一个小的XY染色体区域解释了野生雌雄异株的性别决定诉酿酒用葡萄以及在驯化葡萄藤中雌雄同体的逆转

背景

在葡萄L.驯化引起了花形态的巨大变化:野生结果表明亚种是雌雄异株，而雌雄同体在驯化亚种中主要占主导地位。V. V.葡萄。性别决定染色体区域基因多态性的特征可能有助于阐明葡萄驯化的历史和植物性染色体的进化。属的葡萄,性别决定被认为是由一个主要基因座与三个等位基因控制，男性米,雌雄同体H和女性F,具有等位基因优势米>H>F。先前的遗传学研究将性别位点定位在2号染色体上。我们使用了地理多样性的DNA多态性诉酿酒用葡萄基因型以确定该位点的位置，表征遗传多样性和候选基因选择的痕迹，并探索雌雄同体的起源。

结果

在V. V.西尔维斯特里斯，一个154.8 kb的性别决定区，也存在于其他葡萄属种，跨度小于1%的染色体2。它表现出单倍型多样性，连锁不平衡和分化，通常对应于一个小的XY性别决定区，XY雄性和XX雌性。在雄性等位基因中，发现了a的净化选择痕迹海藻糖磷酸酶,一个exostosin和一个WRKY转录因子在遥远的地理区域之间，多态性水平非常低。多样性和网络分析均表明H等位基因与米比F等位基因。

结论

雌雄同体等位基因似乎来源于野生葡萄藤的雄性等位基因，连续的重组事件允许多样性从X染色体区域输入到Y染色体区域，并减缓该区域向完全异型染色体的扩展。我们的数据与多个驯化事件一致，并显示了来自其他亚洲人的渗透痕迹葡萄属种进入栽培葡萄藤基因库。

野葡萄藤，葡萄l .无性系种群。结果表明是驯化葡萄藤的野生祖先V. V.葡萄［1]、[2]，用于酿酒和食用葡萄生产[3.]。属葡萄属，一科的单系分类单元葡萄科［4]、[5]，包括大约60种，主要分布在亚洲和美洲，除了驯化的葡萄藤外，所有的葡萄藤都是雌雄异株(雄花和雌花生长在不同的植物上)[6]、[7]。在葡萄驯化过程中，花的生殖形态发生了根本性的变化，在驯化的葡萄中从雌雄异株转变为雌雄同体[8]。在驯化葡萄藤中雌雄同体发育的地理起源仍然没有阐明，也不知道它是否发生在初级[1]、[9]和/或据信发生在地中海周围地理上不同地区的二次驯化事件[10]、[11]。

性表达葡萄属花被认为是由一个有三个等位基因的主位点控制的，雄性米,雌雄同体H和女性F,与一个米>H>F等位优势[6]、[7]、[12-14]。几个基于种间杂交的遗传图谱证实了该属的性别决定论葡萄属受到位于2号染色体上靠近SSR标记VVIB23的单个主要基因组区域的控制[15-17]。最近，一种复杂的种间杂交(诉酿酒用葡萄x (诉锐利x诉灰质])， Fechter等采用[18]将性别位点的位置缩小到位于第2染色体4.907.434和5.037.597 bp之间的143 KB基因组区域[18的物理地图上诉酿酒用葡萄参考基因组序列(PN40024 12x。0版本[19])。到目前为止，性位点在2号染色体上的共定位诉酿酒用葡萄无性系种群。酿酒用葡萄只在一个种内杂交的遗传图谱中得到证实[20.]，重组距离最近的遗传标记(VVIB23)为0.4 cM。此外，在V. V.西尔维斯特里斯亚种，性别定位仍有待证实。

正确性染色体的进化在植物中是相当罕见的:事实上，大约是。目前已知有40种开花植物具有发育的性染色体，其中一半具有异型性染色体[21]。在雌雄异株物种中，性染色体可以通过抑制染色体上靠近的互补优势的雄性和雌性不育突变之间的重组而开始发育[22]。然后，这个性别决定区域将逐渐增大，越来越多地纳入性别连锁基因，最终进化成异型性染色体[21]、[22]。性染色体进化过程中涉及的一些过程，如基因重组的抑制或Y染色体的遗传退化，目前尚不清楚，只有研究不同物种和不同进化阶段的性别决定系统才能提供一些答案[23]。而性别决定位点在葡萄属对物种的研究主要是为了开发用于繁殖的早期性别遗传标记[18]、[20.]， Fechter等人的工作。[18]，表明存在一个小的性别决定区域葡萄属物种可能是研究性染色体进化早期阶段的良好候选者。

在本研究中，我们在遗传和地理上不同的野生和驯化葡萄中探索了性位点附近的序列多态性，目的是:i)确认性位点在葡萄中的位置和边界诉酿酒用葡萄无性系种群。结果表明;Ii)从连锁不平衡、遗传多样性、选择特征和候选基因等方面描述性别区域;iii)利用这些信息探索驯化葡萄藤雌雄同体的地理和遗传起源。

由于野生葡萄藤携带了驯化葡萄藤雌雄同体的起源性位点的祖先形式，我们首先绘制了与该性性状相关的序列多态性葡萄无性系种群。结果表明。然后，我们比较了不同野生和驯化葡萄种群中与性别性状相关的多态性，以研究驯化葡萄雌雄同体现象的起源。

