从细胞内细菌中突出鞭毛蛋白的先天免疫反应诱导，'CandidatusLibibacter Solanacearum'

背景

”CandidatusLiberibacter solanacearum ' (Lso)是一种韧皮部受限的α -变形杆菌，与马铃薯致命的斑马片病(Solanum Tuberosum.)．与Libibacter的其他成员一样，LSO-ZC1编码含有鞭毛蛋白域域的蛋白质（FLA_LSO)与保守的22氨基酸肽(flg22_LSO)．要了解这种不持续的细胞内细菌引发的先天免疫应答，我们研究了引发免疫力的病原体相关的分子模式（PAMPs）尼古利亚娜·宾夕法尼亚州，使用FLG22_LSO肽和全长佛罗里达州_LSO基因。

结果

我们的结果表明佛罗里达州_LSO通过农杆菌介导的瞬时表达在接种叶片中诱导了慢性的坏死性细胞死亡N. Benthamiana.，同时伴随着活性氧(ROS)的产生。此外，几个与先天免疫相关的代表性基因的表达被flg22短暂上调_LSO在n benthamiana。佛罗里达州的_LSO然而，与FLG22相比，诱导对​​这些代表性基因的更强的上调_LSO，特别是鞭毛素受体鞭毛素感应2（FLS2.）和呼吸爆发氧化酶（rbohb.)n benthamiana。虽然合成的flg22既没有引起细胞死亡，也没有引起ROS_LSO，在烟草，番茄和马铃薯植物的渗透叶中观察到弱胼舌沉积。

结论

LSO的鞭毛和其功能域，FLG22_LSO共享病原体相关分子模式的特征，并触发独特的先天免疫反应N. Benthamiana.．在宿主植物中，鞭毛蛋白缓慢而微弱地激活固有免疫反应可能反映了其细胞内生命周期的性质。我们的发现为马铃薯斑马片病的发展和抗性育种提供了新的见解。

斑马片(ZC)是一种重要的马铃薯病害，给美国的马铃薯生产商和加工商造成了数百万美元的损失[1］．本病在1994年在墨西哥州萨尔略附近的马铃薯田发现，并于2000年在美国德克萨斯州报道[2］．自2000年以来，这种疾病已蔓延到其他几个州，并伴随而来的是严重的经济影响[1］．疾病症状的特征是坏死斑点和髓射线变色，在块茎，叶褪绿，扭曲的茎，肿大的节，血管变色，叶烧焦，和萎蔫[3.]，[4］．斑马切片病的推定因果剂是'CandidatusLiberibacter solanacearum '(也被称为Ca．Libibacter psyllaurous），由马铃薯牛奶杆菌传播，Bactericera cockerelli［3.]，[5］．LSO具有显着减少的基因组，与另一个重要的植物病原体分享高度相似性，'Ca。Libibacter Asiaticus'（LAS）[6]，[7］．也与其他作物的疾病有关，包括西红柿、胡萝卜(Daucus Carota L.）在芬兰和芹菜（Apium graveolens)在西班牙[3.］．目前，所有商业马铃薯品种似乎都易受LSO感染的影响，并且唯一用于控制疾病传播的策略是通过管理马铃薯Psyllid [1］．

植物免疫依赖于对病原体的两个水平的防御反应:基础防御的组成部分病原体相关分子模式(PAMP)触发免疫(PTI)和反映对特定菌株免疫的效应触发免疫(ETI) [8]，[9］．PTI与PAMP的识别和植物质膜受体的激活有关[8]，[10.］．通常，PTI诱导若干重要的信号传导途径，包括钙离子（CA.²⁺)内流、活性氧(ROS)的产生和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活[10.］．位于鞭毛蛋白n端结构域的肽flg22与宿主表面定位模式识别受体FLS2 (flagellin sensing 2)之间的相互作用拟南芥,也进行了研究。在答:芥,FLS2与受体激酶BAK1相互作用，形成一个具有功能的FLS2/BAK1复合物，随后出现典型的PTI反应[8]，[10.］．直接同源的拟南芥FLS2已经在包括N. Benthamiana.［11.]，Lycopersicum esculentum［12.] 和选用高产粳稻［13.］．最近，有研究表明，沉默的表达nbfls2.抑制flg22诱导的下游基因表达[14.］．在拟南芥,由FLG22引起的ROS突发由rbohd.［15.］．在N. Benthamiana.，rbohb.的同系物rbohd，是产生活性氧和沉默nbrohbb.完全消除活性氧爆发[14.]，[16.］．在N. Benthamiana，在闪光后快速快速激活两种丝裂原激活蛋白激酶（MAPKS），水杨酸诱导的蛋白激酶（SIPK）和伤口诱导的蛋白激酶（WIPK）[17.］．此外，SIPK和WIPK在细菌免疫中都是必不可少的N. Benthamiana.［14.］．

