拟南芥叶片诱导油菜素内酯缺乏的后果

背景

油菜素内酯(BR)缺乏和BR不敏感突变体的鉴定为BR是一种有效的促进生长的植物激素提供了确凿的证据。拟南芥突变体的特点是莲座结构紧凑，株高降低，根系减少，发育迟缓，育性降低。细胞的扩增、分裂和多种发育过程都依赖于BR。BR作用的分子和生理基础是多样的。BR信号通路控制转录因子的活性，许多BR应答基因已被确定。然而，对矮突变体的分析可能在一定程度上揭示表型变化是形态和生理改变的影响。这种限制尤其适用于已建立的器官，如玫瑰叶的分析。

结果

在本研究中，通过两种方法分析了BR在成熟叶片中的作用模式。首先，将BR生物合成抑制剂(油菜素唑)施用于21日龄野生型植物。二是BR缺陷植株的BR补充，即CPD（本构型光形态形成侏儒)反义和cbb1（cabbage1)突变株在21天后停止。BR在成熟叶片中的作用与刺激细胞扩张、增加叶片指数、淀粉积累、增强CO有关₂释放三羧酸循环，并增加生物质产量。细胞数量和蛋白质含量几乎不受影响。

结论

以前对BR促进生长的分析主要集中在基因组效应上。然而，生长与基因表达模式变化之间的联系几乎没有为生长的生理和代谢基础提供线索。我们的研究分析了BR水平改变的叶片的综合代谢数据集。数据表明，BR促进生长可能取决于增加碳水化合物和能量的供应和使用。BR可能同时刺激合成代谢和分解代谢途径。

油菜素内酯(Brassinolide, BL)于1979年因其促进节间生长的能力而被发现[1]。从那时起，已经有数百篇文章研究了这种促进生长的作用。切除的组织(如下胚轴、上胚轴、子叶、节间、叶和根)、原生质体、细胞悬浮培养、完整的幼苗和整株植物接受油菜素内酯(BR)处理，BR在所有情况下都有刺激生长的潜力[2]。大量的BR缺乏和BR不敏感突变体拟南芥在水稻、番茄和豌豆等作物中，3.]。这些突变体通常矮小，叶片圆润，深绿色，开花延迟，雄性生殖力和结实率降低，衰老延迟。BR的作用还包括控制木质部的形成[4]、[5]，气孔发育[6]-[8]，以及进一步的发展过程[9]-[12]。大量研究分析了BR治疗和BR缺乏的基因表达模式。然而，这些研究几乎没有阐明BR依赖性生长的代谢和生理基础，因为同工酶、细胞壁蛋白和其他因素的确切功能往往仍然不清楚。

BR发挥的作用并非多余，因为BR突变体不可能与其他植物激素或其拮抗剂互补[13]。主要BR受体BRI1 (brassinosteroids - insensitive 1)的过度表达刺激了生长。然而，转录物和代谢物水平的潜在变化与其他生长刺激途径有很大不同[14]。最突出的直接BR效应是基因表达模式的改变[15]。转录因子如BES1 (bri1-EMS-suppressor 1)和BZR1 (Brassinazole-resistant 1)调控BR应答基因[16]-[19]。BR促进生长的生理机制似乎是多方面的，并取决于组织和发育阶段[qh]2]。它们包括控制水通道蛋白活性和水跨膜运动[20.]、细胞骨架组织[21]-[23]，以及细胞壁力学性质的改变[24]、[25]。一些关于拟南芥和作物的研究探讨了BR对初级代谢的影响。这些研究的重点是光合作用和汇强度，并测量了特定的酶活性或代谢物。早期的一篇文章表明BR刺激CO₂小麦的同化[26]。这一发现在黄瓜等其他植物中也得到了证实。27]和米饭[28]。在拟南芥中，突变BRI1受体(Y831F)的表达促进了茎的生长，并在光照期结束时提高了光合速率和淀粉水平[29]。Rubisco活性和1,5-二磷酸核酮糖的再生是自然条件下光合作用最重要的限制因素。BR对Rubisco活性的积极作用已被证实[26]、[27]。余et al。［27]也假设对核酮糖-1,5-二磷酸再生有积极作用。光合作用的增强与可溶性糖和淀粉含量的增加以及鲜重和干重的平行增加有关。与这些数据一致，BR缺乏的拟南芥突变体显示出急剧降低的CO₂同化率、淀粉水平降低、蔗糖水平降低的趋势以及生物量积累减少[30.]。