植物材料和表型性状数据

植物材料包括73株野生葡萄(39株雌性，34株雄性)和39株雌雄同体驯化葡萄(附加文件)1)。这些葡萄从139个野生基因型和2.323个驯化基因型中筛选出[24以最大限度地提高遗传多样性和地理代表性。来自其他物种的三种基因型也被认为代表了亚属的遗传变异葡萄属：诉balansaeana，诉coignetiae和诉monticola［25]。葡萄取自自然种群或法国国家葡萄种质收集(INRA, Domaine de Vassal, France;http://www1.montpellier.inra.fr/vassal/)。考虑的基因型根据遗传分析而变化(附加文件)1)。性别表型(雄性、雌性或雌雄同体)通过多年来反复观察花的形态来评估，并根据国际葡萄和葡萄酒描述符组织(代码编号OIV-151 [26])。

DNA提取

根据dnasy Plant Mini Kit (Qiagen)的说明，从150 mg的叶片中提取DNA，将1%的聚乙烯吡罗烷酮(PVP 40000)和1%的β-巯基乙醇添加到缓冲液AP1中，以消除多酚，多酚是粗葡萄细胞裂解液中大量存在的体外酶反应的强抑制剂。

扩增子测序

几项研究将性别定位在葡萄属靠近2号染色体上的SSR标记VVIB23 [15-17]、[20.]、[27]。此外，我们在葡萄无性系种群。结果表明，利用11个SSR标记分离了几个由开放授粉产生的种内杂交(数据未显示)。利用这些信息，我们设计了11个扩增子，覆盖了2号染色体(PN40024葡萄藤基因组参考序列，版本12x) 4.781.551 bp和5.037.597 bp之间的区域。0 (19];表格1、附加文件2引物序列)。该区域既包括VVIB23 SSR标记，也包括Fechter等人定义的143 kb区域。18)(图1)。我们没有进一步扩大下游的覆盖范围，因为我们发现SSR标记VMC3b10(位置5.057.413 bp)在我们的野生葡萄图谱群体中与性别隔离无关(数据未显示)。

根据Fechter等人。[18]， 2号染色体143 KB区域(12x。在4,907,434和5,050,616 bp之间的等位基因对应于雌雄同体黑皮诺40024的雌性等位基因，而稍微不同的雌雄同体等位基因位于未分配的scaffold d_233 (12×.0的染色体UnRandom)。12×。0 scaffold_233与8×葡萄基因组参考序列的2号染色体共线[19];这两种组合都显示了12x染色体2号组合中不存在的两个区域。0引用序列版本:一个区域之间的3-氧酰合酶III C端(KASIII)和PLATZ转录因子，和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APT3)区域[18]。APT3将雌性个体与雄性和雌雄同体个体区分开来[18]。一个基因磷脂磷酸酶2(PAP2)，无法通过12x的Gaze注释预测。0参考序列版本，但经8×参考序列版本的Gaze注释，并经Fechter等人确认[18在12× ×上。0引用序列版本。

在我们的工作中，11对引物中的8对可以使用12x的Gaze注释来设计。0引用序列版本(表1,图1)。利用8×reference序列版本的Gaze注释，在PAP2基因中开发了一个引物对(VSVV011)1)。另一对引物(VSVV010)被专门开发用于覆盖假定的APT3区域，以区分雌性个体与雄性个体和雌雄同体个体[18]。最后一个扩增子(VSVV008)被设计用于扩增12x上KASSIII和PLATZ转录子之间区域的一个基因。0 scaffold_233;该基因的预测蛋白与an一起爆炸乙烯生产过剩1基因(ETO1, blastx e值= 4e-83)。对于ETO1和APT3扩增子，通过对12× 2号染色体上未分配的scaffold_233 (12×.0的UnRandom染色体)和8×reference序列版本进行人工重新排列，估计其在葡萄基因组物理图谱上的位置。0引用序列版本。因此，在我们的工作中，12x。这两个放大器的0个位置是近似的(表1)1)。

所有引物对均采用Primer3软件V.0.4.0设计[28]、[29]以便扩增600至1300 bp的长度，并覆盖部分启动子和第一外显子和内含子[28]、[29]。热循环包括最初的严格循环(94°C持续3分钟，然后是12个94°C持续30秒的循环，从65°C到56°C，每个循环减少0.70°C，持续45秒，72°C持续120秒)和额外的25个94°C持续30秒，56°C持续45秒，72°C持续90-120秒。使用AMPure®试剂盒(agcourt®，MA, USA)纯化的PCR产物进行测序;按照标准方案使用BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied BioSystems, CA, USA)，反应产物用CleanSEQ®Kit (agcourt)纯化，并在3130×l遗传分析仪(Applied BioSystems)上读取。使用Staden软件v.2.0.0导入、对齐和修剪原始序列文件(AB1格式)[30.];日志含义使用Staden接口手工调用SNP。然后，导出fasta文件，随后在其他软件和管道中进行分析。

