香杨萜类合成酶及其对草食诱导挥发物排放的贡献(gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2Ba）gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

作为对毛虫取食的反应，杨树释放出一种复杂的挥发物混合物，其中包括几种化合物。据报道，杨树挥发物在植物与昆虫的相互作用以及植物内部和植物间的交流中起着信号作用。虽然挥发性混合物主要由单萜和倍半萜组成，但关于它们在杨树中的形成还有很多需要了解的。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

本文报道了西苦瓜(gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2Ba)，由38名成员组成。11gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因(gydF4y2BaPtTPS5gydF4y2Ba-gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)可从舞毒蛾(gydF4y2BaLymantria dispargydF4y2Ba)损坏gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba叶片及异种表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba发现10种编码酶具有TPS活性。分析gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba草食受损叶片和未受损对照叶片的转录本丰度表明，gydF4y2BaPtTPS6gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtTPS7gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtTPS9gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtTPS10gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtTPS12gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtTPS13gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtTPS15gydF4y2Ba，均在草食后显著上调。以单叶为食的吉卜赛蛾gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba树木受损叶片诱导释放挥发性物质，而相邻未受损叶片诱导不释放挥发性物质。此外，茉莉酸及其异亮氨酸缀合物的浓度以及gydF4y2BaPtTPS6gydF4y2Ba基因表达仅在受损叶片中增加，表明在树内没有发生系统诱导。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的数据表明，草食诱导的挥发性萜烯的形成gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba主要是受转录积累的多重调控吗gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba可能是由茉莉酸盐介导的。草食动物受损的叶子在局部释放的挥发物可能有助于草食动物的敌人在树冠上找到它们的宿主或猎物。gydF4y2Ba

挥发性有机化合物(VOCs)在植物与环境的相互作用中发挥着多种作用。例如，花和果实的挥发性有机化合物分别被认为是传粉媒介和种子传播者的引诱剂，而据报道，植物性挥发性有机化合物在植物间和植物内部的交流以及植物对食草动物和病原体的防御中具有各种功能[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。植物营养器官挥发性有机化合物的排放通常是由生物胁迫引起的，如昆虫的食草性[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。这种诱导的挥发性混合物可以吸引食草动物的天敌，这种反应被称为间接防御[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。例如，草食动物出没的挥发性混合物gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba、黑杨树(gydF4y2Ba杨树黑质gydF4y2Ba)和玉米(gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba)对不同的拟寄生物有吸引力[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]-[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。然而，除了作为间接防御信号的作用外，食草动物诱导的植物性挥发性有机化合物还可以作为食草动物的毒素和驱虫剂发挥直接防御作用[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]-[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

一般来说，草食动物诱导的挥发性混合物通常以萜烯为主，但也包括其他种类的天然化合物，包括绿叶挥发物、醇、酯和含氮挥发物。萜烯是植物次生代谢物中数量最多、种类最多的一类[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。它们是由类异戊二烯(CgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba甲羟戊酸途径或2- c -甲基赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径中产生的单位。这种C的从头到尾的凝结gydF4y2Ba_5gydF4y2Ba由戊烯基转移酶催化的单元可形成香叶基二磷酸(GPP)、法尼基二磷酸(FPP)和香叶基香叶基二磷酸(GGPP)。萜烯合成酶(tps)是萜烯代谢的关键酶，它将这些前体转化为大量不同的萜烯碳骨架[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。大多数植物基因组都具有一个中等大小的编码萜烯合成酶的基因家族[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。根据它们的系统发育关系，植物tps可分为7个不同的支系[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。TPS-a、TPS-b和TPS-g是被子植物特有的分支，其中TPS-a分支主要含有倍半萜合成酶，TPS-b和TPS-g分支主要含有单萜合成酶。含有单萜类、倍萜类和二萜类合成酶的TPS-d分支和含有二萜类合成酶的TPS-h分支是裸子植物和番茄植物。gydF4y2Ba卷柏moellendorfiigydF4y2Ba)具体，分别。裸子植物和被子植物共酚二磷酸合成酶(CPS)和丁香烯合成酶(KS)分别构成TPS-c和TPSe/f分支。最近，在植物中发现了一类新的萜烯合成酶gydF4y2Ba美国moellendorffiigydF4y2Ba与微生物萜类合成酶序列相似，被命名为微生物萜类合成酶(MTPSL)基因[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

虽然少数萜烯合成酶在植物初级代谢中发挥作用，例如赤霉素的生物合成，但大多数萜烯合成酶在参与生态相互作用的次生代谢物的生物合成中起作用。由于在草食诱导的挥发性混合物中萜烯的显著存在[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，萜烯合成酶受到了很多关注，并且有很多证据表明它们参与植物防御。例如，从野生番茄(gydF4y2Ba茄属植物habrochaitesgydF4y2Ba)注入栽培番茄品系，结果增加了对食草动物的抵抗力[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。中芳樟醇合成酶的过度表达gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba也增加了这种植物对蚜虫的抵抗力[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。此外，草食诱导的利马豆萜类合成酶(gydF4y2Ba种豆科gydF4y2Ba)和玉米，例如，据报道产生倍半萜烯，这种萜烯已被证明能吸引食草昆虫的天敌[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

关于植物对草食反应的大部分信息主要基于草本植物。然而，近年来越来越多的研究开始对裸子植物和被子植物的木本植物进行挥发物介导的植物防御。例如，众所周知，杨树在被食草动物破坏后会释放出一种复杂的挥发性混合物[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。虽然单萜和倍半萜被认为是最主要的化合物，但迄今为止从杨树中仅分离和表征了8个萜烯合成酶基因。这些包括异戊二烯合成酶(IPS)gydF4y2Bap·阿尔巴gydF4y2BaxgydF4y2Bap . tremulagydF4y2Ba(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]， PtdTPS1 fromgydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2BaxgydF4y2Bap .摘要gydF4y2Ba(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]、黑杨树的PnTPS1及PnTPS2 (gydF4y2Bap .黑质gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]和四种TPS (PtTPS1-4)来自西部苦瓜(gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba) [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba的种类gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba已经完全排序了[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在本报告中，我们描述了鉴定和功能表征gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因家族gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba由三十八名成员组成。15gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba可以从草食损害的叶片中分离到基因，其中11个以前没有被鉴定过。qRT-PCR分析显示，这些基因大部分在草食后表达上调，表明它们可能参与植物防御。为了更详细地研究草食动物诱导的挥发物生物合成的空间调控，我们对草食动物侵染的单叶和相邻的未侵染的单叶进行了全面的挥发物收集，并将观察到的挥发物的挥发模式与其他叶片进行了比较gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因表达数据以及这些组织中的植物激素水平。gydF4y2Ba

