一种快速活细胞酶联免疫吸附测定法鉴定抗细胞表面抗原的抗体gydF4y2Ba衣藻reinhardtiigydF4y2Ba以及它在从自然环境中分离藻类与相关细胞壁成分的应用gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

细胞壁对大多数细菌、古菌、真菌、藻类和陆生植物来说是必不可少的，以提供形状、结构的完整性，并保护它们免受无数生物和非生物环境因素的影响。就真核藻类而言，人们对单个物种或物种之间细胞壁的组成、结构或组装机制以及这些差异如何使藻类能够生活在多种多样的环境中所知相对较少。在这篇文章中，我们描述了驼峰抗体片段(VHHs)和流线型ELISA分析作为一种强大的新工具，获取单特异性试剂，检测单个藻类细胞壁组分，并分离共享特定细胞表面组分的藻类。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

为了开发新的微藻生物勘探工具，以帮助寻找具有相似细胞壁和细胞表面成分的藻类的环境样本，我们生产了针对单细胞藻类的细胞表面成分的单链骆驼脂抗体，gydF4y2Ba衣藻reinhardtiigydF4y2Ba．我们克隆了可变区域域(VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaHs)从驼峰重链抗体和过量生产的这些单克隆样抗体的版本gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．使用这些VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaHs，我们已经开发了一种准确、简便、低成本的ELISA，使用活细胞作为抗原的来源，其原构象，需要不到90分钟的执行。该ELISA技术被证明与使用来自细胞裂解物的蛋白质的标准ELISA一样准确，通常需要>24小时才能完成。在克隆的V星人中gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba海关,VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11，亲和度最高(ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba< 1 nM)gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba细胞表面。采用活细胞酶联免疫吸附法(ELISA)检测海藻与gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba在自然环境的水样中。此外，mcherry标记了VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba用H B11结合荧光激活细胞分选(FACS)技术筛选了推测为野生近缘的菌株gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba和其他来自相同环境样本的藻菌。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

骆驼科V抗体gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH结构域提供了一种高度特异的工具，用于检测藻类的单个细胞壁成分，并允许从不同的生态系统中选择共享特定细胞表面分子的藻类。gydF4y2Ba

陆生植物和藻类的细胞壁为抵御各种环境因素和胁迫提供物理支持和保护。虽然我们对植物细胞壁了解很多[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，我们对藻类细胞壁的了解还比较初级[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．例如，虽然我们知道藻类和陆生植物的细胞壁可以含有丰富的富含羟脯氨酸的糖蛋白，例如，[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，对藻类细胞壁的组成和结构以及藻类物种内部和物种之间细胞壁组成的多样性的研究远远落后于陆生植物。因此，目前还不可能对陆生植物和藻类(以及不同种类的藻类)之间的细胞壁组成、合成和沉积进行详细的比较。为了帮助解决这一缺陷，我们寻求开发一种技术，不仅可以在一种特定藻类中识别细胞表面特异性分子，还可以在各种环境位置的近缘藻类物种中识别分子。针对这些细胞壁蛋白、糖蛋白和其他成分产生的单克隆抗体在最近被用作检测和鉴定植物和藻类细胞壁成分的有力工具[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，并有潜力成为分离具有共同细胞表面成分的藻类的极具价值的工具。另一种提供与传统单克隆抗体相同的单分子特异性的替代方法包括使用驼峰抗体[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba由单个重链分子组成，作为高特异性、高亲和力的抗体广泛应用于各种应用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba] - [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．编码单域抗原结合片段的基因(VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH)骆驼脂重链抗体(我们通常称之为VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaHs或者，或者，单域抗体(sdAbs)或纳米体]可以被克隆到噬菌体表达载体上，使噬菌体展示文库的克隆被“筛选”为VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaHs对抗特定靶抗原[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．(初始平移时可同时筛选多个目标)。对单个克隆基因进行修饰，产生带标记的VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba在酶联免疫吸附试验中容易检测到的H，以测量它们对目标抗原的亲和力，或例如，在细胞表面表达目标抗原的藻类物种的选择中。作为这个方法的最初概念证明，我们选择利用gydF4y2Ba衣藻reinhardtiigydF4y2Ba(以下简称衣藻)是迄今为止细胞壁研究最多的藻类[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了获得羊驼抗衣藻抗原的抗体，我们用衣藻全细胞提取物免疫羊驼，制备了编码可变结构域的噬菌体展示文库(VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH)单个单域抗体的区域，每个区域对单个藻细胞抗原上的特定表位具有特定的亲和性[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．从噬菌体显示库包含VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaHs对衣藻蛋白和其他免疫原性分子的培养，筛选了一些噬菌体克隆，它们能很好地结合在活衣藻细胞的外表面。随后VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba将每个噬菌体克隆的H基因亚克隆到一个gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba超表达向量。VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba将H编码序列克隆到E-Tag肽段编码区域的上游，便于对E-Tag /V进行检测gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH嵌合蛋白。对过度生产的单个电子标记纳米体的表征gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba使用标准的酶联免疫吸附试验(elisa)表明，当这些抗原与聚苯乙烯微量滴定板孔壁结合时，这些克隆与衣藻细胞裂解物中的蛋白质和其他分子具有中等到高的亲和力[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

