丝氨酸脱羧酶的不同功能进化:鉴定两种使用疏水氨基酸作为底物的新型乙醛合酶

背景

II型吡哆醛5′-磷酸脱羧酶是一类重要的系统发育多样的氨基酸代谢酶。在植物体内，这类酶主要有芳香氨基酸脱羧酶、谷氨酸脱羧酶和丝氨酸脱羧酶。植物芳香氨基酸脱羧酶的进一步进化分化导致了具有不同底物特异性和酶活性的亚类。尽管具有相同的同源性，但在谷氨酸脱羧酶或丝氨酸脱羧酶(SDC)中没有这种进化差异。

结果

两种先前表征的丝氨酸脱羧酶样(sdc样)酶的比较分析表明，尽管它们的一级序列高度保守，但它们具有不同的底物特异性。这些同源sdc样蛋白的交替底物偏好表明sdc样蛋白可能发生了功能分化。为了鉴定额外的sdc样功能分化，重组表达和表征了两个未表征的sdc样酶。

结论

对两种丝氨酸脱羧酶样重组蛋白的广泛生化分析导致了一个有趣的发现;这两种蛋白质都催化从疏水氨基酸底物生成乙醛衍生物。具体地说,Medicago truncatula[GenBank: XP_003592128]中投arietinum[GenBank: XP_004496485]催化苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和色氨酸的脱羧和氧化脱胺生成相应的乙醛。这些蛋白的混杂醛合成酶活性分别从蛋氨酸、亮氨酸和色氨酸中产生4-(甲基硫代)丁醛、3-甲基丁醛(异戊醛)和吲哚-3-乙醛。的比较生化分析Medicago truncatula和中投arietinum针对两种先前表征的sdc样酶的酶进一步强调了这些新型醛合酶不同寻常的底物特异性和活性。由于对苯丙氨酸的强烈底物偏好，这两种酶很可能在体内都起苯乙醛合成的作用。然而，由于它们显著的序列差异和不寻常的底物混杂性，这些酶在功能和进化上与典型的苯乙醛合成酶不同。这项工作进一步阐述了植物II型PLP脱羧酶的功能复杂性及其在次生代谢物生物合成中的作用。

丝氨酸脱羧酶(SDC)的生化特性首次建立于拟南芥(AtSDC) [1]．有人提出，该酶通过产生乙醇胺(胆碱生产的主要中间体)在胆碱合成中起主要作用[2]、[3.]．乙醇胺也是磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)的前体;PE和PC都是真核生物膜中的主要磷脂[4]-[6]．这一发展战略的重要性答:芥通过对AtSDC缺陷突变体的研究，证明了该突变体的发育。一个T-DNA插入答:芥SDC基因表现出发育缺陷，包括叶片坏死、多花序和花不育[7]．

AtSDC酶的功能表征为基于同源蛋白的序列同源性预测相似功能提供了模板，而无需进行广泛的生化验证[1]、[7]．事实上，在GenBank的搜索中发现了许多未表征的植物SDC样序列，这些序列被注释为SDC蛋白或SDC样蛋白。此外，我们注意到许多sdc样蛋白也被注释为组氨酸脱羧酶(HDC)样蛋白。通过文献检索发现，植物中的HDC注释来自于一个截断的番茄同源物的克隆，该同源物与细菌的HDC序列高度相似[8]．然而，一项对两种植物hdc样酶的研究表明，它们对丝氨酸具有严格的脱羧活性，而对组氨酸没有可测量的活性[1]．基于这些酶的功能研究，作者认为所有标记为HDC的植物序列都可能具有sdc的功能[1]．在我们的数据库搜索中，我们还发现了一些个人茄属植物lycopersicumsdc样序列被标记为芳香氨基酸脱羧酶(AAAD)。其中一个sdc样AAADs序列(SlAAAD)的生化分析显示对酪氨酸和苯丙氨酸具有显著的脱羧活性[9]．尽管具有芳香氨基酸脱羧活性，但这些番茄酶与其他植物aaad的同源性有限(同源性为10-15%)[10]-[13]．相反，这些番茄aaad与所鉴定的植物atsdc的同源性显著增加(57%的同源性)[1]．