最近已显示出于单独的异种杆菌属的另一个成员，Ca．亚洲Liberibacter asiaticus (Las)，编码一种功能鞭毛蛋白，部分恢复运动Sinorhizobium meliloti fla.变异并具有病原体相关分子模式的特征[18.］．与LAS一样，LSO Genome包含相同数量的开放阅读框架（30 ORF），这对于鞭毛的结构和组装是必不可少的[6］．在本研究中，由于Lso无法在培养中生长，我们研究了Lso鞭毛蛋白(Fla_LSO)及其肽flg22_LSO在足底通过渗透或农杆菌介导瞬时表达。我们的结果表明，瞬时表达式佛罗里达州_LSO在烟草植物中诱导ROS生产和慢性坏细胞死亡的延迟增加。虽然FLG22来自P.铜绿假单胞菌（用作控制）诱导典型的ROS突发，FLG22_LSO肽没有诱导烟草，番茄或马铃薯的ROS生产，但在这三种物种中诱导胼舌沉积。我们进一步证明了肽FLG22_LSO和鞭毛，fla_LSO诱导与PTI相关的基因的表达N. Benthamiana.．这些结果为细菌鞭毛蛋白在马铃薯斑马片病发展中的作用提供了新的见解。

也编码鞭毛蛋白与保守的flg22_LSO肽

在LSO-ZC1基因组中，通过序列分析鉴定了几种鞭毛生物合成相关基因的簇。CKC_02645的特征在于编码含鞭毛蛋白域的蛋白质。该基因含有1374个核苷酸，并编码457个氨基酸蛋白，称为FLA_LSO．佛罗里达州_LSO从鞭毛中分享61％的身份Ca．Libibacter Asiaticus（LAS），来自鞭毛的59％的身份Ca。Libibacter Americanualus（LAM）和鞭毛素的51％的身份l . crescensBT1。鉴定了保守的鞭毛蛋白结构域，其由位于FLA的N末端位于29至50位的22个氨基酸组成_LSO被命名为flg22_LSO．FLG22._LSO与Las、Lam和L. crescens bt1的flg22多肽具有86%的同源性，与近缘物种的flg22具有77%的同源性农杆菌肿瘤术和Sinorhizobium Meliloti.1021，不引起植物的免疫反应[19.]，[20.］．FLG22._LSO与FLG22共享41％的身份铜绿假单胞菌和FLG22的55％的身份假单胞菌皂苷PV。Tabaci.，这引发了强烈的非健康先天免疫反应[21.］．在FLG22中，氨基酸残基D4​​2对于其PAMP活性至关重要[22]，[23］．尽管flg22_LSO含有氨基酸D42，只有另外两个氨基酸在RINSAKDDA中心motif中被保守(图)1)．

由瞬时表达引起的细胞缓慢坏死死亡佛罗里达州_LSO在N. Benthamiana.

的瞬时表达测定佛罗里达州_LSO在N. Benthamiana.，各种浓度A. Tumefaciens.GV3101带或不带佛罗里达州_LSO测试过。在od.₆₀₀0.8和1.2，用PBIN渗透区观察坏死细胞死亡：佛罗里达州_LSO在接种后8天;单独对PBIN载体的对照表现出氯化，而不是坏死，没有载体的GV3101没有显示出可见的反应（图2)．此外，细胞死亡测定电解质渗漏的叶盘与MgCl浸润₂， GV3101携带pBin载体和pBin:佛罗里达州_LSO结构体。过度表达佛罗里达州_LSO在4 dpi和5 dpi上增加电解液渗漏(附加文件1:图S1)。总之，这表明鞭毛蛋白基因的表达，佛罗里达州_LSO，导致浸润区坏死细胞死亡N. Benthamiana.．然而，在番茄和马铃薯接种中，在接种后没有观察到含有PBIN载体的各种浓度的GV3101或PBIN：佛罗里达州_LSO(数据未列)。

