草食虫诱导的黑色杨树挥发发射的时间（Populus nigra.)，以及草食动物年龄和身份的影响，影响作为草食动物敌人线索的个体挥发物的价值

背景

草食虫诱导的植物挥发物作为介导食草动物敌人的吸引的信号是一种众所周知的现象。具有短暂的草本植物物种的研究表明，各种生物和非生物因素都能强烈影响挥发排放动态的数量，组成和时序。但是，关于这些因素如何影响长寿木质多年生长期的波动排放的知识几乎没有了解。

本研究的目的是研究黑杨树(Populus nigra.）在草食病发作后通过几天夜间循环。我们还确定了不同草食虫物种，吉普赛蛾的毛虫的影响（Lymantria Dispar.)及白杨天蛾(Laothoe populi)，以及不同草食动物发育阶段的排放。

结果

主要挥发性化合物的排放动态响应草食病和日夜周期的时间而异。在食草动物攻击后不久，食用叶挥发物在食草动物攻击后不断发射，在较小的程度上开始发射醛氧基肟，较小程度，不管昼夜六周期如何，在食草动物去除后迅速停止。然而，大多数萜烯的排放表明，与草食病的开始和结束的反应更延迟，与夜晚相比，白天的排放显着更大。毛虫物种的身份仅引起排放的微小变化，但发育阶段的变化对早期龄量的挥发性发射产生了强烈影响L. DISPAR.诱导更含氮的挥发性和三萜胶，而不是同一物种的晚龄毛细胞。

结论

结果表明，草食性诱发的黑杨树挥发物中，只有少数的挥发物释放与草食性发生时间密切相关。有趣的是，最近的一项研究表明，这些可能是食草性天敌最可靠的线索，也是寄生在以黑杨树为食的舞毒蛾幼虫的食草性天敌的最佳引诱剂。

食草动物在植物的挥发性排放中引起显着变化。据报道这种现象来自不同订单的许多植物物种，并且可能源于真核细胞出现前长度的光合细菌，导致这是植物的祖先特征[1]，[2]．众所周知，食草动物诱导的植物挥发物会吸引食草动物的捕食者和寄生性动物，因此经常被称为植物的“呼救”，以减少食草动物的压力[2] - [4]．但是，如果食草动物敌人招募是植物的真正健身益处，或者植物挥发物是食草症的天然敌人的可靠提示，还尚不清楚吗？5] - [7]．在理解植物挥发物的生态作用方面，主要的限制是所释放的混合物的复杂性，以及我们对昆虫如何感知和处理嗅觉信息的知识的缺乏[4]．

草食病挥发排放的一个有​​趣方面是其动态性质。挥发性排放模式在草食病变过程中发生变化，在草药开始后如何发射化合物的变化[8] - [12]，在食草动物停止后，减排了多久发射[9]，[10]，[13和昼夜循环的变化[14]．大量的草食性挥发物，如绿叶挥发物(GLVs)和萜类化合物的排放模式在文献中得到了很好的描述。然而，对于排放量较低的化合物，如芳香族化合物和氨基酸衍生物(含氮和硫的化合物)，我们所知甚少[2]，[4]，[15]，[16]虽然有证据表明，这种次要化合物可能对草食动物及其天敌的高生态值[17] - [20.]．

已显示食草动物敌人使用植物挥发性排放的差异成功区分宿主植物物种或品种[21.] - [26.]，以及不同生理胁迫条件下植物之间的差异[27.]．草食虫寄生素和捕食者还可以从关于攻击食草动物物种的性质的挥发性线索获得详细信息，以及其发育阶段或寄生术地位[14]，[28.] - [30.]．多种食草动物的出现增加了挥发性排放物的复杂性，在某些情况下增加了食草动物敌人的吸引力[31.] - [35.]．

了解食草动物敌人如何应对不同植物 - 食草动物组合发出的挥发物将增加我们对特定化合物的生态作用的理解，但我们了解在这种情况下会影响波动排放的内容有很多差距。例如，挥发物的光谱是如何通过不同的草食虫物种改变或不同的饲养阶段很少考虑（但看到[36.]）。此外，在草食病开始后，大多数关于草食动物敌人招募的研究专注于出现的挥发物（但看到[37.]）。

