摘要
背景
水稻稻瘟病是世界水稻产区最严重、最常见的病害之一。大多数抗性基因通过遗传群体连锁定位得到。我们广泛检查了16个稻瘟病菌株，并基于366个品种的80万个单核苷酸多态性变体进行了进一步的全基因组关联研究籼稻登记入册。
结果
共鉴定出30个相关位点。最强信号(Chr11_6526998，P=1.17 × 10−17)位于基因内Os11g0225100，其中的大米Pia-抗blast基因。在QTL周围检测到另一个关联信号Chr11_30606558论坛．我们的研究确定了这种基因Os11g0704100，一种含有核苷酸结合位点-亮氨酸富重复结构域的抗病蛋白，作为主要候选基因论坛．为了探索该基因的潜在机制，我们进一步检测了12号染色体上与CH149 (P=7.53 × 10−15)．的基因,Os12g0424700而且Os12g0427000，两者都被描述为含有蛋白的激酶样结构域，被认为是该位点全部功能所必需的。此外，我们在3号染色体上发现了一些关联，但尚未报道任何与水稻稻瘟病抗性相关的位点。此外，我们还发现了可能参与抗性调控的新功能候选基因。
结论
这项工作为进一步研究这些候选基因的潜在功能提供了基础。在任何给定的GWAS中，真实关联的子集将与结果弱相关;因此，大规模的复制是必要的，以证实我们的结果。未来的研究将重点通过基因转化和转移DNA插入突变筛选验证这些候选基因及其功能变体的作用，以验证这些基因在水稻中产生抗稻瘟病的能力。
背景
稻瘟病是世界上所有水稻种植区经常发生的严重问题。据估计，每年被这种疾病破坏的大米可以养活6千万人[1］．这种疾病是由真菌引起的Magnaporthe oryzae，这是一个复杂属的遥形子囊菌真菌由干涉变形组成[2]、[3.］．这种真菌对宿主的适应性很强，在任何生长阶段都能引起感染。病原体的多样性和疾病的复杂性使其成为全面解决这一问题的巨大挑战。1］．
使用阻力(R)基因在作物育种计划中已经是，而且毫无疑问仍将是疾病控制的主要手段。在大米中，大约是180度R已分离出由病原体感染引起的疾病的基因(http://www.ricedata.cn/ontology)．基于保守基序(核苷酸结合位点(NBS)、富亮氨酸重复序列(LRR)、toll-白介素受体(TIR)、卷曲线圈(CC)、跨膜受体(TM)、蛋白激酶(PK))，R基因分为NBS-LRR、RLK、LRR-TM、TM-CC四类[4］．目前已鉴定出68个涉及稻瘟病抗性的基因座，涉及83个主要稻瘟病抗性基因，至少24个抗性基因已克隆(http://www.ricedata.cn/gene)．爆破抵抗一般分为完全抵抗和部分抵抗[5］．完全抗爆性，由一个主基因控制，是定性和种族特异性的，涉及基因如加以［6]，皮塔饼［7),而Pi9［8］．另一方面，对爆炸的部分抗性被认为是定量的和持久的，因为它通常是非种族特异性的和多基因的特征。已鉴定出许多部分耐药位点，如pi-21［9]、[10］．水稻不能抵抗一种分离的Magnaporthe oryzae除非病原体的基因能让它在水稻植株上无毒。孤立的Magnaporthe oryzae除非水稻具有对该分离物具有抗性的基因，否则该分离物对水稻不可能是无毒的。11］．因此，在大多数易发稻瘟病的水稻生态系统中，培育高效、持久抗稻瘟病的水稻品种仍然是最经济可行和最无害环境的管理方法。
针对遗传群体的QTL方法不适用于识别全基因组范围内的巨大表型变异[12]、[13］．全基因组关联研究(GWAS)已成为一种强大的方法，同时筛选复杂表型背后的遗传变异。2005年，GWAS首次应用于一种人类疾病，即老年性黄斑变性[14］．随后，一系列GWAS研究已发表[15] - [18］．然而，由于缺乏有效的基因分型技术和开发高密度单倍型图谱的资源有限，GWAS应用于动植物复杂性状的解剖才刚刚开始。无论是QTL方法还是GWAS方法，通常都需要通过遗传转化来鉴定候选基因。
在水稻中，越来越多的基因组资源在基因组序列方面被创造出来[19]、[20.]和高密度SNP图谱[12]、[21]、[22］．黄等人。[21]、[22]利用Illumina对世界各地丰富的水稻地方品种进行下一代测序，生成低覆盖率的序列数据，并构建了水稻的综合HapMap (栽培稻)，可用于农艺性状的GWAS。在我们的研究中，我们在一项全基因组关联研究(GWAS)中基于366个基因分型的805158个SNPs变体广泛检测了blast抗性籼稻不同的加入[21]、[22］．本研究的目标是利用GWAS鉴定大量与稻瘟病抗性相关的基因座，这些基因座可能对水稻生产和改良很重要。