除了源效率外，BR还可以提高汇强度。番茄d^x突变体在果实中产生生物活性BR，但在茎部中没有，并提供了一个选择来解剖BR在果实和茎部的依赖过程。干重和淀粉含量d^x水果显著减少[31]。BR施用于叶片部分正常化代谢变化d^x这表明芽源性BR依赖因子是水果正常代谢所必需的。以往的研究强调BR与番茄下胚轴生长期转化酶活性的相关性[32]。因此，一些报告证明了BR对源效率和汇强度的要求。

本研究采用互补时间序列试验的方法，对拟南芥莲座叶片诱导的BR缺乏进行了分析。首先，用外源BR补充BR缺陷植株。随后BR处理的疏漏导致BR缺乏。其次，将油菜素唑(BRZ)应用于野生型植物。BRZ与DWF4酶结合，在C-22羟基化步骤特异性地阻断BR的生物合成[33]。成熟叶片的BR依赖性生长与淀粉水平升高、通过三羧酸(TCA)循环的代谢通量增加、细胞扩增和生物量增加有关。

长期实验分析BR缺乏的形态学和生化后果

BR缺乏或BR不敏感突变体的分析由于严重的侏儒症和重大的形态变化而变得复杂[3.]。使用具有轻微表型变化的突变体，如cbb1/dwf1（cabbage1 /矮人1) ［13]、[34可以减轻这个困难。已知等位基因导致的表型变化较轻det2（de-etiolated2），cpd（本构型光形态形成侏儒），dwf4（矮人4)，以及其他生物合成突变体。的cbb1/dwf1突变体可能由于前体的积累而产生不寻常的生物活性BR，并表现出改变的BR反应[34]、[35]。

为了开始对形态完整植株的BR缺乏症状进行分析，我们进行了两组互补的时间过程实验(图2)1)。在时间过程实验中，植物在受控的生长室中以随机方式平行生长(详见方法)。时间过程实验各进行3次，共进行6次独立实验。

第一种方法使用BR缺陷突变体。CPD反义(aCPD学生)植物和br缺陷植物cbb1 / dwf1-6突变体(13]、[30.用200 nM油菜素内酯(BL)治疗3周。野生型植株平行生长，同时用对照液处理。对照溶液除添加BR外与BR溶液相同(详见方法)。BR的补充完全正常化的形态和生物量生产CPD反义植物。的CPD-反义植物与野生型几乎无法区分。的生长缺陷cbb1植物部分被外源BR补充(图2)221日龄鲜重cbb1芽与野生型完全相同。与野生型相比，叶片长度和宽度减小，叶片更直立，表面略皱，莲座紧凑。因此，外源BR不能完全替代内源BR。3周后停止BR治疗(第0天)CPD反义和cbb1植株开始出现BR缺乏或BR明显缺乏。至此，采样开始了。分别在停止处理后的第0、1、3、6、9和14天采集生化分析样本。在施用条件下，植株在整个试验过程中均处于营养期，未开始抽苔。

第二种方法使用野生型植物(C24)，在没有任何处理的情况下生长三周(图2)3.随后，分别用10 μM BRZ、20 μM BRZ或对照溶液处理植株。较低浓度(如1至5 μM BRZ)先前已应用于合成生长介质(例如[36]、[37])，但不适用于我们的时间过程实验，因为它们只对土壤生长的植物产生很小的生长影响。较高BRZ浓度的必要性可能反映了叶片通过功能性表皮吸收较弱。BRZ应用开始后(第0天)，在如上所述的相同时间点(即第1、3、6、9和14天)取样进行生化分析。