尽管对植物挥发物的研究历史悠久，但大多数研究集中在草本物种，相对较少的研究探讨了木本多年生植物的草食性诱导挥发物的排放及其生态作用(如[18]，[38.] - [43.]）。

在木本植物中，杨树因其生态和经济的重要性而成为一种模式生物。另外，由于基因组的完成杨树trichocarpa［44.]，许多遗传，基因组，生化和分子工具现在可用，并且越来越多的信息积累了开启门，以研究杨树生物学的许多方面，包括直接和间接防御[18]，[45.]．

在以前的一项研究中，我们记录了黑杨杨杨树发射的挥发性化合物的巨大多样性Populus nigra.）在食草动物攻击并确定寄生虫Glyptapanteles liparidis,主要寄生于舞毒蛾二龄(L. DISPAR.）黑色杨树上的毛虫被吸引到草食病遗址杨树发射的含少氮挥发物。当化合物在现场条件下单独呈现化合物时，寄生瓣和绿叶挥发物也被吸引，表明这些物质可能是在杨树树上喂养的广泛西敌人的重要提示[18]．然而，在这个早期的研究中，我们并没有探究为什么这些化合物可能被寄生蜂偏爱，而不是其他更丰富的杨树挥发物，如萜类。

我们假设作为草食敌人重要线索的化合物应该具有一定的特征。它们应该A)表明食草动物的实际存在(在食草动物开始捕食后迅速释放，在食草动物离开后迅速停止释放)，B)在食草动物敌人觅食时独立于光明和黑暗环境释放，C)提供关于身份的信息，食草动物的年龄和数量。本研究的目的是研究黑杨树(Populus nigra.）在草食病过程中，并探讨了响应不同草食物的挥发排放的差异，食草动物的发育阶段和饲养量。这些数据应该有助于确定哪些化合物可能是草食动物敌人的最有用信息来源。

舞毒蛾食草后黑杨树挥发性物质排放的时间动态

调查黑色杨树的昼夜模式（Populus nigra.)，我们选择了20种化合物作为该植物主要挥发性成分的代表:绿叶挥发物(GLVs)、单萜(环和非环)、同萜、倍半萜、含氮化合物和芳香族化合物。未受损树木的挥发物混合物主要由glv和环单萜组成，这些挥发物几乎只在光照期间释放(图)1额外的文件1:图S1)。喂4.^TH.通用食草动物的血液幼虫Lymantria Dispar.造成了测量到的所有挥发物的排放增加，尽管增加的程度随化合物类别、日循环和食草动物的时间而不同。

glv，例如(Z在食草动物的开始后，在食草动物开始时迅速发射-3-己烯基乙酸酯，除草剂去除后减少。他们白天和夜间发布，白天发出了更大的排放。在白天的萜类化合物的排放也比晚上更大，但食草病后发射的增加并不与草食病的发作不一致，但在毛虫损伤开始后仅发生几个小时。此外，在食草动物去除后，萜素素仍在发生几小时，并且在某些情况下甚至直到实验结束48小时后（图1额外的文件1:图S1)。在萜类化合物中，环单萜类化合物在诱导后仅表现出适度的排放增加(大约两倍)。相比之下，无环单萜、倍半萜和同萜DMNT在未受感染植物的顶空中仅以极少量存在，但其含量却增加了许多倍(例如，E）-β-杂项，4000倍用于DMNT和250倍（E)-β-石竹烯)1额外的文件1:图S1)。

含氮化合物中，2-甲基丁醛肟的释放在草食期立即引起，并在第一个全光期增加到最高水平。辐射速率不受光期或暗期的影响，在食草期结束后，辐射速率下降到基线水平(图)1）.另外两种含氮化合物，苯基氰化物和吲哚的释放模式不同，表现出显著的日间节律(白天的释放量是夜间的2-3倍)，且在去除毛虫后下降速度较慢(附加文件)1:图S1)。

在芳族化合物中，几乎从草食病的爆发术中排出水杨酰醛，两天和夜间，在移除食草动物后突然停止（图1）.另外两种芳香族化合物，苄醇和苯乙醇，则表现出更多的双相排放模式，白天升高，晚上减少(附加文件)1:图S1)。通过草本诱导的慢性诱导慢性的排放比水杨醛更慢，并且在对照中保持明显较高的排放水平，直到实验的几乎结束，而不是在草药停止后迅速下降，因为西兰基醛达到水杨醛。