由于功能不同的SlAAAD和AtSDC酶之间广泛的序列相同，我们推测这些酶可能在底物特异性上有一些重叠。为了明确这两个sdc样序列的生化活性，我们评估了AtSDC酶对芳香氨基酸的活性和SlAAAD酶对丝氨酸的活性。此外，我们表达和表征了两个以前未研究的sdc样酶Medicago truncatula和中投arietinum以确定SlAAAD和AtSDC底物选择性的重叠。我们对这些未表征的sdc样蛋白的研究有了一个有趣的发现。我们的数据清楚地表明m . truncatula和c . arietinum蛋白质作为乙醛合成酶的功能与底物偏好的大体积疏水氨基酸。在本报告中，我们提供了描述这些重组酶的底物特异性、催化反应和动力学性质的数据。这项新活动的研究m . truncatula和c . arietinum乙醛合成酶为更好地理解植物II型吡哆醛5 ' -磷酸脱羧酶的功能进化提供了见解。

AtSDC和SlAAAD活性的定性分析

最初，我们对sdc样酶的兴趣是由一篇不寻常的番茄sds样SlAAADs的报道引起的[9]．尽管sdc和aaad被认为具有共同的进化祖先，但这两个群体之间发生了显著的进化分歧，导致有限的序列保守。虽然每个组内的单个酶(aaad和sdc)保持较高的序列同一性(通常大于50%)，但这些相关组之间的酶保持显著降低的同一性(通常低于15%)。因此，脱羧SlAAADs的芳香氨基酸和脱羧AtSDC的丝氨酸之间的高序列一致性(57%)是非常罕见的。事实上，这些酶广泛共享的特性使我们相信在底物特异性上可能存在重叠。SlAAAD的原始表征没有测试丝氨酸作为底物，而AtSDC的原始报告没有检查苯丙氨酸是否作为潜在的底物[1]、[9]．为了研究它们的真实底物谱，我们对AtSDC和SlAAAD进行了表达、纯化和脱羧活性测定。对AtSDCs基材偏好的分析证实了原始报告的结果[1]．AtSDC仅对丝氨酸有活性，对组氨酸、多巴、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或谷氨酸没有可测量的脱羧作用(附加文件)1:图S1)。同样的SlAAAD脱羧实验显示对酪氨酸、多巴、苯丙氨酸和色氨酸有活性，对丝氨酸、组氨酸或谷氨酸没有活性(附加文件)1:图S2)。这些结果证实了这些高度同源的酶的不同功能。

MtAAS的表征

为了评估能够区分这些功能不同的酶的生物物理特性，我们克隆、表达并纯化了一种sdc样酶Medicago truncatula(MtAAS)和一种sdc样酶中投arietinum(CaAAS)。MtAAS和CaAAS最初使用已知的II族氨基酸脱羧酶底物(丝氨酸、组氨酸、谷氨酸、酪氨酸、多巴、色氨酸和5-羟色氨酸)，通过高效液相色谱电化学检测试验(HPLC-EC)进行检测[10]、[13]、[14]．尽管证明没有可测量的胺产物形成的任何测试底物，在色氨酸反应混合物的每一种酶检测到一个宽峰。随着孵育时间的增加，峰值尺寸成比例地增加(图2)1A-C)，表明宽峰对应于反应产物。重组酶和色氨酸反应混合物中的产物峰似乎是芳香乙醛，基于其与先前研究的芳香乙醛相似的色谱行为[13]、[15]、[16]．这个类乙醛峰提示MtAAS和CaAAS酶可能是芳香醛合酶而不是SDC酶。醛可以被硼氢化物还原成相应的醇[13]、[15]．重组蛋白与色氨酸反应混合物用NaBH处理₄在HPLC-ED分析之前，宽产品峰(图2)1a - c)转换为尖峰(图1D-F)。在硼氢化物处理的反应混合物中检测到的尖峰，在相同的HPLC-EC分析条件下，与真正的吲哚-3-乙醇具有相同的保留时间，在不同的流动相条件下，与HPLC-EC分析的标准品共洗脱(图2)1G)。该产物与真正的色胺的色谱行为的比较表明，这些酶的功能是一种新的醛合酶，而不是脱羧酶1:图S3)。随后使用气相色谱-质谱法(GCMS)进一步确定这些酶的活性。苯丙氨酸酶产物的相同洗脱时间和破碎模式与真正的苯乙醛标准表明MtAAS和CaAASs在乙醛生产中的作用(图2)2）.