毛霉TPS基因家族gydF4y2Ba

来确定的成员gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因家族gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba，我们使用杨树基因组的第二个改进版本(v3组装)进行BLAST分析，gydF4y2Bahttp://www.phytozome.net/poplargydF4y2Ba)。该分析显示了38个全长gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba编码最小长度为520个氨基酸的假定蛋白质的基因，包括先前发表的基因gydF4y2BaPtTPS1gydF4y2Ba-gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。此外,19gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba在数据库中找到了基因片段。Bacterial-likegydF4y2Ba支持gydF4y2Ba正如前面所描述的gydF4y2Ba美国moellendorffiigydF4y2Ba(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]在杨树基因组中没有被发现。七个中的六个gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba38株杨树的基因亚家族均有分布gydF4y2Ba支持gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1) [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。的gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba亚族有16个成员和gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2BabgydF4y2Ba杨树亚科有17个成员，占多数gydF4y2Ba支持gydF4y2Ba，而只有两名成员分别落入gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2BacgydF4y2Ba和gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2BaegydF4y2Ba亚家族，只有一个gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因聚集在gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2BafgydF4y2Ba亚科。作为成员gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2BacgydF4y2Ba和gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2BaegydF4y2Ba亚家族最有可能代表共丙二磷酸合成酶和凯伦合成酶(保守的蛋白序列基序见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2)，这些不参与挥发性生物合成，我们在本研究中没有对它们进行更详细的研究。染色体位置被分配到29全长gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba这些基因被发现位于19条杨树染色体中的11条。大约三分之一gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因和一半的gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba在第19号染色体上发现了基因片段，表明该染色体上发生了多次重复和重组事件(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。在其他染色体上，最多3个gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因被发现了。九个gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因和4gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基于新的基因组版本，基因片段未与杨树染色体连锁。许多这些序列具有高度的核苷酸同一性，这使得在基因组中的注释和分配变得困难。因此，人们仍然可以预期杨树的实际数量会发生变化gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因和它们的位置作为杨树基因组的新版本被释放。gydF4y2Ba

杨树TPS基因的分离及其结构特征gydF4y2Ba

利用舞毒蛾(gydF4y2BaLymantria dispargydF4y2Ba)损坏gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba叶，十五开阅框gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因可以被扩增和克隆。其中十一棵代表杨树gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba以前没有被描述过的基因。根据Danner及其同事(2011)的命名法，这些基因被指定为gydF4y2BaPtTPS5gydF4y2Ba来gydF4y2BaPtTPS15gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。基于它们与杨树TPS序列的相似性以及与其他植物TPS序列的相似性(另附文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4)，由gydF4y2BaPtTPS5gydF4y2Ba-gydF4y2Ba15gydF4y2Ba初步分类为4种单萜合成酶(MTS) (PtTPS6、PtTPS12、PtTPS13、PtTPS15)， 6种倍半萜合成酶(STS) (PtTPS5、PtTPS7、PtTPS8、PtTPS9、PtTPS11、PtTPS14)和1种二萜合成酶(DTS) (PtTPS10)。PtTPS5-15的长度都在550到840个氨基酸之间(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S1)，包含典型的保守元素，包括DDxxD基序和NSE/DTE基序(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5)，两者都参与了金属辅因子的结合[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。有趣的是，PtTPS11和PtTPS14具有改变的NSE/DTE基序，其含有甘氨酸残基而不是丝氨酸/苏氨酸。另一个典型的序列基序，RR (x)gydF4y2Ba_8gydF4y2Ban端部分的W基序也改变，表示为RP (x)。gydF4y2Ba_8gydF4y2BaW在PtTPS11和PtTPS14中表达，在PtTPS15中完全缺失。萜烯合成酶的另一个保守蛋白序列是rxr基序，它与底物电离后二磷酸基团的络合有关[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。在PtTPS15中，RxR基序被修改为RxQ，这在PtTPS3中也存在[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。TPS10，一个假定的二萜合成酶，在这个位置显示一个RxK基序(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表1)。gydF4y2Ba

一般来说，MTS和DTS含有n端信号肽，这些肽将这些蛋白质靶向到质体，即GPP和GGPP生物合成的位点[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。相比之下，倍半萜合成酶定位于细胞质中，其中FPP作为该类酶的底物。TargetP 1.1服务器(gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/gydF4y2Ba)用于信号肽预测。预测PtTPS6, PtTPS12和PtTPS13的质体转运肽(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表1)支持它们在质体中作为MTS的作用。然而，对于推测的MTS PtTPS15和DTS PtTPS10，没有信号肽可以预测。gydF4y2Ba

杨树tps的异源表达及体外功能鉴定gydF4y2Ba

对杨树TPS进行功能鉴定，全部分离gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因异源表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。为了确保预测的信号肽不干扰表达，截断了gydF4y2BaPtTPS6gydF4y2Ba(Δ57元),gydF4y2BaPtTPS12gydF4y2Ba(Δ126元)gydF4y2BaPtTPS13gydF4y2Ba(Δ126nt)表示。截断的选择使得RR(x)gydF4y2Ba_8gydF4y2BaW-motif仍然存在。在共底物氯化镁存在的情况下，用GPP、FPP和GGPP检测原料提取物中的蛋白质，分别测定单萜、倍半萜和二萜的形成活性。gydF4y2Ba

所有假定的MTS (PtTPS6、PtTPS12、PtTPS13和PtTPS15)都接受GPP作为底物并产生单萜烯(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaB). PtTPS6形成(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-辛烯为主要产物，少量(gydF4y2BaZgydF4y2Ba) - - -β-ocimene。PtTPS15只产生芳樟醇，而PtTPS12产生芳樟醇和微量的β-茶树烯(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-辛烯和α-萜烯。而PtTPS13产生α-蒎烯、β-蒎烯、sabinene、1,8-桉叶油脑和α-松油醇5种单萜烯。PtTPS6和PtTPS13与FPP孵育未见产物形成。相比之下，PtTPS12显示出广泛的倍半萜产物谱，并产生至少25种不同的倍半萜，其中γ-姜黄烯是主要的一种，PtTPS15能够将FPP转化为神经醇(图1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

