野生枇杷自然杂交的分子证据(枇杷)及其亲属大肠prinoides

背景

种间杂交长期以来被认为是植物进化和物种形成的关键过程。它在Pyrinae亚部落属中相当常见。在Eriobotrya是一种小的树属，大肠prinoidesvar。daduheensis被公认为是各种各样的大肠prinoides，两者之间的天然杂交大肠prinoides而且大肠粳稻，或多种大肠粳稻．然而，到目前为止，还没有令人信服的证据证明它的地位。

结果

对其中89个个体的4个核基因和2个叶绿体区进行了测序Eriobotrya它们共存的两个地方的分类群。在每个被研究的核和叶绿体位点之间发现了一些固定的核苷酸替换或间隙大肠粳稻而且大肠prinoides．的35个人中大肠prinoidesvar。daduheensis的核苷酸可加性大肠粳稻而且大肠prinoides在至少一个核基因中，其中10个在所有四个核基因上都具有核苷酸可加性。最单的大肠prinoidesvar。daduheensis也与那些大肠粳稻而且大肠prinoides．在两个叶绿体区，有28个和7个个体与之相同大肠粳稻而且大肠prinoides,分别。

结论

我们的研究为混血儿身份提供了令人信服的证据大肠prinoidesvar。daduheensis．大多数杂交个体是后代杂交。这两个大肠粳稻而且大肠prinoides可以担任女性家长。差异适应可能维持物种边界大肠prinoides而且大肠粳稻面对杂化和潜在的基因渗入。

种间杂交长期以来被认为是植物进化和物种形成的一个关键过程[1] - [3.］．了解自然杂交过程不仅有助于澄清分类学的不确定性，而且有助于阐明许多适应性的起源、植物多样性的维持和物种形成的过程[2］．自然杂交在Pyrinae亚部落(原蔷薇科Maloideae属)之间和属内相当普遍，该亚部落含有许多经济上重要的水果，如苹果、木瓜、梨和枇杷[4］．在Pyrinae的16个属中观察到属间杂交[5]，而在Pyrinae的许多属中已经发现了更频繁的基因内杂交，包括Amelanchier［6]，Crataegus［7] - [9),而花楸属［10]、[11］．Pyrinae属之间和属内自然杂交的盛行表明杂交可能在Pyrinae的进化过程中起着重要作用[4]，并为培育水果新品种提供了巨大的机会。

属Eriobotrya采用。，一个small genus of Pyrinae consisting of approximately 26 species, is distributed in Himalaya, eastern Asia and western Malesia [12］．枇杷(研究)。采用。，commonly known as loquat, is an important fruit tree cultivated throughout Southeastern Asia [13]、[14]，而野生枇杷只分布在中国的云南、四川、湖北、广西和广东[15］．的21个Eriobotrya在中国发现的物种有三种Eriobotrya除枇杷外，在秋季开花的品种包括大肠prinoides，大肠prinoidesvar。daduheensis而且大肠malipoensis：大肠prinoidesRehd。会。产于四川和云南大肠prinoidesvar。daduheensis张海珍分布在四川汉源和石棉两个县大肠malipoensis只发生在云南麻栗坡[15］．

大肠prinoidesvar。daduheensis有许多中间形态特征大肠粳稻而且大肠prinoides以及独特的花粉形状和过氧化物酶同工酶模式[16］．它后来被认为是种间杂交大肠粳稻而且大肠prinoides基于核型和过氧化物酶同工酶数据[17］．在该研究中，3个类群都被报道为具有相同染色体的二倍体(2n = 2x = 34)。此外，核型大肠prinoidesvar。daduheensis要么是3A型(与大肠粳稻)或2A型(与大肠prinoides),大肠prinoidesvar。daduheensis在过氧化物酶和等位酶之间显示出一定的加性大肠粳稻而且大肠prinoides．Liang等人进一步的核型分析得到了不同的结果，三个类群都是2A型。因此,他们重新考虑大肠prinoidesvar。daduheensis的一个明显的变种大肠粳稻［18］．

这些有争议的结果大多基于形态学分析、核型分析和等位酶分析等传统方法，这些方法足以为许多物种提供令人信服的结论，这些物种显示出高度的形态可塑性或中间形态特征是由杂交以外的力量引起的[19］．在Pyrinae亚部落的大多数物种中，多倍体、无混合和杂交的频繁发生使传统方法对杂交事件的识别变得更加困难。

