小rna在相互杂交中表现型的作用茄属植物lycopersicum而且美国pimpinellifolium

背景

在以往的研究中，表现出不同表型的互交杂交种已经得到了很好的记录，许多影响不同表型的因素已经得到了广泛的研究。然而，关于小rna的谱在互交杂种中是否不同，以及这些小rna如何影响基因表达和表型，我们知之甚少。为了更好地理解这一机制，我们分析了小rna在互惠杂交表型上的作用。

结果

相互之间的混合动力车茄属植物lycopersicum简历。Micro-Tom和美国pimpinellifolium生成了WVa700行。果实形态指数、单果重和株高在互交杂交种间存在显著差异。然后，通过小rna的高通量测序，我们发现76个已知miRNAs的表达水平在互反杂交种之间具有高度的可变性。随后，共410个靶基因被预测与这些差异表达的miRNAs相对应。此外，基因本体论(GO)注释表明，这些目标基因主要参与代谢过程。最后，通过qRT-PCR对miR156f、171a等差异表达miRNAs及其靶基因进行分析，其表达水平与不同表型具有良好的相关性。

结论

本研究表明，小rna的表达谱在互交杂交种之间存在差异，并且根据表型的不同也观察到不同表达的基因。目的基因的qRT-PCR结果显示，差异表达的miRNAs对其目的基因具有负调控作用。靶基因的表达与不同表型的观察结果具有良好的相关性。这些发现可能有助于阐明在互交过程中通过表观遗传修饰对不同表型有显著影响的小rna。

广泛杂交是植物进化中常见的现象，通过将许多期望性状从野生物种转移到作物上，为作物的改良做出了巨大贡献，如水稻[1)、小麦(2]和sun-flower [3.］．此外，在几种不同的植物物种中，互交杂种之间的显型有显著差异。例如，一项早期的研究使用拟南芥作为母性父母答:arenosa由于父本表明产生了许多活的种子，尽管无法获得相互杂交的种子[4］．在某些情况下，互作杂种之间的活力是不同的，例如答:芥生态型C24和Col-0 [5］．尽管有充足的实验证据证明这一现象的发生，但许多不同的机制，包括父源效应[6]，剂量敏感型调节剂[7]，基因印迹[8，转座元件激活[9]，细胞质-核相互作用[10]、母体效应[11]，细胞质遗传[12] - [14，优势度模型[15，超优势效应和上位效应[16] - [19]，已经被提出来了解互交杂交种之间的不同表型。

先前的研究表明，表观遗传修饰，特别是涉及小rna的修饰，是植物发育和生长的主要因素。因此，我们推测了一种有趣的可能性，即表观遗传修饰可能在互交杂交种之间的不同表型中发挥重要作用。小rna包括miRNAs和sirna，作为介质和调节，在表观遗传过程和基因表达中发挥着广泛的作用。例如，24-nt siRNAs可以介导DNA甲基化和转座子沉默[20.] - [22]， 21-nt siRNAs和miRNAs可通过切割靶基因调控基因表达水平[23]、[24］．根据以往的研究，杂交可能会引起小rna的变化[25] - [28］．此外，李[29]发现小rna通过嫁接(无性杂交)的改变可以导致表型变异。然而，目前尚不清楚互交杂种的表观遗传学发生了什么变化，以及表观遗传学如何影响互交杂种的基因表达和表型。因此，发现杂交后小rna的差异，以及这些小rna如何调节互交杂种之间的基因表达和后续表型是值得探索的。

番茄是一种模式植物，也是一种非常重要的经济蔬菜作物。30.］．野生番茄营养品质较高，抗病基因较多，与栽培番茄杂交的可行性较高[31]、[32］．远缘杂交通常用于将野生番茄的优良性状合并到栽培品种中进行遗传改良。本研究首次建立了栽培番茄与野生番茄的互交，以确定互交杂种之间是否存在不同的表型。其次，基于不同的表型，通过高通量测序分析小rna，以探索互惠杂交之间的差异。第三，通过qRT-PCR分析差异表达miRNAs对应的预测靶基因的表达情况，观察基因与表型的相关性。这些结果表明小rna可能是互交杂种表型变异的原因。