为了研究这些新型醛合酶(AASs)的底物特异性，对20种蛋白质原氨基酸(外加5-羟色氨酸和多巴)进行了过氧化测定。酶反应混合物然后通过使用皮尔斯®定量过氧化物测定试剂盒进行测定。AASs催化了一个相当复杂的芳香氨基酸脱羧-氧化脱胺过程，导致生成芳香乙醛，CO₂而不是AAAD衍生的芳基烷基胺和一氧化碳₂(图3.) [13]、[15]、[17]、[18]．因此，过氧化氢的产生可以作为进一步区分AAS和AAAD酶活性的标志。MtAAS和CaAAS的结果表明，对大多数测试底物的乙醛合成酶活性非常低，而对几种大体积、非极性和疏水氨基酸(苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和色氨酸)的乙醛合成酶活性显著。

MtAAS和CaAAS的动力学性质

接下来，展示显著比活性的氨基酸被用于MtAAS和CaAAS酶的完整动力学研究。动力学表征的底物包括苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和色氨酸。结果表明，上述氨基酸作为底物功能良好(表2)1)(附加文件1:图S4-S5)。所有活性底物都具有相似的生物物理特性(体积大、非极性和疏水)。这种底物混杂在典型的AASs中是非典型的[15]、[17]、[18]．

底物混杂性比较

MtAAS和CaAAS的动力学表征结果阐明了这两种酶不同寻常的活性和底物特异性。为了强调这些AASs的混杂性，我们测试了它们对同源AtSDC和SlAAAD酶的首选底物。文献检索和我们自己的分析表明，AtSDC和SlAAAD酶都保持严格的底物特异性[1]、[9]．重组表征的AtSDCs仅对丝氨酸有活性，而重组表征的SlAAAD催化芳香底物(苯丙氨酸、酪氨酸、多巴和色氨酸)的脱羧。利用MtAASs首选底物(苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和色氨酸)对SlAAAD和AtSDC进行HPLC-EC检测，进一步验证了之前报道的AtSDC和SlAAAD活性。结果表明，AtSDC对MtAAS和CaAAS底物缺乏可测量的活性，而SlAAAD对亮氨酸和蛋氨酸缺乏活性。除了不同的底物特异性外，AAS过氧化氢测定AtSDC和SlAAAD对其首选底物(分别为丝氨酸和酪氨酸)没有过氧化产物(附加文件)1:图S6)。缺乏AAS活性的AtSDC和SlAAAD的底物谱有限，这突出了重组特征混杂的MtAAS和CaAAS酶的不寻常性质。

II型吡哆醛5′-磷酸(PLP)依赖性脱羧酶是一类在氨基酸代谢中起重要作用的酶。这组酶从一个共同的古老进化起源经历了功能进化，产生了一系列具有严格底物选择性的亚家族[14]．植物II型PLP脱羧酶包括芳香氨基酸脱羧酶(AAADs)、丝氨酸脱羧酶(sdc)和谷氨酸脱羧酶(gdc)。植物sds催化丝氨酸脱羧生成乙醇胺[j]1]， gdc催化谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸(GABA) [19]和aaad催化芳香氨基酸脱羧生成芳香芳基烷基胺[10]-[12]．根据各自的底物特性，每一组负责独特产物的生物合成[1]、[10]、[19]．虽然所有的植物II型PLP脱羧酶都是从一个共同的进化祖先进化而来的，但显著的进化分歧导致了有限的序列保守[14]．虽然每个组(aaad、sdc和gdc)内的单个酶保持较高的同一性(通常大于50%)，但这些相关组之间的酶保持显著降低的同一性(通常低于15%)。例如，有特征的拟南芥GDC (NP_197235)和SDC (NP_175036)， GDC和AAAD (NP_001078461)的一致性为5%，SDC和AAAD的一致性为14%。