6个假定的STS中有4个能够将FPP转化为不同的倍半萜(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaA). PtTPS9产生(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-石竹烯和少量α-葎草烯。相比之下，PtTPS11显示出更广泛的产物谱，包括18种不同的倍半萜，其中-榄香烯、烯丙二烯、β-亚麻烯和一种未识别的倍半萜代表主要峰。PtTPS5也可以观察到这种复杂的产物光谱，产生至少27种不同的倍半萜，以一种未知的倍半萜醇为主，而PtTPS7产生超过15种不同的倍半萜，以元素为主要产物。因为倍半萜烯β-榄香烯(PtTPS11)和榄香烯(PtTPS7)是由石榴烯A的热重排产物[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]和丁香醇[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]，在热气相色谱进样过程中，PtTPS7和PtTPS11的产物也使用较冷的气相色谱进样器(温度，150℃)进行分析。虽然β-榄香烯和榄香烯在GC色谱图中仍然存在，但可以观察到烯甲烯A峰(PtTPS11)和正己烷醇峰(PtTPS7)的扩增，表明这些酶具有真正的活性(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S6)。与PtTPS5、PtTPS7、PtTPS9和PtTPS11相比，假定的STS PtTPS14对FPP仅表现出边际活性，并产生微量的微生物烯D(数据未显示)。然而，PtTPS8不产生倍半萜。当GPP作为底物时，PtTPS11形成了几种单萜烯，包括月桂烯、柠檬烯、萜烯和芳樟醇(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)。对于其他STS, GPP观察到微量活性(PtTPS5, PtTPS7和PtTPS9)或无活性(PtTPS8, PtTPS14)(数据未显示)。正如预测的那样，PtTPS10代表一种DTS，能够将GGPP转化为香叶芳樟醇。GPP和FPP均未被PtTPS10接受。其他tps均不能接受GGPP作为底物。gydF4y2Ba

手性分析表明PtTPS9只形成(-)-对映体。gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-石竹烯(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S7A)。对于PtTPS15，倍半萜产物为(gydF4y2Ba3 sgydF4y2Ba)-橙花醇，而单萜产物为(gydF4y2Ba3 sgydF4y2Ba)-芳樟醇(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S7B, S7C)。外消旋混合物(gydF4y2Ba3 sgydF4y2Ba，gydF4y2Ba3 rgydF4y2Ba)-芳樟醇是由PtTPS12(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S7D)。PtTPS11形成(-)-β-elemene(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S7E)，对应于(+)-germacrene A作为实际的酶产物，因为立体化学构型保留在C7 [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

TPS基因表达受草食性影响gydF4y2Ba

分析是否表达gydF4y2BaPtTPS5gydF4y2Ba-gydF4y2Ba15gydF4y2Ba受到草食的影响，利用qRT-PCR方法在草食受损的顶端叶片(LPI3，叶片质体时间指数(LPI)的详细描述见材料和方法)与对照树各自未受损的叶片中测量了这些基因的转录丰度。的表达水平gydF4y2BaPtTPS5gydF4y2Ba-gydF4y2Ba15gydF4y2Ba食草动物攻击后普遍增加(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。其中6个基因轻微上调，约2- 8倍，转录物积累显著增加gydF4y2BaPtTPS9gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtTPS10gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtTPS12gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtTPS15gydF4y2Ba但不是gydF4y2BaPtTPS5gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtTPS11gydF4y2Ba/gydF4y2Ba14gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表2)。扩增子的重复测序gydF4y2BaPtTPS11gydF4y2Ba/gydF4y2Ba14gydF4y2Ba-qRT-PCR反应显示gydF4y2BaPtTPS11gydF4y2Ba来gydF4y2BaPtTPS14gydF4y2Ba成绩单。一个更大的显著归纳可以显示为gydF4y2BaPtTPSgydF4y2Ba7和gydF4y2BaPtTPS13gydF4y2Ba，受损叶片的转录本丰度分别比未受损对照叶片高24.1倍和13.3倍(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2BaPtTPS6gydF4y2Ba对草食损害的反应最强，转录物丰度增加了44.1倍(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表2)。未进行qRT-PCR分析gydF4y2BaPtTPS8gydF4y2Ba由于没有观察到相应蛋白的活性。总之，qrt分析显示Δ的显著差异gydF4y2BaCqgydF4y2Ba值(gydF4y2BaCqgydF4y2Ba_TPSgydF4y2BaΔgydF4y2BaCqgydF4y2Ba_{辅助基因gydF4y2Ba})。gydF4y2BaPtTPSgydF4y2Ba基因(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S3)。gydF4y2BaPtTPS11gydF4y2Ba/gydF4y2Ba14gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtTPS12gydF4y2Ba有ΔgydF4y2BaCqgydF4y2Ba-大于15表示低表达水平。相比之下，小ΔgydF4y2BaCqgydF4y2Ba-值被观察到gydF4y2BaPtTPS6gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtTPS9gydF4y2Ba表明与另一个相比，转录物丰度更高gydF4y2BaPtTPSgydF4y2Ba基因。gydF4y2Ba

叶龄和位置影响草食诱导的挥发性混合物的定量组成gydF4y2Ba

我们以前的研究[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]已经记录了从整个过程中释放出的复杂的挥发性气味gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba被舞毒蛾破坏后的树木。为了解决萜烯释放是否受叶片年龄和位置影响的问题，我们从单个叶片进行了挥发性收集(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S8)。采用60 m长的WAX(聚乙二醇)色谱柱进行气相色谱-质谱分析，以确保更好地分离复杂的挥发性混合物。单个草食损害的叶片释放出多达78种不同的挥发物，其中58种可以被识别gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S4)。如前所述，(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-辛烯，一种单萜，和(gydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-法尼烯，一种可能由倍半萜合成酶PtTPS2产生的倍半萜，是最丰富的挥发物(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。此外，(gydF4y2BaZgydF4y2Ba)-3-己烯醇、2-苯乙醇、苯甲醛、苄基氰化物和吲哚在草食后也被高度诱导(另附文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S4)。与受损叶片相比，邻近未受侵染的叶片仅释放少量挥发物，与未受侵染的对照树的叶片相当，表明未发生系统性诱导。gydF4y2Ba

对不同年龄阶段(LPI3至LPI10)未侵染的叶片释放的挥发性混合物进行比较，发现树内单一化合物的数量差异(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S4)。在未受损的对照树中，芳樟醇(p = 0.008, RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.18)和(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-辛烯(p = 0.036, RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.12)，而(gydF4y2BaZgydF4y2Ba)-3-己烯醇(p = 0.05, RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.1)， nonanal (p = 0.007, RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.18)和壬烷醇(p = 0.09, RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.12)在老基叶散发的挥发性混合物中占主导地位。然而,(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-石竹烯(p = 0.87)和(gydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-法尼烯(p = 0.76)的释放量与叶片位置无关(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S4)。在草食动物侵染幼嫩的顶端叶片(LPI3)或年老的基部叶片(LPI10)后，这种发育差异变得更加明显。近先端较年轻的受损叶片通常释放更多的萜烯(顶端1297±143 ng h)gydF4y2Ba^1gydF4y2BaggydF4y2Ba^1gydF4y2Ba新鲜体重vs基础体重475±96;P = 0.001;T = -4.768;数字gydF4y2Ba4gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S5)，苯甲醛(p = 0.008, T = 15)和乙酸苯乙酯(p = 0.003, T = -4.165)与基部附近受损的老叶片(附加文件)相比gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S4)。然而，发现醇壬醇从较老的受损叶片中释放的量更高(p = 0.041, t = 2.437)。除苯硝基烷(p = 0.008, T = 15)和吲哚(p = 0.004, T = -3.927)在较年轻的受损叶片中含量更高外，含氮化合物的诱导模式与叶龄无关(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S4)。gydF4y2Ba

