意大利黑麦草抗灰斑病新主位点的鉴定(gydF4y2Ba多花黑麦草gydF4y2BaLam)。gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

灰色叶斑病(GLS)，由gydF4y2BaMagnaporthe oryzaegydF4y2Ba(鉴定gydF4y2BaPyricularia oryzaegydF4y2Ba)对黑麦草的影响是一个非常严重的问题。严重感染的小幼苗在几天内就会死亡，草的树桩也会被这种疾病严重破坏。因此，抗gls品种的开发已成为黑麦草育种中值得关注的问题。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在一个交叉衍生的FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba意大利黑麦草种群(gydF4y2Ba多花黑麦草gydF4y2BaLam.)表明，群体对GLS的抗性可能由1 ~ 2个优势基因控制，广义遗传率为66.5 ~ 77.9%。在散装分离分析中，两个SSR标记在意大利黑麦草连锁群(lg3)中均表现出特异性信号，表明抗性基因位点可能在lg3中。因此，我们构建了覆盖133.6 centimorgan的LG 3的遗传连锁图谱，与意大利黑麦草LG 3的其他SSR标记和之前被分配到黑麦草LG 3的草锚探针，以及从水稻染色体(Chr) 1的EST图谱中选择的水稻表达序列标记(EST)衍生标记，因为黑麦草LG 3与水稻Chr 1同源。利用遗传连锁图谱和表型资料进行QTL分析gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba群体检测出GLS抗性的主要位点。优势分数对数最高的QTL解释的表型变异比例为61.0 ~ 69.5%。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

发现了一个新的GLS抗性位点，其遗传位置与已知的其他GLS抗性位点不同。广义遗传力和由QTL解释的表型变异比例相似，提示小麦GLS抗性表型的大部分遗传因素gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba种群可以用单一抗性位点的函数来解释。我们将新抗性位点的假定基因命名为gydF4y2BaLmPi2。LmPi2gydF4y2Ba将有助于今后与其他抗性基因结合开发抗gls品种。gydF4y2Ba

意大利黑麦草(gydF4y2Ba多花黑麦草gydF4y2Ba产自地中海地区，主要用于干草和青贮。它是欧洲和亚洲温带地区最重要的牧草之一，因为它对牲畜的适口性和消化率都很高[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

细菌性疾病，由真菌病原体引起gydF4y2BaMagnaporthe oryzaegydF4y2Ba(鉴定gydF4y2BaPyricularia oryzaegydF4y2Ba)是水稻最严重的病害。在稻瘟病流行年份，稻瘟病可能造成灾难性的生产损失。因此，许多研究人员利用遗传、病理和生物技术方法对稻瘟病进行了研究，通过确定水稻抗性机制的许多方面和该疾病的致病性来控制该疾病的暴发[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

黑麦草病，又称灰叶斑病(GLS)，最近已成为日本意大利黑麦草的一个非常严重的问题[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和多年生黑麦草(gydF4y2Bal为gydF4y2BaL.)在美国[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．该病害的病原真菌与引起稻瘟病的病原真菌属同一种[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．疾病症状最初表现为叶和茎上的棕色小点，然后发展为浸水的斑点，进一步发展为中心为灰色、边缘为深棕色的圆形或椭圆形病变。如果gydF4y2Bam . oryzaegydF4y2Ba严重感染易感基因型的叶片，受感染的叶片死亡，小幼苗在几天内被杀死。gydF4y2Ba

在多年生黑麦草品种中已经观察到对GLS的抗性表型的多样性，并在两种多年生黑麦草的品种和试验系中发现了一些抗性基因型[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba和意大利黑麦草[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．此外，这种耐药性可能由几个主要基因位点控制[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba具有很高的遗传性[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，表明基于循环选择的育种方案可以有效提高黑麦草对GLS的抗性[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在这种情况下，我们已经确定了GLS抗性基因的一个位点，gydF4y2BaLmPi1gydF4y2Ba，意大利黑麦草连锁群(LG) 5 [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，并使用基于合成的比较基因组学方法对水稻基因座周围的表达序列标签(ESTs)进行了靶向定位[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．类似地，Curley等人[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]从意大利×多年生黑麦草杂交种亲本无性系的定位群体中，报告了LG 2、3、4和6抗GLS的4个数量性状位点(qtl)。这些成果有望促进黑麦草抗gls品种的育种，因为育种家可以利用与上述抗性位点紧密相连的遗传分子标记轻松筛选抗gls基因型。gydF4y2Ba