鉴定与性性状相关的序列多态性

野生葡萄藤的表型性别遗传只产生雄性和雌性变异，在成年群体中这一比例接近1:1(即使已经观察到一些性别表型变异[13]、[26]，在我们的样本中只发现了两个变体，M和F)。基于之前的观察、初步数据分析和文献调查，我们可以对葡萄的性别遗传做出最简洁的假设[6]、[7]、[17]、[18]、[20.]，是一个XY系统，其中，在性别位点，女性是纯合子(XX)，男性是杂合子(XY)。

为了绘制基因组上的性位点，我们首先使用了遗传关联方法，在来自不同地理来源的多种野生基因型中寻找性花表型和序列多态性之间的相关性1)。然而，使用一般或混合线性模型寻找关联导致了太多的假阳性(SNP与性别相关，但只能解释部分表型)。因此，我们使用了类似于Siegismund [31]，使用Fisher检验分别比较每种多态性以及雄性和雌性野生葡萄纯合子和杂合子基因型的预期比例和观察比例。预期的比例被假定遵循Hardy-Weinberg定律，并从整个群体(男性和女性个体的总和)中观察到的等位基因频率计算出来。观察到的计数是在雄性和雌性葡萄中实际记录的纯合子和杂合子基因型的数量。索引被编码为存在/不存在(附加文件3.)。费雪试验是用fisher.testR统计软件的函数[32]。我们只考虑缺失数据少于20%且样本中最小等位基因频率高于5%的序列多态性。当零假设的偏差概率低于经Bonferroni校正的多假设检验的0.05 p值阈值(0.05/n, n对应研究多态性的总数)时，认为检验显著。

性别区域的连锁不平衡

为了探索覆盖性别区域的扩增子之间和内部的连锁不平衡，我们使用了衡量。R2VS() R包中的函数LDcorSV [33]。r²VS每个两两相关的平方是否经样本的亲缘性和遗传结构修正[33]。这里考虑的样本由18名男性和18名女性组成(附加文件)1)。这36个样本是在数据缺失最少的样本中选出的，剔除了最密切相关的个体，平衡了它们的地理代表性。遗传结构矩阵由20个SSRs数据集计算[24]本研究中所有野生基因型的数据，使用STRUCTURE软件[34]。我们使用的模型具有不相关的等位基因频率，混合，没有先前的种群信息，之前显示与葡萄藤相关[35]。10个结构运行(每个运行5 × 10)⁵迭代和5 × 10⁵每个k水平下的重复数)，并比较估计组分配的稳定性。根据10个STRUCTURE重复之间的相似性模式和Evanno的Δks统计数据推断出最可能的亚种群数量[36]。亲属关系矩阵通过ML-Relate软件得到[37]与上述相同的SSR标记和基因型。

多样性米，F和H单倍型与选择特征

为了比较雄性、雌性和雌雄同体等位基因在显著性连锁扩增子上的多样性(见附加文件)1对于考虑的基因型)，使用PHASE v2.1使用默认参数值重建单倍型[38]、[39]。个体单倍型的归属米，F和H在单倍型树(附加文件)的帮助下进行类群(以下称为单倍群)4)用最大似然法(PhyML 3.0 [40])在SeaView v4.3.3中实现[41]，并基于广义时间可逆(GTR)模型[42]。

遗传多样性米，F和H单倍型评价采用单倍型数(Nh)、分离位点数(S)、单倍型多样性(H)和核苷酸多样性(π)进行统计。为了检测性别区域的选择特征，田岛的D [43和傅和李的D* [44用dnnasp v5软件进行统计[45]分别用于雄性、雌性和雌雄同体单倍群。为了证实Tajima's D、Fu和Li's D*检验、E统计量和DH检验在男性单倍群上检测到的选择痕迹[46的雄性单倍型计算诉balanseana作为外群体(表12)。

最后，我们评估了雄性、雌性和雌雄同体单倍群之间的种内遗传分化，以及雌雄同体之间的种间分化v.v.西尔维斯特里斯和葡萄属物种单倍型，使用Fst统计[47]、[48也可以使用DnaSP v5软件。的葡萄属用于统计的物种有诉balanseana，诉monticola和诉coignetiae。

H单倍型的起源

结合四个性别连锁扩增子的单倍型米，F和H重建大单倍型。再次运行PHASE v2.1，使用100个熟透周期，其中包含100次迭代，细化间隔为1和10次重复。通过多次运行，验证了算法的收敛性。然后，了解起源H对驯化葡萄的单倍型进行了网络分析F，米和H使用Bandelt等人描述的中位连接方法进行大单体型[49]并在Network v4.6.1.1中实现。［50]。在运行网络计算之前运行了一个星型收缩。

最后，网络距离(以突变数为单位)与H单倍型来自米单倍群、地理起源、葡萄用途(餐桌、葡萄酒或两者)、驯化程度(古代或现代栽培品种)[51])和驯化葡萄藤的遗传结构祖先[35]用方差分析进行了探讨。

与性别特征相关的序列多态性

选择了11个扩增子，共代表9.523 bp，用于部分扩增基因序列，以覆盖性别位点及其边界[18]、[20.]。对这11个扩增子在65个遗传和地理上不同的野生基因型样本(31个雄性和34个雌性)进行测序1， [GenBank: KJ575622-KJ57662])，鉴定出146个多态性位点(附加文件3.): 137个snp和9个indels。36个snp位于内含子，20个位于外显子，其中10个非同义。在女性和男性基因型中分别发现51个和64个多态性的等位基因频率明显偏离Hardy-Weinberg比例(图2)2b).这些显著多态性主要存在于VSVV006、VSVV007、VSVV009和VSVV010中，分别占女性显著多态性的87.04%和男性显著多态性的90.60%。