草食动物种类、发育阶段和摄食强度对挥发物排放的影响

比较5的草食病^TH.龄L. DISPAR.幼虫到2ⁿ龄L. DISPAR.另一种鳞翅目的幼虫，专家Laothoe populi，我们观察到三种处理方式都有非常典型的损伤模式(图25 .选b^TH.龄L. Populi.幼虫引起很少，但非常广泛的损害在少数叶片，往往完全吞噬整个叶片。五龄L. DISPAR.毛虫也造成了少叶的大量病变，但大多数避免了叶子静脉，只有很少消耗整个叶片（图25 A)。此外^TH.龄L. DISPAR.毛虫从一片叶子移动到另一片叶子的频率更高，因此总体上破坏的叶子更多L. Populi.．相比之下，第二龄L. DISPAR.毛虫引起了许多小病变，经常改变饲养位置，导致较小的叶片对中等损伤。第五龄量L. DISPAR.和L. Populi.结合了，两种草食病之间的中间损伤模式分开测量（图2B)。

为了量化不同草食动物处理在挥发性排放物方面的取食差异，我们计算了每个处理中观察到的受损叶片数量和病变数量。结果表明，挥发性总散发量与受损叶数和损伤叶数(R²= 0.603, p = 0.005²= 0.735，p = 0.0002，以及这两个损伤参数之间的显着相关性（R²= 0.739, p = 0.00022因此，我们使用主成分分析作为一种因子还原技术，将这两个参数合并成一个单一的成分，我们称之为喂料强度。然后应用广义最小二乘模型(GLS)计算了草食处理(幼虫种类和龄期)、摄食强度(无论处理与否)以及它们之间的相互作用对20种研究化合物的排放速率的影响(表)1）.相对于每种治疗中食用的总叶面积计算排放，以控制治疗之间草食程的变异。

相比之下p .黑质在不同处理之间的挥发物，只有四种化合物在两种被测试的毛虫取食时排放显著不同(专家)L. Populi.和通才L. DISPAR.两个5^TH.Instar）:(E)-β-石竹烯、3-甲基丁醛肟、月桂烯和橙烯醇(图3.），所有损坏后都会在更大的丰富发射L. DISPAR.．四种化合物在两种草食动物的联合破坏与普通草食动物单独破坏之间也存在差异:(E) - - -β石竹烯,3-methylbutyraldoxime (Z)-3-己烯醇和橙花醇(图3.）.这些化合物以较高的量发射L. DISPAR.而不是两种物种组合。组合损伤治疗中的排放与专业食草食草引起的损伤没有显着差异（L. Populi.）单独（图3.额外的文件2:图S2)。草食龄期对挥发性物质的释放有很强的影响L. DISPAR.:早龄期L. DISPAR.诱导更大的含氮挥发物和大多数萜类的排放而不是晚瞬间L. DISPAR.和L. Populi.(图3.额外的文件2:图S2)。

饲养强度也对大多数黑杨挥发物的排放产生了显着的直接影响：所有单波培，塞霉素和（E)、β-石竹烯、所有含氮挥发物(不包括吲哚和GLV) (Z)醋酸3-hexenyl(图4额外的文件3.:图S3，表1）.有趣地，DMNT的排放是最丰富的草本诱导挥发物之一，被显示出不受食草动物的饲养强度或身份和发育阶段的影响，这也是芳族化合物苄醇和苯乙醇的情况（桌子1）.对于草药治疗（草食性身份和发育阶段）和饲养强度之间的相互作用，我们仅观察到两个芳族化合物，水杨醛和苯乙醇的显着效果。

杨树中的主要群体中草化诱导的挥发物显示出不同的时间发射模式

食草动物诱导的植物挥发物作为食草动物敌人线索的价值取决于它们的排放与食草动物的存在有多密切的关联。有些化合物几乎在食草性开始后立即释放，在食草性停止后很快停止释放，而另一些化合物，特别是萜类化合物，在开始食草性12小时后才首次释放，并在食草性停止后继续释放一天或更久。这些差异表明，触发和控制这些化合物生物合成的机制非常不同[2]，[15]，[16]．同一化合物类不同植物种类之间也存在差异。例如，GLV的排放通常被认为限制在实际发生叶片损害时[46.]， 但在这儿 （Z）-3-己烯醇排放在草食病停止后24小时继续（附加档案1:图S1)。只要存在食草动物，就应该发出是食草动物敌人最具诊断性提示的挥发物。