与其他植物II型PLP脱羧酶不同，植物aaad经历了额外的功能进化，导致多个具有不同功能的类似物[10]．植物AAAD亚家族包括色氨酸脱羧酶(tdc) [12]、酪氨酸脱羧酶(tydc) [11]和芳香乙醛合成酶(AASs) [17]．TDCs和TyDCs分别催化吲哚和酚类氨基酸脱羧生成相应的芳香芳基烷基胺，而AAS催化更复杂的脱羧/氧化脱胺反应，由酚类氨基酸底物生成芳香乙醛。虽然这种功能差异在植物aaad中有很好的记录[10]，在植物SDCs或gdc中没有类似差异的报道。

在这项研究中，我们研究了植物sdc样酶，以评估它们的功能差异。为了进一步了解底物选择性的变化，我们分析了两种sdc样酶Medicago truncatula和中投arietinum。MtAAS和CaAAS的活性分析和完整的动力学表征表明，新型醛合酶具有对苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和色氨酸的活性。这些类sdc酶能够分别从苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和色氨酸生成苯乙醛、4-(甲基硫代)丁醛、3-甲基丁醛(异戊醛)和吲哚-3-乙醛。通过k来判断_猫/ K_米MtAAS和CaAAS底物的值，以及之前苯丙氨酸脱羧和氧化脱氨酶的表征[17]、[18]，很可能MtAAS和CaAAS作为苯乙醛合成酶(PAAS)的作用在活的有机体内苯乙醛(一种植物挥发性物质)的生产20.]-[22])。尽管对苯丙氨酸有明显的偏好，但色氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的特异性常数与其他重组表征的PAAS酶相当。比如k_猫/ K_米矮牵牛花PAAS和拟南芥PAAS对苯丙氨酸的反应速率为k_猫/ K_米0.678秒⁻¹毫米⁻¹和k_猫/ K_米0.012秒⁻¹毫米⁻¹分别为(17]、[18]．生理上相关的k_猫/ K_米对色氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的MtAAS和CaAAS值表明这些底物可能催化生成产物体内。

如果苯丙氨酸确实是MtAAS和CaAAS的首选生理底物，那么有人可能会问，为什么这些酶对其他生物物理上相似的氨基酸表现出显著而不寻常的活性。我们想到了两个可能的解释。首先，这些酶确实利用这些氨基酸底物来产生对进化有用的化合物。其次，这些酶最近(从进化的角度来看)从SDC分化出来，目前正在进化和调整酶对苯丙氨酸的特异性。为了分析第一种解释，我们进行了文献检索，努力找到4-(甲基硫代)丁醛、3-甲基丁醛(异戊醛)和吲哚-3-乙醛产物形成的例子。虽然4-(甲基硫代)丁醛和3-甲基丁醛(异戊醛)被证明是未知的酶产物，但关于吲哚-3-乙醛的生产有很多参考文献[13]、[23]、[24]．吲哚-3-乙醛是原始色氨酸依赖的吲哚-3-丙酮酸(IPA)生长素生物合成途径中的一种中间体[23]、[24]．虽然许多文献表明吲哚-3-乙醛是生长素的中间体，但完整的吲哚-3-乙醛依赖的生物合成途径尚未得到证实。尽管已经鉴定出能够催化吲哚-3-乙醛转化为吲哚-3-乙酸(IAA)的植物醛氧化酶，但迄今为止还没有能够生成吲哚-3-乙醛的酶[25]、[26]．有趣的是，通过MtAAS或CaAAS的色氨酸脱羧和氧化脱氨能够执行这一功能。因此，有理由认为这种酶可能是生长素生物合成的一个可能环节(图2)4）.

关于MtAAS不寻常产物形成的第二种解释表明，4-(甲基硫代)丁醛、3-甲基丁醛(异戊醛)和吲哚-3-乙醛是苯乙醛生产中的意外副产物。这种催化乱交似乎是次生代谢物生物合成酶的常见后果[27]-[29]．次级代谢物生物合成酶的这种机械弹性常常导致催化效率降低，而底物容许性更大[27]-[29]．尽管可能会发生意想不到的化学反应和产物形成，但具有适应性优势的产物的合成仍然会推动基因的增殖。单个次级代谢物生物合成酶不需要精确的底物特异性或化学反应;它们只需要合成一种有用的化合物来维持种群。此外，这种混杂的底物特异性可能使单个酶发挥多种生理作用。当生物体暴露在波动的环境中时，其中一种次要产物可能随后赋予生殖优势。