然而，由于抗性由少数主要基因控制的破坏是稻瘟病中已知的现象[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，目前已鉴定的抗GLS基因位点在黑麦草中的持久性不能得到保证，今后应寻找其他抗GLS的新基因位点，用于开发抗GLS的耐久抗性品种。gydF4y2Ba

因此，我们试图从FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba群体聚类分离分析[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba以及利用水稻基因组信息的syntenbased比较基因组学方法。利用扩增片段长度多态性(AFLP)和简单序列重复(SSR)标记进行聚类分离分析，构建了黑麦草lg3的遗传连锁图谱。水稻est衍生标记的靶向定位进一步丰富了连锁图谱。利用连锁图谱和表型资料进行QTL分析gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba群体检测到一个抗性基因位点，可解释受接种叶龄影响的表型变异的61.0 ~ 69.5%。抗性基因位点的位置被证实与之前由Curley等人在黑麦草lg3上发现的GLS抗性基因位点不同。[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．我们指定了抗性基因gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba作为黑麦草抗GLS的新基因。gydF4y2Ba

f群体对GLS抗性的评价gydF4y2Ba

我们分别对第二年轻的仍在扩张的叶子和第三年轻的完全扩张的叶子进行了两次独立的接种，这两个叶子在FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人群(共接种4次)。7天后，我们根据表中所示的评分表对每个接种时刻进行评分gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

每一基因型的平均表型值都是从幼叶或膨大叶的每个实验数据和所有四个实验中计算出来的。FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba幼叶试验中有59株抗性(0-2分)和46株易感(3-4分)，扩叶试验中有72株抗性和33株易感，四种接种的平均值为65株抗性和40株易感(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．幼叶实验中分离比均为1:1 (gydF4y2BaXgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 1.61,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.20)和3:1 (gydF4y2BaXgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 2.31,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.13);然而，所有四种接种的平均分离比在统计学上不同于1:1和3:1。这些结果表明，在FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba种群可能由一两个显性基因控制。gydF4y2Ba

两者之间存在显著的相关性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．特别是同叶期结果之间的相关系数较高(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．重复测量方差分析(ANOVA)显示有显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba所有接种GLS严重程度的基因型差异均< 0.01);但在相同叶龄内，不同处理间差异不显著gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).使用与上述重复测量方差分析相同的数据集的双向方差分析显示有显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)的基因型和叶龄对GLS严重程度的影响显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).由重复测量方差分析结果计算的广义遗传力百分比见表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba幼叶试验、扩叶试验和四种接种处理的A分别为70.1%、77.9%和66.5%。gydF4y2Ba

GLS抗性基因的检测gydF4y2Ba

为了检测主要基因位点，我们使用了散装分离分析[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba因为我们成功地检测到了一个主要基因，gydF4y2BaLmPi1gydF4y2Ba，对于GLS抗性使用先前研究中的方法[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．首先，我们用64个引物组合进行AFLP测序，鉴定出两个标记E38/M47和E32/M59，这两个标记在抗性亲本和抗性体中都有特异性信号。初步的遗传连锁分析和随后的QTL分析表明，这两个标记是连锁的，并与GLS抗性相关(数据未显示)。这一结果鼓励我们利用Hirata等人开发的黑麦草参考图谱中的SSR标记进一步进行分析。[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]以识别含有电阻位点的LG。利用218个SSR标记进行散装分离分析，发现4个标记在抗性亲本和抗性体中具有特异性信号。其中，标记08-08B和9-12A已被报道在黑麦草lg3上定位，二者之间的遗传距离相对较近，而另外两个标记12-01E和17-01H则分别被报道在lg6、lg7和lg2上定位[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．由此推测，抗性基因位点可能在黑麦草lg3中。尽管如此，4个抗性体特异性SSR标记都被选择用于LG 3的图谱构建。gydF4y2Ba