互交杂交种及其亲本表型分析

找出远缘杂交的倒数杂交之间是否有不同的表型茄属植物lycopersicum简历。Micro-Tom和美国pimpinellifolium选择WVa700系，分析杂种的表型特征(图1)．结果表明，与亲本相比，微汤姆× WVa700的叶面积、冠宽和果形指数均较大，而WVa700 ×微汤姆的叶长和果形指数均较小1)．此外，结果还表明，与WVa700 × Micro-Tom相比，Micro-Tom × WVa700的果实形状指数显著提高，单果重和株高显著降低(图2)1E;F;额外的文件1)．由此可见，互交杂交种间果实形状指数、单果重和株高的表型差异显著。

互交杂交种及其前体中的小rna测序

成熟的小rna在细胞质中产生;因此，我们通过高通量测序分析不同细胞质的互交杂种中的小rna，以确定它们之间是否存在差异，并探讨小rna与互交杂种中基因表达和表型的关系。建立了4个独立的小RNA文库(Micro-Tom、WVa700、Micro-Tom × WVa700和WVa700 × Micro-Tom)，测序数据分别存入NCBI的SRA数据库，注册号为SRX722032、SRX722033、SRX722034和SRX722035。

从Micro-Tom、WVa700、Micro-Tom × WVa700和WVa700 × Micro-Tom的叶库中剔除长度为15 ~ 30 nt的无sRNA序列的reads后，共获得12657989、11212106、11263114和11227866个reads2)．长度分布以20 ~ 24 nt为主，其中21 nt和24 nt长度最多，分别约为16%和45%。与WVa700 × Micro-Tom相比，Micro-Tom × WVa700的21 nt和24 nt sRNAs更丰富。在四种番茄中，24个nt sRNAs的积累高于21个nt sRNAs的积累。

重复相关siRNAs的分析

从Micro-Tom、WVa700、Micro-Tom × WVa700和WVa700 × Micro-Tom中分别获得12519660、11081459、11125150和11030188个clean reads，包括miRNA、rRNA、repeat、snRNA等3.；额外的文件4)．注意，重复相关的前四个sirna在唯一标记和总标记的LTR序列上都是匹配的。令人惊讶的是，与Micro-Tom × WVa700相比，WVa700 × Micro-Tom中所有四种与重复相关的sirna累积到较低的水平5；额外的文件6)．siRNA来源于重复序列，介导依赖于rna的DNA甲基化，在基因表达中起重要作用。因此，重复相关siRNA丰度的差异可能会影响互交杂种的染色质稳定性和基因表达。

相互杂交间已知mirna的分析

通过miRBase工具找到了已知的mirna。在搜索序列后，44个属于25个科的保守miRNAs被检测到7)．此外，还对每个科的丰度进行了分析8)．不同科间的丰度有显著差异。miR157、miR166、miR167和miR168 4个家族的reads显著高于其他家族。有趣的是，与WVa700 × Micro-Tom相比，Micro-Tom × WVa700 4个家族的mirna含量都更高，说明这4个家族的mirna可能是番茄植株生长发育的基础和不可或缺的因素，可能是造成互交杂交种间基因表达差异的原因。

为了探索mirna对互交杂交种表型的不同影响，我们采用分层聚类的方法对差异表达的已知mirna进行分析2)．76个miRNAs的表达水平，包括13个保守的和63个非保守的miRNAs，在互惠杂交中高度可变，总共有63个miRNAs显示出超过4倍的变化(附加文件9)．其中，有40个mirna在Micro-Tom × WVa700中表达量高于WVa700 × Micro-Tom，如保守mirna (miR156f-3p、miR171a-3p、miR535a和miR169a)和非保守miR5081在Micro-Tom和WVa700中表达量相似。miR482c、miR394a、miR535b、miR169b、miR170、miR393a、miR160a、miR165a等其他36个miRNAs在Micro-Tom × WVa700中表达水平明显较低。因此，差异表达的miRNAs可能与互交杂交种之间显著不同的表型有关。