的并行分析CPD反义,cbb1BRZ处理的野生型植物可以在评估BR缺乏时避免基因型或处理特异性限制。

CPD和dwf转录水平升高表明BR缺乏

的CPD［38),DWF4［39]基因编码参与BR生物合成的酶。这些基因的表达与内源性BR水平呈负相关。高转录水平表明低BR水平，反之亦然[40]。CPD和DWF4通过定量RT-PCR分析转录物水平(图2)4)。

在BR补充停止或BRZ治疗开始一天后，转录物水平不变可能表明存在剩余的BR或BR生物合成基因的诱导存在时间滞后。从第3天开始观察到更大的差异。CPD转录水平CPD-反义植物以前被描述过[30.]。由于不完整CPD基因抑制，表型改变CPD反义植物比反义植物温和得多cpd/cbb3敲除突变体和其他BR缺陷突变体，如cbb1/dwf1-6［13]、[38]。更强的DWF4中的表达cbb1突变体与CPD-反义植物对应观察到的生长缺陷(图2)4(A和B)。不同浓度BRZ处理植株间差异不大。10 μM BRZ诱导的应用CPD和DWF4表达几乎与20 μM BRZ一样有效(图2)4C和D)。

诱导的BR缺乏损害叶片的膨胀

莲座3叶和莲座4叶的新梢鲜重和长度在1天后出现显著差异cbb1植物(图2A和C)CPD-反义植物分别在6天和1天后与野生型差异显著(图2)2A和C)。在分析期结束时(第14天)，cbb1和CPD-反义植物鲜重分别为野生型的36%和68%(图2)2A). BR缺乏对叶片宽度的影响不太明显(图2)2D).由此导致的叶片指数下降(即叶片更圆;［41])是缺溴植物的一个很好的特征(例如[42])。BRZ处理的植株在第1天的茎部鲜重略有下降(图2)3.A).对照植物的生物量差异随着时间的推移而增加。叶长和叶宽减少。类似于CPD反义和cbb1叶片宽度受到的影响小于叶片长度(图2)3.C和D)。

叶片厚度取决于BR水平和基因型。例如，BR缺陷突变体如det2叶片厚度增加。低浓度的外源溴化硼使玉米叶片厚度降低det2还有野生植物。较高的浓度导致野生型叶片厚度增加[43]。在本研究中，叶片厚度为CPD-反义植物和BRZ处理植物从第0天到第6天的增强减弱。与之相反，叶片厚度cbb1在此期间，植物的数量增加得更多5)。

第5叶和第6叶在第3天和第6天平行分析。在叶长、叶宽和叶厚上观察到类似的影响(附加文件1:图S1和S2, A-C)。

生长减少主要是由于细胞大小减小

BR缺陷植株的叶片尺寸较小可能是由于细胞扩增、细胞增殖受损，或两者兼而有之。先前对BR突变体的分析揭示了对细胞增殖和细胞扩增的影响。BR缺陷突变体如dwf1，det2［42),cpd［44]的特点是细胞分裂率降低和细胞扩增减少。

在本研究中，相似大小的栅栏和海绵状薄壁细胞CPD反义,cbb1，第0天观察到野生型植物(图2)6A和B)，表明先前的BR应用使细胞扩展正常化。后来，栅栏和海绵薄壁细胞CPD反义和cbb1与野生型相比，植物变得更小(图1)6A和B)。在较年轻的叶片上也得到了类似的结果(附加文件1:图S1、D和E)。对细胞数量的影响不太明显。的cbb1叶片表现出细胞数量减少的趋势，表明先前BR处理未使细胞分裂率完全正常化。相比之下,CPD-反义植物在第0天及以后与野生型完全相同(图2)6C和D;额外的文件1:图S1, F-H;额外的文件1:图S3A)。BRZ在野生型中的应用减小了细胞大小(图2)7A和B;额外的文件1:图S2, D和E)，但细胞数量没有显著减少(图2)7C和D;额外的文件1:图S2, F-H)。