近年来，单拷贝或低拷贝核基因已成功用于鉴定植物杂交[19] - [21］．苹果基因组序列的完成为开发外显子引物和内含子交叉引物(EPIC)提供了充足的ESTs，以检测Pyrinae亚部落成员的DNA序列变化[22] - [24］．在这项研究中，三个类群各有超过20个个体(大肠prinoidesvar。daduheensis,大肠粳稻而且大肠prinoides)在两个地点(含源和石棉)进行了4个低拷贝核基因和2个叶绿体DNA片段的测序，解决了以下两个问题:1)是大肠prinoidesvar。daduheensis种间杂交?2)如果是，杂交的程度如何?这些杂交个体是F吗₁S或下一代混合动力车，还是两者都有?通过这些努力，我们进一步探讨了可能导致杂交发生的因素，杂交对亲本种的影响，以及面对基因流动时物种完整性的可能机制。

在这四个核基因和两个叶绿体区域，大肠粳稻而且大肠prinoides显示了固定的核苷酸替换。TPP2位点有2个固定核苷酸取代，GDSL1位点有5个核苷酸取代和1个1 bp的核苷酸取代，GDSL2位点有4个核苷酸取代，WD位点有3个核苷酸取代和1个90 bp的核苷酸取代加拿大皇家银行L +公安局B区域(表1；数字1)．

我们接下来关注的是那些表现出固定差异的站点大肠粳稻而且大肠prinoides的序列分析大肠prinoidesvar。daduheensis．为方便起见，我们为的每个个体指定了序列类型大肠prinoidesvar。daduheensis若其序列图谱为H、J、P型大肠粳稻而且大肠prinoides相同的,大肠粳稻，并与大肠prinoides,分别。的35个人中大肠prinoidesvar。daduheensis的核苷酸可加性大肠粳稻而且大肠prinoides(H型)存在于至少一个核基因中2)．

的35个个体中大肠prinoidesvar。daduheensis10个个体的4个核基因均为H型，23个个体的至少一个核基因为H型2)．其余2个个体，1个(DP6)在4个核基因上均为P型，另1个(DP8)在4个核基因上均为P型或J型。21人中有9人患有典型的大肠prinoidesvar。daduheensis在非典型个体中，只有1个个体在4个核基因上均表现为H型大肠prinoidesvar。daduheensisDP1-DP9和DJ1-DJ5:形态介于两者之间大肠prinoidesvar。daduheensis,要么大肠prinoides或大肠粳稻)．在这些核基因中，只有两个非典型个体的两个核基因为J型2)．

在两个叶绿体区，J型和P型分别有28个和7个大肠prinoidesvar。daduheensis,分别。DP6在4个核基因上均表现为P型，但在叶绿体区表现为J型。在4个核基因均检出H型的10个个体中，J型和P型个体分别有7个和3个2)．

对于单倍型分析，大肠粳稻拥有比。更高的多样性大肠prinoidesTPP2、GDSL1和GDSL2基因分别为2、6和4个单倍型大肠粳稻中分别有1、2和1个单倍型大肠prinoides)．这种情况在WD基因上正好相反大肠粳稻只有一个单倍型和大肠prinoides有三个。在叶绿体区，未观察到种内变异。这些单倍型都不与大肠粳稻而且大肠prinoides在所有四个核基因和两个叶绿体区域。为大肠prinoidesvar。daduheensis，大部分单倍型(18/25)与大肠粳稻或大肠prinoides(图1)．还有7种独特的单倍型大肠prinoidesvar。daduheensis其中6个基因与单倍型之间只有1个突变步骤大肠粳稻或大肠prinoides．

大度鹤蕨杂化起源的分子证据

的分类地位大肠prinoidesvar。daduheensis一直存在争议。它被认为是一种大肠prinoides［16两者之间的自然杂交大肠prinoides而且大肠粳稻［17，或各种各样的大肠粳稻［18］．但是，由于采样非常有限，关于其地位一直没有令人信服的结论。在本研究中，我们的目的是通过测序四个核基因和两个叶绿体区域的足够样本，以表征其状态Eriobotrya在两个位置。我们的结果表明，在碱基之间有一些固定的核苷酸替换大肠粳稻而且大肠prinoides在所有四个核基因和两个叶绿体区域，表明两个物种分离良好。大多数人的大肠prinoidesvar。daduheensis(33 / 35)显示核苷酸加性大肠粳稻而且大肠prinoides至少在一个核基因中，提供直接证据证明它们是杂交的大肠粳稻而且大肠prinoides．其余两个个体DP6和DP8也是杂交种，因为DP6在四个核基因上都是P型，在叶绿体区域是J型;DP8在两个核基因上是P型，在另外两个核基因上是J型。在十个个体中大肠prinoidesvar。daduheensis的核苷酸加性大肠粳稻而且大肠prinoides在四个随机选择的核基因上都观察到了，这表明它们可能是F₁混合动力车。其他个人的大肠prinoidesvar。daduheensis肯定是新一代的混合动力车。10个假设的F₁在两个叶绿体位点上，分别有7个和3个亲本为J型和P型，说明这两个品种都可作为母本。在本研究中，来自3个核基因的7个单倍型是独特的大肠prinoidesvar。daduheensis(图1)．这可能是由于来自亲本物种的未采样多态，或杂种的新突变。

