杂交落叶松不定根发育的转录组和蛋白质组分析(日本落叶松×长白落叶松）

背景

落叶松(日本落叶松×长白落叶松)是我国东北地区重要的造林树种。它们通常通过根茎扦插繁殖。尽管生根的重要性，但对落叶松杂种不定根发育的调控知之甚少。钛技术是一种表征非模式物种转录组的新方法。该方法可用于差异表达基因的鉴定，然后利用二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)分析其对应的蛋白。在本研究中，我们分析了两个无性系的半木质化扦插山柰以不同的生根能力研究不定根发育的分子基础。

结果

我们分析了两个克隆;无性系25-5，生根能力强;无性系23-12，生根能力弱。我们构建了25-5和23-12在两个发育阶段的4个cDNA文库。采用454焦磷酸测序平台进行测序。共产生957832个原始读取;95.07%为高质量reads，被组装成45137个contigs和61647个单次序列。unigenes的基因本体论注释表明，unigenes的功能包括在分子功能、生物过程和细胞成分类别中的不同作用。我们分析了75个蛋白点(-fold change≥2，P.≤0.05）通过2D-Dige，并使用MALDI-TOF / TOF MS鉴定差异表达的蛋白质。转录组和蛋白质组的联合分析显示与两种途径，多胺合成和应力反应相关的基因可能在不定根发育中发挥着重要作用。

结论

这些结果为不定根发育的分子机制的研究提供了基础和重要信息。我们还首次展示了两种重要技术的结合使用作为推进非模型研究的强大方法，但其他重要的落叶松属。

落叶松对造林非常有用，因为它们的幼体生长快[1]．在各种睡莲中，杂种日本落叶松×长白落叶松在中国东北山区广泛种植，因其优质木材、抗虫性和适宜性[2]．根茎插条的使用正在成为最流行的方法来繁殖这些杂种。不定根形成是茎秆扦插的关键步骤，是一个受多种因素影响的复杂过程[3.] - [6.]．尽管落叶松具有重要的生态和经济意义，但对该物种的基因组研究很少。这对了解落叶松不定根形成和发育的生物学过程具有重要意义。

在我们之前的研究中，两个克隆的山柰在2001、2002、2003和2007年的生根率分别为100.0%、94.7%、93.3%、96.3%和25.1%、19.6%、21.5%、22.9%。因此，这两个无性系是研究不定根形成生物学过程的良好材料。此外，我们还研究了杂交落叶松半木质化插枝不定根的发育过程[2]，包括3个关键阶段:切割后14 ~ 18天，细胞脱分化和分裂;25-35 DAC用于分生组织的形成和发育;50-55 DAC用于根的形成和伸长。早期的14和25 DAC对根相关基因的表达和调控至关重要。这些对杂交落叶松不定根发育的解剖学和生理学研究，为进一步研究不定根发育的分子机制提供了可能。

虽然不定根形成是大多数植物无性繁殖的关键发育过程，但不定根形成的分子机制仍然知之甚少[7.]，因为不定根形成是由环境和内源因素调节的复杂定量遗传性状。已经进行了有限数量的不定根形成的分子研究。布兰特等人。[8.]在不定根形成的不同发育阶段确定220个差异表达基因松果体contorta用吲哚-3-丁酸处理下胚轴。Butler等人[9.[，]着重研究了苹果不定根形成过程中的基因表达模式，并鉴定了苹果不定根形成过程中的多种mrna。Sorin等[10通过拟南芥不同突变基因型的蛋白质组学分析，确定了一些与不定根形成正面或与不定根形成的分子标记。陈等。[11提供了一种适合研究的方法德诺维根器官形成。阿卡米等人[12[通过微阵列转录组分析，鉴定出决定不定根起始和形成的特定基因矮牵牛织布达(W115行)。Subramaniyam等人[13]获得了人参不定根完整的转录本表达谱。然而，由于基因组信息有限，对落叶松不定根形成的基因进行了研究。