BR缺陷植株淀粉含量降低，蛋白质水平不变

合成BR刺激CO₂同化(26]-[29),而cbb1和CPD-反义植物的光合速率降低[30.]。生物化学和形态因素都可以解释光合作用的减少。碳供应减少的后果包括淀粉水平降低、能量平衡受损、生物合成前体供应减少和生长下降[45]。与之前的报告一致，淀粉水平在CPD反义,cbb1， BRZ处理植物从第3天开始(图2)8A和B)淀粉含量的降低CPD反义和cbb1与先前确定的水平相比，植物相对较小[30.]。这可能反映了最初补充BR可以避免的严重细胞异常的缺乏。己糖和蔗糖水平没有明显改变(附加文件)1:表1)。叶绿体超微结构检查显示BR缺陷植株叶绿体完整。青铜治疗,CPD反义,cbb1叶绿体在第3天趋向于形成类囊体网络，颗粒堆积减少，第6天的程度更小(图2)9和10)。

早期对BR的研究表明，蛋白质合成抑制剂(如环己亚胺和嘌呤霉素)会干扰BR依赖性生长[46]。这表明BR诱导了大量特异性蛋白质的合成，但并不会不加选择地增加总蛋白质的合成。与这一观点一致的是，BR缺陷植株叶片的总体蛋白质含量没有显著改变(图2)8C和D)。

降低了BRZ处理植物的TCA循环活性

线粒体呼吸代谢是ATP的主要来源，并与整个细胞代谢的适当维持有关[47]、[48]。三羧酸(TCA)循环是呼吸代谢的重要组成部分。它将乙酰辅酶a的乙酰基氧化成CO₂线粒体呼吸链氧化产生NADH。在植物中，乙酰辅酶a是由丙酮酸脱氢酶通过丙酮酸氧化脱羧而产生的糖酵解产物[49]、[50]。

叶片在[3:4-]中孵育¹⁴C -葡萄糖或[1-]¹⁴C]葡萄糖。有限公司₂在丙酮酸脱氢酶或苹果酸酶的作用下，从C3和C4位置优先释放[51]、[52]。喂养[3:4-]¹⁴[C]-葡萄糖转化为BRZ处理的叶片导致了较低的进化¹⁴有限公司₂与对照组相比(图2)11A).葡萄糖的C1通过氧化戊糖磷酸途径(OPPP)的酶即6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶或TCA循环的酶异柠檬酸脱氢酶释放[51]、[52]。用[1-]饲喂BRZ处理的植物¹⁴[C]-葡萄糖往往导致较低的¹⁴有限公司₂与模拟处理植物相比的进化(图1)11B)。

质谱法测定了TCA循环中间体的相对含量。天冬氨酸是由草酰乙酸转氨化合成的，可以用来估计草酰乙酸的水平。几种TCA循环中间体的水平在BRZ处理的植物中增加(图2)12)。柠檬酸盐、苹果酸盐和天冬氨酸的水平与对照组显著不同(附加文件)1表2)。TCA循环中间体水平升高的趋势也被观察到cbb1突变体(附加文件)1:图5)。酮戊二酸水平在第6天显著升高(附加文件)1表S3)。

较低的公司₂从[3:4-]释放¹⁴C]-葡萄糖通过丙酮酸脱羧酶和/或苹果酸酶和TCA循环中间体水平的增加表明，BR缺乏植物的TCA循环活性较弱。一氧化碳的释放₂从[1 -¹⁴C]-葡萄糖进一步与通过TCA循环的通量减少一致，但也可能表明氧化戊糖磷酸途径(OPPP)的活性降低。

研究BR缺乏症的实验方法

BR缺乏植株在细胞伸长、细胞分裂、细胞分化、繁殖和衰老、发育光控等方面表现出侏儒症和多种缺陷[j]。3.]。生育能力下降和男性不育是BR缺陷突变体的共同特征。BR似乎在胚胎发生中基本上是可有可无的[53]。然而，幼苗发育在很大程度上取决于BR。拟南芥突变体的下胚轴长度、子叶生长和对环境刺激的反应受到损害[2]、[3.]、[12]、[13]。BR缺乏损害植物早期生长，后期表型变化不可避免地被早期生长缺陷修饰。因此，突变体分析可以适当地解决植物发育的早期阶段，但关于BR在后期功能的结论充满了不确定性。

