紫色与非紫色胡萝卜花青素生物合成相关结构基因转录谱分析(胡萝卜胡萝卜L.)品种显示出不同的模式

背景

胡萝卜(胡萝卜胡萝卜L.)是全球种植的10种最具经济价值的蔬菜作物之一。紫色胡萝卜品种在其主根中以不依赖光的方式积累丰富的花青素，而其他颜色的胡萝卜品种则没有。花青素是植物重要的次生代谢产物，保护植物免受强光、重金属和病原体的伤害。此外，它们是人体健康的重要营养素。紫胡萝卜品种花青素积累和非紫胡萝卜品种花青素产量损失的分子机制尚不清楚。

结果

3个紫胡萝卜品种的主根均富含花青素，且在发育过程中含量逐渐增加。相反，6个非紫色胡萝卜品种的主根地下部分花青素积累失败。六个新的结构基因，CA4H1，CA4H2，4 cl1，4氯，CHI1,F3'H1，从紫色胡萝卜中分离出来。我们分析了这些基因以及其他已知参与花青素生物合成的结构基因在3个紫色胡萝卜品种和6个非紫色胡萝卜品种60 d龄时的表达谱。PAL3 / PAL4，CA4H1,4 cl1紫色胡萝卜的表达量高于非紫色胡萝卜品种。的表达CHS1，CHI1，F3H1，F3'H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2这些基因在紫色胡萝卜主根中高表达，而在非紫色胡萝卜主根中不表达或几乎不表达，与花青素的存在高度相关。

结论

本研究从胡萝卜中分离出6个参与花青素生物合成的新型结构基因。在分析的13个结构基因中，PAL3 / PAL4，CA4H1，4 cl1，CHS1，CHI1，F3H1，F3'H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2可能参与紫胡萝卜主根花青素的生物合成。CHS1，CHI1，F3H1，F3'H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2可能导致橙色和黄色胡萝卜失去不依赖光的花青素生产。这些结果表明，紫色胡萝卜品种主根花青素的产生和非紫色胡萝卜品种花青素产量的减少与许多结构基因有关。非紫色胡萝卜品种主根中不表达或几乎不表达的基因可能是由于调控基因失活所致。我们的研究结果为胡萝卜和其他根茎类蔬菜在分子水平上的花青素生物合成提供了新的见解。

花青素是一种分布广泛的水溶性色素，属于植物化学物质类黄酮类。已经鉴定出超过635种花青素[1]。这些植物主要含有六种常见的苷元(花青素、天竺葵苷、飞燕草苷、芍药苷、矮花苷和锦葵苷)和各种类型的糖基化和酰基化化合物[2]。花青素保护植物免受强光、重金属和病原体的侵害，在花中起着重要作用[3.]、[4]。由于它们毒性低且颜色多样，因此经常被用作合成着色剂的健康替代品[5]。先前的研究已经证实，花青素为人体健康提供抗氧化剂，可以预防多种疾病，包括高血胆固醇水平、心血管疾病和紫外线辐射损伤。2]、[6]-[8]。

胡萝卜(胡萝卜胡萝卜L.)是全球种植的10种最具经济价值的蔬菜作物之一[9]。胡萝卜品种有五种主根颜色类型:紫色、橙色、黄色、红色和白色。虽然橙胡萝卜品种(d .胡萝卜ssp。巨大成功var。巨大成功)占产量的大部分，紫胡萝卜(d .胡萝卜ssp。巨大成功var。atrorubens)越来越受欢迎，很大程度上是因为它们的果肉主根中含有大量的花青素。紫色胡萝卜品种已经存在了3000多年，比橙色胡萝卜品种要古老得多[10]。紫色胡萝卜中的花青素通常被用作糖果、冰淇淋和饮料中的天然食用色素，这是因为它们在高温和光照下保持稳定，并且pH值增加[11]、[12]。紫胡萝卜主要含有花青素类花青素;有些品种的主根中还含有微量的芍药苷或芍药苷基花青素[13]。