因为每个标准的ELISA检测都需要几个小时的时间[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，我们寻求一种同样准确，但更快，更方便和经济的方法来确定与VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaHs与衣藻细胞表面分子结合。考虑到对衣藻细胞表面特异性抗体的初步选择是用活衣藻细胞进行的，我们认为有可能开发一种改进的ELISA程序，用活细胞提供检测所需的抗原。取代了e标记的sdAbs与蛋白质和其他固定在聚苯乙烯表面的分子结合以选择高亲和力的VgydF4y2Ba_HgydF4y2Bah，我们假设我们可以在含有e标记V的微隐管中使用一定数量的衣藻细胞(提供多余的细胞表面抗原)gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH抗体，然后通过简单离心和细胞悬浮液的多次洗涤步骤除去不粘附的纳米体。gydF4y2Ba

以标准形式[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba] - [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]， elisa已被证明是一种可靠和准确的方法，用于测量特定抗原的抗体亲和力，并提供与医学研究和实践、农业、法医和工业相关的样本中抗原浓度的估计。标准ELISA方案的一个重要限制是将目标抗原与固体基质(通常是聚苯乙烯微量滴定板孔壁)结合所需的时间和从微量滴定板孔中去除未结合抗体所需的多次洗涤步骤。在本研究中，标准的ELISA方案用一组微隐管重新制备，每组微隐管中包含一定数量的衣藻细胞，并接种逐渐增加数量的e标记VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba海关。目的是在用于标准ELISA测定的微量滴定板中模拟相应的抗原饱和孔。随后的步骤包括与辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗体孵育、添加非显色底物和HRP反应显色产物的分光光度分析，这些步骤与标准ELISA程序中的相应步骤基本相同。gydF4y2Ba

检索过去的文献发现了两个早期的用于动物细胞的活细胞ELISA分析的发展实例。第一次(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]涉及到使用各种类型的活的人类癌症和非癌性细胞来筛选和描述单克隆抗体，特异性抗原存在于癌细胞上，但在相同组织类型的非癌性细胞表面没有。第二个(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]还利用活细胞酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了不同类型癌细胞的特异性抗原——在本例中是牛淋巴肉瘤细胞。Lourenço和Roque-Barreira综述了使用哺乳动物细胞的活细胞ELISA的最新例子[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．在全细胞ELISA分析中使用各种固定过程杀死的细胞的例子有很多，但是，正如广泛认可的那样，这些方法存在这样一个事实:所涉及的固定过程经常改变结构，因此，研究的目标表面分子的抗原性[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．我们开发藻细胞活细胞ELISA分析的目标是为藻类和微生物群落提供一个强大而便捷的新工具，用于检测和大致量化具有靶向细胞表面抗原的微生物种群。gydF4y2Ba

在此，我们成功地开发了一种快速、小规模、活细胞的藻类酶联免疫吸附测定方法，证明了其与标准酶联免疫吸附测定方法的等效性，并利用它来测定各种VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaHs对衣藻细胞表面的成分，并显示出高亲和力的VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11抗体特异性结合衣藻和其他密切相关的叶绿素藻类。我们还提供了V结合特异性的可视化gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11对衣藻细胞表面产生和利用VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba在荧光显微镜下，H B11绿色或红色的荧光蛋白鲜艳地装饰着活的衣藻细胞的外部，而不是不相关的藻类的表面。最后，我们采用活细胞ELISA技术，用荧光标记的VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11抗体证明环境水样中存在衣藻的野生亲缘叶绿素，并通过荧光激活细胞分选分离出衣藻的野生亲缘个体gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba在那些水样中。gydF4y2Ba