研究BR在发育后期作用模式的一种方法是应用BR生物合成抑制剂[33]。以往的方法通常是补充BRZ [33]、[37]、[54]及其他唑类衍生物(例如丙环唑、[55];伏立康唑,56];YCZ, (57])到合成生长培养基，这意味着对幼苗或小植株进行了分析。另一种方法是在有限的时间内补充BR缺陷突变体，然后剥夺合成BR。这两种方法各有利弊。例如，BRZ被视为一种高度特异性的抑制剂，但它可能也会影响其他p450。虽然BR缺陷突变体对合成BR有反应，但BR饲养不能完全模拟BR的内源分布。

基于这些原因，本研究采用了这两种方法并并行分析(图2)1)。实验的前三周假定存在野生型BR水平或持续供应合成BR(突变体互补三周)。此时(第0天)，突变体和对照体中BR生物合成基因的转录水平和生长情况相似(图2)2，3.，4)。增加CPD和DWF4转录物水平表明，植物在1 - 3天内变得缺乏BR(图2)4)。

成熟叶片BR缺乏会损害细胞的扩张

叶片生长初期主要靠细胞增殖。细胞同时分裂和生长。在过渡区，细胞分裂和扩增之间形成增殖梯度。从细胞增殖到细胞扩增(细胞生长但不分裂)的转变是由一系列因素控制的。细胞分裂首先在叶尖处停止，并沿纵轴逐渐停止[58]。器官的最终尺寸是通过伸长生长来实现的。

突变体分析表明，BR对细胞分裂和细胞伸长都有影响det2和cpd显示细胞大小和细胞数量都减少[42]、[44]。BR控制细胞分裂和扩增之间的过渡[16]。此外，BR控制器官边界的形成[59]、[60]，木质部形成[61]和气孔发育[8]、[62]。

我们将分析重点放在发育后期的成熟叶片上。在这一阶段(播种后21天及以后)，3 ~ 6叶发生细胞扩增和细胞增殖。栅栏和海绵状薄壁组织明显小于CPD反义,cbb1、BRZ处理植物(图2)6，7、附加文件1:图S1, S2)。细胞数量略有减少cbb1突变体(图6、附加文件1:图S1、S3)。然而，细胞增殖在CPD-反义和BRZ处理后的植株与野生型相似(图2)6，7、附加文件1:图S1-3)。因此，成熟叶片中的细胞扩增依赖于BR，但细胞分裂几乎不受损害。

叶的厚度由叶肉解剖结构和细胞大小决定。叶肉组织的细胞组织改变了光和CO的拦截₂扩散到光合作用的位置。BR或其他植物激素和刺激对叶片厚度的影响没有很好的文献记载，因为叶片生长的变化通常在两个维度上进行评估。在本研究中，BRZ处理和CPD-反义植物与叶片厚度减少相关(图2)5、附加文件1:图S1, S2, S4)。相反，叶片厚度在cbb1植株在第6天增加更多(图2)5、附加文件1:图S1、S4)。基因型差异的原因可能是基因型的不完全归一化cbb1植物。另外,cbb1植物可以合成替代BR，并以不同的方式对BR作出反应，正如水稻所报道的那样brd2（BR-deficient dwarf2突变体(Hong)et al。［35])。

淀粉积累减少可能导致生长减慢

BR缺乏植物生长减少可能是碳有效性降低的结果。体内淀粉含量cbb1，CPD与野生型相比，BRZ处理过的叶片含量较低(图2)8)。这大概是CO急剧减少的结果₂同化率[30.]。最佳淀粉代谢是昼夜碳平衡和生长的关键[45]。淀粉合成受损的突变体，如phosphoglucomutase (pgm)或淀粉降解受损的突变体，如淀粉过量（sex1)显示侏儒症[63]。夜间淀粉动员过快或过慢都会导致生长速度减慢[64]。因此，碳供应不足可能导致BR缺陷突变体的生长受损。