随昼夜节律释放的变化也可能影响挥发物作为草食天敌引诱剂的价值。大多数食草动物诱发的和本构性挥发物的排放被发现在一个强烈的日变化方式。萜类化合物尤其遵循这一趋势，在所有测量的化合物中，光周期比暗周期的辐射要高得多。以前对草本植物的研究也发现单萜(C₁₀)、倍半萜烯(C₁₅)和同萜(C₁₅-衍生的同萜(DMNT))在白天比夜晚高得多[9]，[47.]．由于挥发性萜类生物合成的许多底物来自甲基赤藓糖醇磷酸途径，因此可能与光相关[48.] - [50，与光合作用密切相关[51]．

其他种类的化合物在昼夜排放模式上表现出不太明显的趋势。某些绿叶挥发物(GLVs) [(Z)-3-乙酸己酯]、含氮化合物(苯基氰化物、吲哚)和芳香族化合物(苯乙醇)在光照下表现出强烈的昼夜节律，释放量更多，而其他部分则表现出较弱的昼夜节律或根本没有昼夜节律。据报道，glv有时是独立于任何昼夜节律而释放的[38.]，[52]或者只是在晚上[47.]．据报道，在一系列植物物种中，草本植物和木本植物的许多化合物已经报道了挥发性排放的昼夜变异，由食草动物或病原体诱导[9]，[47.]，[53] - [56]，包括杨树[38.]，[42.]但监管机制尚不清楚。

食草动物敌人吸引力的日夜变异的重要性取决于敌人的活动节奏。如果敌人在整个24小时周期中活跃，则独立于光和暗的发光图案，例如2-甲基丁醇氧化肟，水杨醛或一些GLV，可能是最有利的。对于仅在特定时期活跃的敌人，那些时间的发射是最关键的。

排放响应于草食发育阶段而变化，但不是草食性物种

在我们的研究中，我们发现两种不同的草食性物种喂养的黑杨中的挥发性排放差异很少，Lymantria Dispar.和Laothoe populi．对这种缺乏物种特异性的可能解释是，这两种鳞翅目昆虫以相同的方式进食，并且在它们的唾液中共享相似的激发子。在以前的研究中，咀嚼叶的鳞翅目幼虫和蚱蜢的进食导致了类似的挥发物混合物[12]，[57.]，[58.建议这些挥发物是通过咀嚼昆虫攻击的一般反应。支持这个建议是，尽管食草动物多样化了，但只有几个引发植物防御反应的Elicitors已经在迄今为止的草食性口腔分泌物中发现了[59.] - [62.]．

与来自单个饲养公会的节肢动物草食虫相比，如叶片咀嚼物或韧皮饲养者，可能来自不同饲养行会的节肢动物诱导不同的植物挥发性发射模式[63.]，[64.]，虽然文献中有一个例外，挑战这个想法[65.]，[66.]．如果单个物种的年轻和较旧的幼虫之间存在饲养模式差异，这些可能也可能导致排放的差异。在我们的研究中，我们发现“喂养强度”（组合损坏的叶片数量和病变数量的因子）不同于早期和晚期Lymantria Dispar.．事实上，在晚瞬间之间的喂养强度方面更加相似L. DISPAR.和瞬间Laothoe populi比早期和晚期之间L. DISPAR.这就导致了挥发性排放的相应差异。含氮挥发物和大部分萜类化合物在早龄期和晚龄期的释放速率都较高L. DISPAR.．因此，不同龄期和危害强度对挥发物的挥发分分布的影响大于不同种类的草食动物。在先前的研究中，亦有报道单一草食动物不同龄期的摄食所引起的放射谱的改变[30.]，[67.]，[68.，并可能帮助食草动物的敌人找到他们喜欢的猎物或宿主阶段。在我们的研究中，不同龄期之间的差异也可能是由于这样一个事实，即尽管我们控制了草食动物的体重，但在第二龄期草食处理的取食毛虫数量远高于5龄期^TH.Instar Prodingments。然而，在自然条件下，许多蛾和蝴蝶毛虫在开发的艰巨之后是艰苦的，并且在后期龄到孤零零[69.]．因此，我们治疗的差异反映了自然条件。