RNA测序是在全基因组范围内获取功能信息的一种强大而快速的方法，特别是对于大基因组和非模式物种。Wu et al. [14]通过454测序研究了北美人参7个发育阶段根样本的基因表达。他们的结果表明，人参皂苷的生物合成发生在不同的发育阶段。Firon等[15]，通过RNA测序研究了甘薯贮藏根形成启动的分子机制。Alagna等人[16]丰富了目前仅有的少量橄榄序列数据，并通过454焦磷酸测序鉴定了涉及果实品质的基因。转录组概况的广泛分析[17] - [19]已经确定了在特定生物过程中发挥作用的功能基因。然而，mRNA转录水平的变化并不总是反映蛋白质水平的变化，在蛋白质水平上调节细胞事件的方式有很多。因此，一个互补的蛋白质分析是必要的，以澄清分子事件在特定的发展阶段。二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)在蛋白质分析方面具有许多优势。李等人[20.]利用2D-DIGE检测到黄瓜根中某些蛋白质丰度在应对缺氧时发生了显著变化。Yan等人[21]利用蛋白质组学分析研究了提供充足氮的玉米植株对生长限制的反应。Wang等[22这些研究结果表明，转录组学或蛋白质组学分析是发现参与调控生物过程的基因和蛋白质的有效方法。Yang等人[23结合蛋白质组学和转录组学分析，揭示了NaCl处理下甜菜M14叶片和根系的候选基因和蛋白质的详细功能特征。

为了更好地了解杂交落叶松不定根发育过程，本研究对两个不同生根能力的无性系在不定根发育两个重要阶段的转录组特征进行了研究。在蛋白质水平上进一步分析了两个克隆间表达差异的一些基因。这些数据可以显著扩展落叶松的转录组和蛋白质组数据库，并为了解落叶松和其他针叶树不定根发育调控的分子基础提供了一个有价值的平台。

测序

与其他技术相比，454焦磷酸测序技术是一种更好的选择德诺维非模式植物转录组的测序和分析，因为每次运行产生的reads数量高，获得的contigs的测序错误率低[24]．该技术已被用于构建包括玉米在内的植物的表达序列标签(EST)库[25],栗[24),橄榄16]，北美人参[14和红薯[15]．Zhang等[26利用454序列分析了日本落叶松体细胞胚胎发生过程。本研究以不定根发育的两个重要阶段的两个无性系为材料，构建了4个cDNA文库。利用454 GS FLX Titanium平台对每个cDNA文库进行测序。4个cDNA文库共获得957832条原始reads。大部分原始读数在450 - 500 bp之间。通过对适配器序列进行修剪，去除小于50个碱基的短序列，从4个cDNA文库中共获得910,607条高质量reads。因此，95.07%的原始读取是有用的。这些高质量读取的长度分布如图所示1．大约90%的reads长度在300 - 500 bp之间。

这910607个高质量的阅读被组装成45137叠连群(重叠群是一组重叠的RNA片段来自一个单一基因源)和61647单例(单个基因识别同类地区目标基因组,但不与其他基因集群形成一段被称为单例)。contig长度分布如图所示2；68.79%(31048)的contigs为300-800 bp, 24.06%(10859)的contigs为400-500 bp。中位contig长度为739 bp，平均contig长度为663 bp。unigenes的长度与之前的转录组分析中获得的相似艾[27],栗[24]，美国人参[28),而Cucurbita浆果[29]．这里所示的数据代表了产生cDNA资源的第一种大规模努力，并在不定根开发期间分析杂交落叶松的转录组。这些资源已在公开上提供;原始数据已提交到GenBank存储库的短读取存档（SRA）划分（登录号SRP015266）。转录组序列应该有助于落叶松的基因发现，并且有助于阐明不定根发育的基因组。

功能标注与分类

首先将所有独特的序列与使用BLASTN算法的NCBI的非冗余数据库（NT）中的序列进行比较。然后，将它们与使用BLASTX算法的两个主要公共蛋白质数据库（方法）中的序列进行比较。当E值截止值设置为10-5时，共注释共25965个CONTIG序列，占所有CONTIG序列的57.5％。