分子分析表明21个典型的个体中有9个大肠prinoidesvar。daduheensis有可能F₁混血儿，而非典型个体只有1 / 14大肠prinoidesvar。daduheensis．这些结果表明，典型大肠prinoidesvar。daduheensis包含许多F₁混血儿，而大多数是非典型的大肠prinoidesvar。daduheensis后一代人混合动力车。

这四个核基因是从苹果进化而来的，苹果是梨科植物的远亲Eriobotrya，也成功应用于Eriobotrya而且Rhaphiolepis在本研究中，还有其他Pyrinae属，如车轮棠而且花楸属(Chen et al.未发表数据)。这说明这4个核基因可作为吡啶属植物杂交鉴定和系统发育分析的通用核标记。

金银花与金银花自然杂交的影响因素

该植物的地理分布、花的形态和花期大肠粳稻而且大肠prinoides可能为这些物种之间的杂交提供了充足的机会。这两种在中国四川思棉和汉源发现[15]，在生境上有部分同域分布;然而,大肠粳稻喜欢较高的海拔和大肠prinoides更喜欢低海拔。植物的花期大肠粳稻而且大肠prinoides亦有重叠:两种花期均在10月至2月[16］．在2007年12月的实地调查中，我们发现大肠粳稻，大肠prinoides而且大肠prinoidesvar。daduheensis同时开花。除了花序的大小和花柱的数量外，两种植物的整体花形态非常相似[16]，秋天的蜜蜂和冬天的雀形类鸟类是它们共同的传粉者[25］．简而言之,大肠粳稻而且大肠prinoides有足够的机会在它们一起发生的地方自然地相互杂交。

枇杷与枇杷杂交的结果分析

在本研究中，被调查的35个个体中有25个被证实为后代杂种，这表明F₁杂交种可与亲本回交，并可发生渐渗。在我们的实地调查中，成百上千的大肠prinoidesvar。daduheensis个体被发现，所以基因渗入的可能性很大。尽管在两种样本个体中均未观察到基因渗入的信号大肠粳稻或大肠prinoides由于只分析了4个核基因和叶绿体DNA，因此不能排除这种可能性。大肠粳稻而且大肠prinoides占用有轻微重叠的差异高度范围。差异适应可能维持物种的完整性大肠粳稻而且大肠prinoides在存在杂交和潜在的基因渗入的情况下。

渐渗杂交之间大肠粳稻而且大肠prinoides可能有助于增加它们野生种群的遗传多样性，这可能有利于它们在快速全球气候变化的背景下长期生存。同时，当地人可以利用天然杂交种选育枇杷新品种。两者的野生个体Eriobotrya品种被广泛用作嫁接枇杷品种的砧木，因此许多野生群体已被破坏(范等人的个人观察)。这些的当前状态Eriobotrya物种需要有效的保护。

根据4个低拷贝核基因和2个叶绿体区域的序列数据，我们为杂交起源提供了有力的证据大肠prinoidesvar。daduheensis他们发现大多数杂交个体可能是下一代杂交。本研究成功地将低拷贝核基因应用于Pyrinae亚部落杂交种的鉴定，所开发的引物可应用于Pyrinae的其他属。