结果
表型变异
研究了16株稻瘟病菌在苗木上的浓度，并在各试验田采用DLA法对稻瘟病进行了抗性评价。相关系数表明，爆炸菌株CH131、CH154和CH159的DLA分别与纬度显著相关r= 0.12,P=2.4 × 10−2；r= 0.15,P=3.4 × 10−3；r= 0.14,P=6.9 × 10−3)，而CH251的DLA与经度(r=−0.27,P=1.6 × 10−7)(附加文件1:图S1)。基于SharedAllele距离[23]采用算术平均非加权对群法[24]，该菌株可分为两组:一组仅由致病性较弱的菌株CH131、CH212、CH362和CH193组成，另一组由其余12株致病性较强的菌株组成(附加文件2:图S2)。
GWAS对16株爆炸菌株的抗性
为了研究水稻稻瘟病抗性的基因型变异，对水稻稻瘟病抗性进行了GWAS分析籼稻，采用EMMAX算法[25］．我们共鉴定了30个相关位点P=1 × 10−8为全基因组显著性阈值(图1、表1)．50%的检测菌株(16株中有8株)至少有一种显著关联，平均每个菌株有3.8种关联。CH171株最多，有8种连锁反应，其次是CH182株，有7种连锁反应，CH186、CH212和CH362株只有1种连锁反应。相关位点的全基因组分析在12条染色体上存在随机分布。其中7个位点分别分布在11号染色体和12号染色体上，10号染色体上没有一个。相关位点的染色体分布在附加文件中3.:图S3，与已知位点的分布趋势相似。此外，GWAS热点位于11号染色体和12号染色体上，这与报道的研究一致[26］．相同或邻近的snp与多个性状显著相关。例如，11号染色体上30.6 Mb的snp与CH182和CH149有关，12号染色体上13.0 Mb的snp与CH172和CH186有关。这说明这些菌株可能具有共同的机制，可能是由多效性或紧密连锁的基因引起的。并对检测到的重要位点进行了说明，分别对应于抗病蛋白、nns - lrr蛋白、含激酶样结构域蛋白、重金属转运/解毒蛋白以及其他已知和未知蛋白(附加文件)4:图S4)。
水稻稻瘟病抗性的全基因组关联研究。曼哈顿有八个菌株，(一)CH102,(b)CH149,(c)CH171,(d)CH172,(e)CH182,(f)CH186,(g)CH212,(h)CH362。负log10-transformedP全基因组扫描的值与12条染色体上的每条位置对应。灰色水平虚线表示全基因组显著性阈值。8个菌株的定量-分位数图，(我)CH102,(j)CH149,(k)CH171,(左)CH172,(m)CH182,(n)CH186,(o)CH212,(p)CH362。
GWAS结果评估和候选基因功能鉴定
通过搜索相关基因座的侧翼区域，有四个基因靠近甚至落在两个已知的克隆基因上(Pia［27]，实物支付债券［28])，以及一个QTL (论坛［29])，先前使用近等基因系或重组自交系进行了图谱克隆，这表明我们的GWAS具有较高的分辨率。我们通过搜索含有保守基序的蛋白质来预测候选基因R基因。为了进一步验证相关性的可能性，我们对部分候选基因进行了实时荧光定量PCR (问(附加文件5:表S1，附加文件6:表S2)及其在公共数据库中的表达式配置文件。
R基因在检测入侵病原体和激活防御机制方面起着至关重要的作用[30.]，其中nbs - lrr型R基因一直是植物遗传学中研究最广泛的研究目标。最强关联结果(峰值SNP: Chr11_6526998;P=1.17 × 10−17)，解释了26.6%的表型方差，是围绕基因的Os11g0225100(图2A)，这是大米中的一种Pia从11号染色体的一个区域编码NBS-LRR型蛋白[27］．的表达式Os11g0225100(图2B)抗性地种高于易感地种。接种后，抗性地方品种的抗性水平提高，而易感地方品种的抗性水平没有变化。来自微阵列数据的表达式概要(图2C)表明Os11g0225100该基因在幼叶、成熟叶和种子根中均有较高的表达量。
已知基因的关联和基因组位置，Os11g0225100．(一)最强的信号位于编码区。(b)接种前后表达的比较。(c)的表达模式Os11g0225100从公共微阵列数据。