(E)-β-茜草烯和(E)-β-石竹烯的局部和全身释放分别与PtTPS6和PtTPS9的表达模式相关gydF4y2Ba

确定局部和全身萜烯排放模式是否被gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因表达，转录物丰度(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-辛烯合成酶PtTPS6和(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-石竹烯合成酶PtTPS9在舞毒蛾损伤的叶片(LPI3和LPI10)、最邻近的叶片(LPI4和LPI9)以及与它们血管连接最紧密的叶片(LPI8和LPI5)中进行了测定[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。gydF4y2BaPtTPS6gydF4y2Ba草食损伤叶片中LPI3和LPI10基因表达均显著升高。然而，较年轻的LPI3叶尖诱导比较老的LPI10叶尖诱导更强(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表2、表6)。相比之下,gydF4y2BaPtTPS9gydF4y2Ba在LPI3叶的顶端有轻微的诱导，而在LPI10叶的基部没有诱导(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表2、表6)。总之，转录丰富gydF4y2BaPtTPSgydF4y2Ba在草食受损的叶片中，与受损树木最邻近的叶片和维管相连的叶片相比，以及与未受损对照树的所有叶片相比，6的表达都强烈上调。另一方面，gydF4y2BaPtTPS9gydF4y2Ba草食对基因表达影响不大。没有明显的上调gydF4y2BaPtTPS9gydF4y2Ba在邻近叶片或维管连通叶片中可以检测到转录本(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表2、表6)。gydF4y2Ba

草食损伤叶片中茉莉酸盐浓度升高gydF4y2Ba

草食动物诱导的挥发性释放通常由茉莉酸盐和其他植物激素介导[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]-[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，我们测量了在顶叶(LPI 3)或基叶(LPI10)上遭受草食的树木的单个叶片(LPI 3-10)中这些化合物的浓度。如图所示gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，未受损对照树ABA含量呈梯度;RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.23, p = 0.001)和水杨酸(SA;RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.4, p = 0.009)，较年轻的叶片中浓度较高。相反，12-氧-植物二烯酸(OPDA)浓度在老基叶(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.55, p = <0.0001)，而茉莉酸(JA)及其异亮氨酸缀合物(JA- ile)、(-)-茉莉烯异亮氨酸和(+)-7-异茉莉烯异亮氨酸均匀分布在整个树中(p = 0.44;P = 0.76;P = 0.94)。草食动物伤害后，与对照树和同一树内未受伤害的叶片相比，受损叶片中JA和JA- ile偶联物的浓度显著增加，且与叶片位置无关(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表6)。SA、ABA和OPDA的显著诱导只发生在受损叶片的顶端损伤后或以下(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表6)。gydF4y2Ba

杨树的TPS-a和TPS-b亚家族很大，由重复事件产生的成员组成gydF4y2Ba

陆地植物一般有中等大小gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba由重复基因复制产生的基因家族[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。在这项研究中，我们记录了gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba包含38个完整长度gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba其当前注释中的基因(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。因此，有了杨树gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因家族在规模上与gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因家族gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(32gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因)[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]，米饭(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba34岁的gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因)[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]、高粱(gydF4y2Ba高粱二色的gydF4y2Ba, 24岁gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因)[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba和西红柿(29)gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因)[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。相比之下，葡萄(gydF4y2Ba葡萄gydF4y2Ba)、白云杉(gydF4y2Ba云杉glaucagydF4y2Ba),gydF4y2Ba美国moellendorfiigydF4y2Ba包含大gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因家族有69 69 66假定功能gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因，分别[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。的gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba然而，苹果的基因家族仅由10个假定的功能基因组成gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。以杨树居多gydF4y2Ba支持gydF4y2Ba被发现聚集在gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2BabgydF4y2Ba亚家族(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。这些分支通常包含gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba分别参与倍半萜形成或单萜形成的[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。在拟南芥中，多个基因复制事件发生在植株内gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba/gydF4y2BabgydF4y2Ba基因亚家族[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。存在多个副本gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba/gydF4y2BabgydF4y2Ba杨树的基因也显示了类似的基因复制机制。大量的gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba/gydF4y2BabgydF4y2Ba基因与在每棵杨树中发现的两个基因形成对比gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2BacgydF4y2Ba和gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba-gydF4y2BaegydF4y2Ba亚科。这些亚家族通常分别含有共alyl diphosphate synthases (CDS)和kaurene/kaurene样synthases (KS/KSL)，参与植物的次生代谢和初级代谢。针叶树中也有较小的TPS-c和TPS-e亚科[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]和葡萄[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]而拟南芥只含有一个CDS和一个KS基因[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

PtTPS6、9、10、12和15可能与草食诱导的挥发物形成有关gydF4y2Ba

单萜合成酶PtTPS6被证明可以产生(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-辛烯，是草食诱导的杨树挥发性混合物中最丰富的化合物之一。在草食上，显著增加gydF4y2BaPtTPS6gydF4y2Ba可以观察到转录积累，提示PtTPS6在草食动物诱导的(gydF4y2BaEgydF4y2Ba) - - -β-ocimene形成gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba(数据gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。（gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-辛烯可由大量植物在花香中产生[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]，如草食动物引起的叶子挥发物，例如烟草(gydF4y2Ba烟草sppgydF4y2Ba)，玉米(gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba)、棉花(gydF4y2Ba陆地棉gydF4y2Ba)和拟南芥植物[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，也可作为精油的一部分，例如洋甘菊(gydF4y2Ba洋甘菊recutitagydF4y2Ba) [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。当加入到由蜘蛛螨引起的挥发性混合鱼叉花(gydF4y2BaTorenia矮牵牛gydF4y2Ba)， (gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-辛烯能够增强混合物吸引掠食性螨的能力[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。相比之下，(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-ocimene是另一种食草动物的天敌，gydF4y2BaGlyptapanteles liparidisgydF4y2Ba舞毒蛾幼虫的寄生蜂[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。除了对昆虫有影响外，(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-辛烯还可以通过介导防御相关基因的诱导在植物间的交流中起作用[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。因此(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-桉树烯合成酶PtTPS6可能在杨树的直接或间接防御中发挥不同的作用。gydF4y2Ba