衣藻活细胞ELISA分析候选VHH纳米体gydF4y2Ba

每个候选衣藻细胞表面特异性sdAb抗体通过克隆VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH编码区转入硫氧还蛋白A和6 × His(用于重组蛋白纯化)编码序列下游的pET32b过表达载体和E-tag表位编码区上游(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)，后者允许承认VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH通过与马萝卜过氧化物酶(HRP)结合的e -tag特异性抗体，其相对酶活性作为在给定的试验中结合到目标抗原的sdAbs的数量的衡量。每个TrxA/6 × His/VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH/E-tag嵌合蛋白对衣藻细胞表面抗原(过量)的亲和性进行了快速、小规模、活细胞ELISA程序，详细描述在方法中。这种检测速度的关键在于，添加的抗体的结合需要不到30分钟的时间达到平衡(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，两个清洗步骤中的每一个都是通过快速连续的微漂离心/细胞重悬步骤来完成，总共只需要4分钟。随后与e -tag特异性和HRP结合的二抗孵育，通过两个离心/细胞重悬步骤去除未结合的二抗体，与非显色3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB)孵育，并在450 nm处测量黄色反应产物的吸光度，这些都需要30-40分钟。根据多次实验的经验，这导致总检测时间小于1.5小时。标准elisa利用抗原在微量滴定板的聚苯乙烯壁上过夜吸附，并进行大约5至8小时的额外操作。gydF4y2Ba

VHHs与衣藻细胞表面分子的亲和力分析gydF4y2Ba

三个细胞表面特异性单链抗体，VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11, VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH H10和VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba用衣藻活细胞酶联免疫吸附法(ELISA)分析H C3。两个nanobodies (VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11和VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH H10)显示ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba水平10 nM或更少，VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11的EC亲和力最高gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba< 1 nMgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH C3, EC明显增高gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值，只比sdAb提出时得到的值略低gydF4y2Ba肉毒梭状芽胞杆菌gydF4y2BaBoNT/B全毒素- VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH在这些研究中作为阴性对照(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．重要的是，使用衣藻活细胞ELISA的实验结果产生了几乎相同的ECgydF4y2Ba_50gydF4y2BaV的值gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11, VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH H10和VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH C3和VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH BoNT/B(即，分别为0.5 nM, 10 nM, 50 nM和1000 nM)，在我们最初的研究中使用标准ELISA分析得到[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

VHH B11对叶绿素藻类的特异性gydF4y2Ba

来确定VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11可以识别所有藻类，或仅限于叶绿素藻类，我们对两种异孔藻(又名Stramenopiles)进行了活细胞ELISA分析，gydF4y2BaNannochloropsis大洋洲gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba这种pseudonanagydF4y2Ba．当在活细胞ELISA中取代衣藻时，这些藻类都没有表现出高于背景水平的亲和力(即VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH提升装置(图/ B)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．同样,VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba在模拟实验中，H H10只对衣藻有亲和力(数据未显示)。有趣的是，我们重复了对叶绿素藻的活细胞elisagydF4y2BaCoccomyxa subellipsoideagydF4y2Ba并没有观察到明显的亲和力。基因组的大小gydF4y2Bac . subellipsoideagydF4y2Ba它们生活在寒冷的极地地区，与生活在温带气候的近亲叶绿素相比，它们的体型大大缩小了[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．叶绿素基因组中丢失的一个关键基因家族是编码糖基磷脂酰肌醇转氨酶的家族，该家族将细胞表面蛋白质附着在质膜上[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．无论是这种基因的缺失还是其他基因的缺失都可能导致V的缺失gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11与这一种吊藻细胞壁的相互作用将需要等待未来确定的抗原的身份，其中VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11绑定。然而，能力的VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11抗体用于检测来自不同环境、关系密切的绿藻细胞壁之间的差异，这表明驼峰抗体和单克隆抗体有助于确定不同藻类细胞壁组成的具体差异，并确定这些差异如何促进生态适应。gydF4y2Ba

关于V的特异性gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11用于叶绿素藻类，值得注意的是，在下面描述的研究中，对来自自然环境的几个水样本进行了测试，一些包含大量和各种藻类的样本使用VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11或VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH H10 -再次表明这两种sdAbs对衣藻或衣藻相关藻类的细胞表面有很强的选择性，而对远亲藻类没有很强的选择性。gydF4y2Ba