我们观察到位于下游±13 kb和0.5 kb的其他信号论坛，是先前研究发现的稻瘟病QTL [29并被映射到11号染色体上。这些snp与CH182 (Chr11_30606558，P=2.94 × 10−11,图3.a)和CH149 (Chr11_30618466，P=9.94 × 10−9,图3.B)，分别解释了13.6%和15.9%的表型方差。Os11g0704100被描述为一种含有核苷酸结合和富亮氨酸重复序列(NB-LRR)结构域的抗病蛋白，这表明Os11g0704100最大程度的候选基因为论坛．如问PCR(图3.C,d)，的表达式Os11g0704100和的相似吗Os11g0225100．来自微阵列数据的表达式概要(图3.E)表明该基因在低水平上构成性表达。因此，我们推测抗病性蛋白Os11g0704100可能是很大程度上的候选基因论坛．
先前确定的QTL附近的强相关信号，论坛．(一)与CH182缔合。(b)与CH149关联。接种前后表达的比较。(c)接种菌株CH182。(d)接种菌株CH149。(e)的表达模式Os11g0704100从公共微阵列数据。
激酶蛋白家族成员也参与其中R基因介导的抗病，如已报道的基因美国专利商标局(以番茄计)[31]，Xa21(以米计)[32),而Rpg1(以大麦计)[33］．一个显著SNP (Chr12_13690289，P=7.53 × 10−15,图4a)与CH149相关的6个基因簇(表2)，解释了18.0%的表型方差。根据基因本体(GO)分析，Os12g0424700而且Os12g0427000被描述为含有蛋白的激酶样结构域，并被鉴定为先天的该位点的候选基因。为Os12g0424700的结果问PCR(图4B)也类似于Os11g0225100．和来自微阵列数据的表达配置文件(图4D)表示。Os12g0424700表达量低，在P6花序(22-30 cm)达到峰值。为Os12g0427000，接种后表达量下降(图4c)，在大多数组织和器官中表达量低(图4E)，与Os11g0704100．因此，我们推测这两个基因可能是该位点全部功能所必需的。这与大米的情况类似Pikm［34]，各π［35),而拟南芥RRS1而且RPS4［36]，这表明完全相同的完全抗病表型可能是不同位点的结果。
GWAS产生的新区域。(一)图中显示，在峰值SNP Chr12_13690289的两侧各有一个150kb的区域。接种前后表达的比较。(b)接种菌株CH182。(c)接种菌株CH149。(d)的表达模式Os12g0424700从公共微阵列数据。(e)的表达模式Os12g0427000从公共微阵列数据。
为了评估GWAS是否涉及新的功能位点，我们进一步探索了显著的SNP, Chr12_13032951 (P=4.25 × 10−13)，在第12号染色体上。该SNP与菌株CH186显著相关(图5A)，并解释高达21.6%的表型方差。在侧翼区域，有10个候选基因涉及，包括锌指蛋白、组蛋白H3、推测的植物转座子蛋白等(表3.)．qPCR分析(图5b,c，附加文件7:图S5)证明Os12g0416300，Os12g0417100,Os12g0417600可能是最有希望参与该区域正向调控的候选基因。Os12g0416300(图5b)和Os12g0417600(图5D)在抗性地方品种中表达量高于易感地方品种，接种前后无差异。不像他们，表达水平Os12g0417100(图5C)接种后增加。此外，微阵列数据显示Os12g0417100(图5E)在低水平上构成表达，Os12g0417600(图5f)在P6花序(22 ~ 30 cm)高表达，在不同发育阶段的其他组织器官中表达量较低。芯片里没有探针Os12g0416300．对于其他人来说，它们可能在抗爆炸调节中没有作用或作为负调节(附加文件)8:图S6)。
新型GWAS功能位点检测。(一)相关位点Chr12_13032951。基因接种前后的表达，(b)Os12g0416300，(c)Os12g0417100而且(d)Os12g0417600．(e)的表达模式Os12g0417100从公共微阵列数据。(f)的表达模式Os12g0417600从公共微阵列数据。
在其他具有全基因组意义的snp中，Chr11_27068156 (P=5.36 × 10−9)位于已知克隆基因上游±37 KB处，实物支付债券，它也由两个相邻的NBS-LRR基因组成，对许多中国水稻稻瘟病分离株具有高而稳定的抗性[28］．更有趣的是，我们发现了一个信号(Chr03_1170958，P=7.92 × 10−9,图1e, m)在第3染色体上相关，该染色体上未发现相对的blast抗性位点。搜索侧翼区域(附加文件9:表S3)，Os03g0122000编码含有蛋白质的激酶样结构域Os03g0120400编码含有蛋白质的重金属转运/解毒蛋白结构域等。目前尚不清楚哪些基因参与了抗性调控，但这一区域有待进一步研究。