花青素的生物合成途径在许多植物物种中得到了广泛的研究，包括越桔(Vaccinium myrtillusL.)，葡萄(葡萄)，苹果(马吕斯×有明显)，拟南芥（拟南芥)、Mitchell petnia [佩妮axillaris×(佩妮axillaris×佩妮矮牵牛简历。“天堂的玫瑰”)和甘薯(番薯甘薯林林总总)[14]-[20.]。参与花青素生物合成途径的基因有两类:结构基因和调控基因。结构基因编码的酶直接催化导致花青素形成的反应步骤;这些基因的转录是由调控基因控制的，如MYB，bHLH,WD40基因(16]、[17]、[21]。参与花青素生物合成的结构基因已经在许多植物物种中被鉴定出来[14]-[18]、[20.]-[23]。在胡萝卜中也发现了一些参与这一途径的功能基因;这些基因包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)、黄酮3-羟化酶(F3H)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)和白花青素双加氧酶(LDOX)基因[24]。我们描述了udp -半乳糖的存在:花青素3-O-半乳糖转移酶(UCGT)在我们前期研究中紫色胡萝卜品种中的表达[25]。然而，肉桂酸4-羟化酶(CA4H)、4-香豆醇辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮-黄酮异构酶(CHI)和类黄酮3'-羟化酶(F3'H)基因尚未在胡萝卜中发现。

为了深入了解紫色和非紫色胡萝卜品种花青素生物合成的差异，我们从主根来源的cDNA中克隆了6个新的花青素生物合成结构基因。从转录水平分析了3个紫色胡萝卜品种和6个非紫色胡萝卜品种主根中13个结构基因的表达模式。平行测定了花青素的积累量。这项工作的目的是确定花青素生物合成途径关闭的阶段，从而导致非紫色胡萝卜品种花青素的损失。

9个胡萝卜品种在不同发育阶段的主根颜色

花青素在胡萝卜主根不同部位、不同发育阶段积累;这导致主根呈现紫色或深色。在60 d龄的胡萝卜中，花青素积累在‘深紫’和‘紫68’主根的皮层和木质部，但只在‘天子号’的皮层(图2)1)。在其他6个胡萝卜品种中，主根未检测到紫色或深色。‘深紫’、‘紫68’和‘天子号’主根的皮层、韧皮部和木质部都有花青素的积累。在其他6个品种中，除了‘黑田’、‘三红六村’和‘军川红’的90日龄和120日龄的下胚轴根外，这些主根部位未检测到紫色或深色;当暴露在光线下时，表皮呈现深色(图2)2)。120日龄的‘三红六村’和90日龄的‘君川红’主根的下胚轴衍生部分未受光照，表皮未见紫色或深色。

9个不同发育阶段胡萝卜品种主根花青素含量的比较

3个紫色胡萝卜品种(‘深紫’、‘紫68’和‘天子2号’)的主根总花青素含量在发育过程中显著增加(图2)3.)。这些品种在生长60 ~ 90天的主根中积累花青素的效率高于生长90 ~ 120天的主根。紫68的主根花青素含量在3个紫胡萝卜品种中均最高。3个橙色胡萝卜品种(‘黑田’、‘三红六村’和‘君川红’)的主根在60 d后未检测到花青素。90 d时，‘黑田’主根和‘三红六村’主根花青素含量分别为6.47 mg/100 g鲜重(fw)和1.35 mg/100 g fw;‘君川红’主根在本阶段未检测到花青素。‘黑田’、‘三红六村’和‘君川红’120 d主根花青素含量分别为0.56、0.21和0.23 mg/100 g。3个黄胡萝卜品种在3个生育期的主根中均没有花青素的积累。

