去污剂不溶性膜的直接纯化gydF4y2BaMedicago truncatulagydF4y2Ba根微粒体:漂浮与沉降的比较gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

膜微结构域被定义为高度动态的，富含固醇和鞘脂的结构域，抵抗非离子洗涤剂的增溶作用。在植物中，这些所谓的洗涤剂不溶性膜(DIM)组分已经通过密度梯度(G)的常规超离心从质膜中分离出来。在动物中，基于低速沉淀的快速(R)方案也被开发出来，以从微粒体中回收DIM作为起始材料，从而避免了耗时的蔗糖梯度。在目前的研究中，我们试图比较快速方案的能力gydF4y2Ba与gydF4y2BaGradient是直接从细胞微粒体中分离DIMs的方法gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba的根源。为此，对两种方法回收的Triton X-100洗涤剂不溶性组分进行了分析和比较，以测定其甾醇/鞘脂含量和蛋白质组谱。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

从甾醇富集、植物鞘脂长链碱基和典型DIM蛋白标记物的存在推断，从植物中制备DIM的可能性gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba根微粒体在快速和梯度方案中都得到了证实。与鞘脂相反，发现DIMs的甾醇和蛋白质谱取决于所使用的方法。也就是说，通过GeLC-MS/MS分析，DIM组分中spinasterol的含量存在差异，仅共享39%的常见蛋白质。蛋白质的定量分析表明，每种纯化过程都产生了一个特定的富含dim的蛋白质亚群gydF4y2BaMedicagogydF4y2Ba根微粒体。值得注意的是，这两个蛋白质组被发现显示特定的细胞定位和生物学功能。gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba对R-和G-富集蛋白相对于微粒体的膜相关特征的分析表明，两种蛋白质组之间最显著的差异对应于沉淀后预测的含信号肽蛋白比例(R)的增加，而漂浮后的比例(G)的减少，这表明分泌蛋白可能有助于R- dim蛋白质组的特异性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

尽管微粒体被用作初始材料，但我们发现G-DIM部分的蛋白质组成仍然主要反映了传统的浮法提取的源自质粒的dim。同时，通过低速沉淀法分离出似乎针对分泌后期通路的DIM组分的可能性支持了植物微结构域在其他细胞器中的存在。gydF4y2Ba

将细胞分隔成细胞器或形成外部环境屏障的生物膜由脂质和多种脂质组成gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-膜蛋白、脂质修饰蛋白和脂质相关蛋白，主要参与转运、信号传导、分化和应激适应过程。除了指质膜(PM)内脂质和蛋白质均匀分布的流体马赛克模型[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]，大量证据支持微域假说[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，指出特定脂质和蛋白质在称为膜筏的微域内的不均匀分布也会使膜区隔。膜筏最初以动物和酵母细胞为特征，被定义为质膜[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]富含鞘脂和甾醇的纳米或微结构域，在多种生理情况下(包括炎症过程和细胞凋亡)作为启动信号事件的平台[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。与这些结构域的功能意义相关的主要假设依赖于膜蛋白的横向分离，这种分离创造了一个动态支架来组织特定的细胞过程[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。在植物中，富含鞘脂和甾醇的膜微结构域也从PM中分离出来。对其蛋白质含量的表征表明，它们在参与生物/非生物胁迫信号传导和响应的蛋白质中富集[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]-[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，这表明植物膜微结构域可能发挥与其动物对应结构域相似的信号功能。gydF4y2Ba

由于鞘脂和甾醇的富集，膜筏形成紧密的液体有序相(Lo)，与PM的其余部分分离。对Lo洗涤剂增溶的抵抗力增强gydF4y2Ba与gydF4y2Ba液体无序相(Ld)使研究人员认为，在低温下不溶于非离子洗涤剂的膜组分可能含有假定的筏状组分。该理论的一个警告是，回收的洗涤剂不溶性膜(DIM)组分仅在洗涤剂处理后存在，与天然膜结构不对应[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。然而，它们在甾醇、鞘脂和特定蛋白质亚群中的显著富集，其中一些在PM内呈簇状分布[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，鼓励它们作为生物膜中存在的Lo微域的生化对应物。从实验的角度来看，在将洗涤剂应用于富含pm的制剂后，DIM馏分通常通过超离心纯化到蔗糖梯度上，并以低密度漂浮的环状形式出现，其结构以囊泡和膜片为代表[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。最初，微结构域被认为只存在于PM和属于晚期分泌途径的膜中[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba大多数DIM制备确实是用pm富集馏分作为起始原料进行的[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]-[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]-[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，从而阻碍它们在其他细胞膜内的识别。尽管如此，在对从高尔基复合体膜中提取的dim进行表征时，细胞器内筏状区域的存在被进一步提出[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，线粒体[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]和液泡[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。迄今为止，对植物DIMs细胞内分布的最广泛的研究已经在拟南芥中进行了，使用的是来自液体根愈伤组织培养的全细胞膜[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。值得注意的是，得到的结果强烈地表明，在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba根，DIMs主要来源于PM鞘脂和富含固醇的微结构域，由于它们大量消耗胞内细胞器蛋白。gydF4y2Ba

尽管人们认识到膜微结构域在植物与微生物相互作用中的重要性，但这一结果是否也适用于农艺植物还没有得到研究。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba])。虽然gydF4y2BaMedicago truncatulagydF4y2Ba十多年前被保留下来，作为研究豆类和根系与真菌和细菌共生相互作用的模型[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]，只有一篇报告专门分析了桶状介质中的DIM组分[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。研究表明，可以获得与Triton X-100不溶性膜相对应的膜筏结构域gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba根点。此外，有证据表明它们在信号传导、细胞运输和氧化还原过程相关的蛋白质中富集。一种称为共生REM (MtSYMREM1或MtREM2.2)的raft蛋白[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba也被发现控制gydF4y2BaSinorhizobium melilotigydF4y2Ba感染以及根瘤菌释放到宿主细胞质内的根共生结构，即所谓的根瘤[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。同样，哈尼和朗[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]鉴定了固氮细菌感染所需的两种与微结构域相关的植物小花体。这些数据提高了木筏可能参与导致结节成功发生的分子事件的可能性，并且很容易推测其他的共生关联，如菌根，也可能需要适当的木筏结构来建立和发挥作用。因此，阐明共生和豆类生理学中的微结构域功能意味着增加对其细胞分布的了解，并结合快速有效的方法来分离它们。gydF4y2Ba