芳樟醇是杨树挥发性芳香的另一重要成分，可由PtTPS3和PtTPS12产生[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。而PtTPS3只形成(+)-(gydF4y2Ba3 sgydF4y2Ba)-芳樟醇，PtTPS12产生外消旋芳樟醇混合物(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S7)。杨树放出(+)-(gydF4y2Ba3 sgydF4y2Ba-芳樟醇以及(-)-(gydF4y2Ba3 rgydF4y2Ba芳樟醇()gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]，这两种酶都可能有助于树中芳樟醇的形成。的上调gydF4y2BaPtTPS12gydF4y2Ba转录本还支持PtTPS12在草食动物诱导的挥发性生物合成中的功能(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。有趣的是，PtTPS12还具有倍半萜合成酶活性gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba形成了倍半萜的复杂混合物(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。然而，在PtTPS12的n端有一个转运肽，这表明PtTPS12是一个质体定位gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba根据在杨树挥发性混合物中不存在PtTPS12倍半萜类产物，其功能为单萜合成酶。gydF4y2Ba

PtTPS15gydF4y2Ba编码神经醇合成酶(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。这个TPS集群与PtTPS3(附加文件)一起属于TPS-g系列gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4) [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。两种萜烯合成酶的特征都是不存在RR(x)。gydF4y2Ba_8gydF4y2Baw基序，这是TPS-g支系成员的典型特征[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。PtTPS15和PtTPS3产生(+)-(gydF4y2Ba3 sgydF4y2Ba)橙花叔醇gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba，对映体也存在于杨树气味中(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S7) [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。与PtTPS3相反，PtTPS15没有传递肽，因此更有可能负责(+)-(gydF4y2Ba3 sgydF4y2Ba)橙花叔醇生物合成gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba。橙花醇已被证明可转化为同型萜烯DMNT，后者被认为在植物防御中起重要作用[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。Danner和同事(2011)已经推测了(-)-(gydF4y2Ba3 rgydF4y2Ba在草食动物诱导的DMNT生物合成中产生神经醇的PtTPS4。作为gydF4y2BaPtTPS4gydF4y2Ba草食攻击后仅轻微诱导，预测存在另一种神经醇合成酶。由于转录积累gydF4y2BaPtTPS15gydF4y2Ba那么PtTPS15很可能参与了DMNT生物合成前体的产生gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。TMTT是另一种由gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba。TMTT的前体香叶芳樟醇是由二萜合成酶PtTPS10产生的(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。成绩单水平gydF4y2BaPtTPS10gydF4y2Ba在草食动物损伤后增加，对应于TMTT的诱导释放(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。据描述，DMNT和TMTT都是从几种植物中释放出来的，包括玉米、利马豆、拟南芥和番茄[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]以及TMTT和DMNT的作用，例如分别在番茄和拟南芥中吸引捕食性螨[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

挥发性(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-石竹烯据报道可以吸引地上和地下的玉米食草动物的敌人[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。在我们的研究中，(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-石竹烯的排放量在草食损害后没有显著增加，但受损叶片的排放量有增加的趋势，对应于(gydF4y2BaEgydF4y2Ba-β-石竹烯合成酶(gydF4y2BaPtTPS9gydF4y2Ba)成绩单(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。然而，Danner和同事(2011)描述了(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-石竹烯作为草食诱导的杨树挥发物。植物年龄、温室条件和以前的感染可能导致(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-石竹烯在本研究中使用的植物。gydF4y2Ba

PtTPS13的主要产物1,8-桉树脑仅在草食诱导的挥发性混合物中微量存在gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S4)。转录本丰度低(由高Δ表示)gydF4y2BaCqgydF4y2Ba-value，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S3)很可能是低排放量的原因(图3)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。的gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaPtTPS5、PtTPS7和PtTPS11(倍半萜醇和石榴烯A)的产物，图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)在草食诱导的杨树挥发物混合物中未检测到，尽管qRT-PCR分析显示草食受损叶片的转录水平高于未受损对照叶片(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。转录物丰度低(如gydF4y2BaPtTPS11gydF4y2Ba高ΔgydF4y2BaCqgydF4y2Ba价值;额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(表S3)，但也很高gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2BaFPP值或各自蛋白质的低周转率或寿命可以解释各自的缺乏gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba产品的酶在杨树挥发性混合物。或者，产物可以进一步转化为非挥发性代谢物，如倍半萜植物抗毒素。有报道称倍半萜合成酶参与植物抗毒素的生物合成[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]-[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。例如，在玉米中，草食诱导的β- macrocarpenter合成酶的存在和挥发性混合物中缺乏这种倍半萜导致了β- macrocarpenter衍生的植物抗毒素的发现[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。Germacrene A，少校gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaPtTPS11的产物，被证明是菊苣(gydF4y2BaCichorium intybusgydF4y2Ba)及除虫菊(gydF4y2BaTanacetum cinerariifoliumgydF4y2Ba) [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]-[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。因此，我们认为PtTPS5和PtTPS7产生的倍半萜醇以及PtTPS11产生的芽孢烯A在杨树中进一步代谢。gydF4y2Ba

总的来说，在杨树基因组中编码的38个推测的TPS中，本研究可以对11个TPS酶进行功能表征。包括先前发表的4种单萜类和倍半萜类合成酶、萜烯D合成酶PtTPS1、(gydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-法脂烯合成酶PtTPS2，芳樟醇/神经醇合成酶PtTPS3和PtTPS4 [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]以及异戊二烯合酶[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，大约有一半gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因组中存在的基因现在已经被表征和它们的酶功能gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba确定。杨树在取食后释放的几乎所有萜烯都可以用目前已知的15种单萜合成酶、倍萜类合成酶和二萜合成酶的酶活性来解释gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表8)。然而，这是可能的gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因在其他器官中表达gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba就像其他植物一样。例如,gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba对甘菊和拟南芥花或根中特异性表达的基因进行了描述[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