讨论
在这项工作中，GWAS被用于水稻稻瘟病定量抗病基因的关联作图，这与在玉米中所做的工作相似[37］．在GWAS中使用高密度全基因组snp不仅可以发现真正的候选基因，而且可以全面了解性状的调控机制。
尽管全基因组关联研究正变得越来越可行，但似乎种群结构仍将受到相当大的争论，这可能会导致假阳性率的增加[38］．然而，问题的严重程度不仅取决于样本结构的程度，还取决于表型[39］．受种群结构强烈影响的性状将表现出较高的假阳性率[40] - [42］．为了减少由遗传结构导致的假阳性，我们的研究只使用了籼稻面板，并优化了EMMAX算法中的所有参数。事实上，虽然EMMAX算法，或混合线模型[43]，降低了通货膨胀P-value时，往往会掩盖真实的位点，降低检测功率[12］．在这种情况下，大多数人类研究的关联映射很可能是病例对照研究，如果选择了明智的对照[44］．
尽管存在这些局限性，我们在水稻中鉴定出30个与稻瘟病抗性相关的基因座籼稻一个位于3号染色体上。毫无疑问，数据中存在伪信息，要彻底预测假关联与真关联是不现实的。为了分析候选基因，我们结合基因注释，问从微阵列数据中提取PCR和表达谱，研究可能导致表型变化的潜在功能多态性。在这些相关的位点中，有些与先前识别的基因和qtl重叠或重合[27] - [29］．如果将范围扩大到300 kb(±150 kb)，可能会检测到更多的已知基因，例如皮塔饼［7]、[45]、[46］．此外，我们检测到以存在为特征的新相关位点R基因。此外，值得注意的是，最强的关联并不总是与候选基因相对应，这可能反映了一种确定偏差[12]，而这些基因可能更有趣，因为它们参与代谢调节[38］．结果表明，水稻稻瘟病抗性受一系列机制的制约[47]，且与基础阻力有相当大的机制重叠[48］．
染色体热点常被发现用于水稻稻瘟病，如先前报道的，11号染色体具有最多的相关位点:15个位点涉及24个主要稻瘟病抗性基因(http://www.ricedata.cn/gene)．在本研究中，相关位点和候选基因也经常出现在11号染色体上。余等．［49他们发现水稻拷贝数变异(CNVs)的最高频率出现在11号染色体上，许多CNVs中的基因与抗性有关。这些编码蛋白大多具有保守的核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复序列(LRRs)。同时，植物中的NBS-LRR基因倾向于聚集在基因组中相邻的位点[50］．我们还分析了一组候选基因，如之前的研究所观察到的那样，这些基因协同参与了胚芽抗病性的功能调控，或在调控中发挥了直接作用[28］．热点的解释可能是发生了生化连接，或者它们与原始水稻基因组高度相关，指向相同的基因组位置。
我们发现几个snp与同一菌株有关。这可能是一种多基因效应，是众多基因座的累积，受上位效应和加性效应的影响。此外，部分菌株在同一区域表现出显著的关联，说明这些菌株具有相似的遗传控制，说明这些菌株可能具有共同的机制，可能是由多效性或紧密连锁基因引起的[51］．这一结果符合表型数据的分类。这些相关性表明，该区域的突变是爆炸病的一个重要控制点，由于其一般无种族特异性，应被认为是对爆炸病的定量部分抗性。否则，不同的P这些相关值表明，这些位点反映了不同品系抗病性的差异。
结论
在GWAS中使用高密度全基因组snp不仅可以发现真正的候选基因，而且可以全面了解性状的调控机制。我们的研究结果进一步证实，GWAS是分析定量抗病基因与传统QTL定位的有力补充方法。这项工作为进一步研究这些候选基因的潜在功能提供了基础。在任何给定的GWAS中，真实关联的子集将与结果弱相关;因此，大规模的复制是必要的，以证实我们的结果。未来的研究将重点通过基因转化和转移DNA插入突变筛选验证这些候选基因及其功能变体的作用，以验证这些基因在水稻中产生抗稻瘟病的能力。
方法
植物材料
我们使用的关联映射面板由黄等人先前详细描述的517个中国水稻地方品种组成。[22]并存入EBI欧洲核苷酸档案(登录号ERP000106)，其中包括籼稻面板(366籼稻品种)及粳稻面板(136粳稻品种)。鉴于栽培水稻的两个亚种之间存在很强的种群分化，我们没有在整个种群中寻找关联。同时，由于样本量较少粳稻的子集进行GWAS籼稻大米。
表型变异