在显著多态性中，28个完全符合XY性别决定模型。对于这些多态性，最常见的等位基因，100%的男性基因型是杂合的，100%的女性基因型是纯合的，例如，男性是A/T，女性是A/A，但从不是T/T(图2)2c、附加文件3.)。在雌雄同体驯化基因型中，这些相同的多态性在大多数情况下处于杂合状态(附加文件)5)。这28个多态性只存在于VSVV006、VSVV007和VSVV009扩增子中，且其中3个多态性导致非同义氨基酸变化(VSVV006和VSVV007的第38、61和66个多态性)，完全符合XY模型3.)。

此外，VSVV006、VSVV007、VSVV009和VSVV010的18个显著多态性仅轻微偏离XY性别决定模型，所有雌性基因型中最常见的等位基因为纯合子，而雄性基因型中有1或2个非杂合子(附加文件)3.)。例如，对于图6中的多态性126(交叉)2b, c)对应于APT3基因第二个内含子的性别连锁索引[18]，所有雌性无indel为纯合子，92%的雄性为杂合子(23个杂合子，1个带indel的纯合子，1个不带indel的纯合子)(附加文件)3.)。在VSVV008扩增子中，仅发现1个SNP与XY性别决定模型略有偏离(图2)2b和附加文件3.)。

相比之下，尽管很少发现它们明显偏离Hardy-Weinberg比例(Fisher检验)，但在VSVV002、VSVV003、VSVV004和VSVV005中发现的多态性在很大程度上偏离了XY模型，尤其是在男性基因型中(图5)2和附加文件3.)。

总之，VSVV006、VSVV007、VSVV009和VSVV010扩增子中的46个显著多态性要么严格(28)要么紧密(18)符合XY性别决定模型。这些结果使我们能够在PN40024物理图谱(12× 2) 2号染色体上的4.884.818和5.036.645位置确定性别位点的边界。0版本)。该区域由基因片段VSVV005和VSVV011外部分隔，共151,83 kb，包含13个候选基因(图2)1和附加文件6)。

性别区域的连锁不平衡

在18株雄性和18株雌性野生葡萄的子样本上估计了扩增子内和扩增子间连锁不平衡(LD)1)，计算两两平方相关系数r²VS［33]，校正样本的结构和亲缘关系。只分析了缺失数据小于20%和次要等位基因频率为0.2的序列多态性。在这些阈值下，VSVV001片段中没有保留多态性。

最高的LD值出现在四个性别连锁片段内部和片段之间(图2)3.)。所有两两比较的四个性别连锁片段的平均LD为r²VS= 0.72，总物理长度为109.76 kb。最大平均扩增子内LD为r²VS= 0.84 / 374 bp，最小值为r²VSVSVV009 = 0.63 / 504 bp。扩增子间最大LD为r²VS= 0.81 (109.39 kb)，最小值为r²VSVSVV007和VSVV009之间= 0.63 (67.84 kb)。片段VSVV008(仅与性别弱连锁)与性别连锁片段(r²VS= 0.31)。

生物多样性米，F和H单倍型与选择特征

的米，F和H利用最大似然单倍型树对4个性别相关扩增子(VSVV006、VSVV007、VSVV009和VSVV010)进行单倍型鉴定。根据XY模型和所描述的优势规则葡萄属（米>H>F［6]、[7]、[12-14])，将包含雌性、雄性和雌雄同体基因型单倍型的单倍群命名为雌性Fhaplogroup(附加文件4);它应该包含F单的FF女性,曼氏金融男性和高频雌雄同体的基因型。不同的是，交替的单倍型存在于雄性和雌雄同体基因型中，而不存在于雌性基因型中F单倍群，被认为是米和H单体型分别(附加文件4)。

对于野生雌性和雄性基因型，数量F在雌性单倍型群树中发现的单倍型与XY性别模式(1F雄性基因型为单倍型，雌性基因型为2倍型;表格3.)。然而，也有一些雌雄同体的基因型，要么只有一个或两个扩增子，要么没有扩增子，要么只有两个扩增子F单体型。这种与性模式的背离在VSVV010中尤为明显。

对于分集参数的计算和选择特征的估计，我们对F雌雄同体驯化基因型的单倍型F雄性和雌性野生基因型的单倍型，从而检测驯化区室和野生区室之间不同的多样性或选择模式。除VSVV010外，米单倍群的单倍型(Nh)数量最少，单倍型(H)和核苷酸(π)多样性水平最低，表明主要存在一种单倍型，在罕见变异中SNPs数量较少(表2)2)。极端的例子是VSVV007扩增子，它只观察到两个单倍型，在849 bp上只相差一个SNP(图中多态性n. 3)4)。另一方面，在VSVV010中，米单倍群显示出高的单倍型多样性，相当于驯化和野生F单倍群，且π值高于其他扩增子(表2)2)。的F野生和驯化基因型的单倍型比野生和驯化基因型的单倍型数量和多样性显著增加米haplogroups。总的来说，驯化和野生F单倍群表现出相似的多样性模式。