草食动物诱导的毛卡柏萜类释放仅限于受损叶片，可能由茉莉酸盐介导gydF4y2Ba

本文描述了从草食受损叶片局部释放的挥发性混合物和从未受损相邻叶片系统释放的挥发性混合物的定性和定量组成的比较gydF4y2Bap .黑质gydF4y2Ba杂交杨树(gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2BaxgydF4y2Ba摘要gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。在这两项研究中，均报道了草食损害部位上方未受损叶片的系统性挥发性诱导。相反，我们发现在单叶水平上没有系统诱导挥发物发生gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表4、表5)。正如已经在玉米[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]，挥发性物质的释放仅限于受损叶片。这种特定的局部挥发性释放可能在植物内信号传递中起重要作用，并为寄生蜂寻找寄主提供可靠的近距离信号。gydF4y2Ba

众所周知，茉莉酸及其氨基酸偶联物是食草动物诱导的植物防御的介质，包括许多植物物种中挥发物的释放[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。Clavijo McCormick和同事(2014)在最近发表的一篇论文中证明，黑杨树草食后茉莉酸盐水平上调。此外，外源施用JA对gydF4y2Bap .黑质gydF4y2Ba和gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba叶片导致挥发性释放增加[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba[附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S9)和转录组分析gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2BaxgydF4y2Ba摘要gydF4y2Ba用森林帐篷毛虫处理过的叶子(gydF4y2BaMalocosoma disstriagydF4y2Ba)揭示了茉莉酸盐生物合成和挥发性形成相关基因的上调[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。草食诱导的局部萜烯释放gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba也反映在gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba与未受损的相邻叶片相比，受损叶片中的转录本和茉莉酸盐含量(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。因此，JA和JA- ile缀合物似乎是植物挥发性生物合成转录调控的主要信号gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba。gydF4y2Ba

虽然施用JA可诱导黑杨挥发物排放，但施用SA不能诱导黑杨挥发物排放，但草食后SA含量增加[j]。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。在实验中gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba结果表明，只有在较年轻的顶端叶片上食草才能显著增加受损叶片中的SA浓度(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。有趣的是，在草食受损叶片+ 5的维管连通叶(LPI)中也检测到SA水平升高[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]在草食受损的叶子下(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。此外，顶端草食导致基叶中OPDA和ABA的浓度增加(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。从叶尖向下传播的移动信号可以解释这些观察结果，并将为已经描述的杨树的基本系统防御反应提供合理的机制[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们研究了萜烯合成酶基因家族gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba以及它对草食诱导的挥发物形成的贡献。杨树挥发性萜的产生主要受多个转录本积累的调控gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因。限制挥发性物质向受损叶片的释放可能在植物内部信号传递中起作用，有助于草食性天敌更好地在树冠上找到它们的宿主或猎物。虽然大约三分之一的杨树TPS似乎与草食诱导的挥发性萜产生有关，但其他TPS的功能尚不清楚。它们可能在杨树不同器官的其他防御反应中起作用。gydF4y2Ba

植物和昆虫材料gydF4y2Ba

香杨树(gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2Ba(625号克隆，NW-FVA, Hann;在夏季温室条件下(24°C, 60%湿度，16 h/8 h明暗循环)，在1:1的沙子和土壤混合物(Klasmann盆栽基质)中生长，直到它们达到约1米高。舞毒蛾(gydF4y2BaLymantria dispargydF4y2Ba)鸡蛋批次由Hannah Nadel, APHIS, USA提供。孵化后，用人工饲料(舞毒蛾饲料，MP Biomedicals LLC, Illkirch, France)饲养。gydF4y2Ba

杨树挥发物的收集与分析gydF4y2Ba

为了研究舞毒蛾取食后挥发物的空间分布，我们采集了单叶挥发物。8片叶片(从LPI3到LPI10, LPI =叶片质体时指数[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba])，分别用一个PET袋(“bratschlauuch”，Toppits, Minden, Germany)将两端用电缆粘合剂固定。树上到处都是gydF4y2Bal . dispargydF4y2Ba分别采集顶叶(LPI3)和基叶(LPI10)的幼虫和LPI3 ~ LPI10叶片的挥发物(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S8)。五个gydF4y2Bal . dispargydF4y2Ba将饥饿12 h的3 ~ 4龄幼虫放于叶片上。毛虫用杨叶喂了一个星期gydF4y2Ba之前gydF4y2Ba到实验开始的时候。采食24 h(16.00(第1天)~ 16.00 h(第2天))。采用Tholl等人(2006)所述的推拉系统，在毛虫去除后第2天光照期中期(10.00 - 16.00 h)收集挥发物6小时[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]。空气通过聚四氟乙烯管在系统中保持流动。木炭过滤后的空气以1.5 l/min的流速不断泵入袋中。排出的空气(流量:1l /min)通过一个装有30mg Super Q (ARS, Inc.， Gainesville, FL, USA)的过滤器，以吸附挥发性化合物。收集后，用100 μL含壬酯的二氯甲烷(10 ng μL)作为内标洗脱过滤器2次，对挥发物进行解吸gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)。测量lpi3处理树、lpi10处理树和未损伤对照树各5个重复。gydF4y2Ba

定性和定量挥发性分析使用Agilent 6890系列气相色谱仪耦合Agilent 5973四极质量选择检测器(界面温度，250°C;四极温度，150℃;源温度，230℃;电子能量，70 eV)或火焰电离检测器(FID)，分别在300°C下工作。采用ZB-WAX色谱柱(Phenomenex, Aschaffenburg, Germany, 60 m × 0.25 mm × 0.15 μm)和He (MS)或HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(FID)作为载气。样品(1 μL)在初始烘箱温度40℃下不劈裂注射。温度保持2分钟，然后以5°C min的梯度增加到225°CgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba，再保持2分钟，然后进一步升高到250°C，梯度为100°C mingydF4y2Ba^1gydF4y2Ba通过将保留时间和质谱与Fluka (Seelze, Germany)、Roth (Karlsruhe, Germany)、Sigma (St. Louis, MO, USA)、Bedoukian (Danbury, CT, USA)获得的真实标准品的保留时间和质谱进行比较，或通过Wiley和National Institute of standards and Technology库中的参考光谱来鉴定化合物。醛肟标准品的合成参照Irmisch et al. 2013 [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

植物组织取样，RNA提取和逆转录gydF4y2Ba

草食24h后收获杨树材料，用液氮速冻，-80°C保存，待进一步加工。研磨后，根据制造商的说明，使用Invisorb Spin Plant RNA Mini Kit (Invitek GmbH, Berlin, Germany)分离总RNA。使用分光光度计(NanoDrop 2000c, Thermo Scientific, Wilmington, USA)和Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies GmbH, Waldbronn, Germany)测定RNA的浓度、纯度和质量。在cDNA合成之前，0.75 μg的RNA用1 μL DNase (Fermentas GmbH, St. Leon Roth, Germany)进行DNase处理。利用SuperScript™III逆转录酶和寡核苷酸(dT)从dna酶处理的RNA中制备单链cDNAgydF4y2Ba_{12 - 18gydF4y2Ba})引物(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。gydF4y2Ba