经BRZ处理的植物和植物的电子显微图cbb1突变体显示出颗粒状囊体较少的趋势(图2)9，10)。类囊体堆积的分子基础尚不清楚。这可能反映了质体发育的延迟，类囊体结构对光照条件的适应改变，蛋白质组成的改变，或其他调节机制的变化。Grana赋予功能优势，如增强光捕获和微调光系统之间的能量分配[65]、[66]。可以想象，观察到的叶绿体结构的变化有助于降低光合速率和淀粉积累。先前对BR突变体的质体结构和功能进行了分析。引起这种兴趣的一个原因是BR作用和光形态发生之间的联系[12]。Light-growndet2植物发育出结构改变的叶绿体。例如，8天大的det2与野生型相比，叶绿体体积更小，形状更圆，颗粒堆积减少，叶绿素a/b比值异常高，表明其处于未成熟状态[67]。然而，Azpiroz和同事[68并没有描述光生长的叶绿体结构的改变dwf4植物。鉴于有多份报告描述BR处理过的植物或BR突变体的质体性质发生改变([69]和其中的参考文献)，对潜在的结构和分子变化进行更详细的分析可能是值得的。

生长减少与TCA循环活性降低有关

TCA循环将丙酮酸和苹果酸的氧化与NADH的生成联系起来。NADH被线粒体呼吸链用于ATP的生产。的减少释放¹⁴有限公司₂BRZ处理植物中标记的葡萄糖(图11)和处理过BRZ的TCA循环中间体水平升高(图2)12),cbb1植物(附加文件)1图S5)表明，BR缺乏植物通过TCA循环的碳通量减少。TCA循环活性降低可能影响碳水化合物的有效利用，并损害生长，特别是在黑暗时期。此外，TCA循环为各种生物合成途径提供了前体[48]、[50]。

用于蔗糖合成的ATP和用于合成代谢的碳前体的产生减少可能是生长减少的结果或原因。BR缺乏和生长减缓可能伴随着对碳水化合物、氨基酸和其他生物合成前体的需求减少。另一方面，BR缺乏植物的光合作用减少会减少线粒体反应的底物供应，减少通过TCA循环的通量。考虑到光合作用和TCA循环之间的多方面联系，情况变得更加复杂。TCA循环酶活性的改变可导致光合作用增加、减少或不变[70]、[71]。因此，确定代谢变化的原因和影响是复杂的。标记研究和网络模型的应用对于精确地确定BR缺乏植物的代谢物通量和代谢途径的相互作用是必要的。

详细描述了BR缺陷突变体的形态。大量研究在分子和细胞水平上探讨了溴化硼缺乏的后果。通过这种方式，目前对BR的理解得以发展。然而，BR缺陷突变体的矮化和多种形态变化使分析变得复杂。BR在发育后期的作用模式不能完全确定。在这项研究中，我们使用了两种方法来分析BR在成熟叶片中的作用。施用BR生物合成抑制剂，3周后停止BR缺陷植株的BR补充。首次采用代谢谱法对BR缺乏症的代谢变化进行了全面分析。我们的分析表明，诱导的BR缺乏会损害淀粉积累、TCA循环活性、细胞扩增和生物量生产。需要进一步的研究来确定代谢通量的变化以及基因组BR效应与分解代谢和合成代谢途径之间的确切联系。 Transgenic approaches such as the inducible expression of RNAi hairpins represent another approach that would enable tissue-specific repression of BR biosynthesis. This could particularly help to separate the role of BR in sink and source tissues.

生长条件

C24野生型从诺丁汉拟南芥资源中心(NASC)获得，NASC ID: N906。的CPD-反义线和cbb1突变体在[13]、[30.]。用于生长实验的种子来自于温室中平行生长的植物。的cbb1突变体在结实前和结实中反复用BR处理。在控制的生长室内(7天:16 h光照[140 μmol m])，让种子发芽和幼苗生长2周²年代¹(20℃，75%相对湿度)/8 h夜间[6℃，75%相对湿度];此后7天:光照8 h [140 μmol m]²年代¹(20℃，60%相对湿度)/16 h夜间[16℃，75%相对湿度])。随后，将植株移入受控生长室(光照16 h [140 μmol m])长日照条件下²年代¹(20℃，60%相对湿度)/8 h夜间[16℃，75%相对湿度])。所有基因型以随机方式在同一室中同时培养，每个重复一个。为避免生物和非生物胁迫，采取了一切必要措施。