为了验证不同水平的miRNA表达，我们用茎环RT-PCR对10个保守的miRNA进行了定量实验。定量实验结果与测序数据一致(图3.)．

不同表达miRNAs靶基因的预测

预测不同表达miRNAs的靶基因，以阐明miRNAs与表型之间的关系。

共预测了76个差异表达miRNAs的410个靶基因。这些靶点的基因功能是通过基因本体(GO)注释确定的，涉及生物过程、细胞成分和分子功能(图1)4)．前三名的生物过程是代谢过程(20%)、细胞过程(18%)和对刺激的反应(12%)。靶基因主要位于细胞、细胞部位和细胞器内的比例分别为29%、29%和23%。此外，分子功能的靶基因中有50%属于结合基因，39%属于催化活性基因，说明这些靶基因可能参与许多代谢过程，这些靶基因与不同表型之间可能存在复杂的关系。

为了解释互交杂交种之间可能的特异关系和不同表型之间的关系，采用定量RT-PCR分析方法测定了参与叶片发育的6个预测靶基因的表达水平，包括ARF16(miR160a),HD-ZIP(miR165a),生长素盒蛋白质(miR393a),盒蛋白质(miR394a) [33] - [36]，发展的果实，包括SBP(miR156f-3p) [37和植株高度，包括sci(miR171a-3p) [38)(图5)．结果表明SBP而且sciWVa700 × Micro-Tom高于WVa700，而ARF16，HD-ZIP，生长素盒蛋白质而且盒蛋白质WVa700 × Micro-Tom较低。因此，本研究中靶基因的表达水平与其对应mirna的丰度呈负相关。

在几种不同的植物物种中，互交杂种的不同表型已被充分记录。与WVa700 × Micro-Tom相比，Micro-Tom × WVa700的果实形状指数显著提高，单果重和株高显著降低。因此，了解互交后的不同表型是如何发生的是很重要的。

互反杂交中24-nt sRNAs的不同图谱

miRNAs的长度通常为21或22 nt，而sirna的长度为24 nt [39］．在本研究中，通过高通量测序，数量最多的两个sRNAs分别是miRNAs(约16%)和sirna(约45%)，这与之前对番茄植物的一项研究相似，该研究显示24-nt sRNAs积累的数量超过21-nt sRNAs [40］．

从srna的长度分布来看，24 nt srna在总srna中所占比例最高，从47.51% (Micro-Tom × WVa700)到42.62% (WVa700 × Micro-Tom)不等(附文件)2)，这一趋势与互交杂种的总DNA甲基化水平一致。结果还表明，Micro-Tom × WVa700的DNA总甲基化水平不显著高于WVa700 × Micro-Tom(未发表结果)。因此，24-nt sRNAs的不同谱可能会影响相关基因的表达，从而调节表型。此外，在前四个与重复相关的sirna中，都与一个LTR(一种逆转录转座子)相匹配，该LTR在Micro-Tom × WVa700中比在WVa700 × Micro-Tom中具有更高的水平5和额外的文件6)．此外，LTR可以通过种间杂交重新激活，这在之前的几项研究中已经得到证实[41]、[42］．因此，我们推断，由不同的重复相关siRNAs调控的LTR的不同反应性可能会影响互交杂种之间的表型变异。