虽然DIM馏分已经成功地从gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba以PM为起始材料的根组织[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，这个程序需要大量的根组织。此外，净化PM馏分在某种程度上是劳动密集型和耗时的。为了克服这些技术限制以及扩大豆科植物根中DIM种群的覆盖范围，我们在当前的研究中研究了一种替代方法，该方法依赖于跳过PM分离步骤的可能性，直接从微粒体中分离DIM组分，如先前在其他动植物模型系统中所述(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.因此，这项工作旨在直接从gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba通过比较先前描述的DIM纯化的两种快速方案来根整细胞膜[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。使用土壤生长的根gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba本研究首先分析了洗涤剂终浓度和洗涤剂/蛋白质比对DIM馏分脂质和蛋白质形态的影响。然后，我们选择特定的实验条件并使用GeLC-MS/MS蛋白质组学方法，其中生物样品通过SDS-PAGE分离，切片，凝胶消化并通过LC-MS/MS对从两种不同方案中检索的DIM部分进行分析。进一步对比了不同DIM蛋白群体的功能和细胞分布。gydF4y2Ba

截尾草根微粒体中DIMs的纯化gydF4y2Ba

在目前的研究中，首先根据基于差速离心的策略从土壤生长的植物中提取整个根细胞膜gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba细胞培养[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。根据两种不同的方法从根微粒体部分进一步分离DIMs。前者由亚当和合作者开发[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]是一种通过低速沉淀提纯人体细胞DIM组分的快速方法，该方法利用了耐洗涤剂微域在冷非离子洗涤剂中的不同溶解度。简单地说，在细胞机械破坏后，作者直接用冷Triton X-100 (TX-100)处理匀浆，并将样品离心，以回收颗粒中洗涤剂不溶性物质。然后用β-辛基葡萄糖苷作为洗涤剂将这些dim溶解，离心后回收所得上清。这个程序被称为快速或r协议，与博尔纳使用的程序进行了比较gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，这是细胞提取物在蔗糖密度梯度(G)下的经典漂浮，如图所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．后者最初使用拟南芥愈伤组织培养，依赖于tx -100不溶性微粒体膜的轻浮力密度。因此，R-和G-DIM亚群按照“方法”一节的解释制备，随后分析其相对于原始微粒体部分的脂质和蛋白质组成。此外，考虑到R-和G-DIM提取方法依赖于使用不同的TX-100/蛋白质比和TX-100终浓度(分别为R3:1和G3:2)，我们还研究了洗涤剂与蛋白质比(w/w)和洗涤剂终浓度(% v/v)对脂肪和蛋白质组成的影响。gydF4y2Ba

固醇，而不是鞘脂，在R-和G-DIM组分之间有差异富集gydF4y2Ba

我们进行了三个独立的实验，并检测了R-和G-DIM组分的脂质含量，以评估甾醇和鞘脂(膜微域的典型特征)的富集情况。首先以表前列醇为内标，采用气相色谱法测定甾醇的组成。数字gydF4y2Ba2gydF4y2BaA显示了相对于作为DIM纯化起始材料的微粒体(Mic)组，R-和G-DIM组分的代表性洗脱谱。根据以往资料[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]， spinasterol被记录为两个DIM组分中含量最高的甾醇，但在R-和g -DIM中，spinasterol的平均富集倍数分别从2.8增加到3.9(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaB).由于R-和G-DIM提取物的TX-100/蛋白质比率和TX-100最终浓度不同，因此可以根据这两个参数定量spinasterol含量。在相同的TX-100/蛋白比和最终TX-100浓度下，R-和G-DIM组分之间的spinasterol富集仍然存在显著差异(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图A1A)。这些结果明确了R-法和g -法的纯化步骤，即低速离心gydF4y2Ba与gydF4y2Ba蔗糖梯度，是造成spinasterol浓度差异的原因，与tx -100相关参数无关。gydF4y2Ba

由于长链碱基(LCB)是所有鞘脂的共同主干，因此采用气相色谱-质谱法对其进行定量分析[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]作为获取R-和G-DIM组分中鞘脂总富集的一种方法。无论采用何种方法制备DIM，得到的总LCB组成(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaC)与之前报道的数据一致gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，尽管有证据表明存在额外的次要二羟基化LCB (d18:0, d18:1和d18:2)，但其检测先前归因于GC-MS的高灵敏度[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。有趣的是，R-和g -部分都高度富含三羟基化LCB(与Mic相比，t18:0和t18:1增加了6倍)。这些化合物主要在鞘脂类的糖基肌醇磷酸化神经酰胺中被发现[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。此外，无论使用何种浓度的TX-100, R-和g -样品也表现出非常相似的LCB特征，具有相同的富集褶(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:额外的A1B)，强烈提示鞘脂含量与DIM分离方法无关。总的来说，R-和g - dim的脂质组成证实了它们在鞘脂和甾醇中相对于微粒体部分的富集。gydF4y2Ba

DIM蛋白组成受提取方法的影响gydF4y2Ba

由于原始设置的TX-100浓度在R和G方案之间的差异，洗涤剂浓度和洗涤剂/蛋白质比(洗涤剂/蛋白质比= 3至6，最终浓度为1至2)对DIM蛋白质组成的影响也在考马斯蓝染色后可视化的一维SDS-PAGE条带图的基础上进行了初步评估。如图所示gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA，从R-DIM样品中获得的蛋白质谱看起来与它们起源的微粒体片段不同，但在感兴趣的条件下(R3:1和R3:2)，在质量上大致相似。尽管存在一些微小的差异，但将d:p的比例增加到6:1并没有显著改变蛋白质模式。这些观察结果也适用于G-DIM样本。相比之下，R和g组分之间的蛋白质模式存在明显的定性和定量差异，这表明在我们的实验条件下，DIM蛋白质含量在很大程度上取决于分离工艺而不是洗涤剂浓度。gydF4y2Ba

为了进一步分析和比较共提取的蛋白质与富含甾醇的DIM组分，在承认DIM脂质和蛋白质组成在此范围内不依赖洗涤剂后，使用TX-100浓度的原始设置，即R3:1和G3:2条件，进行了鸟枪蛋白质组学方法。由于二维电泳在解析整体膜蛋白方面的局限性[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]，选择1D凝胶耦合液相色谱-串联质谱(GeLC-MS/MS)研究DIM馏分的蛋白质组成。该工作流程结合了基于尺寸的蛋白质分离和所得组分的凝胶内消化，成功地扩大了膜蛋白的覆盖范围gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba根(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，也适用于光谱计数等相关的蛋白质定量方法[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