由FLG22引起的胼incization_LSO和flg22._拉斯

保守的鞭毛蛋白结构域flg22_拉斯从Ca。亚洲Liberibacter asiaticus渗入烟草诱导胼胝质沉积[18.］．与FLG22相比_拉斯，flg22._LSO有三个氨基酸取代，包括位于38位的丝氨酸(S)到丙氨酸(a)，以及位于40位和41位的丙氨酸(a)到丝氨酸(S)的取代(图1)．合成肽FLG22_LSO和flg22._拉斯在40 μM的浓度下，浸渍于叶面N. Benthamiana.西红柿和土豆。在浸润区未见肽引起细胞死亡，但可见胼胝质沉积N. Benthamiana.，番茄和土豆，来自FLG22的胼舌_LSO与FLG22相比_拉斯在烟草和番茄中(图3.)．与烟草和土豆相比，用一种肽处理后，在番茄中观察到更强大的胼舌沉积（图3.e和f）。

活性氧的产生佛罗里达州_LSO而不是flg22_LSO在N. Benthamiana.

PTI响应的重要事件之一是ROS生产的快速和瞬态爆发。我们检查了FLG22是否诱导ROS生产_LSO或flg22_拉斯．既不是flg22_LSO也不是flg22_拉斯在0.1 μM、1 μM、10 μM和40 μM条件下，烟草、番茄和马铃薯均能产生活性氧爆发;而控制flg22从P.铜绿假单胞菌在三种植物物种中以0.1μM浓度显示典型的ROS生产（图4)．相比之下，在瞬态表达式中检测到ROS生产N. Benthamiana.叶子与渗透A. tumefasciens.含Pbin：佛罗里达州_LSO和pBin:佛罗里达州_拉斯克隆分别（图5)．浸润后第3天和第4天ROS反应最强。然而，在这些多肽和结构体浸润的番茄或土豆中没有检测到ROS反应(数据未显示)，这与这些植物中没有明显的细胞死亡的观察相一致。

PTI基因表达瞬时上调FLG22_LSO在N. Benthamiana.

许多植物基因的表达在PAMP触发的免疫中上调[24]，[25］．目的:研究pamp相关基因的表达水平N. Benthamiana.flg22后_LSO渗透，进行逆转录酶定量PCR（RT-QPCR）。后N. Benthamiana.被flg22渗透了_LSO肽，在渗透后0.5,1.0,3.0和6.0小时（HPI）测量转录物丰度。表达nbfls2.在0.5 hpi时上调2倍，在1.0 hpi时上调3倍以上，在3.0 hpi时下调3倍以上_LSO治疗（图6)．之前，三个标记基因N. Benthamiana.，NbCYP71D20，nbacre31.和nbacre32.，在flg22之后迅速增加_ps治疗(14.]，[26］．这三个pamp标记基因都是由flg22瞬时诱导的_LSO在1.0 HPI下，随后在我们的RT-QPCR测定中拒绝，这表明FLG22_LSO诱发典型的短暂性PAMP触发免疫基因反应。FLS2直接与细菌鞭毛蛋白结合，然后与BAK1相互作用形成识别复合物[8］．但是，表达水平NbBAK1在我们的测定中显示出明显差异。体细胞胚胎发生受体激酶3（nbserk3.)/BAK1为pamp触发免疫所必需N. Benthamiana.［26］．的表达模式nbserk3./NbBAK1在flg22上没有明显的变化_LSO治疗。两个MAPKs,nbwipk.和NbSIPK，在我们的实验中在1.0 hpi时短暂升高。nbrohbb.除3.0 HPI外，表达上调约2倍。值得注意的是，这些PTI相关基因中的大多数在0.5HPi或1.0 HPI上上调，然后在3.0 HPI下递减。据报道，在光合作用中发挥关键作用的增塑青蛋白在PTI对非致病性的反应中诱导P.荧光［11.］．在我们的实验中，成绩单丰富NbPlastocyanin在1.0 HPI增加5倍，在3.0 HPI时几乎10倍（图6)．我们的结果表明，我们的结果表明FLG22_LSO瞬时诱导pamp触发的基因表达N. Benthamiana.．

长期持久的PTI基因表达佛罗里达州_LSO在N. Benthamiana.