饱和VHH B11结合增加衣藻细胞密度gydF4y2Ba

在最初的实验中，为了确保在我们的活细胞elisa中存在过量的细胞表面抗原，需要设定浓度的VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11 (20 nM)在每一组微隐管中加入逐渐增加浓度的活衣藻细胞(即从2.5 × 10gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba细胞/0.5 mL ~ 2.5 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba细胞/ 0.5毫升)。本实验的结果表明，略小于10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/0.5 mL即可引起所有VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11分子与细胞表面抗原结合(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．因此，对于后续的活细胞检测，衣藻细胞浓度约为10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba取细胞/0.5 mL。gydF4y2Ba

用于环境样品中藻类检测的活细胞ELISA方法的改进gydF4y2Ba

通过对新的活细胞ELISA方案的改进，我们还开发了一种快速、小规模的方法，用于粗略估计衣原体相关细胞(即VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B1结合)的藻类样本从自然环境。在这些试验中，藻类样品通过离心浓缩，并在VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11和试剂的细胞密度与衣藻活细胞ELISA程序中使用的相同。两次洗涤后，细胞按照规定的方案(见上文的描述和方法)与HRP偶联的E-tag抗血清孵育，并测定酶活性。使用活细胞ELISA分析10个独立的环境水样，可以快速鉴定出其中3个样品含有数量可观的藻类，能够结合VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

GFP/mCherry VHH B11嵌合体及其在莱茵蒂相关单细胞藻胶藻鉴定中的应用gydF4y2Ba

对环境样本中藻类的进一步分析利用了我们早先描述的[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba绿色荧光蛋白(GFP)的编码区与V的5 '端偶联gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11编码区gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)产生GFP/VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11妄想。这种嵌合体可以用共聚焦显微镜来证明抗体与衣藻细胞表面的特异性结合gydF4y2Ba7gydF4y2BaA).用GFP V孵育衣藻gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B5抗肉毒毒素纳米体(阴性对照)未产生荧光染色细胞(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaD),孵化的gydF4y2Ba海洋纳米绿藻，球孢菌，gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba这种pseudonanagydF4y2BaGFP / VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11没有产生GFP信号(数据未显示)。gydF4y2Ba

搜索gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba或在上述讨论的水样中，我们将藻类与mCherry/V混合gydF4y2Ba_HgydF4y2Bahb11嵌合体前共聚焦显微镜检查。而7个样本未能产生能够结合mCherry/V的细胞gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11纳米体，三个水样显示最高的ELISA值(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba: #5， #6和#9)含有一个能与mCherry/V结合的藻细胞亚群gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11。与mCherry/V的结合相比gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba细胞壁(图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)，两种藻类结合的程度几乎相等(图gydF4y2Ba9gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)，而第三个界限明显较低(图gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

作为mCherry/V实用程序的进一步演示gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11纳米体，我们将环境水样9的细胞置于mCherry/V孵育后进行荧光激活细胞分选gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B1。通过这样做，我们能够捕获单个细胞(例如，细胞隔离#9-2i;数字gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)与mcherry标记的纳米体结合，在固体培养基上培养，准备根据其18S核糖体RNA基因的DNA测序进行分类分类(如下所述)。gydF4y2Ba

与VHH B11 sdAb反应的叶绿素亲缘物种鉴定gydF4y2Ba

发现了三种能与V发生强烈反应的菌株gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba在环境水样中的H B11，我们通过对其核糖体内转录间隔区(ITS1和ITS2)进行测序来识别藻类[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．首先，为了进一步确保三种环境分离株都是无菌的，我们对单个克隆进行了多轮抗生素洗涤、稀释和在三磷酸(TP)平板上电镀。在ITS分析之前，将每个分离株的三个或更多去污克隆合并在一起。gydF4y2Ba