当黑杨树幼树同时受到晚熟的攻击时L. DISPAR.和L. Populi.与晚期感染的树木相比，毛虫减少了几种化合物的排放减少L. DISPAR.一个人。先前的研究已经记录了多种食草动物攻击时挥发性排放的衰减，然而，也有不同物种同时进食时挥发性排放增加的例子[70]．

进一步研究幼虫阶段和同时攻击对不同草食物对挥发排放的影响是必要的，以便更好地定义这些差异并调查它们对食草动物敌人的影响。

黑杨树挥发物在吸引植食性天敌方面的潜在作用

我们最初的假设是，作为草食天敌线索的植物挥发性化合物应该:A)可靠地表明食草动物的实际存在;B)只要食草动物的敌人活跃，就能独立于光或暗循环而被释放出来;C)提供关于食草动物的身份、发育阶段和丰度的具体信息。虽然没有单独的化合物从p .黑质满足所有要求，2-甲基丁醇氧化肟和水杨醛最佳地满足前两种要求，而许多化合物是关于食草动物同一性的信息（3-甲基丁醇氧化肟，牛烯（E)-β-石竹烯和橙花醇)、植食性龄期(醛肟，大多数萜烯)和植食性丰度(大多数挥发物)。

最符合标准的挥发物列表可以作为敌人的良好信号p .黑质食草动物与那些以前发现的对braconoid koinobient寄生蜂有吸引力的化合物显示出显著的对应关系Glyptapanteles Liparidis.，这是早期Instar的专家L. DISPAR.毛毛虫。醛氧化物，2-和3-甲基丁醇氧化肟是唯一展示实验室生物测定中的吸引力的化合物，而2-甲基丁醇氧化肟（3-甲基丁肟未测试），苄基氰化物，（Z）-3-己烯醇，（Z）-3-己烯基乙酸乙酸甲酸乙酯和LILLOOL对自然的不同寄生虫物种的群落具有吸引力p .黑质站(18]．知道其他敌人的主要吸引力线索会很有趣L. DISPAR.．个体食草食草诱导挥发物对食草动物敌人的重要性也可能取决于其宿主或猎物特异性程度[71.]．通则寄生素和捕食者可能朝向丰富的广泛化合物定向，通常用脱疱疹（如GLV），而专家可能受益于响应更具体的化合物（例如醛氧肟）。尽管在晚期龄伤害时，即使是黑色杨树挥发性发射的差异L. Populi.和L. DISPAR.是次要的，寄生虫仍然可以在自然条件下定位他们的猎物，因为它们具有非常敏感的嗅觉系统，以检测我们无法使用我们的分析设备检测的易失性提示的轻微变化。

在患有在生物宿主内部发展的Koinobiont寄生虫的情况下，早期龄幼虫的产卵存在偏好，以防止封装的风险，以及允许完成内部缺血性幼虫阶段，如果主持人进入蛹[72.]，[73.]．从这个意义上说，对寄主寄生蜂来说，能够发出早期危害信号的化合物具有重要意义。

食草动物诱导的挥发物的排放模式也可能反映了这些物质在植物中的其他作用。植物挥发物与对抗食草动物的直接防御有关[74.]、植物内部和植物之间的通讯[75.]，以及对非生物胁迫的抵抗力，如高光和温度[76.]．其中一些角色的重要性可能在每天的周期中有所不同。例如，由于光照和高温压力会在白天发生，抗这些压力的挥发物，如异戊二烯和单萜，可能会在白天大量释放。

批评结论

在被食草动物伤害时，植物通常会释放出大量多样的挥发性化合物，这些化合物已被证明对直接防御食草动物和吸引食草动物敌人有重要作用。在黑杨树中，一些混合的单独化合物已被证明在吸引敌人方面是有效的[18]．在这里，我们表明这些活性化合物可能被食草性天敌选择为线索，因为它们是更可靠的指示食草性存在的指标，并提供了有关危害物种的年龄和身份的信息。

植物和昆虫

Populus nigra.

黑杨树是在夏季条件下在气候室(白天~14:10 h:夜间光周期，22°C - 19°C，湿度60%)中生长的，从老树获得茎截枝。白天从早上6点开始到晚上8点结束。插枝种植在2 L的花盆中，花盆中含有黏土、腐殖质和沙子的比例为2:1的混合物。在试验开始前，定期施肥和浇水。

Lymantria Dispar.