表达佛罗里达州_LSO及其诱导PAMP相关基因表达N. Benthamiana.在渗透后被调查A. tumefasciens.含Pbin：佛罗里达州_LSO或空的pBin载体质粒。高水平的表达佛罗里达州_LSO在接种后1 ~ 4天出现强条带(dpi)。在8dpi上观察到一个非常微弱的带(图7A). RT-qPCR数据进一步显示，与宿主内参基因相比，接种后的转录本丰度增加到3 dpi时的最高水平，并下降到无法检测的水平NbEF1α（图7b）。同时，在2,3,4和8 dpi测量PAMP相关基因的基因表达水平（图8)．RT-qPCR数据显示nbfls2.在4 dpi时上调9倍以上。丰富的NbBAK1/nbserk3.4 dpi时增加约2倍。其他三个pamp相关基因的表达，NbCYP71D20，nbacre31.和nbacre32.在渗透后的不同时间略微上调并且略微不同。两张照片，特别是NbWIPK,在4 dpi上上调超过4倍。nbrohbb.在4dpi时显著增加，这与我们的ROS检测结果一致，即在4dpi时检测到最强的ROS产生。与flg22在1.0和3.0 hpi的瞬时高诱导相比，在评估期间，质体青苷的表达水平逐渐下降_LSO．ppam相关基因的表达佛罗里达州_LSO与肽flg22的瞬时上调有何不同_LSO归纳。这些基因大部分在4dpi时被强烈诱导，然后下降，这与该基因的表达模式有关佛罗里达州_LSO在N. Benthamiana.．

我们的结果表明，LSO鞭毛素基因的瞬时表达（佛罗里达州_LSO）诱导爆发的ROS和缓慢坏死的细胞死亡N. Benthamiana.但在番茄和土豆中没有。虽然肽flg22_LSO没有诱导细胞死亡或ROS反应，它确实在所有三种植物物种中诱导胼沉积．我们确定用合成的肽FLG22瞬时上调PAMP触发基因的表达_LSO治疗。我们进一步表明，这些基因受到的影响更大农杆菌- 全长基因的瞬时表达，佛罗里达州_LSO．我们的结果表明，LSO Flagellin及其短肽，FLG22_LSO具有PAMP活动，并且它们都触发了PTI响应。

Lso和Las肽诱导的胼胝质沉积

许多报告文件，flg22_LSO肽可以诱导植物防御反应，包括反应性氧物质（ROS），发病机制相关基因表达和胼舌沉积[27］．FLG22的氨基酸D42_LSO的激发子活性是必需的Xanthomonas.和P.注射器PV。Tabaci.在非宿主物种中[22]，[23］．在我们的研究中，flg22_LSO，但在烟草、番茄和马铃薯植株中却能诱导胼胝质沉积。这表明flg22_LSO可能与这三种植物的FLS2受体相互作用。此外，利用flg22筛选了100多个马铃薯基因型_LSO和flg22._拉斯．我们发现FLG22_LSO和flg22._拉斯在几种马铃薯品种和全鞭素基因中诱导ROS反应具有与酵母两种杂交测定（段未发表的数据）中的马铃薯FLS2受体相互作用的能力。FLG22肽来自A. Tumefaciens.和S. Meliloti.具有D42氨基酸，但没有显示PAMP活性[27］．这表明除了D42之外，其他氨基酸也对FLG22 Elicitor活性也重要。S38和A39所做的氨基酸变化完全废除了FLG22的粘性活性_拉斯，表明这些位置的丝氨酸和天冬氨酸对flg22是必需的_拉斯烟草植物的认可[18.］．与FLG22相比_拉斯，flg22._LSO具有三种氨基酸取代，并比FLG22诱导更胼舌沉积_拉斯在烟草和番茄中。值得注意的是，尽管在使用flg22的渗透植物中未检测到ROS的产生，但仍观察到胼胝质沉积_LSO或flg22_拉斯．然而，胼胝质沉积有时可以在宿主植物对病原体感染的反应中看到，同时也是非宿主抗性的一个组成部分，在柑橘中Las感染反应中形成了高水平的胼胝质[28］．

被诱发的坏死细胞死亡佛罗里达州_LSO在N. Benthamiana.