从原则上讲，在一个特定的组织样本中，集合在一个contig中的读取序列的数量越高，编码该基因的mRNA分子的数量就越高。超过700的读数显示在附加文件中1．在58个contigs中，4个参与植物生长发育过程中的细胞壁重塑，10个参与适应性胁迫反应和多种胁迫应答基因的表达调控，2个参与多胺合成。其他的参与蛋白质翻译、合成和降解。植物细胞壁在植物生长过程中起着许多关键作用，包括调节细胞分化、细胞间粘附和通讯以及抵御病虫害和病原体的入侵[30.] - [33，了解哪些基因参与了植物细胞壁的形成和重塑是非常重要的。本研究检测到的细胞壁重塑相关基因应该与切割伤口有关。与压力相关的基因可以提高各种细胞类型对抗压力的存活率。多胺是细胞生长和分化的关键调控因子，多胺合成相关基因的检测应与不定根发育的不同阶段有关。有关应激相关基因和多胺合成相关基因的详细讨论可在以下部分找到。

我们使用了基因本体（GO）分类系统来确定标记基因的可能功能。Go本体分析表明，在切割（DAC）和25℃后14天的25-5和23-12的CDNA序列的基因函数的分布相似（图3.和4.）.所鉴定基因的功能涵盖了各种生物过程。在106784个unigenes (45137 contigs +61647 singleton)中，13316个unigenes被划分为生物过程(BP)类，5590个unigenes被划分为细胞组分(CC)类，10885个unigenes被划分为分子功能(MF)类。GO分类系统中的BP、CC和MF类别包含34个子组(图)3.和4.)，覆盖了杂种落叶松基因表达的全部图谱。在某些类别中涉及的基因数量在14和25 DAC之间存在显著差异(图)3.和4.）.25-5(数据3.)，“催化活性”和“结合”基因检测在25 DAC比14 DAC增加(p值分别为0.0307和0.0484，附加文件2)， 23-12几乎没有变化(数据4.）.在不定根分生组织形成阶段(25DAC)检测到参与多种生物学过程的“催化活性”和“结合”基因增加，对根的形成起重要作用。战绩为23(图4.)，“生殖过程”基因在25 DAC显著下降(p值为0.0335)，而25-5几乎没有变化(图3.）.虽然25-5和23-12的“免疫系统过程”基因分别在14和25 DAC之间没有显著变化，但25-5的基因在25 DAC下增加了29.8%，23-12的基因在25 DAC下减少了18.6%，这有利于25-5形成不定根。不定根形成是一个受多种因素调控的复杂过程，25DAC中25-5的“信号通路”基因显著增加(p值为0.0241)，而23-12的“信号通路”基因几乎没有变化，说明信号通路参与了不定根分生组织形成的调控(25DAC)。14 DAC和25 DAC之间检测到的基因数量和每个GO类别的p值的详细信息显示在附加文件中2．

差异表达的蛋白质

使用蛋白质组学方法研究了从14 DAC、25 DAC和35 DAC切割组织中提取的蛋白质谱。我们检测到86个差异表达蛋白(fold changes≥2，P.由2 d-dige≤0.05)。随后使用DeCyder™软件对这些蛋白进行分析(图)5.点1 - 75)。大约有三分之一(32.4%)的差异表达蛋白存在于25 DAC(不定根中最初的细胞形成阶段)。利用MALDI-TOF/TOF-MS成功鉴定了75个蛋白。这些蛋白质的详细信息见附加文件3.．从2D-DIGE凝胶上的点位置判断，大多数蛋白质的理论分子质量(MM)和计算的等电点(pI)与实验数据一致(图)5.；额外的文件3.）.然而，存在一些例外，例如斑点7,8,9,15,29,41和66，其具有大于相应识别的蛋白质的理论MM，以及斑点32,37,48,49,54和71，具有小于相应识别的蛋白的理论MMS（参见附加文件3.）.几种蛋白质具有相同的功能注释，在凝胶上的几个不同斑点（斑点10,11,25,26和27）中显示出（图5.）.这种现象在以前的研究中也有报道[34]．对此有几种可能的解释，包括翻译后修饰、蛋白质降解、不同的编码基因以及由交替剪接mrna产生的蛋白质翻译。另一种可能是这些斑点代表落叶松特有的蛋白质同源物。