因此，GeLC-MS/MS对两组独立提取的R-和g - dim以及初始根微粒体部分进行了分析。使用小于0.05的多肽误认概率，当只保留每个DIM的两个重复中共同鉴定的蛋白时，在微粒体和DIM部分中总共鉴定了874个非冗余蛋白，如附加数据(附加文件)所列gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表A1)。微粒体、R-和G-DIM蛋白的维恩图分布如图所示gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB，表明相对于最初在微粒体片段中鉴定的821个片段，R-和G-DIMs包含相当相似的蛋白质数量，分别对应234个和219个片段。尽管大多数与dim相关的蛋白质(84%)如预期的那样也存在于原始微粒体片段中，但53个片段(16%)在dim中被唯一识别，这表明实验程序能够识别在全膜质量分析中未被检测到但在分离时被揭示的次要蛋白质。值得注意的是，R-和G-DIMs的比较表明，这两个部分共有126个蛋白质，从而定义了一个保守的dim相关蛋白质核心集，总体上占根微粒体蛋白质组的15%gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为了研究R-和G-DIMs之间这些常见蛋白质的定量分布是否存在差异，使用光谱计数来估计蛋白质丰度，这是基于与给定蛋白质匹配的记录肽光谱的累积和[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。在计算4个重复中每个蛋白质的归一化光谱丰度因子(NSAF)值后，只有6个蛋白质在R-和G-DIMs之间表现出显著的(p < 0.05)差异积累(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC)。也就是说，线粒体输入受体亚基TOM40同源物、束状蛋白样阿拉伯半乳糖蛋白和己糖激酶在R-DIMs中显示出比G-DIMs更高的丰度，而延伸因子1- α、v型质子atp酶亚基H和天冬酰胺合成酶在G-DIMs中相对于R-DIMs过度积累。结果表明，无论提取方法如何，这126种蛋白质在很大程度上都与DIM相关蛋白的数量保守性相对应，其中最丰富的10种蛋白质包括跨膜孔蛋白(水通道蛋白，OMP)，呼吸链相关蛋白(ATP合成酶，黄素蛋白)，β -葡萄糖苷酶G1和泛素，这些蛋白质在植物DIM中经常被描述(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表A2) [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。相反，Venn图还显示，在R-和g -部分鉴定的234个和219个蛋白质中，分别有108个(46%)和93个(42%)蛋白质是R-和G-DIM所特有的(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba这指出，在327个与dim相关的蛋白中，有61%(201个蛋白)是与dm相关的gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba根根据纯化过程进行微分分割。因此，尽管两种方法都具有相同的蛋白质提取效率，正如从r和g组分中鉴定的相似的加入数量推断的那样，它们仍然对微粒体蛋白表现出不同的选择性。gydF4y2Ba

富含dim的蛋白质在R级和g级之间有所不同gydF4y2Ba

为了进一步定量评估R-和g -DIM的蛋白质组成与初始微粒体的差异程度，计算了每种蛋白质的DIM和Mic组分的NSAF值之间的丰度比。在此基础上，根据Borner 's，重复性显示R-和G-DIMs丰度至少比微粒体高2倍的材料被认为是dim富集蛋白gydF4y2Ba美国标准gydF4y2Ba．其中65个为R- dims所特有(称为“R2xspecific”)，46个为G-DIMs所特有(称为“G2xspecific”)，而42个为R-和G-DIMs所共有(称为“RG2xcore”)(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD)。从这些结果中，因此得出结论，每个提取过程产生一个特定的富含dim的蛋白质子集gydF4y2BaMedicagogydF4y2Ba在最初的874个鉴定中，R-和g -方案分别占7.4%和5.3%。因此，其余的研究基本上致力于比较这两个特定的蛋白质组和核心亚群，相对于微粒体部分。gydF4y2Ba

在研究我们的蛋白质组学数据中先前发表的植物dim相关蛋白的代表性时，通过使用鉴定制图工具和对[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]及[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，在总共327种R-和G-蛋白中鉴定出152种在植物微结构域中被描述的蛋白，其中包括33种在文献中通常被称为典型植物DIM标记的蛋白，如䲟鱼蛋白(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表A2)。值得注意的是，在DIM富集的基因组中，共鉴定出14个DIM标记gydF4y2BaMedicagogydF4y2Ba蛋白质，包括束状胶质样阿拉伯半乳聚糖蛋白、刺猬相互作用蛋白、受体样激酶、14-3-3样蛋白、磷脂酶D、动力蛋白和漂浮蛋白。然而，它们的分布在rx2特异性和gx2特异性子集之间存在显著差异(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaE)，从而支持了R-和g -方法对某些种类的蛋白质表现出不同的选择性的观点。gydF4y2Ba

最后，为了解决是否已知或假定的非膜蛋白可能在R-和G- DIM部分富集，我们使用，作为参考点gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba， Daher及其同事所描述的基本原理[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba这种方法倾向于在许多生物体中同源蛋白质共享相同位置的基础上进行相似性搜索，这种策略被认为比使用人工智能更有信心gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba蛋白质定位的算法预测[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。因此，首先将从R-和g -方案中获得的富含dim的蛋白与BLASTP与TAIR数据库进行比较，并将其视为膜gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba当同源序列显示至少70%的配对一致性和截断期望值为egydF4y2Ba^{-40年gydF4y2Ba}在直接测定的基础上，实验证明具有膜定位，包括膜复合物的核心积分或亚基[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。在缺乏TAIR同源物的情况下，LegumIP注释与拟南芥推断的细胞成分总体上达到80%的一致性，尽管在很大程度上不太详细，但用于解决蛋白质定位(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表A2)。在缺乏可靠的膜同源物的情况下，富含dim的蛋白被保留为非膜蛋白，除非预测显示至少以下一个标准:形成α螺旋TM结构域或嵌入膜脂双分子层的β桶，由于疏水尾部而锚定在膜上，和/或针对分泌途径，如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。利用这种设计，在之前记录的227种富含dim的蛋白质中，有10种主要来自细胞质来源的蛋白质被鉴定为膜组分的潜在污染物(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表A2)。然而，当考虑到它们在微结构域形成中的已知或假定的功能相关性，特别是在介导疏水相互作用和/或在植物-微生物相互作用界面上对微生物进入/调节的反应中的作用时，这些作用主要依赖于胞吐、内吞作用或防御化合物的局部分泌[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]，我们特意选择不从R-和G-DIM分数中丢弃它们。也就是说，patellin-5与疏水分子(如磷酸肌苷)结合，并促进它们在不同细胞位点之间的转移。脂肪酶/脂氧合酶的PLAT/LH2家族结构域存在于多种膜或脂质相关蛋白中，动力蛋白通过沿着细胞骨架微管行走来运输各种细胞货物。泛素，已知其与PM蛋白的连接可诱导内吞作用和/或蛋白酶体依赖性降解[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba而咖啡酸3- o -甲基转移酶则参与植物细胞壁的强化，并通过增加细胞壁结合阿魏酸聚合物的形成来应对伤害或病原体的挑战。主要的乳胶蛋白属于细胞分裂素特异性结合蛋白，在病原体防御反应中也有作用。分类和装配机械部件50gydF4y2Ba（gydF4y2Ba细胞分裂蛋白(FtsZ同系物)是分裂细胞中间环的一部分，它是收缩细胞膜/细胞包膜所必需的，定位于含有长链脂肪酸的磷脂，它在稳定高度弯曲的膜结构域中起重要作用[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。最后，糖蛋白结合蛋白(凝集素)被认为通过pm驻留蛋白的交联促进刺激依赖性微结构域组装[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