不同的表型可能是由不同表达的mirna引起的

已有研究报道通过miRNAs与其靶基因之间的序列特异性相互作用进行基因调控可以影响植物的生长发育。在之前的一项研究中，丧失功能的突变体ARF16（MIR160a基因)被用来在叶子中寻找有趣的表型[33]，表明不同的表达水平可能会影响叶片的发育。此外,通过定位HD-Zip，生长素F-box蛋白、F-box蛋白基因和miR165a、miR393a、miR394a等miRNAs也调控叶片的发育，对叶片形态的构建有贡献[34] - [36］．本研究显示，杂交种与亲本在叶面积和叶长性状上存在显著差异。同时，miR160a、miR165a、miR393a和miR394a在互交杂种中表达差异显著。此外，微汤姆× WVa700单果重较轻1)，而miR156f-3p在Micro-Tom × WVa700中的表达水平显著高于WVa700 × Micro-Tom9)．一种可能是miR156积累的增加导致表达的减少SBP这影响了果实的重量，这在转基因番茄植株中得到了证实[37］．此外,SCARECROW-LIKEA（sci)，是miR171的靶标，与株高有关[38］．本研究发现miR171a-3p的株高和表达水平存在显著差异。综上所述，互交杂交种中miRNAs和靶基因的表达水平因表型的不同而不同。因此，在远端杂交过程中，负向调控靶标的miRNAs的表达可能导致互交杂种之间的不同表型。

综上所述，互交杂交种的主要特征是具有相同的核基因组，但细胞质和表观基因组可能有很大的差异。将互交杂交种之间的表型差异仅仅归因于一个因素，无助于理解这些差异背后可能的分子机制。在本研究中，包括miRNAs和sirna在内的小rna在互惠杂交中表现出差异。由于互交杂交成熟小rna的模式不同，MIRNA基因的不同修饰可能是由于表观基因组的不同而导致这些不同表型的原因。在细胞质中，单个成熟的miRNAs被装载到RNA诱导沉默复合体中，以指导mRNA的切割[39]、[43］．此外，Lu等人在之前的研究中报道，母体sirna可以调节互交中的种子大小[6］．因此，来自不同亲本的不同细胞质也可能影响小rna对植物发育的调控作用。综上所述，需要进一步的研究来更好地了解小rna在互惠杂交中是如何发生的。

本研究表明，小rna的表达谱在互交杂交种之间存在差异，并且根据表型的不同也观察到不同表达的基因。目的基因的qRT-PCR结果显示，差异表达的miRNAs对其目的基因具有负调控作用。靶基因的表达与不同表型的观察结果具有良好的相关性。这些发现可能有助于阐明在互交过程中通过表观遗传修饰对不同表型有显著影响的小rna。

植物材料

茄属植物lycopersicum简历。Micro-Tom (2n = 24)和美国pimpinellifolium纯系和自交系均采用WVa700 (2n = 24)。分别将Micro-Tom和WVa700杂交得到Micro-Tom × WVa700和WVa700 × Micro-Tom。在相对湿度为60%、温度为23℃、光照时间为16 h、黑暗时间为8 h的温室中，选择4种番茄100株，平均每种番茄25株。

表型特征

从个体互交杂交种中随机选取3株健康植株Micro-Tom和WVa700。观察了20种不同的形态表型。根据这些因素确定叶片表型，包括叶面积[44]，叶长(定义为从茎部的叶插入点到顶叶顶端的距离)[45]，叶宽(定义为两个最长的侧叶顶端之间的距离)[45，最大叶片的L/W和单株叶片数。对植株的株高、冠宽和茎粗进行了评价。在开花前的同一发育阶段(约45天)观察了四种番茄植株的叶片表型和植株形态。此外，还记录了首花节、花序数、每花序花数和花期等花性状指标。在花期观察了四种类型的花性状。此外，研究的果实性状包括单果重量、直径和高度;果形指数(h/d比)和破碎期[46];每花序的果数;果期阶段;成熟阶段;以及坐果率。在果实成熟时观察了4个品种的果实性状。该数据为三次测量的平均值，并经过方差分析(ANOVA) [47］．