PtTPS基因的鉴定与分离gydF4y2Ba

鉴定推定的杨树gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因，BLAST搜索gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba基因组数据库(gydF4y2Bahttp://www.phytozome.net/poplargydF4y2Ba)，以PtTPS1 (JF449450)和AtGAS2 (Q9SAK2)作为查询序列。三十八全长gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因的最小长度为520个氨基酸。15(包括gydF4y2BaPtTPS1gydF4y2Ba-gydF4y2Ba4gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba从草食受损的叶片中获得的cDNA可以扩增出这些序列gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba。引物序列信息见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S10。PCR产物克隆到测序载体PCR®中gydF4y2Ba^-gydF4y2BaBlunt II-TOPO®(Invitrogen)和两条链都被完全测序。信号肽预测使用TargetP 1.1服务器(gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/gydF4y2Ba)，若信度等级(rc值)大于4，则为正预测。序列保存在GenBank中，登录号为KF776503 (gydF4y2BaPtTPS5gydF4y2Ba)， kf776504 (gydF4y2BaPtTPS6gydF4y2Ba)， kf776505 (gydF4y2BaPtTPS7gydF4y2Ba)， kf776506 (gydF4y2BaPtTPS8gydF4y2Ba)， kf776507 (gydF4y2BaPtTPS9gydF4y2Ba)， kf776508 (gydF4y2BaPtTPS10gydF4y2Ba)， kf776509 (gydF4y2BaPtTPS11gydF4y2Ba)， kf776510 (gydF4y2BaPtTPS12gydF4y2Ba)、kf776511 (gydF4y2BaPtTPS13gydF4y2Ba)， kf776512 (gydF4y2BaPtTPS14gydF4y2Ba)， kf776502 (gydF4y2BaPtTPS15gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

PtTPS在大肠杆菌中的异源表达gydF4y2Ba

开放式阅读框架gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因被克隆为gydF4y2BaBsagydF4y2BaI分裂成pASK-IBA7载体(IBA-GmbH, Göttingen，德国)。的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株TOP10 (Invitrogen)用于表达。37℃培养，OD诱导gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6，加入200ug/l的无水四环素(IBA-GmbH)，随后放置在18°C下，再培养20小时。离心收集细胞，并用超声波(Bandelin UW2070, Berlin, Germany)在冷冻提取缓冲液(50 mM Mopso, pH 7.0，含5 mM MgCl)中处理3 - 30 sgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 5 mM抗坏血酸钠，0.5 mM PMSF, 5 mM二硫苏糖醇和10% (v/v)甘油)。14000 g离心除去细胞碎片，通过Econopac 10DG色谱柱(BioRad, Hercules, CA, USA)将上清淡化为测定缓冲液(10 mM Mopso, pH 7.0, 1 mM二硫苏糖醇，10% (v/v)甘油)。gydF4y2Ba

重组PtTPS分析gydF4y2Ba

为了测定不同萜烯合成酶的催化活性，酶测定采用含40 μl细菌提取物和60 μl含10 μM (gydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-FPP或(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-GPP和10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，在聚四氟乙烯密封，螺旋盖1ml气相色谱玻璃小瓶中进行。将100 μm聚二甲基硅氧烷(SUPELCO, Belafonte, PA, USA)组成的SPME(固相微萃取)纤维置于瓶顶空间，在30°C下孵育45分钟。为了分析吸附的反应产物，SPME纤维直接插入气相色谱仪的进样器中。为了测定二萜合成酶的活性，如上所述，用50 μM (gydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-GGPP为底物，上覆100 μl己烷。在30°C下孵育60 min后，收集己烷相并使用GC-MS进行分析。gydF4y2Ba

作为阴性对照，我们培养生蛋白提取物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba用底物GPP、FPP和GGPP分别表达空载体pASK-IBA7，如上所述。如附加文件所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S9，除了极少量GPP和FPP水解产物外，没有形成萜烯烃或萜烯醇，这些产物可能是由非特异性产生的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba磷酸酶。gydF4y2Ba

采用上述方法对杨树挥发物进行了TPS酶产物的GC-MS分析鉴定。色谱柱为DB-5MS (Agilent, Santa Clara, USA, 30 m × 0.25 mM × 0.25 μm)。样品(SPME)在50°C的初始烤箱温度下无分裂注射。温度保持2分钟，然后以7°C min的梯度增加到240°CgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba，并以60℃min的梯度进一步升高到300℃gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba对于使用冷却器进样器的GC-MS分析，进样器温度从220°C降低到150°C。挥发性二萜分析，在初始烤箱温度为80℃时，不劈裂注入2 μl的己烷样品。温度保持2分钟，然后以7°C min的梯度增加到250°CgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba，并以100℃min的梯度进一步升高到320℃gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba保持2分钟。gydF4y2Ba

手性GC-MS分析采用Rt™-β dexsm色谱柱(Restek, Bad Homburg, Germany)，温度程序为50°C(保持2分钟)，温度为2°C mingydF4y2Ba^1gydF4y2Ba至220°C(保持1分钟)。对映异构体的鉴定采用来自(Fluka, Seelze, Germany)的标准品。外消旋混合物(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-caryophyllene由Stefan Garms(德国耶拿MPI for Chemical Ecology)提供。洋甘菊合成A(+)-细菌烯A合成酶MrTPS3 (gydF4y2Ba洋甘菊recutitagydF4y2Ba) [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]用于制备正宗的(+)-德国rene A标准品。gydF4y2Ba

PtTPS表达的qRT-PCR分析gydF4y2Ba

从草食处理24 h的叶片中分离RNA，按上述方法制备cDNA，用水1:3稀释。为了放大gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba设计了长度在110 ~ 200 bp之间的基因特异引物对gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba在60°C左右，GC含量在40 - 55%之间，引物长度在19 - 25 nt之间(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S9)。由于序列相似性高，只使用1对引物进行扩增gydF4y2BaPtTPS11gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtTPS14gydF4y2Ba。从四个生物重复中获得的PCR产物测序显示了转录本的平均百分比gydF4y2BaPtTPS11gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtTPS14gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

通过琼脂糖凝胶电泳、熔融曲线分析、标准曲线分析和克隆PCR扩增子序列验证，证实了引物的特异性。gydF4y2Ba泛素gydF4y2Ba被用作参考基因[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]。样品使用Brilliant®III SYBR®Green QPCR Master Mix (Stratagene, CA, USA)， ROX作为对照染料，一式三份。所有反应均采用以下PCR条件:95°C初始孵育3 min，然后扩增40°循环(95°C 20秒，60°C 20秒)。在退火和每个循环的延伸步骤中进行板读数。在55°C至95°C循环结束时记录熔化曲线数据。gydF4y2Ba