综上所述，上述数据证实，快速(R)和梯度(G)协议都可以直接从gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba根微粒体，从甾醇富集推断，存在典型的鞘脂长链碱基来自植物，富集在膜蛋白中包括著名的植物DIM报告者，但也表明用于DIM提取的方法，即低速离心gydF4y2Ba与gydF4y2Ba相对于初始微粒体，漂浮定性地影响了DIM部分中富集的蛋白质组的组成。因此，为了更深入地了解富含dim的蛋白质可能优先分配到R-或G-DIM部分的过程，相应的gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba进一步表征了蛋白质的亚细胞定位，功能相关性和已知的驱动膜结合的特征。gydF4y2Ba

R-和g - dim富集蛋白的细胞位置不同gydF4y2Ba

目的:分析大豆中dim相关蛋白的亚细胞定位gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba根相对于微粒体部分，我们使用上述工作流程，有利于相似性搜索gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba预测。使用这些标准，记录了当前DIM馏分中富集的227种蛋白质的23种不同定位，详见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表A1。在这方面，由于叶绿体定位于根的蛋白质是指那些属于非光合质体的蛋白质，因此它们进一步被称为非绿色质体蛋白质。为了最大限度地减少误解，在可能的情况下，将每个膜组分与其对应的细胞器(例如质体与质体膜)结合后，将这23个定位限制为17个。实际上，虽然每个细胞隔室都经过了实验检查，但在相应的研究中没有具体解决时，对整个细胞器定位的参考也可以包括其膜居民。根据TAIR和LegumeIP注释，考虑到蛋白质经常居住的多个细胞位置(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(见表A2)，通过绘制相应蛋白质组学数据集中每种细胞成分的出现率，从而为每个感兴趣的R、G和微粒体部分绘制亚细胞谱，如图2所示gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba

请记住，每个频率并不是指唯一的亚细胞成分，频率可能偏向于研究最多的拟南芥和豆科细胞器，尽管如此，它还是从图中出现gydF4y2Ba4gydF4y2BaA质膜在RG2xcore蛋白质组内的发生率最高，这一结果证实了PM在很大程度上有助于微结构域富集蛋白的观点[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。然而，正如郑之前观察到的那样，尽管线粒体的蛋白质在这个核心部分相对于初始微粒体大部分被耗尽gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，位于细胞壁和非绿色质体等其他细胞成分上的那些恰好富集gydF4y2BaMedicagogydF4y2Ba根变暗。因此，该核心组分获得的亚细胞图谱与以下观点一致:除了质膜外，DIMs还可以从其他几个细胞区室中提取，正如之前在分析富含细胞器的组分时对内膜系统所证明的那样(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表A1)。在这方面，尽管DIM组分中存在植物细胞壁相关蛋白在文献中已被广泛报道[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，在微域中获取质体成分的文献记录要少得多。尽管如此,gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaTOC75蛋白是质体外膜的一个组成部分，在不溶性洗涤剂膜的一部分中被发现[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，支持了特定蛋白质可能包含在质体膜微域中的观点。在目前的研究中，一种β -羟酰基-(酰基-载体蛋白)脱水酶FabZ (Medtr2g008620)被实验归因于叶绿体包膜和细胞壁，使人联想到β -羟酰基-(酰基-载体蛋白)脱水酶前体gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Badim (gydF4y2Ba13gydF4y2Ba由于该酶不显示叶绿体转运肽(cTP)，但根据HAMAP预测可能是质体编码的(数据未显示)，因此这种在脂质生物合成中起作用的蛋白质很可能在质体膜上发挥特定功能。同样，磷脂酶D α是一种值得注意的植物DIM标记物，参与磷脂酰胆碱的代谢，磷脂酰胆碱是细胞膜、脂肪酶/脂氧合酶和patellin-5的重要成分(见上文)，也属于可定位于非绿色质体的R-和G-DIMs中共同富集的脂质相关蛋白(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表A2)。关于质体，值得注意的是，这些细胞器是专门用于脂肪酸前体合成的，这些脂肪酸前体要么直接在它们自己的膜内组装，输出到内质网进行质体外脂质组装，要么重新输入以合成质体脂质[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

与微粒体相比，我们对那些在R-和G-DIMs中特异性富集的蛋白质特别感兴趣，这两个部分的亚细胞模式之间记录的最显著差异包括细胞质/细胞壁/未定义膜组分中蛋白质的富集和R特异性亚群中核蛋白的缺失，而胞浆连丝和核相关蛋白则在g特异性部分中富集(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2BaA).在记录的22个特异性富集于R-DIM的胞质蛋白中，只有6个没有表现出与膜的特征驱动关联，根据实验注释，它们被专门分配给了胞质，这表明胞质蛋白与R-DIM的关联大多数不是由非膜蛋白驱动的。同样，所有位于细胞壁上的13种蛋白质都被预测具有膜特征，如芽孢样蛋白，α - d -木糖苷酶，α -1,4-葡聚糖蛋白合成酶，半胱氨酸蛋白酶抑制剂5，果胶酯酶，β - d -葡萄糖苷酶，β -木糖苷酶，木聚糖1,4- β -木糖苷酶(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表A2)。同样值得注意的是，r -程序产生的DIM部分在核蛋白中大部分耗尽，与Adam先前描述的基于梯度的方法所观察到的相反gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。虽然主要由核糖体蛋白组成，但在G-DIM分离过程中特异性富集的大多数核归属蛋白至少显示出与膜相关的特征，这总体上最大限度地降低了在提取过程中游离核糖体撞击脂质部分的可能性[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。最后，胞浆连丝定位的蛋白碰巧选择性地富集在G-DIMs中，这可以从22个归属于这个区室的片段中推断出来，尽管不是唯一的，其中dim标记flotillin属于(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表A2)。在植物中，胞间连丝对应于允许细胞间通讯的膜质通道。它们嵌入细胞壁，由内质网和质膜的专门区域定义，这可能解释了它们的大量代表性(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(见表A2) G-DIMs富集的胞间连丝蛋白中的转运蛋白和受体样激酶，这与最近专门研究胞间连丝的蛋白质组学研究中观察到的结果相似[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。由于每个细胞器对蛋白质分选和/或特定代谢途径的相对专门化，因此我们预计R-和g - dim富集蛋白在不同细胞区室中的差异分布可能具有功能相关性。gydF4y2Ba