在黑麦草lg3上定位的2个抗体特异性AFLP和4个SSR标记及其他38个SSR标记[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，构建了黑麦草LG 3的遗传连锁图谱gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人口。AFLP和SSR标记的带型分离类型见表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．结果表明，FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba选择2个AFLP和29个SSR标记的群体进行图谱构建。gydF4y2Ba

GLS抗性位点周围的靶向定位gydF4y2Ba

黑麦草品种lg3染色体与水稻染色体Chr 1同源[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba];因此，我们从Chr 1 [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba基因距离大约为每5厘摩根(cM)或更小。此外，定位于黑麦草LG 3上的草锚探针[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba被选中。共筛选出76个水稻EST无性系和7个锚点探针，设计引物对。在水稻EST无性系中，51对引物(67.1%)成功扩增出来自母本和/或父本的清晰聚合酶链反应(PCR)产物。37对引物(48.7%)成功扩增了FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba单链构象多态性(SSCP)分析中的群体。同样，来自草锚探针的两对引物(28.6%)成功扩增了来自母本和/或父本的清晰PCR产物;在SSCP分析中，两者在亲本间具有多态性。大多数SSCP分析显示多个频带(数据未显示)。然而，从SSCP分析中得到的大多数带型可以分为表中所示的五种分离类型gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．SSCP分析的详细结果也显示在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．共有27个水稻est源标记和2个草锚探针源标记被划分为5个分离类型，用于构建LG 3的遗传图谱。gydF4y2Ba

遗传连锁图谱的构建gydF4y2Ba

使用JoinMap 4分析AFLP、SSR和SSCP数据[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．通过对57个标记的LOD阈值为2.0的主要类群的分析，我们成功构建了覆盖133.6 cM的遗传连锁图谱，其中包括2个AFLP-、2个草锚探针-、12个SSR-和16个水稻est衍生标记(图1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在批量分离分析所选SSR标记中，12-01E和17-01H分别归属于LG 6、LG 7和LG 2 [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，也被集成到链接图中;但是，其他SSR标记在连锁图谱中的顺序与前人研究的其他LG 3图谱相同[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，说明本研究的连锁图谱准确地代表了黑麦草的LG 3。显著共线性(斯皮尔曼秩相关rho = 0.64，gydF4y2BaPgydF4y2Ba黑麦草lg3与水稻Chr 1的遗传连锁图谱< 0.01)[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]也使用水稻est衍生标记的顺序信息进行了观察(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

GLS抗性新位点的鉴定gydF4y2Ba

利用GLS严重程度的连锁图谱和表型数据进行QTL分析，揭示了GLS抗性在LG 3中的位点(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．用四次接种试验的幼叶、膨大叶和总叶的表型数据得到的三个LOD评分图形状相似，峰值出现在几乎相同的遗传位置(图1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．四次接种试验中，幼叶、膨大叶和总数据LOD得分最高分别为13.8、15.2和17.9。在4次接种试验中，幼叶、膨大叶和总数据LOD评分最高时，QTL解释的表型变异比例分别为61.0、68.1和69.5%。估计在同一遗传位置上，抗病亲本对幼叶、膨大叶和四次接种试验中LOD评分最高的亲本的加性效应分别为-1.09、-0.99和-1.05。根据4次接种试验的总数据，通过LOD评分图的1-LOD和2-LOD支持区间预测GLS抗性基因位点的位置。水稻est衍生标记C30062被发现是最接近抗性位点的标记(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．由于QTL解释的表型变异的比例与上述广义遗传力的比例相似，因此FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba被认为是由检测到的单基因位点的功能来解释的gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba结果表明，有1 ~ 2个主要位点与耐药有关gydF4y2Ba．gydF4y2Ba我们将抗性位点的假定基因指定为gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba，因为这是GLS抗性的第二个主要位点，仅次于gydF4y2BaLmPi1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba4gydF4y2Ba意大利黑麦草。gydF4y2Ba