小rna的高通量测序

在观察叶片表型的同时，还随机选取了3株健康植株，分别为WVa700、Micro-Tom × WVa700和WVa700 × Micro-Tom。根据制造商的协议，使用Trizol试剂(Invitrogen Inc.)提取幼叶的总rna。这些rna被送往北京基因组研究所(BGI)进行测序。在对原始数据进行分析后，根据所述方法获得清洁序列进行进一步分析[48］．通过长度分布和公共序列分析清洁reads。然后，将序列与基因组进行匹配，发现重复相关的sRNAs，并使用miRBase观察sRNAs和已知miRNAs的表达。为了揭示mirna的差异表达，我们将所有文库中mirna的丰度归一化。归一化公式为实际计数/总计数*1,000,000。然后比较两个库的归一化值，并以fold-change (fold-change = log)的形式进行计算₂(治疗/控制))。此外,假定值使用前面描述的公式[49］．根据miRNAs的表达方式生成集群图;换句话说，相同表达方式的mirna会根据它们的折叠变化值聚集在一起。对于靶基因的预测，我们采用了前面描述的规则[50]、[51］．为了预测靶点，分析了基因的功能，包括它们所参与的生物过程，它们所定位的细胞成分和基因的分子功能。对比分析了互反杂化和F₁杂种(Micro-Tom × WVa700和WVa700 × Micro-Tom)及其亲本(Micro-Tom和WVa700)。

q RT-PCR实验

Stem-loop q RT-PCR用于定量表达差异显著的miRNAs。10个miRNAs的序列来自高通量测序。引物采用引物软件设计。来自高通量sRNA测序实验的两微克总RNA，在设计的互补引物的基础上转化为cDNA。

同时采用poly (A)-tail q RT-PCR方法对靶蛋白的表达进行定量分析。用GenScript软件设计了正向引物和预备引物。用低聚(dT)引物将两微克总RNA转化为cDNA。

在ABI STEPONE Real-Time PCR仪上扩增25 μl，其中SYBR 12.5 μl, cDNA 2.0 μl，正向引物1.0 μl，反向引物1.0 μl，无菌蒸馏水8.5 μl。循环过程为95°C 30 s，然后在95°C和60°C分别进行40次5 s和30 s的循环。所有反应均重复进行，并对每个基因进行无模板和无反转录的对照。阈值周期(C_T)由ABI STEPONE自动获取，并通过比较计算每个基因的折叠变化作为相对量(RQ)值C_T（2^——ΔΔCt)．U6基因和18s rRNA分别为miRNAs及其靶基因的定量参考。引物显示在附加文件中10．

支持数据的可用性

本文的支持数据包含在本文及其附加文件中。

本研究得到浙江省重点科技创新团队(批准号:)资助。2013TD05)，高等教育博士学科点专项科研基金(批准号:2013TD05);20110101110089)。作者感谢邓迪大学生命科学学院细胞与发育生物学学部的陈志辉博士对本文的批判性评论。作者也感谢位于中国杭州的浙江省农业科学院蔬菜研究所的王荣庆提供种子(美国pimpinellifoliumWVa700行)。

从属关系

1. 浙江省杭州市余杭塘路866号浙江大学蔬菜研究所

   李俊星，孙茜，余宁宁，邹晓霞，齐振宇，Muhammad Awais Ghani &陈丽萍

2. 农业部园艺植物生长发育与生物技术重点实验室，杭州310058

   李俊星，孙茜，余宁宁，邹晓霞，齐振宇，Muhammad Awais Ghani &陈丽萍

3. 浙江大学生物系统工程与食品科学学院富力食品科学研究所，杭州，310058

   Jiajin朱

相应的作者

对应到力平陈．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

JL和QS生成sRNA数据并对结果进行解释。NY、JZ、XZ、ZQ和MAG分别进行表型观察和qRT-PCR实验。JL和QS起草了手稿。LC, JL和QS设计研究并进行统计分析。LC监督了这项研究。所有的作者都阅读并认可了最终的手稿。

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