鞭毛是一种与诱导植物和动物防御反应相关的细菌诱导者。在我们的研究中，我们发现瞬态表达佛罗里达州_LSO导致烟草细胞坏死，比报道的典型超敏反应(HR)慢得多[29］．瞬态表达p .两鞭毛蛋白FliC基因伴或不伴信号肽诱导非宿主ROS和fls2依赖性免疫，但5天内不诱导细胞死亡[30.］．在我们的渗透实验中，表达佛罗里达州_LSO在浸润后8 ~ 10天，细胞坏死程度较低，但在浸润后3天达到最高，8天下降至极低水平。这类似于病原体与宿主相互作用中的细胞死亡，比非宿主反应慢得多。最近，据报道，烟草(n .烟草）是LSO的主持人[31]:弱宿主的反应而非非宿主的反应可能解释我们观察到的坏死细胞死亡而不是HR, HR的特征是快速、局部的植物细胞死亡[29］．相比之下，PTI期间PAMP的感知导致小的代谢变化，使能量产生可以在弹药的存在下持续[32］．它是有兴趣的全长的瞬态表达佛罗里达州_LSO内部植物细胞还可以诱导伴随PAMP相关基因表达，ROS反应和缓慢坏死性细胞死亡的上调。FLS2是已知识别细胞外鞭毛蛋白的受体。在哺乳动物中，豆荚中的纸质蛋白质如血红蛋白，诱导对病原体的局部细胞死亡相关的免疫反应。但是，在植物中鉴定不鉴定细胞质核苷酸结合的富含亮氨酸含量或其他细胞质受体[31］．关于植物FLS2的研究大多集中在与鞭毛蛋白调控的细胞外flg22的相互作用上[27，就像被感染时所发生的一样假单胞菌还有许多其他细菌病原体。CandidatusLiberibacter严格地属于细胞内，因此，为了发挥PAMP的功能，它们的鞭毛蛋白需要在植物细胞内被识别。研究表明，该鞭毛蛋白的转基因表达来自水稻不亲和菌株acidovorax avenae.水稻的诱导免疫反应、防御相关基因的表达、过氧化氢的产生和细胞死亡[33］．在另一项研究中，FLS2- gfp转基因表达时，FLS2在与flg22结合之前主要定位于细胞膜上。结合后，FLS2聚集成细胞内的可移动小泡，并在flg22激活时降解[34］．除了局部化细胞膜外，还在原生质体测定中的各种尺寸和形状的细胞内囊泡中观察到FLS2 [35］．这些都表明，FLS2和Lso鞭毛蛋白在植物细胞内存在一条独特的相互作用途径。需要进一步的研究来了解这一途径和下游的宿主反应。

LSO鞭毛蛋白和肽诱导的PTI基因表达应答

作为对上述观测结果的补充，我们研究了flg22_LSO-诱导的基因表达n benthamiana。nbfls2.和其他三种纸质标记基因，NbCYP71D20，nbacre31.和nbacre32.，被证明是迅速和瞬时上调的（图6）如前所述，来自FLG22的假单胞菌［14.]，[26］．我们还评估了其他几个基因，这些基因被报道与不同的宿主防御系统相关。与种族特异性防御反应相关的ACRE (Avr9/Cf9快速诱导)基因被发现通过flg22的渗透而上调_LSO在N. Benthamiana.，与真菌诱导子Avr9处理耐药烟草小种细胞(Cf9基因型)的结果相似[24］．