75种蛋白根据其功能注释可分为8类(见附加文件)3.）.其中14.7%参与碳水化合物和能量代谢，6.7%参与蛋白质翻译和降解，34.7%参与细胞防御，9.3%参与激素相关活动，5.3%参与信号转导，5.3%参与RNA转录和加工，少数参与其他代谢途径。在75种已鉴定的蛋白中，功能未知的蛋白占24%。数字6.A，B显示了不同阶段的一些差异表达蛋白质的差异在不定根开发的不同阶段。

一个值得注意的结果是s -腺苷蛋氨酸合成酶2 (SAMS2, spot 21，图)的表达模式6.A、B)和S-adenosyl甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC,现货22),参与聚胺合成,和late-embryogenesis-abundant蛋白质(现货33)和胞内pathogenesis-related(45点),参与应激反应,是检测到相同的编码基因在转录组分析。这些基因对不定根发育的影响在“重要信号通路的阐明”部分进行了详细的讨论。

阐明重要的信号通路

聚胺合成途径

多胺是小的聚阳离子分子;生物体中的主要多胺是腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和亚精胺(Spm) [35]．它们在生物体中发现普遍存在，在各种各样的生物过程中的功能。多胺生物合成涉及通过特异性酶催化的一系列步骤[36]，[37，包括SAMDC和SAMS。在本研究中，在转录组数据中，contigs UN_lyscdhit99_32363和UN_lyscdhit99_25323分别被注释为SAMS2和SAMDC酶原(表1）.在根细胞脱分化分裂期(14 DAC)和根初始细胞形成期(25 DAC)， 25-5(强生根)基因的读数高于23-12(弱生根)基因的读数。在蛋白质组学分析中，两个蛋白分别为SAMS2 (spot 21)和SAMDC (spot 22);重要的是，在14和25 DAC中，这两种蛋白在25-5中的表达水平都高于23-12(见表)1）.SAMDC蛋白在35 DAC时也上调(见附加文件)3.）.多胺在调节根系发育中发挥作用的结果与其他研究结果是一致的。例如，Tisi等人[38表明多胺分解代谢强烈影响玉米根系发育和木质部分化(玉米）.Niemi等人[39]显示多胺加速了苏格兰松不定根的形成，并增加了随后的根系生长(抗旱性L.）缺口扦插在体外．唐和牛顿[40表明多胺能促进弗吉尼亚松再生苗的根伸长和生长。在其他研究中，多胺被证明可以提高生根率[41]，调节血管的发育[42]，增强根系对盐碱胁迫的耐受性[43]．在本研究中，SAMDC和SAMS2在转录和翻译水平上的表达表明，多胺在杂种落叶松不定根发育中发挥了重要作用，可能通过增加根细胞分裂和增强根系对逆境的耐受性。

压力反应途径

从植物上切下的枝条会受到多种胁迫，如伤人和病原体的攻击。岩屑对应力的反应是复杂的，包括许多代谢变化以保护细胞和大分子。在本研究中，UN_lyscdhit99_17285和UN_lyscdhit99_23395的Contigs分别被注释为胚胎丰富蛋白和假定的细胞内发病相关蛋白(表1）.这两种蛋白质都与各种应激反应有关。我们在蛋白质组图谱中鉴定了相应的蛋白质;胚胎丰富蛋白对应于位点33，细胞内致病相关蛋白对应于位点45。

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)家族是一个大家庭，包括在种子发育晚期或营养组织中响应某些胁迫而积累的蛋白质。许多研究表明，LEA蛋白对植物的耐盐性有重要影响。Aghaei等[44[展示在用100mM NaCl处理的大豆和大豆根系中上调Lea蛋白。Zhang等[45[鉴定出一个假定的耐盐基因LEA1在Thellungiella salsuginea，证实TsLEA1在酵母和转基因中表达具有耐盐性拟南芥．Bai et al. [46[证明转基因烟草表达由基因编码的lea3-1蛋白紫花苜蓿表现出更高的耐盐性。Park等[47[lea14是否可能通过增强甘薯中的根细胞跛行来积极调节对脱水的反应。SMLEA的过度表达显示出更快的根伸长率和较高的盐和耐旱性丹参[48]．在本研究中，一个LEA蛋白被注释在转录组数据中。在根细胞去分化分裂期(14 DAC)，该基因在25-5(生根能力强)无性系中的读数高于23-12(生根能力弱)无性系。与此一致的是，在14 DAC中，25-5中相应的蛋白表达水平高于23-12(见表)1）.然而，读入的数字LEA在根初始细胞形成阶段(25 DAC)， 25-5比23-12低，而LEA在35 DAC的25-5和23-12之间(见附加文件3.）.这些研究结果召集了这一lea可以通过提高扦插的瘫痪，主要在不定根开发的早期阶段来积极地规范对各种压力的反应。