胡萝卜花青素基花青素生物合成结构基因分析

由于花青素基花青素几乎代表了胡萝卜中所有花青素的含量，我们分析了花青素基花青素生物合成的结构基因。我们在紫色胡萝卜中提出了以下基于花青素的花青素生物合成途径(图1)4)。朋友，CA4H,4 cl与胡萝卜花青素生物合成的一般苯丙素途径有关的编码酶。CHS，气，F3H，F3'H，DFR，LDOX,UCGT胡萝卜花青素生物合成花青素途径的编码酶。这些基因的全名及其在GenBank和CarrotDB中对应的登录号列于表中1［25]。

PAL1(基因库ID: D85850.1),PAL3(基因库ID: AB089813.1),PAL4(基因库ID: AB435640.1),CHS1(基因库ID: AJ006779.1),CHS2(基因库ID: D16255.1),CHS9(基因库ID: D16256.1),F3H1(基因库ID: AF184270.1),DFR1(基因库ID: AF184271.1),LDOX1(GenBank ID:AF184273.1)LDOX2基因(GenBank ID:AF184274.1)存在于GenBank中。的CA4H1，CA4H2，4 cl1，4氯，CHI1,F3'H1使用基于blast的搜索工具在CarrotDB中鉴定基因;通过对“深紫”品种基因的克隆和测序，进一步鉴定了这些基因。这些基因的核苷酸和推导出的氨基酸序列保存在国家生物技术信息中心(NCBI)。的NCBI接入号CA4H1，CA4H2，4 cl1，4氯，CHI1,F3'H1列于表中1．

的PAL3和PAL4，CHS2和CHS9,LDOX1和LDOX2基因被认为是等位基因，因为它们在核苷酸序列上具有很高的同一性(>95%);此外，在CarrotDB中每对基因只发现一个对应的基因。因此，每对基因只使用一对特异的引物进行定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)。

以花青素为基础的花青素生物合成基因在60日龄主根中的表达

紫胡萝卜品种在生长60 d时，主根中花青素积累较多。每个花青素生物合成基因用于qRT-PCR的引物对核苷酸序列见表2．PAL3 / PAL4，CA4H1，4 cl1，CHS1，CHI1，F3H1，F3'H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2‘深紫’、‘紫68’和‘天子2号’主根的转录本丰度显著高于‘黑田’、‘三红六村’、‘君川红’、‘贝约1719’、‘七头黄’和‘白玉’主根(图2)5)。相关分析结果显示CHS1，CHI1，F3H1，F3'H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2与花青素生物合成中花青素途径相关的基因编码酶与花青素的存在高度相关(附加文件1:表1)。

其中，“深紫色”的直根mRNA水平最高PAL3 / PAL4，CA4H1，4 cl1，CHS1，F3H1，F3'H1,LDOX1 / LDOX2．紫68的直根mRNA水平最高PAL1，4氯,DFR1．“天子号”的直根mRNA水平最高CA4H2和CHI1的mRNA水平最高，而“黑田”的mRNA水平最高CHS2 / CHS9在主根。

转录水平PAL1和CA4H2都低于PAL3 / PAL4和CA4H1，在所有胡萝卜品种的主根中分别存在。转录水平4氯在“黑田”主根中，“君川红”、“贝约1719”、“七头黄”和“白玉”的含量高于“黑田”4 cl1而“深紫”、“紫68”、“天子号”和“三红六村”的直根较低。在三个紫胡萝卜品种中，mRNA丰度为CHS2 / CHS9在主根上显著低于CHS1．在其他六个胡萝卜品种中，CHS2 / CHS9mRNA表达水平与CHS1在主根(图2)5)。

在许多植物中，花青素的生物合成可以是不依赖光的，也可以是光诱导的。不依赖光的花青素生物合成途径已经在其他植物物种中进行了研究，包括苹果和甘薯[16]、[22]。光诱导的花青素生物合成已经在一些植物物种中被观察到，包括苹果、葡萄和米切尔矮牵牛[18]、[20.]、[23]。紫胡萝卜品种可在主根光照下独立产生丰富的花青素。黄胡萝卜的主根不能产生花青素，橙胡萝卜的下胚轴根表皮只能产生少量花青素。为了确定紫色胡萝卜中参与光不依赖性花青素生物合成的基因和非紫色胡萝卜中负责光不依赖性花青素生产损失的基因，我们分析了3个紫色和6个非紫色品种的花青素途径结构基因。