本研究确定了植物sdc样酶的功能分化。通过酶的分化，一些sdc样酶已经发展出新的底物偏好和化学反应，从而产生改变的产物。在这项研究中，我们鉴定了两种对苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸和亮氨酸具有不同寻常的醛合酶活性的AAS酶。虽然这些酶很可能在花挥发物的产生中起着PAASs的作用，但额外的产物醛的形成开辟了其他生理作用的选择。

试剂

丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、5-羟色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、多巴、苯乙醛、5-磷酸吡哆醛、甲酸、邻苯二醛、过氧化氢溶液和乙腈购自Sigma (St. Louis, MO)。IMPACT-CN蛋白表达系统购自New England Biolabs (Ipswich, MA)。

重组蛋白的制备

m . truncatula互补脱氧核糖核酸,美国lycopersicumcDNA分别由诺贝尔研究所的江琦文博士和弗吉尼亚理工大学园艺系的理查德维勒博士获得。c . acuminata种子是通过丰裕花园获得的。c . acuminata种子在Sunshine Pro Premium盆栽土壤中发芽，在23°C的光周期下生长16 h。100个微爱因斯坦。从整株植物中分离总RNA(12周)Ambion mirVana™miRNA分离试剂盒RNA样品随后使用Ambion TURBO DNA-free™Kit进行dna处理。使用用于RT-PCR的Invitrogen™SuperScript™III第一链合成系统生产cdna。答:芥cDNA的制备方法如前所述[13]．合成引物对，用于扩增m . truncatula[GenBank:XP_003592128] MtAAS基因c . arietinum[GenBank:XP_004496485] CaAAS基因美国lycopersicumNP_001233845 SlAAAD基因和拟南芥NP_175036 AtSDC基因(附加文件1:表1)。

将PCR产物连接到pTYB12 IMPACT-CN细菌表达质粒上。利用DNA测序对每个cDNA插入片段的序列和框架进行验证。选择转化的细菌菌落，用于大规模表达单个重组蛋白。37℃培养细菌细胞。0.15 mM IPTG诱导后，在15℃下培养24小时。将可溶性融合蛋白应用于填充甲壳素珠的柱上，随后在还原条件下水解。亲和纯化使每个重组蛋白的纯度约为85%。通过Mono-Q和凝胶过滤层析进一步纯化重组蛋白(纯度大于95%)。通过SDS-PAGE对重组蛋白的纯度进行评价。用Centricon y -50浓缩器(Millipore)将纯化后的重组酶浓缩至5 mg/ml蛋白，于含5 mM PLP的20 mM HEPES (pH 7.5)中。 Using bovine serum albumin as a standard, purified recombinant proteins concentrations were determined by a Bio-Rad protein assay kit (Hercules, CA).

MtAAS和CaAAS活性测定

在20 mM HEPES (pH 7.5)中制备典型反应混合物50 μl，含25 μg MtAAS重组酶和5 mM底物(20个蛋白原氨基酸加5-羟色氨酸和多巴)，在25℃水浴中孵育。加入50 μl 0.8 M甲酸，20 min后停止反应。离心得到反应混合物的上清液，用(水溶液)皮尔斯定量过氧化物测定试剂盒分析以测定原子吸收光谱活性。色氨酸反应混合物也进行了HPLC-EC分析。在20 mM HEPES (pH 7.5)中制备含有25 μg重组酶和8 mM色氨酸的50 μl反应，在25°C水浴中孵育5、20或40分钟。分别加入200 μl 0.8 M甲酸或200 μl硼氢化物饱和乙醇溶液阻止反应。分离通过50mm磷酸钾等分流动缓冲液(pH 4.0)与0.5 mM硫酸辛酯和45%乙腈实现。在相同的色谱条件下，通过对标准品的比较，对吲哚-3-乙醇进行了验证。