的H单倍群的多样性模式介于两者之间米和F单倍群，但更接近米haplogroups(表2)。对于VSVV010H单倍群的多样性模式与米单倍型，除了较低的单倍型多样性。

为了说明这些发现，每个性别连锁扩增子的单倍型如图所示4(基因型和地理细节见附加文件7)。

这个数据集显示，葡萄藤花的三种性别，雄性、雌性和雌雄同体，可以在97%的地理代表性基因型中正确预测诉酿酒用葡萄样本，使用几个snp，即VSVV007的n. 4至7和VSVV010的n. 8(在图中分别称为1和2的黑色圆圈标识)4一个)。

男性单倍群VSVV006和VSVV009的Tajima’s D、Fu & Li’s D*值均为显著负向(表1)2)。对于VSVV010, Fu和Li的D*统计量接近显著阈值(0.10 > p值> 0.05)。对于男性单倍群(表1)2)，所有扩增子均显示负E值，但只有VSVV006的低频变异显著过量。DH试验检测到VSVV009和VSVV010明显阳性选择。其他性别单倍群均未表现出明显的选择特征。

第一个值(表14)揭示了两者之间的遗传距离米和F四个性别连锁扩增子的单倍群，尽管VSVV010不太明显。的H单倍群在遗传上更接近米比Fhaplogroups。对于VSVV007H和米单倍群具有相同的单倍型，因此显示零距离。相比之下，只在野生和驯化之间发现了轻微的遗传差异FVSVV006, VSVV009，尤其是VSVV010的单倍群。然而，对于VSVV007，野生种群和驯化种群F单倍群似乎是不同的。所有遗传分化值在VSVV010均较低，说明该区域所有性别单倍群的分化程度较低。对于这4个扩增子，雄性(或雌雄同体)和雌性单倍群之间的种内遗传距离远远大于种间遗传距离葡萄属单倍型(表14)。

等位基因H的起源

确定…的起源H等位基因，一个建立在F，米和H大单体型，结合了四个性别连锁扩增子提供的信息(图2)5a).根据这个单倍型网络，基因型对之间的距离与它们之间的突变数量成正比，H大单倍型更接近于米一比一Fmacrohaplotypes。网络显示了两组H大单体型:第一(H1)，在网络的边缘，只由三棵驯化的葡萄藤组成:简历。Tsolikouri (chTSO)Ak ouzioum Tapapskii (chAKO)和简历。西万尼(chfSYLVA)，而第二个，H2把其他的都分组H驯化的雌雄同体葡萄藤的大单倍型。的米野生雄性葡萄的大单倍型位于两者之间Hmacrohaplotypes组。然而，一个雄性野生大单倍型，Lambrusque Ul any and Zitavou A07 (smUNZA07)来自斯洛伐克的一个大单倍型，显示出更接近于H2大单体型比另一个大米macrohaplotypes(图5a).该葡萄藤显示出在其他野生雄性葡萄藤中没有发现的VSVV007单倍型，但在两个驯化的雌雄同体基因型中发现。有关F根据野生或驯化大单倍型的发生情况可划分为3个亚群(图2)5a、b)。的F1群体由大部分野生大单倍型和4个品种组成:简历。品丽珠(chCAF)，简历。西万尼(chfSYLVA)，简历。木酚素(chfLN)和简历。Lameiro (chLAR)。的F2类群主要包含驯化的大单倍型。在这一组中，一些驯化的葡萄有两个相同的单倍型分配给HVSVV010单倍群;大单体型最接近F1和F3组是简历。黑色香槟(chDTN)，简历。麝香葡萄小粒白(chMUF)，简历。Diagalves (chfDIAGA)和简历。Savagnin (chfSAVA77)。最后一组F3野生大单倍型和驯化大单倍型按大致相同的比例分组，其中简历。葡萄牙蓝葡萄酒(chfPORTBL)，简历。歌海娜(chfGRENA)，简历。Ak ouzioum tpapskii (chAKO)和简历。Araklinos (chfARA)。

为了更好地理解的起源H等位基因，我们探讨了网络距离之间的关系H大单体型来自米的(图5B)地理来源、使用和驯化程度[51栽培的葡萄藤。这些特征都没有显示出明显的相关性H大单倍型在系统发育网络中的位置。然后，我们尝试将网络距离与Bacilieri等人定义的结构组相匹配。35]。本研究基于2.096个驯化基因型，揭示了4个主要的遗传群体:a)来自西部地区的葡萄酒品种，b)来自东地中海、高加索、中东和远东国家的食葡萄品种，c)来自巴尔干和东欧的葡萄酒品种，d)一大群具有混合基因组的品种。在这里，方差分析显示出微弱的趋势(r²= 0.15,p= 0.09)，巴尔干和东欧品种的大单倍型，与葡萄酒西方品种相比，更接近野生M大单倍型。

同样，上述定义的3组F大单倍型虽然指向不同的“驯化程度”，但并没有显示出清晰的地理或遗传结构模式来解释群体组成。

两个雌性大单倍型的网络位置诉monticola，诉coignetiae而男性诉balansaeana作为外群体的葡萄藤，其性别表型分布一致:两种大单倍型都在葡萄藤中F雌性的大单倍群，一个在F大单倍群和一个接近米和H男性的大单倍群。最近的驯化大单倍型诉balansaeana其中一个属于两个俄罗斯品种;简历。亚西尔·卡拉(chASS)和简历。Ak ouzioum tpapskii (chAKO)(图5)。