当P.荧光被渗透到非宿主N. Benthamiana.，增塑苷基因显着上调，并且沉默这种基因损害了PTI [11.］．质体青苷是一种小型含铜蛋白，在细胞色素之间充当电子载体b₆f光合电子转移链中的光系统1复合物[11.］．令人惊讶的是，我们的结果显示NbPlastocyaninFLG22的PTI反应中最高诱导基因_LSO治疗。但是，上调的NbPlastocyanin表达逐渐减少了几天农杆菌- 完全长度的表达佛罗里达州_LSO由于缓慢诱导细胞死亡，从叶绿体作用受损的氯化体功能可能导致。据报道，Pamp触发的免疫和光合作用之间存在串扰[32］．尽管用FLG22观察到突出的突发的基因表达的典型模式_LSO渗透，未检测到ROS生产。这可以通过以下事实解释：在钙流入启动后分离出两种不同的信号通路：一个导致ROS突发的一个，另一个到MAPK和其他基因激活[14.］．据报道，除FLG22之外的域界面促成了FLS2介导的诱导拟南芥防御反应[22］．然而，最近识别出从FLG22之外被指定为FLGII-28的第二区域的峰值P. inringae pv。番茄和FLGII-28显示在诱导ROS中N. Benthamiana.不是在拟南芥或bean [36］．此外，据报道，FLG22和FLGII-28的等位基因变异以显着影响植物免疫反应，对细菌运动无影响[36］．这可以解释我们的发现，即全鞭毛蛋白基因，佛罗里达州_LSO而不是肽flg22_LSO这表明，其他鞭毛蛋白结构域，如flgII-28或翻译后修饰也可能与植物的防御反应有关。重要的是要指出瞬态表达式佛罗里达州_LSO仅在烟草中诱导活性氧的产生，而在番茄和马铃薯中不导致活性氧反应。这可能是由于FLS2基因在寄主植物物种/品种之间的序列差异造成的(Duan未发表的数据)。

结果表明，FLS2与鞭毛蛋白直接结合假单胞菌非主机系统[27]，然后与BAK1相互作用形成FLS2/BAK1复合物，激活下游信号通路如MAPK通路。在我们的实验中，两个MAPKs的表达，nbwipk.和NbSIPK确实上调了N. Benthamiana.由这件事佛罗里达州_LSO(图8)．细胞中MAPK途径的延长激活可能导致氧化还原性失衡并产生ROS，最终导致细胞死亡[37］．由于MAP激酶主要受蛋白质水平的调节，这些蛋白的水平在N. Benthamiana.接种后焦距22_LSO或者佛罗里达州_LSO需要进一步调查。

PAMP触发的免疫对于植物来说是限制病原体生长或产生适应二次感染的信号的重要性对植物来说是重要的[38］．PAMP，包括FLG22，活化水杨酸和茉莉酸防御途径的组分，可防止潜在的致病菌[39］．在PTI和Elicitor触发的免疫（ETI）期间发生的分子事件部分重叠，包括SA，ROS和MAPK级联的激活[40］．然而，ETI引起的反应比PTI强烈得多，表明这两种免疫反应在数量上存在差异[8］．发现弗拉的发现_LSO和flg22._LSO具有PAMP活性，触发PTI揭示了细胞内细菌的鞭毛素可以启动植物防御反应。兼容FLS2的鉴定对于马铃薯植物的开发具有增加的抗性至关重要Ca．L.Solanacearum通过标记辅助的常规育种和基因工程。

斑马芯片（ZC）是与韧皮植物有限的细胞内菌相关的重要马铃薯疾病CandidatusLiberibacter solanacearum”(交响乐团)。在本研究中，我们检测了Lso鞭毛蛋白及其功能域flg22的PAMP活性_LSO在足底．我们发现FLG22_LSO具有诱导胼胝质沉积的能力，同时也能触发PTI相关基因的瞬时上调N. Benthamiana.．我们确定了这种表达nbfls2.和三个标记基因，NbCYP71D20，nbacre31.和nbacre32，快速上调。令人惊讶的是，我们发现了表达NbPlastocyanin急剧增加，在3 hpi时增加了10倍。然而，flg22既没有引起细胞死亡，也没有引起ROS_LSO．我们还确定，与肽flg22相比，全长鞭毛蛋白基因的表达诱导了更强的PTI反应_LSO，尤其是对PAMP相关基因的上调nbfls2.和nbrohbb.．此外，表示佛罗里达州_LSO诱导ROS生产和坏死性细胞死亡N. Benthamiana.通过农杆菌- 介导的瞬态表达。发现弗拉的发现_LSO其短肽具有PAMP活性和触发PTI的能力，为细菌鞭毛蛋白在马铃薯斑马片病发展中的作用提供了新的见解，并在抗性育种中有潜在的应用前景。