GLS的严重程度受温度、湿度等环境因素的影响[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．因此，QTL分析群体的表型评价应多次进行，表型评价时的环境条件应尽可能稳定，以增加目标性状的遗传力，因为遗传力越高，分析时估计越准确。因此，我们采用滤纸法[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，据此我们可以评估F的GLS严重程度gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba在完全控制接种条件下的四倍种群gydF4y2Ba体外。gydF4y2Ba这种方法克服了GLS的高致命性和意大利黑麦草的一年性，因为这种方法不需要整株植物，只需要幼苗的脱落叶片。接种试验的相关分析表明，接种试验具有很强的相关性，特别是相同叶龄的试验结果之间的相关性(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．重复测量方差分析表明，同一叶龄内接种试验间差异不显著(表5gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA)，说明滤纸法重复性高。gydF4y2Ba

F型疾病严重程度的频率分布gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba本研究的群体在膨大叶中比在幼叶中倾向于抗性。即幼叶和膨大叶的抗性敏感性分离比分别为1:1和3:1。在黑麦草的GLS中，年轻的幼苗对GLS的敏感性越严重[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，以及病变类型的混合，这些病变类型往往在同一植株的年轻叶片上更为严重[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，已被报道过。这些报告和本研究的结果表明，使用相同的叶片或至少在相同生理条件下的叶片重复评估每株植物的GLS严重程度是很重要的。gydF4y2Ba

耐药分离比表明，在FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人口。然后采用三步分析方法检测耐药基因位点:(1)通过AFLP分析对靶位点进行全基因组调查;(2)利用SSR标记鉴定含有目标位点的LG;(3)利用水稻est衍生的内含子扫描引物，以合成为基础的比较基因组学方法对目标位点进行靶向定位。这些过程迅速检测到FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba利用fllp和SSR分析，分别在LG 3号上鉴定了一个含有抗性基因的位点。随后，利用水稻est衍生引物对进行基于合成的靶向定位，有效地生成了覆盖133.6 cM的增强lg3图谱(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在靶向定位中，67.1%的水稻est引物扩增了来自父本和/或母本的PCR产物。其效率与我们之前的研究几乎相同，在我们之前的研究中，从水稻Chr 9同源黑麦草lg5上提取的ESTs中，有64.3%的内含子扫描引物扩增出清晰的PCR产物[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．虽然尚不清楚本研究使用的水稻est源引物与目标黑麦草基因组序列之间有多大的序列相似性，但采用保守的三'端区(COTER)引物策略对引物进行改进，该引物在3'端8个碱基上与目标基因组序列具有完全相似，因此可以在温带牧草中作为高度转移的标记[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，可能会进一步提高效率。gydF4y2Ba

小麦GLS抗性的QTL分析与表型值gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人口成功地探测到一个主要的gydF4y2BaLmPi2gydF4y2BaGLS电阻在构建的LG 3图谱上的位置(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．虽然从四次接种实验中得到的幼叶、膨大叶的表型值和总数据得到的抗GLS的最大LOD分数随接种叶龄的变化而波动，但在LG 3图谱上观察到的它们几乎在相同的位置(图1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，暗示由gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba位点在不同叶龄均有功能。gydF4y2Ba

柯利等人[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]报告了3个qtl在其定位群体中对GG9的GLS抗性的广义遗传力较高，总表型方差百分比较低，分别为0.895-0.932和32.3-53.0%。他们提到，解释的总表型方差百分比低于从广义遗传力中预期的百分比的原因可能是由于额外的未检测到的低效qtl或最显著qtl区域周围的扭曲分离。相比之下，在本研究中，广义遗传力和表型变异的百分比解释了最高的LOD评分gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba用4次接种试验数据计算的位点分别为66.5%和69.5%。虽然我们只是构建了LG 3地图来检测gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba这些值非常相似，说明在FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人口可以用单一的功能来解释gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba基因。gydF4y2Ba