中午喷洒3次(BL)或5次(BRZ)，每周分别用含有BL或BRZ的水溶液和0.01% Tween 20喷洒。甲醇作为原液的溶剂。在对照溶液中加入相同体积的甲醇。BL和BRZ实验在同一生长室内进行。BRZ喷得更频繁，以确保降低BR水平。

基因表达分析

如前所述进行基因表达分析[72]。定量RT-PCR引物序列为:CPD_fw 5′GGA AAC ACT CTC TGC TTC TTA TGA AAG GT 3′，CPD_rev 5′AAG TAA AGC CAC CAA GAA GTC AAC AAT CT 3′，DWF4_fw 5′AAT CCT TGG AGA TGG CAA CAG c3′，DWF4_rev 5′TCT GAA CCA GCA CAT AGC CTT GG GG 3′，eIF1α_fw 5′TTG ACA GGC GTT CTG GTA aggg 3′和eIF1α_rev 5′CAG CGT CAC CAT TCT TCA AAA 3a′(At5g60390)。

显微镜

光镜检查如前所述[72]。细胞大小和数量的测定覆盖了叶脉周围和叶缘的所有部分。在透射电镜下，将叶片样品用2.5%戊二醛、0.1 m羧酸缓冲液(pH 7.4)、5mm氯化钙在4℃下固定4小时，后用1%的Os0固定₄和0.8% K_3.铁(CN)₆在4℃下保温2h。水洗后用2%醋酸铀酰水染色2小时，随后用乙醇和环氧丙烷脱水，包埋在spr低粘度环氧树脂中。超薄切片(60-70 nm)用Leica UC6超显微切片机用金刚石刀切割，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，在120 kV能量过滤透射电镜(EFTEM，蔡司)下检测。

蛋白质和淀粉含量

测定了1 ~ 4叶的蛋白质和淀粉含量。快速启动™Bradford蛋白测定(BioRad)按照制造商的描述使用。淀粉含量的测定方法如前所述[73]。

代谢物的分析

每次提取从叶子1到4中提取50毫克粉末状植物材料。代谢物提取、LC-MS测量和数据分析按照Giavalisco和同事的描述进行[74]。对于GC-MS分析，使用相同萃取物的极性相，并按照前面的描述进行[75]。

C-flux分析

第三和第四叶的叶盘与标记的葡萄糖在光照下孵育。捕获释放的一氧化碳₂对样品的分析如前所述[51]。

支持数据的可用性

支持本文结果的数据集包含在本文及其附加文件中。

FS进行了植物实验、基因表达、蛋白质和代谢物分析，并协助撰写稿件。JL进行了光镜观察。TO对通量分析做出了贡献。AE和PG对代谢物数据进行预处理。EM进行电子显微镜检查。JK, ARF和LW参与了本研究的设计。CM构思了这项研究，参与了它的设计和协调，并起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

aCPD学生：

CPD-antisense

提单:

油菜素内酯

BR:

Brassinosteroid

青铜:

Brassinazole

气相:

气相色谱-质谱法

质:

液相色谱-质谱法

OPPP:

氧化戊磷酸途径

柠檬酸:

三羧酸

这项工作得到了DFG的资助(MU 1738/7-1)。我们感谢Änne Eckhard和Gudrun Wolter提供的技术援助。

从属关系

1. 波茨坦大学，马克斯·普朗克分子植物生理研究所，德国波茨坦-戈姆，14476

   Florian Schröder, Janina Lisso & Carsten m ssig

2. 马克斯·普朗克分子植物生理研究所，德国波茨坦-戈姆，14476

   Toshihiro Obata, Alexander Erban, Eugenia Maximova, Patrick Giavalisco, Joachim Kopka, Alisdair R Fernie和Lothar Willmitzer

相应的作者

对应到Florian施罗德。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

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