工厂抽样

2007年12月(当三Eriobotrya2008年4月(当这些植物的果实Eriobotrya我们对这三种植物进行了实地调查Eriobotrya中国四川汉源和思棉植物类群。根据它们的形态特征[13]、[16]、[26]和我们自己的观察，7个诊断形态学特征用于识别大肠粳稻，大肠prinoides而且大肠prinoidesvar。daduheensis(表3.)．在两个采样点，只有大肠prinoides可在海拔800米以下的地区找到，而只有大肠粳稻可在海拔1200米以上发现。在海拔800-1200米之间，三个类群都可以找到。此外，有些个体表现出中间形态大肠prinoidesvar。daduheensis,要么大肠粳稻或大肠prinoides(我们暂时把他们当作大肠prinoidesvar。daduheensis)．在这项研究中，我们抽样了28个个体大肠prinoides在800米以下，26只大肠粳稻1200米以上，35人大肠prinoidesvar。daduheensis800 - 1200米(包括典型的21只)大肠prinoidesvar。daduheensis， 5个个体，中间形态大肠粳稻而且大肠prinoidesvar。daduheensis的中间形态9只大肠prinoides而且大肠prinoidesvar。daduheensis)．此外，一个同属种(大肠tengyuehensis)和一种密切相关的属，Rhaphiolepis籼稻,抽样并作为外群(表4)．为公安局B基因，一个序列从Neillia thibetica(Rosaceae)从NCBI网站下载，设置为外群(登录号:JF317470)。所有用于提取DNA的叶子都被收集起来，并储存在硅胶中，放入拉链塑料袋中，直到使用为止。凭证标本保存于中山大学植物标本室。

DNA提取，引物设计，PCR和测序

使用CTAB方法分离基因组DNA [27］．在此基础上，使用Primer Premier 6.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA)设计特定的EPIC引物。这些cdna编码三肽基肽酶II (TPP2)、GDSL酯酶/脂肪酶apg样蛋白(GDSL)和WD重复包含蛋白(WD)。TPP2和WD引物扩增了一个亮带，GDSL引物扩增了两个亮带(我们将其命名为GDSL1和GDSL2)。叶绿体加拿大皇家银行L区用通用引物扩增[28，而部分公安局用特异性引物对B区进行扩增Eriobotrya，从通用引物中获得公安局B1-F和公安局B2-R [29］．所有引物序列列于表中5．

PCR扩增量为20 μL，含基因组DNA 25 ng, 10 ×缓冲液2 μL^{2 +})， 0.25 mM的dNTPs, 0.2 μM的引物，1u的Easy-Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech Co.， China, Beijing)。PCR反应在以下条件下进行:94℃初始变性2.5 min，然后在94℃下30 s, 35个循环，相应的退火温度(TPP2, WD，和加拿大皇家银行L和55°C的GDSL和公安局B) 30 s, 72°C 1分钟，最后在72°C延伸5分钟。PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳纯化，然后使用珍珠凝胶提取试剂盒(Pearl Biotech, Guangzhou, China)。纯化后，用ABI 3730 DNA自动测序仪和BigDye终止循环测序现成反应试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)对它们进行测序。所有序列均存入GenBank，登录号为KF699531-KF699842、KJ735102-KJ735383和KM246943-KM246944。

序列分析

用SeqMan™II (DNASTAR, Inc.， Madison, WI)对序列进行组装和编辑，然后对苹果(http://www.rosaceae.org/species/malus/malus_x_domestica/genome_v1.0)，以确定它们在基因组中的可能拷贝数，并将e值的截断值设为1e⁶最小值为100位。结果显示，这4个被研究的基因每一个都不超过3个命中，表明它们在基因组中是低拷贝基因。对于四个核基因，我们还设计了2-3对固定在不同位置的引物(数据未显示)。对其PCR产物的测序在目标区域产生了相同的序列，支持它们很可能是同源的Eriobotrya．从直接测序的色谱图中发现，可变位点的多态性是核苷酸加性模式的叠加[30.]，并从两边读取序列色谱图进行索引鉴定。4个核基因的单倍型推断采用PHASE v2.1 [31]、[32］．利用network 4.6.1.2 (www.fluxus-engineering.com)与中位数连接算法[33］．

国家自然科学基金项目(31100159、31170202、31170213、31200175)、教育部博士点基金项目(20110171110032)和中央高校基本科研业务费专项资金(13lgpy07)资助。

从属关系

1. 中山大学生命科学学院广东省植物资源重点实验室，广东省高校生物多样性动态与保护重点实验室，广州510275

   范强，陈素芳，李明万，景慧娟，周仁超，廖文波

2. 仲恺农业工程学院园艺与园林系，广东广州510225

   郭魏

3. 中国科学院华南植物园，广东广州510650

   吴魏

相应的作者

对应到Renchao周或文博廖．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

实验设计由WL和RZ构思。所有样品由WG和HJ采集，实验采用QF、SC和ML进行，数据分析采用QF、SC，本文作者为QF、SC、WW、RZ和WL。所有作者阅读并批准了最终稿件。

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