植物及细菌培养

的种子N. Benthamiana.番茄在26℃光照16 h、暗8 h的室中萌发。然后将幼苗转入塑料容器中的Fafard®4P Mix土壤，并在温室中种植。马铃薯品种(大西洋)直接种植在Fafard®4P Mix土壤塑料容器和温室种植。

大肠杆菌生长在37°CA. Tumefaciens.在Luria-Bertani（LB）培养基中在28℃下生长。将Kanamycin（KAN）以50μg/ mL的浓度加入培养基中。

佛罗里达州_LSO植物瞬时表达的构建

的全长基因佛罗里达州_LSO使用基因组DNA作为具有引物的模板（含有引物）的扩增佛罗里达州_LSOF和佛罗里达州_LSOr（5'-aaaCCCGGGTGTCATTTCGATTTTTAAGGATA-3 ';5 ' - AAACCCGGGCTAACCACGGAAAAGAGATAGAATT-3”)。斜体碱基为SmaΙ限制站点包括克隆。PCR产物连接到PCR2.1-TOPO载体，经化学转化大肠杆菌TOPO10细胞遵循制造商的指示(Invitrogen，卡尔斯巴德，CA)。阳性克隆进行质粒分离和序列验证。将共识克隆酶切，凝胶纯化，克隆到二元载体pBINPLUS/ARS-2x35S (pBin)中，生成pBin:佛罗里达州_LSO．然后将重组载体转化为A. Tumefaciens.通过冻融方法GV3101 [41］．

多肽浸润和胼胝质沉积测定

flg22的多肽_LSO（DRVSSGLRVADSSDNAAYWSIA）和FLG22_拉斯（DRVSSGRRVSDAADNAAYWSIA）由寿命（南方普莱德菲尔德，NJ）合成。用双蒸馏水稀释合成肽以终浓度为40μm，并用1ml无每注射器渗入植物叶子。在渗透后（DPI）后，用如前所述的苯胺染色检测给核糖沉积[39］．简单地说，组织被清除并在100%乙醇中脱水。用蒸馏水清洗干净后，在室温下用0.01%苯胺蓝67 mM K染色过夜₂HPO₄（pH12）。染色的材料在50％甘油中安装在50％甘油中并在紫外线（Leitz DMR显微镜，Leica Microsystems，水牛树丛，IL）下观察到。

植物浸润和RNA隔离

A. Tumefaciens.gv3101和A. Tumefaciens.gv3101含有载体pbin或pbin：佛罗里达州_LSO通过添加50μg/ ml kan，在2ml的1b培养基中培养过夜。将50微升培养物接种到新鲜的5ml LB培养基中另外24小时，加入50μg/ ml kan，10mm MES（2-（N- 莫啡氨酸氨基） - 乙烯磺酸）和100μM乙酰苯胺酮。将过夜培养物离心，洗涤，并在Agromix（10mM MgCl）中重新悬浮₂，10 mm mes和100μmacetosyringone）。将悬浮液调整为不同的OD₆₀₀在室温下保存至少3小时。最后用细胞悬液用1ml无针注射器接种植株叶片。

N. Benthamiana.叶片被flg22侵染_LSO在40μm和水中的控制。作为flg22._LSO诱导快速和瞬态粘合触发的基因表达[14.[渗透区以0.5,1,3和6小时收获的后渗透后（HPI），用于RNA分离。满意佛罗里达州_LSO瞬态表达，A. Tumefaciens.gv3101含有载体pbin或pbin：佛罗里达州_LSO用来渗透N. Benthamiana.叶子在od.₆₀₀ ~ 0.5. Similarly the infiltrated zones were harvested at 2, 3, 4 and 8 d post-infiltration (dpi) for RNA isolation because cell death was observed after 8 to 10 dpi. Trizol reagent was used for RNA extraction according to the manufacture’s instructions (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Total RNA was quantified using the Nanodrop and treated with RQ1 RNase-free DNase from Promega Corp (Madison, WI).