相关（PR）蛋白质有关（PR）蛋白是非生物学和生物应力诱导的植物蛋白[49]．它们累积围绕受损的细胞壁，以保护植物免受真菌，细菌或病毒的感染[50.]．许多研究表明，PR蛋白对根系发育具有重要影响。Bantignies等。[51.[表明，PR-10样蛋白在白色羽扇豆根部的根本发育的所有阶段组成型表达。Borghi等。[52.)表明,公关基因影响钾稳态拟南芥．Takeuchi等[53.]，在干旱和盐胁迫下鉴定了一个水稻根特异性PR蛋白。免疫组化分析表明，该蛋白在根的维管系统周围的皮层细胞中大量积累。Koehler等[54.鉴定出与草莓耐寒性相关的PR蛋白。淹水7 d后，小麦种子根中prin1.2丰度显著增加[55.]．在本研究中，PR蛋白在转录和翻译水平上的表达表明它在不定根发育中发挥作用。在不定根细胞脱分化和分裂阶段(14 DAC) 25-5(强生根能力)显著上调(表14)1）.因此，它可能在保护细菌和真菌引起的损伤中发挥至关重要的作用，主要在切割后的早期阶段，从而允许正常的不定根开发。

在本研究中，从RNA和蛋白质水平分析了两个杂交落叶松的杂交落叶松克隆。产生不定根开发的转录组数据库包括总共957832个原始读数，这对落叶松的未来分子研究有用。还分析了不定根发育的蛋白质剖面，鉴定了75个蛋白质，其富集了蛋白质数据库。转录组和蛋白质组的联合分析显示。与多胺合成相关的基因和应力反应可能在不定根发育中发挥重要作用。本研究为随后的外来根部发育的分子机制提供了基础和重要信息。此外，我们首次展示了两个重要技术的结合使用作为学习非模型的强大方法，但其他重要的落叶松属性。

植物材料

在这项研究中，两个克隆的l . kaempferi×l . olgensis、25-5(生根力强)和23-12(生根力弱)，以及两个不定根发育早期阶段，即根细胞脱分化分裂阶段(14 DAC)和根初始细胞形成阶段(25 DAC) [2，以研究不定根形成发育调控的分子基础。本研究利用的所有植物材料均在中国东北辽宁省大谷家林场(经度42°2′48”N，纬度124°47′48”E;海拔225-394米;年平均气温5.6°C) [2]．采用完全随机区组设计，3个重复。每个重复随机取4 ~ 5个插枝，根据无性系和发育阶段进行分离。从每个切口底部取5毫米厚的部分，用于提取RNA和蛋白质。图中显示了不定根发育不同阶段的茎插枝的图像7.A.用于分析的5mm厚部分如图所示7.B.

我们的实验研究符合机构，国家或国际指南。田间研究按照本地立法进行，并借助林业行政部门的权限进行。我们没有使用任何濒危物种，并遵守“濒危野生动物群和植物群”贸易公约。凭证（2013001，2013002，LH 2013003，2013004）的凭证（2013001年LH 2013004）由萧山王，Bejing研究所的萧山王教授确定，并已存放在中国林业学院的植物征中。

RNA提取及cDNA文库构建

总RNA的制备方法为Sánchez等[56.]．使用NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)测定总RNA的浓度和质量，并在进行前检查1%琼脂糖凝胶(见附加文件)4.）.使用智能cDNA合成试剂盒（Clontech，Palo Alto，Ca，USA）将大约1μg总RNA转化为cDNA，优化了在小体积中获得大量清洁cDNA的条件。对于二链合成，PCR使用小等分试样（1/10体积）的主要模板和优点2聚合酶混合物（Clontech）进行。热循环程序如下：在95℃下初始变性60秒，然后在95℃下的18个循环，在65℃下退火30 s，然后在68℃下延伸3闵。对于每个样品和所有PCR反应，使用Purelink PCRTM纯化试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA）纯化PCR产物。用分光光度计（NanoDrop 1000，Thermo Scientific）量化双链cDNA。将产品检查在2％琼脂糖凝胶上以验证cDNA质量和碎片长度。