通过对ITS1和ITS2区域的扩增测序和系统发育分析，分离出2i个具有多个系统发育簇的序列gydF4y2BaDesmodesmusgydF4y2Ba它的ITS2序列显示它在那里gydF4y2Bad . pleiomorphusgydF4y2Ba(图gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．有趣的是，这是为数不多的单细胞双鞭毛物种之一gydF4y2Bad . pleiomorphusgydF4y2Ba这已经被描述[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．同样，菌株2 h系统发育集群与gydF4y2Ba栅藻obliquusgydF4y2Ba另一种分类上独特的单细胞双鞭毛藻类[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．有趣的是,gydF4y2Ba栅藻gydF4y2Ba属最初在形态上的特征为多细胞片状细胞[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．然而，随着分子系统发育技术的改进，许多单细胞双鞭毛细胞以前放在其他组已经转移到gydF4y2Ba栅藻gydF4y2Ba和它的gydF4y2BaDesmodesmusgydF4y2Ba子群(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

菌株2f是唯一的，因为它与一组环境分离株被发现与苔藓植物密切相关(图gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．其演化支的成员包括gydF4y2BaCoelastrellagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba栅藻gydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]，以及几种被错误识别的单细胞双鞭毛藻(被认为是gydF4y2Bac . moewussigydF4y2Ba虽然这一组与衣藻相去甚远(图gydF4y2Ba13gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1和S2)。因为它最近的亲戚已经被确认为gydF4y2BaCoelastreallagydF4y2Ba在美国，我们目前将这种菌株归类为此类。有趣的是，对这三种新型环境分离株的系统发育进行广泛的研究表明，VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11广泛结合细胞壁蛋白质发现在单细胞叶绿素藻类(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1和S2)。这证明了该抗体作为识别新单细胞藻类的工具的广泛用途，但也表明了远亲单细胞叶绿素藻类细胞壁的广泛保护。gydF4y2Ba

用于构建系统发育图的18S核糖体RNA基因ITS1和ITS2区域的DNA序列已保存在GenBank中，登录号列在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2BaS1:表。gydF4y2Ba

未来的研究将集中在V的使用上gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11纳米体有助于衣藻和本文描述的三种不同藻类菌株的目标抗原的纯化和分子表征。长期目标将是使用类似的方法分离和表征额外的细胞壁/细胞表面成分，这样不仅可以比较相关藻类之间的细胞壁组成，而且可以比较陆生植物的细胞壁和它们进化来源的藻类之间的细胞壁组成。gydF4y2Ba

活细胞ELISA方法的一个显著优势是它允许V相互作用gydF4y2Ba_HgydF4y2BaHs与细胞表面抗原的自然状态。与抗原吸附到微量滴定板孔聚苯乙烯表面的标准ELISA程序相比，这是一个显著的改进，这一步骤通常会导致蛋白质变性。文献检索显示，以前没有使用标准elisa或活细胞elisa来识别具有共享细胞壁成分的藻类。因此，本研究为研究界提供了完成这项任务的一种简便的新方法。目前所述的方法有明显的局限性。例如，并非所有细胞表面成分都具有足够的抗原性，在免疫动物中引起强烈的抗体反应，即使获得了紧密结合的抗体，也可能存在目标抗原产生量很低的藻类，或可能产生的目标抗原被埋没或掩盖在细胞壁内。gydF4y2Ba

实验结果证明了V的能力gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11和mcherry标记的VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11允许检测，分离和鉴定来自不同生态系统的藻细胞，与衣藻共享细胞壁和细胞表面成分。这些结果为未来的研究指明了方向，目的是发现更多的叶绿素藻共享的细胞壁/细胞表面成分，并对这些分子进行详细的生化、分子和遗传学研究。更一般地，使用这里描述的活细胞ELISA分析和高度特异性抗体的生产，如VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba本研究中使用的藻类有可能极大地促进未来在自然环境中寻找世界各地许多实验室感兴趣的特定藻类和其他微生物物种。gydF4y2Ba

化学药品和生物制品gydF4y2Ba

E-Tag Antibody (HRP偶联)购自Bethyl Laboratories Inc.(目录编号:a190 - 132 p)。TMB(3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(用于ELISA的液体底物体系)由Sigma公司提供(目录号:T0440)。使用Bio-Rad蛋白测定法测定蛋白质浓度(目录编号500-0005)。gydF4y2Ba

环境水样制备gydF4y2Ba

从霍姆斯湖地区、兰开斯特县和林肯的其他公共和私人池塘收集的环境水样各为10毫升。收集的细胞在TP培养基(缺乏乙酸的TAP培养基)中，在3% CO的光照下保存gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba转速100转/分。ELISA分析和荧光共聚焦显微镜检查如下所示。单海藻细胞结合GFP-VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba用BD流式细胞仪分离H B11。gydF4y2Ba