LmPi2gydF4y2Ba位点与先前确定的抗性基因位点有明显区别gydF4y2BaLmPi1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，因为它们各自位于不同的LG上。相反，Curley等人检测到的四个qtl中的一个[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba也被报道在同一台LG手机上gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba轨迹。不幸的是，我们不能直接区分QTL和gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba大多数草锚探针衍生的标记，其中一些位于Curley等人的QTL周围。[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，由于本研究PCR扩增不成功，无法添加到我们的LG 3的图谱中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．因此，从本质上讲，我们利用Hirata等人报道的LG 3图谱的信息确认了这些遗传位点之间的遗传距离。[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．在这张地图上，最近的草锚探测器CDO460与Curley等人的QTL紧密相连。[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba但与SSR标记08-08B和09-12H在遗传上有超过25厘米的距离，这两个标记都与gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba在我们的地图LG 3(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这意味着gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba位点可能与Curley等人检测到的QTL不同。[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba因此我们认为它是GLS抗性的一个新的位点。gydF4y2Ba

植物抗病基因和抗病基因类似物(RGAs)常在基因组中形成簇[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba] - [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．这两个gydF4y2BaLmPi2gydF4y2BaCurley等人的QTL和上述QTL [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]存在于黑麦草lg3上，其中一种分离的黑麦草RGAs [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]可能位于qtl之间的相应区域[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．类似，如图所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba据了解，水稻Chr 1包含一些抗稻瘟病的基因在黑麦草lg3的共链区周围。由此可见，在黑麦草和水稻的共纤区周围可能形成一个同源的抗病性簇，尽管谷物草之间的共纤区破坏通常显示在抗性基因位点上[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba] - [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba本研究中使用的人群可以用gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba轨迹;因此，该抗性位点将为抗gls品种的选育提供依据gydF4y2BaLmPi1gydF4y2Ba轨迹(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和Curley等人检测到的qtl [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．然而，水稻抗稻瘟病品种的育种历史揭示了一个主要的问题:由几个主要基因控制的抗性的破坏是水稻抗稻瘟病品种开发中最重要的问题之一[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．黑麦草中的GLS和稻瘟病都是由一种共同的致病物种引起的，gydF4y2Bam . oryzaegydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba];因此，有理由预测，如果gls抗性由少数抗性基因控制，同样的现象也可能发生在抗gls品种中。开发由可交换的多个等基因系组成的可转换多系品种，每个等基因系包含一个主要抗性基因，可能是开发抗GLS的持久抗性品种的一种方法，就像水稻的情况一样[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，尽管由于异交的性质，黑麦草的育种系统与水稻的育种系统有很大的不同。gydF4y2Ba

我们从一个交叉衍生的F中鉴定了GLS抗性的遗传位点gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba意大利黑麦草种群(gydF4y2Bal . multiflorumgydF4y2Ba)通过散装隔离分析。在黑麦草lg3上检测到抗性位点，可解释受接种叶龄影响和波动的表型变异的61.0 ~ 69.5%。由于表型方差和广义遗传力百分比相近，导致FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba种群可以用单一抗性位点的函数来解释。该抗性位点的遗传位置不同于其他已知的GLS抗性位点，因此被证实为一种新的GLS抗性位点。我们将新抗性位点的假定基因命名为gydF4y2BaLmPi2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba意大利黑麦草种群(gydF4y2Bal . multiflorumgydF4y2BaLam.)是由两个杂合子个体之间的单个杂交产生的:一个抗gls的cv。“萨里”作为女性父母和gls易感个体的cv。“南庙巴”作为父亲。的简历。“萨里”和简历。“南庙坝”在中国种质资源信息网(GRIN;gydF4y2Bahttp://www.ars-grin.gov/gydF4y2Ba)和JP 67746在国家农业生物科学研究所基因库(NIAS GeneBank;gydF4y2Bahttps://www.gene.affrc.go.jp/index_en.phpgydF4y2Ba),分别。gydF4y2Ba

FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba该群体由105个个体组成，以前曾用于建立滤纸法评价意大利黑麦草的GLS抗性[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．种子播种于96孔托盘(8 × 12孔;28 × 40厘米)，生长在25°C的温室中。FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba用DNeasy植物小试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从叶片中提取群体，并进行多态性分析，如下文所述。gydF4y2Ba