测序和组装

用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)回收消化cDNA。将大约7 μg ds cDNA通过雾化剪切成小片段，并使用GS FLX Titanium试剂盒进行测序。本研究产生的未经处理的EST原始序列已提交至Genbank的Short Read Archive (SRA)部门。包含原始序列和序列质量信息的454 SFF文件可以通过SRA网站访问，登录号为SRP015266。利用GS FLX焦磷酸测序软件，筛选出高质量的序列(>单碱基读取精度99.5%)进行进一步加工和组装。通过内部Perl脚本进行适配器修剪和poly (A/T)和短序列(<50 bp)去除，以获得干净的ESTs。我们使用Newbler软件(与罗氏GS FLX测序仪配套)进行序列组装。质量评分阈值设为40。

功能标注与分类

将组装好的独特转录本与GenBank非冗余数据库中的序列进行比对，使用BLASTN算法查找并去除核糖体RNA序列[57.]．在NCBI非冗余蛋白(Nr)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）使用BLASTX算法，并针对UNIPROT蛋白质数据库（http://www.uniprot.org/help/uniprotkb)及KEGG蛋白数据库(http://www.genome.jp/kegg/）.使用E <1.0-5的典型截止值。去(58.]系统用于序列的功能分类。GO提供了一个结构化和受控的词汇，用于描述基因产物，按三类分类:分子功能、生物过程和细胞成分(http://geneontology.org/）.

基因表达分析

通过Audic等人的方法进行强生根克隆和弱生根能克隆的基因表达的比较。[59.和Barakat等人[24]．

库之间的规范化

我们对库之间进行归一化，包括GO分类中每个库中检测到的unigenes的数量，以及当发现两个库之间的差异时，每个库中读的总数量。规范化的详细信息见附加文件5.．

蛋白质提取与制备

对于每个样本，2克组织在液氮中研磨成细粉，用于提取蛋白质。冻干粉在裂解缓冲液(7 M尿素，2 M硫脲，4% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1- propan磺酸盐(CHAPS)， 10 mM Tris)中室温反复摇匀30 min。4°C, 40 000 × g离心60 min，将未溶解的粉末从匀浆中去除。上清分装于-80°C下保存。用Bradford试剂盒(BioRad, Hercules, CA, USA)测定蛋白浓度，以裂解缓冲液稀释的白蛋白为内标。

用CyDye DIGE fluor标记蛋白质

根据Ettan DIGE用户手册(18-1164-40版AA, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)中描述的协议，样品裂解液用Cy2、Cy3和Cy5进行标记。通常，50 μg裂解液用400 pmol Cy3或Cy5标记，而含有相同数量所有样品的相同体积的混合标准液用Cy2标记。标记反应在暗冰上进行30分钟，然后用1ml 10mm赖氨酸冰上熄灭10分钟。然后将这些标记的样品合并进行2D-DIGE分析。