VHH表达向量gydF4y2Ba

三面结合VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH cDNA克隆[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba将JSC噬菌体载体(GenBank登录号:EU109715)中的NotI/AscI基因进行剪切，并将DNA片段迁移到预先设计的含有E-Tag和NotI/AscI克隆位点的pET32b主干中。由此产生的VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH蛋白产物包含一个n端硫氧还蛋白(Trx a)融合伙伴、一个内部6 × His标签和一个c端e -标签。利用这些表达载体作为骨干，将一个GFP或mCherry编码区直接融合到V的n端gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH编码区允许产生荧光版本的VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaHs用于共聚焦显微镜分析。为此，在V基因的BglII-NotI切割位点插入一个GFP编码区(编码GFP荧光蛋白单体基因的合成结构，Accession Number AAC53663)和一个mCherry编码区(编码mCherry荧光蛋白单体基因的合成结构，Accession Number AY678264)gydF4y2Ba_HgydF4y2BaH表达式向量，这样得到VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH荧光蛋白产物包含一个n端硫氧还蛋白(Trx a)融合伙伴、一个内部6 × His标签、一个GFP或一个mCherry荧光蛋白和一个c端e标签。gydF4y2Ba

VHH融合蛋白的表达和纯化gydF4y2Ba

大肠杆菌gydF4y2Ba应变BL21(DE3)轴承VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba将pET32b的H融合基因在37°C的LB培养基中摇晃培养至ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba0.6。重组蛋白用1 mM IPTG在20℃下诱导表达20小时。取细菌细胞，5000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟后，在冰水裂解缓冲液中重悬[50 mM磷酸钠(pH 8.0)， 300 mM NaCl, 10 mM咪唑，1 mM PMSF，蛋白酶抑制剂鸡尾酒与细菌细胞提取物(Sigma, P8465)]。将重新悬浮的细胞用溶菌酶(浓度为1 mg/mL)处理半小时，然后用VCX 600型超声与材料超声仪(sonic & Materials Inc, Danbury, CT, USA)在4℃超声处理，振幅为30%，每次9.9 s, 9.9 s静置15 min。超声后的细胞裂解液在20,000 ×离心下澄清gydF4y2BaggydF4y2Ba．上清液被装入镍容器中gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-NTA金属亲和树脂，用含有50 mM磷酸钠(pH 8.0)、300 mM NaCl和20 mM咪唑的缓冲液洗涤。用含50 mM磷酸钠(pH 8.0)、120 mM NaCl和250 mM咪唑的洗脱缓冲液释放结合蛋白。将洗脱后的蛋白在50 mM Tris (pH 7.5)下透析。使用Bradford试剂(Bio-Rad, Hercules, CA)测定最终蛋白浓度。V的纯洁gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba通过超载考马斯染色，SDS-PAGE检测H融合蛋白。只有刚准备好的VgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba采用H融合蛋白进行亲和力测定。gydF4y2Ba

Live-cell VHH ELISAgydF4y2Ba

对于live-cell VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH elisa试剂盒，100 μL agydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba(CC124)培养或其他藻类细胞的密度约为10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba将细胞/mL转入1.5 mL离心管中，6000 × g离心2 min，置于含1%干乳的500 μL TAP培养基中重悬(过滤灭菌)。在光照下缓慢摇动细胞5分钟后加入VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH在期望的最终浓度。作为对照，用活衣藻细胞进行类似的孵育，在VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH提出反对gydF4y2Ba肉毒梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba(肉毒毒素VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B5;9). VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH蛋白与细胞在光照下孵育25 min，离心收集细胞，在700 μL TAP培养基中洗涤两次，转至500 μL含相当于0.025 μL未稀释的E-Tag抗体的TAP培养基中。按照上述方法，将细胞置于E-Tag抗体的光照下孵育25 min。离心后，用TAP培养基洗两次，100 μL TMB重悬，混匀。5 min后加入100 μL 1n HCI终止反应。1 N HCI与TMB各混合100 μL作为缓冲液对照。13000 ×离心成球gydF4y2BaggydF4y2Ba在450nm波长下测定上清液吸光度1 min。gydF4y2Ba