一些结构基因(PAL1，PAL3 / PAL4，CHS1，CHS2 / CHS9，F3H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2)，并在紫外光下分析了它们的表达谱[24]、[26]。我们之前的研究证实了这一点UCGT1紫色胡萝卜品种的表达[25]。在这项研究中，6个结构基因(CA4H1，CA4H2，4 cl1，4氯，CHI1,F3'H1对紫色(“深紫色”)和非紫色(“黑田”)胡萝卜品种进行了克隆和测序。PAL3 / PAL4，CA4H1，4 cl1，CHS1，F3H1，F3'H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2这些基因在紫色胡萝卜中的表达水平高于非紫色胡萝卜，可能参与了紫色胡萝卜花青素的生物合成。CHS1，CHI1，F3H1，F3'H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2紫色胡萝卜品种主根中花青素表达量高，而非紫色胡萝卜品种主根中花青素表达量低或不表达。这表明这些基因主要导致了非紫色胡萝卜品种花青素产量的损失。在红薯中也观察到类似的结果[22]。非紫色胡萝卜主根花青素的损失可能是由于调控基因失活所致MYB，bHLH,WD40基因。未来的研究将集中在控制这些结构基因表达的转录因子上，以确定紫色胡萝卜品种花青素产生的关键基因和非紫色胡萝卜品种花青素损失的关键基因。

紫胡萝卜的主根含有丰富的花青素，某些品种的花青素含量最高可达175 mg/100 g fw [27]。在本研究中，三个紫胡萝卜品种在三个不同时期的主根中花青素含量变化显著，从根部着色程度上可以直观地看出。3个紫胡萝卜品种60日龄主根花青素含量与先前报道的几种紫胡萝卜基因型相当[13]。在90天和120天的紫色胡萝卜中，花青素含量高于先前报道，这可能是由于胡萝卜的生长条件和收获时间不同[13];胡萝卜中的花青素积累对生长条件的变化很敏感，如温度、光照和营养[28]-[30.]。3个紫胡萝卜品种120 d主根花青素含量高于草莓、红洋葱和红葡萄，但低于蓝莓[31]。3个橙胡萝卜品种的下胚轴根经光照后，花青素在表皮中积累。这表明在这些橙胡萝卜品种中存在光诱导花青素生物合成途径。

紫色胡萝卜品种在主根光照下独立产生丰富的花青素，而非紫色品种则没有。紫胡萝卜品种花色苷含量随根系生长而增加。对紫色胡萝卜和非紫色胡萝卜中存在的6个新的候选结构基因进行了克隆和测序。PAL3 / PAL4，CA4H1，4 cl1，CHS1，CHI1，F3H1，F3'H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2可能参与紫胡萝卜主根花青素的生物合成。CHS1，CHI1，F3H1，F3'H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2在非紫色胡萝卜中不表达或几乎不表达，因此可能导致橙色和黄色胡萝卜中不依赖光的花青素生产的损失。我们的研究结果为胡萝卜花青素在分子水平上的生物合成提供了新的见解，对其他根茎类蔬菜具有重要意义。

植物材料和生长条件

本研究选用了3个紫色胡萝卜品种(“深紫”、“紫68”和“天子号”)，3个橙色胡萝卜品种(“黑田”、“三红柳村”和“君川红”)，3个黄色胡萝卜品种(“贝约1719”、“七头黄”和“白玉”)(图1)2)。在受控的人工气候室内，将种子播种在含有土壤/蛭石混合物(1:1)的花盆中，光照12小时(2000-3000勒克斯)，黑暗12小时，昼夜温度为22°C/18°C。胡萝卜在同样的条件下生长。收获60、90和120天龄的胡萝卜主根，立即在液氮中冷冻，并在-70°C下保存以备将来分析。每个胡萝卜品种在每个生育期取样3根主根。