性别区域位置葡萄无性系种群。结果表明

从先前对种间杂交的研究中定义的位点[17]、[18]，在一组不同的雄性和雌性野生葡萄藤上对11个基因进行了部分测序。在4个扩增子中发现46个多态性与花的性别完全或强烈相关，从而可以定位诉v。无性系种群。结果表明2号染色体上151.8 kb的性别位点，与Fechter等人定义的143 kb的性别区域完全一致。[18在…上葡萄属种间杂交。我们的结果证实了米等位基因F具有XY性别决定模式特征的等位基因，与控制杂交中的性别分离一致[7]、[12]、[14]。我们还证实，性位点位于SSR标记VVIB23的下游，而先前的研究基于较低的标记密度将其置于上游[17]、[20.]。

在151.8 kb的性别区中，位于中心位置的VSVV008扩增子多态性与性别性状的相关性较弱，只有一个显著SNP，没有完美的M/F关联。一种解释这种模式的假说可能是，局部重组破坏了大脑中的关联模式V. V.西尔维斯特里斯。不幸的是，在我们的工作中，我们无法明确确认VSVV008在性别位点中的位置。实际上，该扩增子的PCR引物是基于8×grape基因组的2号染色体、未分配的scaffold_233上推定的雌雄同体等位基因(12x.0)和雄性之间的基因组序列组合的一致性而设计的诉灰质BAC测序图[18]，其中VSVV008按预期位于VSVV007和VSVV009之间。根据这些信息，我们预计VSVV008只会在雄性中扩增;然而，在我们的诉的抗旱性样本，它放大了性别的冷漠。即使获得的序列或其PCR引物没有在基因组的其他地方爆炸，对VSVV008的真实坐标仍然存在一些疑问;只有新的专门设计的实验才能帮助明确确认VSVV008的位置。

性别位置的特征

在与性有关的四个基因中，我们发现了一个强大的LD，这在葡萄，平均数r²VS0.72的109.76 kb。在诉酿酒用葡萄Lijavetsky等人发现，LD在200多个基因片段中迅速衰减。[52在200 bp左右观察到LD衰减低于0.2，后来Myles等人通过大量基因分型证实了这一发现。[53]。与其他基因组区域相比，性别位点的LD较大可能表明重组受到抑制，这是异型xy样染色体区域的典型特征[23]。

野生葡萄雄性单倍型的单倍型多样性(H)值最低，以一种主要的单倍型为主，在不同的地理来源(从东欧到西欧、高加索和北非)中分布无变异。雌雄同体驯化葡萄单倍型多样性值高于野生雄性，而雌性单倍型多样性值最高，野生池与驯化池间差异不显著。雄性和雌性之间较大的Fst值证实了它们之间明显的遗传分化米和F单体型。负显著Tajima的D值和Fu、Li的D*值米VSVV006和VSVV009的单倍型显示了过量的罕见多态性，揭示了纯化选择。使用诉balanseana作为外群体，曾氏等。E统计量及DH检验[52]证实了VSVV009的这种模式。对于VSVV007米单倍型，这些统计为负但不显著，可能是因为在其849 bp的长度上，我们只发现了一个分离位点。这种单一性可能是稳定选择的信号，特别是因为我们的葡萄样本来自非常不同的地理区域。事实上，在葡萄藤中，先前的研究证明了更高的变异率，根据基因组区域和研究人群，在47-129个碱基对中平均有1个SNP [52]、[54]、[55]。相比之下，F四种性别连锁的单倍型没有明显的选择痕迹，表明这些等位基因是在中性模式下进化的。

总体而言，性别区域呈现出典型的小XY非重组区域的特征[21]。根据普遍接受的植物性染色体进化模型，当两个位置相近的雄性和雌性不育突变发生重组抑制时，该区域可出现在雌雄异株物种中[22]。的F等位基因预计包含隐性的，“功能丧失”型，男性不育突变米等位基因将包含一个功能齐全的男性生育等位基因，在附近的位点上，有一个显性的女性不育突变[23]。在这种情况下，米等位基因可能会受到两个性别决定位点之间重组的选择的限制，因为重组可能导致完全不育，或者恢复到祖先的雌雄同体状态。X染色体和Y染色体中插入、倒位、重复元素和染色体重排的积累[56]可能增加了这一机制，阻碍了减数分裂时的局部染色体配对。事实上，在这个轨迹中，Fechter等人。[18]报道了在女性等位基因中存在额外的重复FMO元件和反转录转座子，这两者都不存在于男性等位基因中。这些结构差异可能有助于抑制M和F等位基因之间的局部重组。对重组的抑制反过来又可能是连锁不平衡的根源，它也可以部分解释生物多样性的减少米等位基因。