实验设计gydF4y2Ba

为了评估GLS抗性，我们采用了重复测量设计，四次接种，包括两个独立接种，每个接种中第二年轻的叶子仍在扩张，第三年轻的叶子完全扩张gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人口。也就是说，我们从每个基因型中分别分离出第二年轻和第三年轻的叶子各两片，并将这四片分离的叶子进行独立接种，每个基因型中第二年轻和第三年轻的叶子分别进行两次接种，共进行四次接种。通过相关样本的实验设计，我们可以检验基因型和接种因子的显著性。此外，由于每个基因型的叶片分别放置在不同的培养皿中，并按随机接种顺序进行各实验，我们还检验了因子叶龄的显著性以及基因型与叶龄的相互作用。gydF4y2Ba

分生孢子悬浮液的制备gydF4y2Ba

孤立的单一姿态gydF4y2Bam . oryzaegydF4y2Ba从日本山口县一种天然感染的意大利黑麦草中获得[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba使用了)。在含5% (w v)的培养基上培养gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})燕麦片，2%gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})和3.5% (w vgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})琼脂，25°C暗处培养10天。用刷子将空中菌丝从表面刮掉。菌丝在25°C的近紫外光下照射5天诱导分生孢子，分生孢子悬浮于蒸馏水中。将分生孢子的终密度和表面活性剂吐温20在接种体中的终浓度调整为5 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba分生孢子毫升gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}0.01% (v vgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}),分别。gydF4y2Ba

人工接种gydF4y2Ba

我们使用滤纸法[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba来评估FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人口。即在两分蘖期或三分蘖期从幼苗中分离2.5°Cm长的叶段，并将叶段背面朝上置于含0.7% (w vgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})琼脂添加40毫克LgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}苯并咪唑。将10微升分生孢子悬浮液滴到2 × 15毫米的矩形滤纸(编号5B;Toyo roshi kaisha，东京，日本)。然后将接种过的滤纸表面与叶片接触。用Parafilm (PM-996;Bemis公司，Neenah, WI, USA)，在25°C的黑暗中孵育24小时。然后取出滤纸，再次用微孔外科胶布(1530-0;3 M保健中心，美国圣保罗)。接种后的叶片在25℃的短日照条件(光照8 h /暗16 h)下孵育7天;光子通量强度为100 μmol m的光gydF4y2Ba^{－2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}在工厂水平上由荧光灯(FL40SEX-N-HG;NEC照明，东京，日本)。潜伏期结束后，根据表中所示的分级表对疾病症状进行评估gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

的隔离分析gydF4y2Ba

10个耐药(0-1分)和10个易感(4分)个体gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba选择4个独立的GLS抗性评价的平均得分。然后将这些抗性和易感个体的基因组dna等量混合，分别构建抗性和易感体，并进行AFLP和SSR分析。gydF4y2Ba

妊娠分析gydF4y2Ba

AFLP分析使用IRDye荧光AFLP试剂盒进行，用于大型植物基因组分析(美国林肯市LI-COR公司)。我们分析了64个AFLP选择性引物组合:gydF4y2Ba生态gydF4y2Ba国际扶轮+ AXgydF4y2Ba_1gydF4y2BaXgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/gydF4y2Ba均方误差gydF4y2Ba我+残雪gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaXgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(XgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba= A或C;gydF4y2BaXgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba= A, C, G或T;XgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba= A或T)。PCR产物经6% (w vgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})在LI-COR DNA分析仪(LI-COR)中变性丙烯酰胺凝胶，根据制造商的说明。gydF4y2Ba