花青素含量的测定

在提取花青素之前，胡萝卜主根在液氮的存在下磨成细粉。胡萝卜主根总花青素含量按照先前描述的方法测定[20.]。总花青素含量以mg花青素3-为单位O-每100克fw半乳糖苷当量(mg/100克fw)。数值为三个独立实验的平均值。

RNA分离和cDNA合成

根据制造商的说明，使用RNA简易总RNA试剂盒(Tiangen, Beijing, China)从胡萝卜的主根中提取总RNA。采用PrimeScript RT试剂盒和gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒(Takara，大连，中国)，按照制造商的方案，从1 μg总RNA合成第一链cDNA。cDNA稀释20倍用于基因克隆和qRT-PCR分析。

基因鉴定、克隆和测序

从NCBI的基因库中检索基因的核苷酸序列。未从NCBI中获取的基因使用胡萝卜的基因组和转录组数据库进行搜索[25]。根据先前描述的方法，通过对' Deep purple '的克隆和测序进一步鉴定了基因[32]。

存在分析

采用引物5设计qRT-PCR引物对，引物温度为59-62℃，长度为19-24 bp, GC含量为45-55%(表5)2)。采用MyiQ实时荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad)和SYBR预混料进行qRT-PCR检测Ex-Taq(Takara)按照制造商的协议。每次反应共20 μL，含SYBR预混料10 μLEx-Taq，稀释后的cDNA 2 μL，每个引物0.2 μM, ddH 7.2 μL₂O. qRT-PCR条件为:95℃变性30 s;95°C循环40次，持续10 s;60°C, 30 s。为了确认扩增子纯度，在qRT-PCR结束时，在60-95°C的温度范围内进行熔融曲线分析。的DcActin1基因被用作内部标准。每个胡萝卜品种采用3个生物RNA样品进行生物重复试验。

统计分析

不同胡萝卜基因型间结构基因表达水平差异采用Duncan 's多量程检验，在0.05显著水平上进行统计学分析。通过相关分析确定花青素生物合成花青素途径相关酶基因表达水平之间的关系(CHS1，CHS2 / CHS9，CHI1，F3H1，F3'H1，DFR1,LDOX1 / LDOX2)和花青素含量经logistic回归分析，显著性水平为0.05。

支持本文结果的数据包含在文章中。

构思设计实验:ASX ZSX。进行实验:ZSX YH FW SX GLW ASX。分析数据:ZSX。贡献试剂/材料/分析工具:ASX。论文作者:ZSX。修改论文:ZSX ASX。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

朋友:

苯丙氨酸ammonia-lyase

CA4H:

肉桂酸4-hydroxylase

4 cl:

4-香豆醇辅酶A连接酶

CHS:

查耳酮合酶

气:

Chalcone-flavonone异构酶

F3H:

黄烷酮3-hydroxylase

F3'H:

类黄酮3 ' -羟化酶

DFR:

Dihydroflavonol 4-reductase

LDOX:

Leucoanthocyanidin加双氧酶

UCGT:

UDP-galactose:花青色素3 -O半乳糖基转移酶

项目资助:新世纪高校优秀人才项目(NCET-11-0670);江苏省自然科学基金项目(BK20130027);中国博士后科学基金(2014-M551609);江苏省高等学校重点学科建设项目和江苏省双创工程。

从属关系

1. 南京农业大学园艺学院作物遗传与种质改良国家重点实验室，江苏南京210095

   徐志生，黄颖，王峰，宋雄，王光龙，熊爱生

相应的作者

对应到Ai-Sheng熊．

相互竞争的利益

作者宣称不存在利益竞争。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。

本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。

如欲查阅本许可证副本，请浏览https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．

创作共用公共领域免责声明(https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

转载及权限