表型测量于2012年在中国杭州的中国水稻研究所农场进行，位于北纬30°32′，东经120°12′。将种子种植在43*30*7.5 cm的塑料盘中，测试来自全国各地的16个品系(CH102、CH122、CH131、CH149、CH154、CH159、CH171、CH172、CH182、CH186、CH193、CH212、CH218、CH242、CH251、CH362)的抗爆性。每盘6行10排播种15粒种子，重复3次。植株在第三至第四叶期，在弱光、室温、高湿度(70 ~ 85%)条件下，采用喷施法培养，以保证产孢和随后易感植株的再侵染。接种后约7 d，用病叶面积(DLA)评价病害反应[52］．在重复分析中采用较高的DLA。
基因分型和关联作图
我们使用了Huang等人的测序数据。21]、[22]在水稻单倍型图谱计划资料库(http://www.ncgr.ac.cn/RiceHap2)．使用等位基因频率为>5%的snp进行关联分析。我们使用高效混合模型关联eXpedited (EMMAX)算法进行GWAS [25］．
重要信号分析
为了识别候选基因并预测其在相应品系相关位点上的假定功能，我们使用了水稻注释项目数据库(RAP-DB)中的基因注释信息。所有在水稻稻瘟病抗性反应中具有特定作用的相关位点的潜在候选基因都在一个200 kb基因组区域内被选择(峰值SNPs上游100 kb和下游100 kb)。
候选基因的鉴定
采用实时荧光定量PCR检测原爆病感染前后候选基因的表达水平(问PCR)。用AxyPrep™多源总RNA Miniprep试剂盒从稻苗叶片中提取总RNA，该试剂盒来自Axygen (Tewksbury, MA, USA)。互补DNA (cDNA)使用Toyobo Co.(大阪，日本)的First Strand cDNA Synthesis Kit，从总RNA中提取dT18引物合成。实时定量PCR (问PCR)引物(附加文件5表S1)和材料(附加文件6:表S2)进行扩增，反应在7500 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)上进行。表达水平β-肌动蛋白用于对每次分析的RNA样本进行标准化。的问每个实验株系至少进行3次PCR检测。表达谱分析也使用Bio-Array Resource for Plant Biology (http://bar.utoronto.ca)．
附加文件
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感谢赵燕博士和黄学辉博士(中国科学院上海生物科学研究院)的技术支持，感谢黄学辉博士和韩斌博士(中国科学院国家基因研究中心)的精彩讨论、建设性建议和对稿件的批判性阅读。国家科技部(2013CBA01404、2013BAD01B02-14)和农业部(2014NWB031)资助。
作者信息
从属关系
相应的作者
额外的信息
相互竞争的利益
作者宣称他们之间没有利益冲突。
作者的贡献
构思并设计实验:CW和XW。进行实验:CW XY QX。分析数据:CW YY XW。贡献试剂/材料/分析工具:XY YF HY YW。写论文:CW YY XW。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。
电子辅助材料
12870 _2014_311_moesm1_esm.ppt
附加文件1:图S1: 16株表型变异的地理分布。红点表示阻力;绿点表示中度易感;黑点表示易感性。(ppt 294kb)
12870 _2014_311_moesm7_esm.ppt
附加文件7:图S5:相关位点Chr12_13032951候选基因的实时荧光定量PCR分析(ppt 208kb)
12870 _2014_311_moesm8_esm.ppt
附加文件8:图S6:相关位点Chr12_13032951候选基因的表达模式分析。(ppt 225kb)
权利和权限
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关于本文
引用本文
王，C，杨，Y，元，X。et al。籼稻稻瘟病抗性的全基因组关联研究。BMC植物生物学14日,311(2014)。https://doi.org/10.1186/s12870-014-0311-6
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- 爆炸的疾病
- 候选基因
- 全基因组关联研究
- 水稻
- R蛋白