2D-DIGE和图像分析

我们进行了如下的2D-DIGE: IPG条(24cm, pH 3-10和NL)与标记样品在黑暗中过夜，用复水化缓冲液(7 M尿素，4% w/v CHAPS, 20 mM二硫苏糖醇(DTT)， 1% v/v IPG缓冲液与微量溴酚蓝)复水化。使用Ettan IPGphor系统(GE Healthcare)在20°C条件下进行了第1维IEF，总时间为67kv h。然后对条带进行两步还原和烷基化处理，然后进行二维SDS-PAGE。用6 M尿素、30%甘油、2%十二烷基硫酸钠(SDS)、50 mM Tris-Cl、pH 8.8和0.5% w/v DTT的溶液平衡后，用相同的溶液处理条带，但用4.5% w/v碘乙酰胺代替DTT。将条带覆盖在12%的聚丙烯酰胺凝胶(20 × 24 cm)上，固定在低荧光玻璃板上，并使用Ettan DALT Twelve System (GE Healthcare)在每个凝胶30 mA下电泳12-18小时。使用Typhoon 9410扫描仪(GE Healthcare)在激发/发射波长分别为488/520 nm、532/580 nm和633/670 nm处获得Cy2、Cy3和cy5标记的图像。DIGE图像由DeCyder 6.5根据Ettan DIGE用户手册(GE Healthcare)进行分析。斑点检测使用DIA(凝胶内差异分析)模块进行，斑点的估计数量设置为2500。只考虑了在所有三种复制凝胶中存在的斑点，并且在大小和形状上定性一致。人工编辑去除伪斑后，使用DeCyder BVA(生物变异分析)模块对DIGE图像进行进一步分析。 A 0.05 significance level was used to define differences between groups when analyzing parallel spots. One-way ANOVA and Student-Newman-Keuls tests were conducted using the SAS software package version 8.2 (SAS Institute).

凝胶蛋白酶消化和MALDI-TOF/TOF-MS分析

分别制备凝胶以获得足够量的蛋白质进行质谱分析。用胶体考马斯亮蓝(CBB)染色。2D- DIGE/DeCyder分析定义的感兴趣的蛋白质从cbb染色凝胶中切除，进行改进的凝胶内胰酶消化程序。凝胶块先在50%乙腈和25 mM碳酸氢铵中变色，然后分别在10 mM DTT和55 mM碘乙酸中还原和烷基化。真空干燥后，凝胶块与测序级改性胰蛋白酶(Promega, Madison, WI, USA)在最终浓度为0.01 mg/mL的25 mM碳酸氢铵中37℃孵育16 h。收集上清液，真空干燥，然后在50%乙腈和0.1%三氟乙酸(TFA)中重新溶解，使用ABI 4800蛋白组学分析仪MALDI-TOF/TOF-MS进行质谱分析。采用正离子反射模式记录TOF谱，质量范围为700 ~ 4000 Da，选择每个样品中最强的10个峰进行MS/MS分析。用胰酶处理的肌红蛋白肽外标法对光谱进行校正。MS/MS结果使用GPS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) - MASCOT (Matrix Science, London, UK)检索，检索标准如下:NCBInr数据库;物种限制，绿色植物; MS tolerance was set at 6100 ppm and MS/MS at 60.6 Da; at most one missed cleavage site; fixed modification was carbamidomethyl (Cys) and variable modification was oxidation (Met); and cleavage by trypsin was on the C-terminal side of Lys and Arg unless the next residue was Pro. If peptides matched to multiple members of a protein family, or if a protein appeared under different names and accession numbers, the entry with the highest score was selected. In addition, the theoretical molecular weights and pI of the identified proteins were calculated using the Peptide Mass program (http://web.expasy.org/peptide_mass/）.

可获得的支持数据

支持本文结果的原始序列数据可在Short Read Archive (SRA)(登录号SRP015266)中获得，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra．

本研究由国家科技支撑计划(2012BAD01B01)和国家自然科学基金(30972393)资助。作者感谢张亮博士对cDNA文库构建和454测序的贡献。作者也感谢Edanz (http://www.liwenbianji.cn/)，感谢他们对改进稿件提出的有益建议。

从属关系

1. 2 .中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室，北京象山路100091

   韩华，孙晓梅，张守功

2. 2 .中国林业科学研究院林业研究所，北京象山路，100091

   孙晓梅，谢云辉，张守功

3. 辽宁省林业科学研究院林业生物技术与分析测试中心，辽宁崇山路，110032

   剑风

相应的作者

对应到Shougong张．

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

HH进行了样本采集、RNA提取、蛋白提取、2D-DIGE、MALDI-TOF/TOF-MS、数据分析和手稿起草;XS指导HH进行生物信息学工作，对数据进行生物信息学分析，并帮助撰写和编辑稿件;YX辅助MALDI-TOF/TOF-MS分析;JF帮助植物准备和样品收集;SZ协调项目设计，编辑稿件。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

开放获取本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。

本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。

如欲查阅本许可证副本，请浏览https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．

Creative Commons公共领域奉献豁免（https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。

再版和权限