MtAAS和CaAAS GCMS产品验证

为了验证MtAAS和CaAAS酶产物的身份，用GCMS分析了含有苯丙氨酸和重组酶的反应混合物。在20 mM HEPES (pH 7.5)中配制500 μl，含50 μg重组酶和10 mM苯丙氨酸的反应混合物，在25℃水浴中孵育20 min，加入等体积的0.8 M甲酸停止反应。gc - cms分析前，用100ul乙酸乙酯提取产物。1 μl样品采用Agilent Technologies 7890B气相色谱和5977A质谱仪进行分析，进样口为250°C，烤箱温度范围为45-185°C，柱为HP 5MS。MtAAS和CaAAS反应中苯乙醛的保留时间和光谱与500 μM真实苯乙醛在相同的分析条件下产生的结果进行了比较。

动力学分析

初始MtAAS和CaAAS活性测定表明，在高底物浓度(5 mM)下，几种疏水氨基酸表现出显著的活性。用亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸和苯丙氨酸分析了酶的动力学参数，以确定酶的结合亲和力和反应速度。50 μl含5 μg重组蛋白与不同浓度底物(0.0025 ~ 45 mM)的反应混合物;取决于单个氨基酸的溶解度)在20 mM HEPES (pH 7.5)中制备，并在25°C下孵育。孵育5分钟后，在每个反应混合物中加入等体积的0.8 M甲酸，并使用Pierce®定量过氧化氢检测试剂盒进行分析。将产品形成与30% (w/w)过氧化氢溶液产生的标准进行比较。动力学数据点为三份，动力学值通过双曲回归进行评估。

MtAAS、CaAAS、AtSDC和SlAAAD活动比较

HPLC-EC进一步说明了不同寻常的MtAAS和CaAAS酶的底物范围。纯化的AtSDC和SlAAAD重组酶对MtAASs和CaAAS的首选底物(苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和色氨酸)以及其他常见的II型PLP脱羧酶底物(组氨酸、丝氨酸、谷氨酸、多巴和酪氨酸)进行了检测。在20 mM HEPES (pH 7.5)中制备50 μl含15 μg重组蛋白和5 mM底物的反应混合物，在25℃下孵育10 min后，用等体积的0.8 M甲酸停止反应。产物(除色氨酸、5-羟色氨酸、多巴、酪氨酸等反应外)用opa -硫醇试剂衍生(使胺转化为电化学活性化合物)。不同的等温缓冲液由50 mM磷酸盐缓冲液pH 4.0, 0.5 mM硫酸辛酯和40-55%的乙腈范围组成，用于opa -硫醇的表征。色胺产物采用50 mM pH 4.3的磷酸缓冲液、28%的乙腈和0.5 mM的硫酸辛酯组成的等温运行缓冲液。多巴胺和酪胺的产物采用50 mM磷酸缓冲液pH 4.3, 18%乙腈和0.5 mM硫酸辛酯组成的等温缓冲液。

PLP:

5 '磷酸吡哆醛

AAADs:

芳香氨基酸脱羧酶

提交:

丝氨酸脱羧酶，谷氨酸脱羧酶

GABA:

谷氨酸变成γ-氨基丁酸

TDCs:

色氨酸脱羧酶

TyDCs:

酪氨酸脱羧酶

经部:

芳香乙醛合成酶

高效液相色谱法:

高效液相色谱法

HPLC-EC:

高效液相色谱电化学检测

全球大气环流模型:

气相色谱质谱法

本研究由弗吉尼亚理工大学生物化学农业与生命科学学院资助。

作者指出

1. Michael P Torrens-Spence

   现在地址:美国马萨诸塞州剑桥市怀特黑德生物医学研究所

从属关系

1. 美国弗吉尼亚州布莱克斯堡，弗吉尼亚理工大学生物化学系

   Michael P Torrens-Spence, Renee von Guggenberg, Michael Lazear，丁海珍，李建勇

相应的作者

对应到Jianyong李。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

除了下面提到的实验之外，所有的研究都是MT写的。ML协助组织控诉、cDNA控诉、克隆、蛋白表达、蛋白纯化、实验开发和生物信息学。RV协助组织控诉、cDNA控诉、克隆、蛋白表达、蛋白纯化、实验开发和生物信息学。HD协助组织控诉、cDNA控诉、克隆、蛋白表达、蛋白纯化和生物信息学。JL监督并指导了这项研究，并帮助撰写了这篇文章。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。

本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。

如欲查阅本许可证副本，请浏览https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

创作共用公共领域免责声明(https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

转载及权限