荧光共焦显微镜gydF4y2Ba

用于分析GFP或mcherry标记的纳米体与细胞表面的结合gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba和其他藻类共聚焦显微镜，0.5 mL细胞培养物以饱和密度，5000 ×离心收集细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba在1.5 mL离心管中静置2分钟。将细胞微球重新悬浮在含1%脱脂牛奶的0.5 mL TAP培养基中，然后在光照下摇15分钟。用TAP培养基洗涤细胞两次，在含1%脱脂干奶的0.5 mL TAP培养基中重新悬浮，然后加入嵌合mCherry或GFP VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B11纳米体到期望的最终浓度，通常为30 nM。荧光肉毒毒素VgydF4y2Ba_HgydF4y2BaH B5为阴性对照。在光照下摇动30分钟后，用TAP培养基洗涤细胞两次。然后使用尼康ECLIPSE 90i系统在1000倍放大倍率下共聚焦荧光显微镜检查细胞。mCherry荧光的激发波长为561.5 nm，发射波长为570-620 nm, GFP荧光的激发波长为448 nm，发射波长为500-550 nm，叶绿素自荧光的激发波长为641 nm，发射波长为662-737 nm，以确保不同荧光通道之间不发生交叉。gydF4y2Ba

环境分离株的分类鉴定gydF4y2Ba

环境样品最初保存为异种保存，但为了进行分类分类，用含800 μg/mL卡苄西林、5 μg/mL环丙沙星、50 μg/mL氯霉素、5 μg/mL甲氧苄氨嘧啶和0.1% twen -20的无菌TP培养基交替洗涤10轮，然后在100离心gydF4y2BaggydF4y2Ba为2分钟。离心后，20 μE光照5分钟，取出含藻上清，1000下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟后丢弃上清，收集成颗粒状的藻细胞。海藻细胞经洗涤和差速离心后，连续稀释后镀于TP琼脂平板上。取单菌落进入新鲜培养基，用显微镜和添加5%酵母抽提物的TAP琼脂复制板检测是否存在污染微生物。随机选取3个独立无性系进行分类鉴定。gydF4y2Ba

用植物特异性自旋柱DNA制备试剂盒(Omega Biotek plant EZNA)从每个独立克隆中制备基因组DNA。采用Phusion DNA聚合酶对ITS1 [GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC(正向)和GCTGCGTTCTTCAGCGAT(反向)]和ITS2 [gggatccatgcttaagttcagcgggt(正向)和GCATCGATGAAGAACGCAGC(反向)]进行两次独立PCR扩增ITS1和ITS2核糖体间隔区。收集预期大小的PCR产物并进行亚克隆(Thermo pJECT)，对三个独立克隆进行测序。对于所有三个菌株，每个独立的藻类和PCR产物克隆产生相同的序列。将ITS1和ITS2序列用BLAST搜索NCBI数据库中密切相关的序列。这些序列由肌肉排列[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．系统发育采用HKY85替代模型，使用PhyML中的最大似然[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，并提供100轮引导支持。gydF4y2Ba

作者感谢博士。Jim Van Etten提供环境水样，Christian Elowsky提供共聚焦显微镜。这项工作的部分资金来自NSF(授予DPW的授予号为MCB-0952533，授予DPW和GAO的授予号为EPSCoR-1004094)和DOE(授予DPW和GAO的授予号为DE-EE0001052，授予DOE CAB-COMM的授予号为DE-EE0003373)。该研究的DNA序列已被存入GenBank。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 内布拉斯加大学林肯分校生物化学系，1901年，美国东北林肯市，68588gydF4y2Ba

   蒋文智和Donald P WeeksgydF4y2Ba

2. 堪萨斯州立大学分子、细胞和发育生物学学部，美国曼哈顿，66506gydF4y2Ba

   萨拉·科西&布拉德利JSC奥尔森gydF4y2Ba

3. 美国约翰霍普金斯大学化学与生物分子工程系，巴尔的摩北查尔斯街3400号，马里兰州，21218gydF4y2Ba

   Julian N Rosenberg & George A OylergydF4y2Ba

4. 突触研究有限责任公司，1448南滚动路，马里兰州巴尔的摩，21227，美国gydF4y2Ba

   Julian N Rosenberg & George A OylergydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba唐纳德·P周gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

WJ、JR、BO、GO和DW构思和设计研究，JW、SO和JR进行实验，JW、JR、BO、GO和DW分析和解释数据，WJ、JR、BO、GO和DW撰写稿件。所有作者阅读并批准最终稿。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可协议授权，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和源代码，提供知识共享许可协议的链接，并说明是否进行了修改。gydF4y2Ba

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