实验设计、研究构思和文章修改做出了重大贡献。YZ指导讨论，对论文写作和语言组织提出了实质性的建议，并对所有序列进行了注释。DL和YZ采集椰浆材料。TL对所有获得的基因序列进行计算注释。YY和WM对椰浆脂肪酸进行提取和检测，并对数据进行统计分析。YY还帮助从椰子果肉中提取总rna。YL进行了几乎所有的实验，起草了手稿，综合分析了所有实验结果的数据，绘制了图表，并参与了生物信息学的分析过程。所有作者阅读并批准了该手稿。

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