在这个区域，远端基因(VSVV010)和中心基因(VSVV008)与性别性状的关联较弱，如果精确定位，可能是一些重组事件的痕迹，足以打破与性别因果基因的关联，但不足以完全模糊LD痕迹(图2)2和3.)。罕见的重组事件可能阻止了这个小的性别区域进化成完整的性染色体葡萄属尽管雌雄异株被认为在数百万年前就出现在这个分类单元中了[57]。最后，如果VSVV008恰好位于性别位点，性别决定论在葡萄属可能是两个相关基因区域的两组不同突变的结果，一个包括VSVV006和VSVV007，另一个包括VSVV009。就像在草莓属virginiana轧机。［58]，雌性和雄性不育突变不能完全联系在一起，从而导致中性和雌雄同体个体的出现。一些雌雄同体葡萄藤已经在自然条件下被观察到，但它们的野生状态今天仍然不确定，因为它们可能是从种植中逃出来的[59]。同样，在长寿命、晚开花和易患病的葡萄中，尽管在野生和实验育种中都观察到不开花的植物，但很难明确地确定这些植物是中性的，还是只是生长在开花限制的条件下。

小的XY区域的长度葡萄不到染色体长度的1%，远短于木瓜的小性别区(占染色体的10%)[60]。在这个小的性别区域flavin-containing单氧酶(FMO)基因和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APT3)已被认为是葡萄花性别测定的良好功能候选者[18]。其他候选基因也可以被提及，比如trehalose-6-phosphate磷酸酶(TPP)通过糖信号修饰控制玉米花序结构[61]及其直接产物海藻糖二糖对开花过渡有显著影响[62]。的WRKY转录因子是最大的转录调控家族之一[63其中一个因素已被证明可以调节胚乳的生长和细胞化拟南芥［64]。VSVV008扩增子被设计在一个基因中，该基因所预测的蛋白质显示出与a乙烯生产过剩1(ETO1)。拟南芥ETO1蛋白特异性地抑制1-aminocyclopropane-1-carboxylate合酶(ACS) (65]、[66]已知与瓜类的性别决定有关(Cucumis梅洛) ［67]。然而，对于淡水螯虾在蛋白质中，多态性与表现型性别无关，这表明Battilana等人发现的关联。[20.是扩展的基因间连锁不平衡(LD)的结果，而不是因果突变的直接指示。

H等位基因的起源和驯化的痕迹

本研究的最后一个目的是阐明驯化葡萄雌雄同体现象的起源。Fst和网络分析都揭示了这一点H单倍型与米比F单体型。因此,H驯化的雌雄同体葡萄藤的等位基因可能来源于米先前作者提出的野生雄性葡萄的等位基因[13]、[68]。有趣的是,在番木瓜,雌雄同体对于Y染色体变异(Y^h)，更类似于决定男性的Y而不是X [60]、[69]。然而，当所有Y和/或Y的组合^h是致命的吗葡萄属HH基因型确实会相互竞争并产生种子，就像某些驯化的葡萄藤，如夏敦埃酒，汉堡马斯喀特，雷司令或红衣主教(Truel per。com .， Vassal INRA)，产生100%雌雄同体的后代。因此,H等位基因可能是一个米等位基因失去了显性雌性不育突变，解释了米等位基因H等位基因。这一假设也可以解释在人类中观察到的生物多样性的增加H单倍型和M单倍型相比

在单倍型的系统发育模式研究中，我们只发现了一个微弱的趋势H东部地区品种的大单倍型与西部品种相比，更接近野生品种米macrohaplotypes。以前的研究将葡萄的主要驯化区定位在地中海地区的东部[9]、[53]，这与我们的数据是一致的。

更有趣的是，网络分析显示F和米/小时单倍群又分为亚群。特别是，野生雌性大单倍型被细分为两个主要群体，一个与雌性大单倍型密切相关解析:选c单倍型，和另一个离得更远葡萄属sp.雌性;驯化的雌性单倍型分为三组，第一类接近于雌性诉balanseana组，和其他两个分支作为独立的血统从主要诉的抗旱性haplogroup。类似地，在米/小时M单倍型之间的微小差异使得野生单倍型之间的差异较小，而栽培的雌雄同体又被分成不同的群体，一个包括东方品种，另一个包含西方成分。通过网络分析获得的总体图像指向了野生动物的遗传结构诉酿酒用葡萄与其他物种相关的单倍型，支持Peros等人提出的假设。[25来自不同亚洲物种的两种叶绿体谱系(诉piasezkii，诉amurensis和诉thunbergii)促成了野生动物的出现诉酿酒用葡萄欧洲的人口。另一方面，群体分化在驯化隔间中，既为驯化隔间F和H单倍型，表明多次驯化事件，如阿罗约等人提出的。[11基于叶绿体遗传多样性。更令人惊讶的是，我们发现H单体型的简历。Assyl卡拉是俄罗斯的一种栽培品种，通过一系列的突变，直接从诉balansaena(图5)。在F群，品种最接近诉balanseana也是一种俄罗斯品种简历。Ak ouzioum tapapski。基于这一证据，我们可以提出这样的假设，在性别区域，除了已知的贡献来自诉酿酒用葡萄ssp。结果表明在美国，驯化葡萄包含了来自不同亚洲品种的遗传贡献。历史上知道，在苏联时期，俄罗斯农业研究人员积极从不同的亚洲地区引进遗传变异，作为抗寒或抗病等位基因的来源[70]。事实上，Venuti等人。[71最近的研究表明，亚洲葡萄属amurensis被育种者用来将抗性基因渗入栽培葡萄中。然而，由于在我们的样本中简历。Assyl卡拉被记载为北高加索地区最古老的传统品种之一[72]，亚洲品种对栽培葡萄的遗传贡献也可能大大早于20世纪初俄罗斯的育种活动。它很可能是通过不同干扰素之间的基因流动自然发生的葡萄属在驯化过程中经过选择的物种。