R-和g - dim富集蛋白的功能相关性不同gydF4y2Ba

为了获得R-和g - dim富集蛋白相对于微粒体蛋白质组的功能概述，根据FunCat注释方案对相应的874个鉴定进行分类[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba将它们分配到七个已知的生物过程中。当考虑到在R-和G - dim中共同富集的蛋白质的比例时，图gydF4y2Ba4gydF4y2BaB显示“运输和囊泡运输”类别明显增加，这与前表一致，表明dim相关蛋白主要在膜运输的背景下被描述[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。信号转导相关蛋白也在该核心蛋白质组中富集，但富集程度低于通常在动物系统中观察到的水平。这一特征先前报道了从燕麦和黑麦的PMs中提取的DIMs，但也在拟南芥的甾醇依赖蛋白中，从而支持了并非所有信号蛋白都必须富集在微结构域的观点[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。值得注意的是,图gydF4y2Ba4gydF4y2BaB还指出，根据所使用的方案，优先表示不同的功能类别。也就是说，相对于微粒体，在r - dim中，在“蛋白质合成/命运”中起作用的蛋白质被耗尽了。在g - dim中没有观察到，这种后期模式与当前研究和Adam注意到的核糖体蛋白的消耗一致gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。此外，与梯度法获得的功能分配相反，属于“防御/细胞救援”和“能量/代谢”过程的蛋白质在r - dim中特异性富集。最后，与“细胞结构/膜形成”相关的类别在G-DIMs中富集的蛋白质中显示出比r介导沉降后更大的增加。为了检查这些功能类别的分布是否可以反映每个DIM部分中细胞成分的差异分配，我们随后绘制了相对于微粒体，在每个细胞器中特异性富集的蛋白质中，funcat赋予的功能的发生率。数字gydF4y2Ba5gydF4y2Ba结果表明，典型的R-DIMS细胞质蛋白和细胞壁/膜蛋白主要参与防御/细胞救援和能量/代谢。相比之下，在g - dim中优先招募的PM和位于胞浆间丝的蛋白主要在细胞结构/膜形成过程中发挥作用。在之前的作品中[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，维持细胞运输和细胞壁功能的蛋白质也被发现在从gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba根质膜。后两种功能类别，以及与生物/非生物胁迫反应相对应的功能类别，在从烟草PM中提取的DIM中得到突出显示[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

综上所述，上述数据表明，尽管存在一个保守的蛋白质核心，R-和g -协议各自导致特定dim蛋白质组的富集，显示特定的细胞定位和生物学功能。与DIM组分相关的蛋白质和/或脂质差异早有报道，但主要取决于提取参数，如温度、浓度和洗涤剂类型[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。然而，在目前的研究中，R和G方案的DIM提取程序(温度、持续时间和洗涤剂)是相同的，因此只有DIM分离过程(即沉淀)不同gydF4y2Ba与gydF4y2Ba浮在蔗糖梯度上。在这种情况下，可以合理地假设，每种方法所显示的选择性可能源于这些差异富集蛋白所显示的某些特定的膜相容性特征。gydF4y2Ba

与R/G蛋白分配相关的膜相关特征gydF4y2Ba

在疏水脂质双分子层中，有利于蛋白质嵌入的特征包括膜跨越蛋白结构域，包括典型的α -螺旋或β -片，疏水表面作为脂质双分子层碳氢化合物核心的界面。此外，新生蛋白的信号肽也可以沿分泌途径介导蛋白质跨膜转运或整合到膜上[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。蛋白质与膜的结合也可以由脂质锚点驱动，脂质锚点可以是永久的共翻译添加物或翻译后修饰。这些脂质修饰包括糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定，n端肉豆蔻酸尾部(肉豆蔻酰化)和半胱氨酸酰化(棕榈酰化)[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。因此，我们进一步监测和比较假定存在的gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-膜(TM)跨越结构域、信号肽(SP)序列和脂质修饰，以及在R和g富集蛋白内，相对于微粒体，从相应的在线预测工具推断(见方法)。gydF4y2Ba

关于脂质修饰在R(胞浆，CW，未确定膜)和G-DIMs (PM，胞间连丝)中特异性富集的每个细胞组分中的分布，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba表明所使用的任何一种方法都不影响推定棕榈酰化蛋白的比例。当考虑到R-和G-部分富集的蛋白质的总亚群时，这一结果也成立(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.总的来说，s -棕榈酰化在很大程度上是最丰富的脂质修饰，与膜室相关的蛋白质gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba，在总微粒体分数范围内预测了487例(59%)候选基因。这一结果与最近来自拟南芥根愈伤组织培养的蛋白质组学数据一致，其中提出的s -酰化蛋白的数量从30个增加到500多个[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。相比之下，相对于微粒体，GPI锚点似乎更频繁地预测r富集蛋白而不是G，只包含少数蛋白质(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.同样，在富含R-和g - dim的蛋白质中，存在假定的n端肉豆蔻酸尾是偶然的。从图中可以看出gydF4y2Ba5gydF4y2Ba两种蛋白质组之间最显著的差异对应于沉淀(R)后预测含sp蛋白比例的增加，而漂浮(G)后预测含sp蛋白比例的减少。当观察R-和G-部分富集的蛋白质总亚群时，也可以在更大的范围内观察到这种行为(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，表明部分分泌后期通路可能有助于R-DIM蛋白质组的特异性。经典的真核生物分泌途径包括新生蛋白易位进入内质网腔，然后通过分泌途径，其中包括高尔基体(GA)和gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-高尔基网络，蛋白质包装到囊泡中，囊泡迁移到PM并与PM融合，将蛋白质货物释放到细胞壁中，或以液泡或其他后高尔基区室为目标[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。带有信号肽且没有额外靶向信息的蛋白质的默认途径是通过内质网、高尔基体和PM，在那里它们被分泌到细胞壁中。值得注意的是，为了靶向PM，蛋白质不需要信号肽，因为额外的序列，包括膜跨越区域，也允许它们流向PM [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。因此，sp预测的蛋白质在细胞壁内的优先分配和特异性富集于r部分的内膜成分表明，含有针对分泌的蛋白质的DIMs可能不具有与通过漂浮获得的DIMs相似的浮力(例如，主要是PM和间连丝DIMs)。与这种可能性一致，当研究韭菜植物细胞中的微结构域分布时，LaloigydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]表明，替代往常ΔgydF4y2Ba^5gydF4y2Ba与PM相比，-甾醇在GA中诱导了DIM的优先形成，这表明甾醇在分泌途径上对DIM的形成没有同等的贡献。还有其他证据表明，甾醇在PM中有优先积累，并通过分泌途径逐渐增加gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba和gydF4y2Ba韭葱gydF4y2Ba［gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。值得注意的是，抑制甾醇生物合成也导致PM内DIM蛋白标记物减少，而不影响到细胞表面的囊泡运输，这表明蛋白质靶向PM微域可能需要特定的甾醇[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。在gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba据报道，spinasterol是由PM制备的dim的主要化合物[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，并且，如上所述，我们还证明了这种甾醇在g组分中比在r组分中富集程度更大。根据这些结果，以及相对于蛋白质分泌占主导地位的r组分，G-DIMs中PM相关蛋白的优先回收，我们因此假设spinasterol富集参与PM和plasmodesma DIMs的浮力，与位于分泌后期途径的DIMs相反，其中甾醇被怀疑浓度较低[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在类似的推理中，研究表明，相对于内质网和高尔基膜，PM内的甾醇富集可以增加其疏水厚度，从而介导对具有相应TM疏水长度的蛋白质的选择性靶向[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。这一过程被称为双层介导机制[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，反映了这样一种观点，即由于微结构域含有高浓度的具有长而饱和烃链的甾醇和鞘脂，它们可能比周围含有不饱和磷脂的脂质基质具有更厚的双层结构[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。因此，具有相对较长的TM疏水区域的蛋白质可能会定位在较厚的双层中，而较短的TM蛋白质应该定位在较薄的非筏区[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。在本研究中，分析TM域的分布，如图所示gydF4y2Ba6gydF4y2Ba结果表明，相对于微粒体，在微结构域部分富集的蛋白质中，预测的α螺旋大幅减少，在R-和G-DIMs中分别从63%下降到18%和32%。除了细胞壁相关蛋白外，在考虑富含dim的细胞区室时也观察到这种模式(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，与TM结构域存在的观点一致gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba不是驱动蛋白质与微结构域结合的先决条件[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。当细化TM结构域的划分时，特别注意它们的数量和长度，这可能有助于细胞器定位和微结构域亲和力，结果表明，相对于微粒体部分，预测由单个跨膜螺旋锚定的蛋白质在两个DIM部分中都大量富集，并且在R-(83%)中比在G-(60%) DIM中更大程度(图3)gydF4y2Ba7gydF4y2BaA).招聘单一的理由之一gydF4y2Ba-gydF4y2Ba在dim内跨越TM蛋白，如先前在烟草和桶状植物的PM微域中报道的那样[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，可能是单体TM蛋白的寡聚化会增加它们对微结构域的亲和力，否则它们只会在筏内停留很短的时间[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。在检查这些单的长度时gydF4y2Ba-gydF4y2Ba跨TM域，图gydF4y2Ba7gydF4y2BaB表明，虽然包含19个氨基酸的螺旋在R-DIMs中比包含24和26个氨基酸的G-DIMs中更频繁地富集，但这些差异可能没有显著的相关性，因为它们只包含极少数的蛋白质。gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba对TM结构域数量的分析还表明，相对于微粒体，预测含有8至12个α -螺旋的蛋白质在G-DIMs中富集，而在R-DIMs中不富集(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba顶部面板)。以前在烟草的PM微域中强调的这一特征[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，因此同意G-DIMs中位于质膜的蛋白质的优先招募(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2BaA)。最后，我们注意到dynamin-2B、flotillin、stomatin和leucine-rich repeat (LRR)蛋白属于预测含有2个β链的膜定位蛋白，相对于微体，这些蛋白在G-中富集，而在R-DIMs中不富集(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba底部面板)。在这方面，dynamin-2B、flotillin和stomatin可以显示类似发夹的拓扑结构，易受微域膜曲率和支架过程的影响[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。同样，LRR具有弯曲的马蹄形结构，已知其驱动蛋白质-蛋白质相互作用[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]，也可以作为筏纳米域靶向信号[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。总的来说,gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba预测表明，R-和g - dim富集蛋白在目前研究的三种蛋白基序(即α -螺旋、β -链和信号肽)的分布不同，这三种蛋白基序可以驱动与膜室的关联。预测的含有sp的蛋白质在细胞壁内的优先分配和特异性富集于R-DIM的内膜成分，表明部分晚期分泌途径可能有助于R-DIM蛋白质组的特异性。gydF4y2Ba