SSR分析gydF4y2Ba

我们对218个引物组合进行了SSR分析，这些引物组合被分配到与意大利黑麦草单倍体核型相对应的7个LGs上的位置[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．PCR在GeneAmp PCR系统9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中进行，反应液为10 μL，含有0.05 μL的Hot Star Taq(5单位μL)gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}；Qiagen)， 1 μL 10× PCR缓冲液，0.4 μL 25 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba、dNTPs 0.8 μL(每个2.5 mM)、引物0.2 μL(每个20 pmol μL)gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})， 20ng基因组DNA和5.35 μL无菌蒸馏水。在95°C第一次处理反应混合物15分钟后，进行以下PCR程序:10°循环，94°C 15秒，65-56°C(每循环-1°C) 15秒，72°C 2.5分钟;30°循环94°C为15's, 55°C 15's, 72°C为1分钟;72℃孵育7分钟。PCR产物用预制聚丙烯酰胺凝胶电泳(GeneGel Excel 12.5/24;GE医疗保健公司，白金汉郡，英国)在Peltier温度调节电泳装置(GenePhor;GE Healthcare)，配有电泳电源(EPS3501XL;通用电气医疗保健公司)，按照制造商的说明。样品缓冲液如下:将23 mL蒸馏水、250 μL 0.1 M EDTA和500 μL 0.5 M Tris混合，用醋酸调至pH 7.5，然后用1.25 mL 1% (w vgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})加入二甲苯氰醇和溴酚蓝10 mg。2微升样品缓冲液与4 μL PCR产物混合。将混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶上，温度调节在25℃，在600 V, 25 mA, 15 W的条件下电泳80分钟。使用Hoefer自动凝胶染色仪(GE Healthcare)中的银染色试剂盒(GE Healthcare)对分离的PCR产物进行银染色。gydF4y2Ba

内含子扫描引物设计gydF4y2Ba

通过Takahashi等人先前提到的一种程序，基于synten基的遗传定位被用于目标抗性基因位点周围的标记饱和。[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．其他研究小组已经证实了黑麦草和水稻之间的同源性[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]、[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba];因此，我们从公共EST地图数据中选择了与黑麦草目标LG同向的Chr中的水稻EST无性系[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba在水稻基因组研究计划(RGP;gydF4y2Bahttp://rgp.dna.affrc.go.jp/E/gydF4y2Ba)．随后，从水稻注释项目数据库(RAP-DB;gydF4y2Bahttp://rapdb.dna.affrc.go.jp/gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．EST克隆的编码序列(CDS)与回收的PAC克隆的核苷酸序列特征同时获得。通过与Spidey进行CDS-to-PAC克隆序列比对，预测目标基因的外显子/内含子结构[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，是一种进行mrna与基因组比对的在线工具(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/gydF4y2Ba)．使用引物分析软件OLIGO v. 6.7 (Molecular Biology Insights, Cascade, Chico, CA, USA)设计预测外显子区域的引物对来扩增预测内含子区域。PCR在GeneAmp PCR系统9700 (Applied Biosystems)中进行，反应液为10 μ l，其中含有与SSR分析中相同的成分。在95°C第一次处理反应混合物15分钟后，进行以下PCR程序:94°C 1分钟和72°C 2.5分钟两个循环;两个循环94°C 1分钟和68°C 2.5分钟;94°C 1分钟，65°C 30秒，72°C 2分钟的两个循环;30°循环，94°C 1分钟，55°C 30秒，72°C 2分钟。然后对PCR产物进行SSCP分析(见下文)。gydF4y2Ba

草锚探针引物设计gydF4y2Ba

PCR引物也由Van Deynze等人开发的草锚探针设计。[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．即从GenBank中检索每个探针的序列数据(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/gydF4y2Ba)．从OLIGO v. 6.7 (Molecular Biology Insights)获得的序列中设计引物对。PCR的步骤与上述内含子扫描引物相同。PCR产物进行SSCP分析，如下所述。gydF4y2Ba

SSCP分析gydF4y2Ba

SSCP分析使用相同的预制聚丙烯酰胺凝胶和用于SSR分析的仪器进行。变性溶液的总体积约为25 mL，其中含有23.75 mL 99%甲酰胺，1.25 mL 1% (w vgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})二甲苯氰醇和10毫克溴苯酚蓝。为了使PCR产物变性，将等量的PCR产物与变性溶液混合制成6 μL的混合物。混合物在95°C下处理5分钟，使DNA变性，然后在冰上迅速冷却。将变性样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，在5或15°C温度调节，在600 V, 25 mA, 15 W条件下电泳100分钟。正如SSR分析中提到的，银染色使分离的PCR产物可见。gydF4y2Ba