L. DISPAR.毛毛虫从蛋孵出离合器(请提供的旋律凯娜和汉娜纳达尔,美国农业部贮木场路哈姆登,CT和秃鹰$ s湾,MA)和人工饲养舞毒蛾饮食(MP生物医学LLC, Illkirch、法国),直到实验开始前两天,是在他们当时的美联储p .黑质叶子适应这种食物来源。所有毛毛虫都保持在气候室中，如上所述，具有相同的光周期，温度和相对湿度条件。

Laothoe populi

L. Populi.幼虫从卵中孵化(购买自英国西福德鳞翅目育种协会)，并在实验室环境温度下用新鲜的杨树叶子饲养。

挥发性物质的收集和分析

时间动态实验

为了调查杨树挥发物的日变化，研究人员在气候室中使用推拉系统收集挥发物，该系统由一个圆形有机玻璃顶部(Ø 26厘米)和一个圆柱形PET袋(Ø 26厘米，50厘米高)组成。在顶部钻了两个孔来固定进出空气的阀门。通过底部开口引入一棵小树(约40厘米高，2个月大)，用电缆捆扎器将pet袋固定在花盆上。在挥发性收集过程中，木炭净化空气以2.5 L min的流速通过特氟龙管泵入系统^-1．同时，1.5米^-1从植物顶空的空气被泵出系统通过特氟龙管通过一个20mg Super-Q (Alltech, FL, USA)过滤器来吸收挥发物。气候舱内的非生物条件与上述条件保持一致。10棵树被分配到两种处理(草食和对照)中，并放置在收集系统中。十五4^TH.在第一次挥发收集之前，在食草动物治疗中，龄涂层蛾毛虫在树木上释放出来。第一个挥发性收集在下午5点开始，剩余3小时光。在白天和夜晚，在6小时间隔内连续地抽出挥发性排放量总共96小时。在48小时后，从食草动物处理的树中取出吉普赛蛾毛虫。在实验结束时，切除并拍摄所有叶子以确定[77.]．以含10 ng/μL乙酸壬酯的200 μL二氯甲烷为内标，从Super-Q捕集器中洗脱挥发物。采用30 m × 250 μm × 0.25 μm DB5-MS色谱柱(Wicom GmbH, Heppenheim, Germany)，将洗脱液的一部分(2 μL)分次注入GC/MS。注入器保持在230°C，以1ml /min的氦气作为载气。进样后，气相色谱/质谱的烘箱温度保持在50°C 3分钟，然后以4°C/min的速度提高到95°C。然后，烤箱以15°C/min的梯度加热到145°C，然后以10°C/min的梯度加热到180°C。最后，烤箱温度在300°C保持3分钟。质谱使用Hewlett-Packard MSD 5973质谱仪(传输线温度:230°C，源温度:230°C，四极温度:150°C，电离能:70 eV，质量范围:40 500 m/z)在溶剂延迟3分钟的情况下记录。通过与标准品的保留时间比较，对化合物进行了鉴定。定量是通过质谱进行的，因为一些挥发性物质在黑暗时期的发射被证明是太低的火焰电离检测。 This however, limited the quantification to compounds that could be acquired commercially in acceptable purity (>90%). Selected ion monitoring was used for quantification in a way that a specific m/z of each compound was referenced to the m/z = 69 of the internal standard. The compound and m/z specific response factors required for absolute quantification were calculated from dilutions of the authentic standards in dichloromethane with a constant internal standard concentration of 8.64 ng/μL. For each compound, two response factors were averaged from two six point calibration curves, one for a lower concentration range (0.2-1 ng/μL) and one for a higher concentration range (1-10 ng/μL). The amount of volatiles emitted was normalized to the leaf area.