在本研究中，首次直接从gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba由相对于PM的复杂膜混合物组成的根微粒体通常用作微结构域分离的起始材料。我们明确地建立了长期的蔗糖梯度离心(G方案)和快速的低速微离心沉降(R方案)都能够回收符合DIM标准的膜组分，这是从甾醇富集、植物中典型鞘脂长链碱基的存在以及包括典型DIM标记物在内的膜蛋白富集推断出来的。相应组分的蛋白质组学分析也表明，尽管存在一个保守的蛋白质核心，R-和g -协议导致特定dim蛋白质组的富集，显示特定的细胞定位和生物学功能。总的来说，即使微粒体被用作初始材料，我们表明G-DIM部分的组成仍然主要反映了通过浮法常规检索的PM微域的组成。与此同时，通过快速差速离心分离似乎针对分泌后期途径的DIM部分的可能性为研究植物微结构域开辟了新的途径。最后，关于我们最初提出的关于植物DIMs细胞内分布的问题，目前得到的结果是gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba根明确支持微结构域的存在，不仅在PM和后期分泌途径中，而且在其他膜细胞器中，包括非绿色质体中。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

Medicago truncatulagydF4y2Ba简历。Jemalong 5种子表面灭菌，27℃黑暗条件下在0.7%无菌琼脂上萌发[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。然后将两龄的幼苗转移到土壤中，生长在400毫升的塑料罐中，罐中装有Epoisses无菌土壤(来自法国第戎INRA Epoisses Domaine d’Epoisses的中性粘土壤土)和沙子(1:2,v/v)的混合物，每周补充两次富氮营养液(Long Ashton [gydF4y2Ba63gydF4y2Ba])，在可控条件下(光周期16 h, 220 μE.mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．s^1gydF4y2Ba光辐照度)。4周后，收集根系，用去离子水轻轻冲洗以去除土壤，在液氮中深度冷冻，保存在-80°C以待下次使用。gydF4y2Ba

微粒体蛋白纯化gydF4y2Ba

微粒体制备的所有步骤均在4℃下按照[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。微粒体的gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba如前所述，通过差速离心获得烟草细胞的根[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。简单地说，冷冻根(约100克新鲜重量)在研磨缓冲液(50 mM Tris-MES, pH 8.0, 500 mM蔗糖，20 mM EDTA, 10 mM DTT和1 mM PMSF)中使用Waring搅拌机均质。匀浆在12000℃下连续离心gydF4y2BaggydF4y2Ba和16.000gydF4y2BaggydF4y2Ba离心后，收集上清液，通过63 μm和38 μm两个连续筛孔过滤，在100,000℃下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba根据所使用的DIM部分分离程序(见下文)，将微粒体微球重悬于缓冲液中，用玻璃杵均质。为避免TX-100干扰，以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，采用RCDC (bicinchoninic acid) Protein Assay Kit (BioRad)测定蛋白质含量。gydF4y2Ba

洗涤剂-不溶性-膜分离gydF4y2Ba

对于Rapid (R)和Gradient (G)协议(图1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，进行了三次独立的dim提取，每次从相当于6毫克蛋白质的微粒体中提取。用符号R/G x:y分别表示R或G方案、x洗涤剂/蛋白质比(w/w)和y (%， v/v)最终洗涤剂浓度。gydF4y2Ba

快速程序按照[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。首先将微粒体部分重悬于pH 7.3的10 mM Tris-MES缓冲液中，其中含有250 mM蔗糖、1 mM EDTA、10 mM DTT、1 mM PMSF、10 μg/ml抑蛋白蛋白和10 μg/ml胰肽。为了增加溶解作用，将重悬微粒体蛋白放入1 mg的组分中，用25 mM Tris-MES pH 6.5，含150 mM NaCl进一步稀释(270 μl终体积)。然后加入30 μl 10% (v/v)的Triton X-100，达到最终去污剂与蛋白质的比为3:1 (w/w)，最终去污剂浓度为1% (v/v)。在冰上轻轻摇晃30分钟孵育。样品在16000x离心gydF4y2BaggydF4y2Ba得到的Triton x -100不溶性部分(DIM)在200 μl含β -辛基葡萄糖苷缓冲液(60 mM β -辛基葡萄糖苷，10 mM Tris HCl pH7.5, 150 mM NaCl)中均质(用微柱)，在冰上轻摇孵卵30 mingydF4y2BaggydF4y2Ba(20 min)从Triton X-100和β -辛基葡萄糖苷不溶性颗粒中分离可溶DIM部分(R-DIM)。合并引用的DIM组分，使用RCDC蛋白测定试剂盒(BioRad)测定蛋白量。gydF4y2Ba