所有样品在96孔板光学PCR机(MxPro - Mx3000P, Stratagene, Agilent Technologies, USA)上运行。在qRT-PCR中，每个处理的5个生物重复作为3个重复进行分析。从MXPro软件导出相对量与校准器平均值(dRn)的数据。gydF4y2Ba

系统发育树重建gydF4y2Ba

对于系统发育树的估计，我们使用了MUSCLE算法(gap open， -2.9;间隙扩展，0;疏水性倍增器，1.5;聚类方法，upgmb)在MEGA5中实现[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba计算所有全长杨树TPS酶的氨基酸排列。在MUSCLE对齐的基础上，利用邻近连接算法(泊松模型)对MEGA5进行树重建。用1000个重复的bootstrap重采样分析来评估树的拓扑结构。根据这一步骤，构建了包含表征的PtTPS酶和其他具有代表性的TPS酶的系统发育树。另一棵树显示所有全长的系统发育关系gydF4y2BaPtTPSgydF4y2Ba基因与代表性gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba从其他植物中提取的基因使用W序列(核苷酸作为三次重复处理)构建，使用MEGA 5如上所述构建邻居连接树。gydF4y2Ba

利用生物编辑软件(BioEdit)构建了所有已鉴定的PtTPS酶的序列，以及杨树二萜合成酶与其他已鉴定的二萜合成酶的序列。gydF4y2Bahttp://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.htmlgydF4y2Ba)和ClustalW算法。gydF4y2Ba

茉莉酸、JA-Ile偶联物、OPDA、ABA和水杨酸的定量分析gydF4y2Ba

用于植物激素分析，用1 ml含60 ng 9,10- d的甲醇提取110 mg细磨叶片材料gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-9,10-二氢茉莉酸，60 ng DgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba-水杨酸(Sigma-Aldrich)， 60 ng DgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-脱落酸(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)和15 ng茉莉酸-[gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba异亮氨酸缀合物作为内标。茉莉酸- (gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba异亮氨酸缀合物是由Kramell等人(1988)用[gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba]异亮氨酸(Sigma-Aldrich) [gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

色谱采用Agilent 1200高效液相色谱系统(Agilent Technologies)。采用Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(50 × 4.6 mM, 1.8 μm, Agilent)进行分离。以甲酸(0.05%)水溶液为流动相，乙腈为流动相。洗脱剖面:0 - 0.5 min, 5% B;0.5-9.5 min, 5-42% B;9.5-9.51分钟42-100% B;9.51 ~ 12 min 100% B, 12.1 ~ 15 min 5% B，流动相流速1.1 ml/min。柱温保持在25℃。配备涡轮喷雾离子源的API 3200串联质谱计(应用生物系统公司)在负电离模式下工作。在条件允许的情况下，通过纯标准品的输注实验对仪器参数进行优化。 The ion spray voltage was maintained at 4500 eV. The turbo gas temperature was set at 700°C. Nebulizing gas was set at 60 psi, curtain gas at 25 psi, heating gas at 60 psi and collision gas at 7 psi. Multiple reaction monitoring (MRM) was used to monitor analyte parent ion → product ion:米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba136.9→93.0(碰撞能量(CE)- 22v;水杨酸的聚簇电位(DP) -35 V;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba140.9→97.0 (ce - 22v;DP - 35v)为DgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba水杨酸的酸;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba209.1→59.0 (ce - 24v;DP -35 V)为茉莉酸;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba213.1→56.0 (ce - 24v;DP -35 V)为9,10- d2 -9,10-二氢茉莉酸;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba263.0→153.2 (ce - 22v;DP -35 V)为脱落酸;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba269.0→159.2 (ce - 22v;DP - 35v)为DgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba脱落酸;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba322.2→130.1 (ce - 30v;DP -50 V)为茉莉酸-异亮氨酸缀合物;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba328.2→136.1 (ce - 30v;DP -50 V)用于茉莉酸-[gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba异亮氨酸共轭。Q1和Q3四极保持单位分辨率。使用Analyst 1.5软件(Applied Biosystems)进行数据采集和处理。通过对标准混合物稀释序列的分析，验证了电离效率的线性关系。相对于相应内标的信号对植物激素进行定量。用于定量12-氧植物二烯酸，顺式opda, 9,10- dgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba以-9,10-二氢茉莉酸为内标，实验确定的响应因子为2.24。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

必要时，对数据进行对数变换，以满足方差的正态性和同质性等统计假设。全文数据以均数±SE表示。比较gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba草食诱导叶片和对照叶片挥发性释放量、顶叶和基叶挥发性释放量以及gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba使用SigmaPlot 11.0 for Windows (Systat Software Inc. 2008)进行学生t检验。使用R2.15.2 (R开发核心团队，gydF4y2Bahttp://www.R-project.orggydF4y2Ba)，以检查树木挥发性排放物的梯度。比较…单叶植物激素浓度gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba和gydF4y2BaPtTPS6gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtTPS9gydF4y2Ba采用以叶片数为固定效应、植物身份为随机效应的混合效应模型(nlme package)，进行最大似然比检验。采用单因素方差分析(ANOVA)分析了不同处理在一个叶片位置上的激素含量和萜烯释放量的差异。模型采用因子水平约简法进行简化[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]，使用R2.15.2完成。gydF4y2Ba

支持数据的可用性gydF4y2Ba

系统发育数据(树和用于生成树的数据)已经存储在TreeBASE存储库中，并在URL下可用gydF4y2Bahttp://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S16450gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

SI, YJ和TGK进行了实验工作。FC和JG参与了研究的设计，并对稿件进行了改进。SI和TGK构思了这项研究并起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

我们感谢Claudia Wenderoth和Katrin Luck出色的技术援助，Michael Reichelt帮助进行植物激素分析，Grit Kunert帮助进行统计，Tamara kr gel和MPI-CE的所有园丁帮助培育杨树。这项工作得到了马克斯-普朗克学会的支持。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 马克斯·普朗克化学生态学研究所，Hans-Knöll-Strasse 8，德国耶拿gydF4y2Ba

   Sandra Irmisch, Jonathan Gershenzon和Tobias G KöllnergydF4y2Ba

2. 美国田纳西大学植物科学系，诺克斯维尔gydF4y2Ba

   蒋一凡，陈峰gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaTobias G KöllnergydF4y2Ba。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。gydF4y2Ba

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如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

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