草食动物种类影响及发育阶段试验

为了研究不同种类毛虫和同一种类不同龄期的黑极乔木挥发性气体排放的差异，将5棵乔木分别进行了以下处理:对照(未受损乔木)、L. DISPAR.第二龄植入草食病（3000毫克幼虫重量 - 批量60毛虫，LD2），L. DISPAR.第五龄（3000毫克幼虫重量 - 3至4毛虫，LD5），L. Populi.5龄(3000 mg幼虫体重- 3 ~ 4只幼虫，LP)，混合草食(3000 mg幼虫体重1500 mg为L. Populi.和1500 for.l . dispar -2个每种物种的毛虫，混合）。称重毛毛虫，用群体分离，并在实验前一天饥饿。在与上述相同的条件下，在气候室中在气候室中进行实验。在实验开始时，凌晨9点，根据治疗，将毛毛虫放置在树上。在加入食草动物后，在48至52小时的4小时内收集挥发物。在挥发性收集期间，毛毛虫仍然在树上。上面描述了挥发性收集和过滤器洗脱的实验装置。使用Agilent 6890系列气相色谱仪进行定性和定量挥发性分析，耦合到Agilent 5973 Quadrupole Mass选择探测器（界面TEMP，270°C;四极），150°C;源TEMP，230°C;电子能源，70eV）和在300℃下操作的火焰电离检测器（FID）。使用Zb-蜡柱（现象，Aschaffenburg，德国，60m×0.25mm×0.15μm）分离挥发束的成分，以及He（MS）或H.₂（FID）作为载气。注入一部分（1μl）样品，而不会在40℃的初始烘箱温度下分开。将温度保持2分钟，然后用5℃/ min的梯度增加至225℃，另外2分钟，然后进一步增加至250℃，100℃/ min，保持1分钟。通过将保留时间和质谱与真实标准的谱系进行鉴定化合物。根据扫描和威利斯所述的有效碳数（ECN）概念，基于其FID峰面积基于内部标准的面积确定所有化合物的绝对量。78.]．我们限制了我们分析到20种高纯度（> 90％）可用标准的化合物（表1）.在实验结束后，从叶子上取下的挥发性幼虫以及实验过程中产生的幼虫，如上述所述进行了收集(附加文件)4:表S1)。每棵树的叶子分别被采收，并拍摄照片，以确定如[77.]．此外，我们记录了每棵树的病变数量和受损叶片数量。

统计分析

所有的统计假设，如正态分布和异方差检验。整个手稿的方法总是给出标准错误(SE)。来确定挥发物的重要性p .黑质在描述不同的草食处理(L. DISPAR.第二个龄,L. DISPAR.第五龄，L. Populi.5龄和混合草食)，通过对因子减少的主成分分析，我们结合了受损叶片数量和损害数量的协变量的影响，如[79.]．我们称之为新的可变给料强度。由于各处理之间的高变异性以及化合物显示出不同的排放模式，我们根据[80]．模型比较采用最大似然比检验，使用赤池信息准则(AIC)作为衡量各自统计模型的预测能力。然后选取AIC值最低的模型进行分析。表格1概述了应用的统计模型。采用广义最小二乘模型(GLS)计算了不同种类、不同龄期和不同组合危害的草食处理、摄食量及其相互作用对化合物排放的影响。当草食处理显著不同时，我们对拟合值进行Tukey检验。使用R 2.15.2 (R Development Core Team;http://www.r-project.org.）.

SBU、GAB、ACM和TGK构思研究，GAB、ACM和SBU设计实验;GAB和ACM与SBU一起进行实验，分析数据，起草手稿。JG对手稿进行了大幅度的修改。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

我们感谢Beate Rothe, Simone Frommeyer, Elisabeth Fial, Isabell Georgy和MPI-ICE温室团队在实验室的帮助。我们还要感谢dr。来自美国农业部的汉娜·纳达尔和梅洛迪·基娜感谢你们提供L. DISPAR.来自MPI-CE生物有机化学系的Stefan Bartram负责DMNT的合成。我们特别感谢MPI-CE科学仪器和公用事业管理部门的Daniel Veit，他对挥发性收集系统的设计和技术支持，以及Grit Kunert对统计程序的建议。这个项目是由马普学会资助的。Andrea Clavijo McCormick是耶拿国际马克斯普朗克研究学院的奖学金获得者。

隶属关系

1. 马普化学生态研究所生物化学系，Hans-Knöll-Straβe 8，耶拿，07745，德国

   Andrea Clavijo McCormick，G Andreas Boeckler，Tobias GKöllner，Jonathan Gershenzon＆Sybille B Unoticker

通讯作者

对应于SYBILLE B不知意．

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

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