遗传连锁图谱的构建gydF4y2Ba

多态标记在FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人口。采用以下分离类型:母本或父本中的一个位点杂合子，代表两个等位基因(lm × ll或nn × np);双亲的位点杂合子，代表两个等位基因(hk × hk);双亲的位点杂合子，代表三个(ef × eg)或四个等位基因(ab × cd)，根据JoinMap 4对亲本基因型进行编码[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．双亲杂合的分离类型作为桥梁标记。利用JoinMap 4中交叉授粉(CP)种群类型编码算法对分离数据进行输入和计算，利用Haldane映射函数计算遗传距离。JoinMap 4的所有其他计算条件都在默认设置下使用。利用MapChart 2.2软件绘制遗传连锁图谱[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

QTL分析gydF4y2Ba

用JoinMap 4中CP群体类型编码得到的遗传连锁图，结合F .gydF4y2Ba_1gydF4y2BaMapQTL 5中简单区间映射的种群[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．LOD阈值也通过排列试验(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)， 1000个重复，在软件中。通过双向伪检验交叉分析估计检测到的QTL的遗传效应[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba标记数据被分离成两个减数分裂，并转化为Van Ooijen所描述的双单倍体种群编码[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

计算Pearson相关系数和卡方拟合优度检验，分析FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人口。采用重复测量方差分析、双向方差分析和Spearman秩相关系数对FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba黑麦草与水稻的群体和遗传图谱共线性。所有这些分析均在R v. 2.15.2软件中进行[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

广义遗传力作为估计基因型方差(gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba)和表型变异(gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_{ph值gydF4y2Ba})用公式计算gydF4y2BahgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba＝gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba/ (gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba+gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_egydF4y2Ba)gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_egydF4y2Ba而且gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_{ph值gydF4y2Ba}误差方差和总和是多少gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba+gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_egydF4y2Ba分别gydF4y2Ba．gydF4y2Ba的gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba可以通过(MSgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba-gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_egydF4y2Ba) /gydF4y2BargydF4y2Ba那里的女士gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba因子基因型的期望均方，表示为gydF4y2BarσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba+gydF4y2BaσgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_egydF4y2Ba,gydF4y2BargydF4y2Ba是每个基因型的接种次数。gydF4y2Ba

支持数据的可用性gydF4y2Ba

支持本文结果的数据包含在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

构思实验:WT, TS, YM。设计实验:WT进行实验:WT, YM, TS分析数据:WT贡献材料:WT, TS, YM, TT撰写论文:WT，所有作者阅读并认可最终稿件。gydF4y2Ba

我们非常感谢住田先生、Kajiwara先生和西井先生(山口县农林综合技术中心)提供的现场隔离gydF4y2Bam . oryzaegydF4y2Ba．我们感谢T. Tsukiboshi博士(NARO家畜和草原科学研究所)就F . GLS抗性表型评估提供的建议gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人口。我们感谢K. Akimoto女士(日本草原农业和草料种子协会)和S. Sasaki女士(日本农科院畜牧和草原科学研究所)在整个研究过程中的技术支持。这项工作由日本赛车协会的研究基金资助，并得到日本国家农业和食品研究组织(NARO)的支持。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 祐一三浦gydF4y2Ba

   现居地址:日本北海道竹里郡长沼町和奈1066号北海道研究室雪牌种子有限公司，邮编069-1464gydF4y2Ba

2. Tohru SasakigydF4y2Ba

   现住址:日本北海道东别市野坡路406号，日本草原农业和饲料种子协会北海道分会，邮编069-0822gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 日本农林畜产研究所饲料作物研究室，栃木县直桥原森本松768号，邮编329-2793gydF4y2Ba

   Wataru Takahashi & Tadashi TakamizogydF4y2Ba

2. 日本草地农业和草料种子协会九州实验站，日本熊本越市高叶1740号，861-1114gydF4y2Ba

   祐一三浦gydF4y2Ba

3. 日本草料农业和草料种子协会饲料作物研究所，日本栃木县直桥原东赤田388-5号，邮编329-2742gydF4y2Ba

   Tohru SasakigydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaWataru高桥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

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再版和权限gydF4y2Ba