根据Borner的说法，对于梯度方案，微粒体颗粒在TNE缓冲液(25 mM TrisHCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA)中重悬gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。用1% (w/w) Triton X-100在4°C下轻柔摇动处理微粒体部分(6 mg蛋白当量)30分钟。增溶后，将膜调至1.8 M蔗糖终浓度(使用2.4 M蔗糖/TNE缓冲液)，在TNE缓冲液中覆盖2 ml 1.6 M、1.4 M、1.2 M和0.15 M蔗糖，然后在200.000下纺丝16 hgydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C。在1.2-1.4 M蔗糖界面处收集dim，用过量的TNE缓冲液洗涤，并在100,000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba静置1小时以去除残留蔗糖。DIM颗粒(G-DIMs)在含缓冲液(60 mM β -辛基葡萄糖苷，10 mM Tris HCl pH7.5, 150 mM NaCl)的1ml β -辛基葡萄糖苷中均质。用RCDC Bio-Rad蛋白法测定蛋白浓度。gydF4y2Ba

游离固醇的提取和分析gydF4y2Ba

从微粒体和DIM部分提取总脂质(R和G;根据Folch的说法，每个样品100 μg等效蛋白质，先前在0.37 M KCl中稀释至最终体积为500 μlgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba65gydF4y2Ba氯仿/甲醇(2:1,v/v)。脂质提取在25 ml玻璃管中进行，管内有特氟龙内衬螺旋盖。在Mic, R和G样品中加入甾醇内标(10 μg表前列醇)，但不加入一个Mic样品(Mic- std)。然后将所有溶液与MetOH/氯仿2:1 (v/v)混合，摇匀并在4°C下放置过夜。第二天，加入氯仿至MetOH/氯仿的最终比例为2:4 (v/v)，并在320下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba收集含甾醇的下层相，在氮通量下干燥，用乙醇洗涤一次，再次干燥。用乙醇KOH (1 ml EtOH, 100 μl KOH (11 N))皂化脂质。在80°C加热1小时后，2毫升小时gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba分别加入0和2 ml己烷，离心(320gydF4y2BaggydF4y2Ba(8分钟)。上部相在氮通量下蒸发至干燥。然后加入100 μl的硅烷化剂(BSTFA/TMCS混合物(5:1 v/v))衍生化，80℃加热1小时。加入400 μl己烷后，用气相色谱法测定样品中的甾醇含量。gydF4y2Ba

气相色谱分析在配备火焰电离检测器的Agilent 7890气相色谱仪上进行，色谱柱为Varian Factor 4 vf - 5ms毛细管柱(15 M, 0.32 mM i.d × 0.25 μm膜厚)。样品在无分裂模式下手动进样(1 μl)(在30秒内进行分裂;注入器温度240℃)。载气为氦气，流速为1.5 ml/min，恒流模式。温度程序以9°C/min的速度从120°C编程到240°C。使用Agilent EZ Chrom Elite软件处理数据，提供每个感兴趣化合物的保留时间和面积。gydF4y2Ba

鞘脂长链碱基的定量gydF4y2Ba

DIM和微粒体组分的LCB含量按先前描述的caas测定gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba从三个单独的实验中得出。简单地说，LCB通过在1ml二氧六环和1ml 10% (w/v) Ba(OH中于110°C直接孵育过夜从馏分中释放出来。gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在水中配制的溶液。孵育前，将用于定量的标准LCB (d14:1, d17:1和d20:0)直接加入到二烷/钡混合物中(每个标准LCB/样品10 μg)。冷却后加入6ml蒸馏水，用4ml二乙醚提取两次LCB。混合的二乙醚相在氮通量下干燥。将干燥的残留物溶解在含有100 μl新鲜制备的0.2 M偏碘酸盐(NaIO)的1 ml甲醇中gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)解决方案。将提取的LCB氧化成醛，然后按照Kojima的描述，在室温和轻微震动下，在黑暗中进行1小时gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]。lcb衍生的长链醛在加入1ml水后提取到1ml己烷中。为浓缩样品，将含醛的己烷相在氮气通量下干燥，最后将醛在100 μl己烷中重悬，注入GC-MS。gydF4y2Ba

lcb衍生脂肪醛的分离采用30 M × 250 μm HP-5MS毛细管柱(5%苯基甲基硅氧烷，0.25 μm膜厚，Agilent)，载气速度为2 ml/min;注射为无分裂模式;进样器和质谱检测器温度设置为250°C (Agilent 6850与质量分析仪Agilent 6975耦合);烤箱温度保持在50°C 1分钟，然后编程25°C/min斜坡到150°C(2分钟保持)，10°C/min斜坡到210°C, 75°C/min斜坡到320°C(5分钟保持)。通过气相色谱分离和质谱检测，根据脂肪醛的保留时间和破碎度进行鉴定[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。测定了每个感兴趣的分子种类的离子电流，并通过与适当的内标准进行比较，进一步用于计算分子的数量。这些结果以微克表示。考虑到单个lcb衍生醛的分子量，计算每个分子种类的摩尔量，并以摩尔%表示。gydF4y2Ba

一维SDS-PAGE和纳米lc -MS/MS分析gydF4y2Ba

微粒体和DIMs样品(20 μg蛋白质当量)与Laemmli缓冲液按1比1混合[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]无需任何加热变性步骤。样品被分离到12%的聚丙烯酰胺小凝胶上，用4.5%的堆叠凝胶，用胶体蓝(G250)染色蛋白质。沿短(1°Cm)迁移分离蛋白质。将单个凝胶通道切成7片，用于凝胶内消化和LC-MS/MS分析。每个切片用水冲洗，并用100 mM NH完全去除gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba50%乙腈(ACN)。加入100 μl的50 mM NH进行还原gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba10 μl的10 μm TCEP (Tris(2-羧基乙基)磷酸HCl)在37℃下反应30 min。加入100 μl的50 mM碘乙酰胺烷基化蛋白质，在20℃下黑暗反应40 min。凝胶切片先用水洗涤，然后ACN洗涤，最后干燥30 min。gydF4y2Ba为胶液gydF4y2Ba用胰蛋白酶在Progest系统(Genomic Solution, East Lyme, CT, USA)中按照标准方案进行消化。凝胶片用10% (v/v)乙酸、40% (v/v)乙醇和ACN连续洗涤两次。然后用25 mM NH连续洗涤两次gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba和雨。随后用125 ng改性胰蛋白酶(Promega)溶于20% (v/v)甲醇和20 mM NH，在37°C下消化6小时gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba．先用2% (v/v) TFA和50% (v/v) ACN提取多肽，再用纯ACN提取多肽。将肽提取物干燥后悬浮于0.05% (v/v) TFA、0.05% (v/v) HCOOH和2% (v/v) ACN的20 μl溶液中。gydF4y2Ba