ROS检测和离子泄漏检测

对于FLG22._LSO和flg22._拉斯肽，叶片N. Benthamiana.在美国，西红柿和土豆一夜之间漂浮在水面上。在测定ROS之前，用100 μl测定液(17 mM lumino, 1 μM辣根过氧化物酶，flg22)代替水_LSO或flg22_拉斯在0.1μm，1μm，10μm和40μm的浓度下。使用Perkin Elmer Victor3 V 1420 Multilabel Plate Counter（Waltham，Massachusetts）测量发光。FLG22肽来自P.铜绿假单胞菌用0.1μm使用作为ROS测定的阳性对照。

佛罗里达州的_LSO测定，A. Tumefaciens.gv3101含有载体pbin或pbin：佛罗里达州_LSO有一个od.₆₀₀在0.5的浓度下，浸透叶N. Benthamiana，如上所述的番茄和土豆。来自渗透区的叶片均在2,3,4和5 dpi上拍摄。如上所述进行ROS测定。

如上所述进行离子泄漏测定[42］．在第2、3、4、5和8 d，用锋利的软木蛀虫在10 mm MgCl2浸渍后，简单地收集6个直径为5 mm的叶盘。A. Tumefaciens.含PBIN：FLA_LSO或pBin载体单独作为对照，然后用10 mL蒸馏水清洗30分钟，然后转移到新鲜蒸馏水中。电导用OAKTON电导率计(新加坡)测量。

逆转录定量PCR（RT-QPCR）

DNase处理的RNA（〜2μg）用于在20μl反应（Invitrogen）中以0.5μg寡聚（DT）底漆和1μl上标III逆转录酶合成第一链cDNA。进行没有逆转录酶的阴性对照，以验证没有基因组DNA污染的情况。使用EPPendorfMasterCycler®RealPlex热循环仪，使用Sybr进行三次进行RT-QPCR。15μL扩增反应包含如下：7.5μLSYBR®GreenPCR母线混合物系统（PerfectA Sybr FastMX LRX，VWR），每个正向和反向引物的250nm，以及2.0μL稀释的cDNA模板。使用以下方案：95℃，5分钟，40个循环为30秒，用于在95℃和30秒的60℃下延伸。底漆nbfls2.设计为5 ' -TCAAATGGTGGATGACTGGA-3 '和5 ' -ATGATATGCTGCTCCCATCC-3 '。的N. Benthamiana.伸长因子1α（NbEF1α）被扩增并用于将值标准化为用引物的内部对照（5'-GAccactgaAgtggatctgttttg-3'; 5'-TagcaccagtGGGGTCCTTCTT-3'）。所有其他引物如前所述使用（nbwipk.，NbSIPK，nbrohbb.，nbacre31.，nbacre32.和NbCYP71D20如在出版物中[14.];NbPlastocyanin如[11.];NbBAK1如[18.] 和nbserk3.如[26]）。评估瞬态表达的佛罗里达州_LSO，如上所述进行组织收集，RNA分离和cDNA扩增。进行RT-PCR和RT-QPCR检测佛罗里达州_LSO在渗透后各次的表达水平。底漆佛罗里达州_LSO设计为5'-ttgcgtgtgctgattcttc-3'和5'-tctgcctgaacagaatgtgc-3'。表达水平对内部控制标准化NbEF1α。同时，2^＿△△CT方法计算靶基因在处理条件下相对拷贝数的变化^＿△△CT方法[43其中Ct是荧光信号交叉阈值的点△CT = CT（靶基因） - CT（内部控制）和△△CT =（CT，目标 - CT，内部控制）时间X - （CT，目标 - CT，内部控制）时间x。

我们感谢Cheryl Armstrong博士对手稿的严格审查，以及Scott Adkins博士和Carrie Vanderspool的提供N. Benthamiana.和番茄植物。本文中提及的商品名称或商业产品仅为提供具体信息的目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。

隶属关系

1. 美国园艺研究实验室，2001,Fort Pierce, florida, 34945

   郝桂霞，丁芳，段永平

2. 美国农业部圣华金谷农业科学中心，国会，加利福尼亚州，93648，美国

   洪林

通讯作者

对应于永平段．

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

GH和YPD对实验进行了构思和设计。GH和MP进行实验。GH、DF、MP对数据进行分析。GH、MP、LH提供试剂/材料/分析工具。GH, ES和YPD撰写了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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