非常小的差别发现之间H和米单倍型的性别连锁扩增子和少量的个体研究使得进一步阐明驯化途径变得困难;这一问题无疑值得进一步探讨，从而加强了Venuti等人的观点。[71新勘探和收集野生葡萄和其他葡萄属目前迫切需要驯化范围东部的物种。

的系统发育位置诉balansaeana，诉coignetiae和诉monticola我们网络中的葡萄藤，以及种间杂交中的分离图谱，都支持一个所有人共享的性位点葡萄属spp。7]、[17]，这表明异型性染色体的发育仍处于该分类单元进化的最初阶段。一般来说，性别决定区域的年龄可以根据发现它的分类群的年龄来估计[23]。如在亚属中葡萄属在美国，雌雄异株是祖传的情况，它的性别决定区域应该至少和它的分离一样古老葡萄属和Muscadinia亚属，被认为大约分化。18我的前[57]。其他雌雄异株种，性别区年龄大致相同，如硅宾latifolia［73]，Bryona dioica［74]或Rumexspp。75]，已经达到性染色体进化的最后阶段，要么是完全的异型性染色体，要么是包含数百个基因的非常大的区域。未来的工作是在更大的基因型样本中对性别位点进行完全测序葡萄属物种可以帮助理解为什么一些雌雄异株植物迅速发展出特定的性染色体，而另一些却没有。

在葡萄无性系种群。结果表明我们确认了一个158,8 kb的性别位点，位于标记VVIB23的下游，显示单倍型多样性，连锁不平衡和分化，通常对应于XY小的性别决定区域，XY雄性和XX雌性。这个小的决定性别的区域，跨越不到1%的染色体2，也存在于其他葡萄属这表明葡萄藤可能是研究多年生物种性染色体进化早期阶段的首选生物。

雌雄同体等位基因似乎来自野生葡萄的雄性等位基因，连续的重组事件允许多样性从X染色体区域输入到Y染色体区域，并减缓该区域向完全异型染色体的扩展。大单倍型网络模式与地中海东部地区的主要葡萄驯化区和地理上不同地区的次驯化事件相一致。最后，我们假设在性别区域，一些驯化的葡萄包含了来自不同亚洲品种的遗传贡献。我们的发现应该鼓励新的勘探和收集野生葡萄，包括其他葡萄属种，在驯化范围的东部。

支持本文结果的序列数据集可在Genbank数据库中获得，[Genbank: KJ575622-KJ57662;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)”。

作者感谢INRA Vassal葡萄藤收集的工作人员，以及Catherine Roux, Catherine br， Amandine Launay的实验室工作，以及Jean-Pierre Peros和Sandrine Maurice对手稿早期版本的有用建议。这项工作得到了法国科学研究中心ATIP项目“ARCHEO-VITIS”、法国科学研究中心项目“FRUCTIMEDHIS”以及法国科学研究中心/朗格多克-鲁西永地区(法国)到S. Picq的博士奖学金的支持。

从属关系

1. 法国蒙彼利埃奥古斯特·布鲁索内街163号，法国蒙彼利埃34090，法国生物多样性社会，法国植物研究所，法国生物与生物多样性研究中心(UMR 5059 CNRS/蒙彼利埃大学2/EPHE/INRAP

   桑德琳·皮克，莎拉·伊沃拉和让·弗朗茨·特拉尔

2. INRA, UMR 1334 AGAP，装备多样性，适应和Vigne，蒙彼利埃，F34060，法国

   Sylvain Santoni, Thierry Lacombe, Muriel Latreille, Audrey Weber, Morgane Ardisson, Philippe Chatelet, Patrice This和Roberto Bacilieri

3. 乔治亚农业大学园艺、葡萄栽培和酿酒研究所，迪戈米校区，David Aghmashenebeli Alley, 13公里。0159，第比利斯，格鲁吉亚

   大卫Maghradze

4. Dpto Biotecnología, Campus de Montegancedo, CBGP-INIA, Autovía M40, km38, Pozuelo de Alarcón，马德里，28223，西班牙

   罗莎Arroyo-Garcia

5. 法国蒙彼利埃34095，法国蒙彼利埃eug Bataillon广场，法国蒙彼利埃2大学

   Jean-Frederic坦拉尔风

相应的作者

对应到Sandrine Picq。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

RB和JFT监督了这项研究，并担任SP的博士工作协调员。SP、SI、DM、RB和JFT从自然种群中取样植物材料。SP、SI和TL进行植物表型分析。TL提供了来自Vassal收集的植物材料。TL, RB和SP解释了有关葡萄栽培历史的统计结果。SP, ML, MA和AW在SS的监督下进行DNA提取和测序，SP和RB进行统计计算。SP和RB在TL, PT, RAG, DM, PC和JFT的帮助和修改下完成了论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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