质谱分析对每个DIM部分(R和G)进行2个独立重复。肽段分离使用Eksigent 2d超纳米olc (Eksigent Technologies, Livermore, CA, USA)，配备C18色谱柱(5 μm, 15°Cm × 75 μm, PepMap, LC包装)。流动相为溶剂梯度a为0.1% HCOOH (v/v)水溶液，B为99.9% ACN (v/v)水溶液，0.1% HCOOH (v/v)水溶液。以0.3 μl/min的流速，使用溶剂B从5%到30%的线性梯度，在60 min内分离多肽，然后在10 min内增加到95%。洗脱后的多肽使用LTQ XL离子阱(热电子)使用纳米电喷雾界面在线分析。电离(1.5 kV电离电位)通过液体结和无涂层毛细管探针(10 μm i.d;新的目标)。使用Xcalibur 2.0.7对肽离子进行分析，获取步骤与数据相关[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba全质谱扫描(质荷比)gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba(2) MS/MS (qz = 0.25，激活时间= 30 MS，碰撞能量= 35%，质心模式)。对步骤1中检测到的三种主要离子重复步骤2。动态排除设置为45秒。gydF4y2Ba

蛋白质鉴定和定量gydF4y2Ba

使用Mascot搜索引擎(gydF4y2Bahttp://www.matrixscience.comgydF4y2Ba)gydF4y2BaMedicago truncatulagydF4y2Ba伪分子数据库(gydF4y2Bahttp://www.jcvi.org/cgi-bin/medicago/annotation.cgigydF4y2Ba版本3.5v3(47529个条目)。胰蛋白酶消化设定为酶促裂解，甲硫氨酸的羧酰胺甲基化和氧化分别定义为固定修饰和可变修饰。前驱体质量精度设定为2.0 Da，碎片质量公差为0.5 Da。作为过滤的第一步，通过查询自制的污染物数据库来去除与角蛋白或胰蛋白酶相对应的序列。根据至少两个E值小于0.05的肽的存在来验证鉴定的蛋白质。为了考虑冗余，蛋白质根据Legoo服务器(gydF4y2Bahttp://www.legoo.org/gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

通过归一化光谱丰度因子(NSAF)分析实现蛋白质组学数据的量化[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。由于NSAF表示百分比，因此所有数据都进行了sin平方根变换，以获得可检验正态性的值分布[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba在95%的置信区间内使用Kolmogorov-Smirnov检验。方案对蛋白质丰度的影响由学生分析gydF4y2BatgydF4y2Ba使用XLSTAT软件包进行测试。gydF4y2Ba

计算机预测gydF4y2Ba

根据Phobius算法预测α -螺旋TM跨度和信号肽(gydF4y2Bahttp://phobius.sbc.su.segydF4y2Ba)，而网上工具(gydF4y2Bahttp://biophysics.biol.uoa.gr/PRED-TMBB/input.jspgydF4y2Ba)被用来歧视gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-膜-链蛋白结构域。n -肉豆蔻酰化、s -棕榈酰化和GPI锚点预测由(gydF4y2Bahttp://mendel.imp.ac.at/myristate/SUPLpredictor.htmgydF4y2Ba), (gydF4y2Bahttp://csspalm.biocuckoo.org/online.phpgydF4y2Ba)，及(gydF4y2Bahttp://gpi.unibe.ch/gydF4y2Ba),分别。鉴定的蛋白的密切同源物gydF4y2BaMedicagogydF4y2Ba在The Arabidopsis Information Resource [gydF4y2Ba70gydF4y2Ba) (gydF4y2Bahttp://www.arabidopsis.org/gydF4y2Ba)数据库具有至少70%的成对一致性和截断期望值egydF4y2Ba^40gydF4y2Ba．如有需要，氯气(gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/gydF4y2Ba)预测cTP，并在HAMAP数据库(gydF4y2Bahttp://www.pdg.cnb.uam.es/cursos/Leon_2003/pages/visualizacion/programas_manuales/spdbv_userguide/us.expasy.org/sprot/hamap/families.htmlgydF4y2Ba)，对质体基因组编码的蛋白质进行评估。gydF4y2Ba

支持数据的可用性gydF4y2Ba

支持本文结果的数据集包含在本文及其附加文件中。gydF4y2Ba

我们感谢法国国家研究机构(Agence Nationale de la Recherche) TRANSMUT ANR-10- blan -1604-0、Germaine de Stael项目(TRANSBIO 26510SG)、勃艮第大区委员会(PARI Agrale 8)、法国ANR PANACEA-ANR-NT09_517917和r gion Aquitaine的财政支持。我们感谢波尔多(波尔多)的msamtabolome - lipidome (gydF4y2Bahttp://www.biomemb.cnrs.fr/page_8ENG.htmlgydF4y2Ba；gydF4y2Bahttps://www.bordeaux.inra.fr/umr619/RMN_index.htmgydF4y2Ba)由法国基础设施研究项目资助，合同MetaboHUB-ANR-11-INBS-0010提供设备。我们感谢来自PAPPSO平台(Gif/Yvette, France)的beno t Valot进行了质谱分析。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. UMR1347 INRA/Agrosup/勃艮第农业大学，Pôle相互作用植物-微生物- erl6300 CNRS, 17 Rue Sully, Dijon Cedex, BP 86510, F-21065gydF4y2Ba

   Christelle Guillier, Jean-Luc Cacas, Ghislaine Recorbet, Arnaud Mounier, francaloise Simon-Plas, Daniel Wipf和Eliane Dumas-GaudotgydF4y2Ba

2. 法国国家科学研究中心，法国波尔多大学膜生物资源实验室，UMR 5200，法国维伦纳夫奥农，F-33000gydF4y2Ba

   Jean-Luc Cacas和ssambastien MongrandgydF4y2Ba

3. UMR CSGA:法国营养科学中心，UMR 6265 CNRS, 1324 INRA-uB，法国第戎gydF4y2Ba

   尼古拉斯DepretregydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaChristelle GuilliergydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

CG构思研究并进行DIM纯化。她还进行了蛋白质和甾醇提取，蛋白质鉴定和表征。GR与CG和JLC一起参与了数据分析和稿件准备。SM和JLC对鞘脂进行鉴定和定量。ND设计并进行了甾醇气相色谱分析。AM为蛋白质表征提供了信息学支持。FSP参与了DIM制剂的设计，并参与了稿件的准备。DW提供了分析设计和财务支持。EDG参与了项目的设计和稿件的准备。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇基于知识共享署名许可(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0gydF4y2Ba)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作品要有适当的署名。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba