欧米茄-3脂肪酸去饱和酶基因家族的全基因组分析Gossypium

背景

世界上种植的大多数商业棉花品种都来自于棉花陆地棉它是由a基因组和d基因组二倍体祖物种种间杂交产生的自然存在的异源四倍体。虽然大多数棉花品种适应温暖、半干旱的热带和亚热带地区，因此在这些地理区域表现良好，但棉花幼苗对寒冷温度敏感，这可能会显著降低作物产量。植物对低温的常见生化反应之一是omega-3脂肪酸的增加，它通过维持膜的完整性来保护细胞功能。我们研究的目的是鉴定和表征omega-3脂肪酸去饱和酶(FAD)基因家族g .,重点是识别与低温适应有关的omega-3 FADs。

结果

11个ω -3 FAD基因在g .分子，以及现存A和D二倍体物种的基因家族特征(g . herbaceum和g . raimondii就(分别)允许四倍体中所有同源物的明确基因组分配g .分子．棉花的omega-3 FAD家族包括五个不同的基因，其中两个编码内质网型酶(FAD3-1和FAD3-2)和三个编码叶绿体型酶的基因(FAD7/8-1，FAD7/8-2,FAD7/8-3）.的FAD3-2基因在A基因组祖先物种中复制是在从D祖先进化分裂之后，但在产生现代四倍体棉花的种间杂交事件之前。RNA-seq分析揭示了在各种器官和细胞类型中保守的、基因特异性的表达模式，半定量RT-PCR进一步揭示了FAD7/8-1在低温处理时特异性诱导g .分子幼苗。

结论

3种棉花omega-3 FAD基因家族在全基因组水平上进行了鉴定，表明该基因家族的建立时间较早，早于A和D二倍体祖种的分裂。FAD基因在包括纤维在内的各种器官和细胞类型中有差异表达FAD7/8-1低温诱导基因。总的来说，这些数据确定了棉花中这一重要基因家族的遗传和功能基因组特性，为未来通过分子育种方法提高棉花非生物胁迫耐受性提供了基础。

棉花是世界范围内的重要作物，为纺织工业提供了大部分纤维，并为食品、饲料和生物燃料提供了大量的油籽。用于商业生产的最常用棉花品种是陆地棉是一种具有非凡进化史的异源四倍体物种。棉花属(Gossypium)起源于大约1200万年前(MYA) [1]并在世界上许多干旱或季节性干旱的热带或亚热带地区经历了迅速的辐射和适应[2]、[3.]。尽管形态表型范围很广，包括乔木和灌木，但细胞遗传学和核型分析显示，大多数植物可以被归类为具有8种不同类型的二倍体基因组中的1种(n = 13) [3.]。含有A、B、E和F基因组的植物常见于非洲和阿拉伯，含有C、G和K基因组的植物常见于澳大利亚的植物，含有D基因组的物种常见于中美洲。g .分子是一种AD四倍体，也主要在中美洲发现，这表明该物种是由非洲的a型种子跨洋传播而产生的，随后与新世界的一个含有d型的祖先物种进行了偶然的种间杂交[3.]、[4]。分子系统学研究表明，A和D二倍体物种分别进化了大约5 - 1000万年，然后在大约1-2亿年前在同一个细胞核中重新结合[5]。g .分子(陆地棉花的来源)随后在过去的几千年里在新大陆被驯化用于纤维生产，因此，它是一个有趣的模型系统，不仅用于研究基因组进化，而且用于研究多倍体在作物发育和驯化中的作用[6]。

考虑到g .分子原产于热带和亚热带，适应干旱和半干旱气候的温暖温度[7]、[8]。在美国，陆地棉花在一年中的不同时间种植，生长季节的开始和结束通常包括不理想的生长温度和环境条件。例如，在生长季节的后半段，炎热和干旱会导致作物产量大幅下降[9]、[10]。此外，在棉花生长季节的早期，棉花暴露在突如其来的低温下，会对棉花幼苗造成严重损害，使植株无法完全恢复。[11] - [15]。因此，培育耐低温胁迫的陆地棉品种可以提高作物的农艺性能，从而对棉花产业产生重大影响[12]、[14]。

植物对低温的适应是一个复杂的生物学过程，涉及许多不同基因的表达变化和许多不同代谢物的改变[16] - [19]。植物对低温的常见生化反应之一是多不饱和脂肪酸(PUFAs)相对含量的增加[20.] - [23]。多不饱和脂肪酸比饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸具有更低的熔化温度，它们的积累被认为有助于在低温下维持膜的流动性和细胞的完整性[24]。例如，低温处理棉花幼苗已被证明可诱导PUFAs的积累[15]、[25]，在处理过程中加入PUFA生物合成抑制剂，使幼苗更容易受到低温损害[15]。相比之下，温暖温度与PUFA含量呈负相关，并在叶片展开过程中发生变化，这影响了棉花植株在田间的光合性能[26]。因此，更好地了解调控棉花多聚脂肪酸产生的基因是提高陆地棉花种质的耐寒性和耐热性的第一步。

植物PUFA产生的代谢途径通常被很好地理解，并主要通过研究各种不同的代谢途径来阐明脂肪酸去饱和酶;或时尚突变体,拟南芥在脂质代谢的各个阶段被阻断27]。简而言之，脂肪酸的生物合成发生在植物细胞的质体中，2个碳单元的连续连接产生了在细胞膜中占主导地位的16或18碳长的脂肪酸。质体间质中存在可溶性脂肪酸去饱和酶，可将18:0转化为18:1，其中冒号前的数字表示脂肪酸链中碳的总数，冒号后的数字表示双键的数目。18:1脂肪酸随后可通过在质体或内质网(ER)中运行的两条平行途径之一进一步去饱和。例如，18:1可以通过称为FAD6的膜结合脂肪酸去饱和酶在质体中转化为18:2，或者18:1可以从质体输出到内质网，并通过称为FAD2的结构相关酶转化为18:2。FAD2和FAD6酶在多肽序列水平上是相似的，除了FAD6蛋白含有较长的n端序列，这是叶绿体转运肽的特征。以类似的方式，18:2可以通过FAD7或FAD8酶在质体中转化为18:3，这两个酶是由两个密切相关的基因编码的拟南芥，或输出到内质网，由FAD3酶转化为18:3。后一组酶(FAD7/FAD8和FAD3)被称为omega-3脂肪酸去饱和酶，因为它们在脂肪酸结构的omega-3位置引入了一个双键。因此，产生18:2的FAD6和FAD2酶，以及产生18:3的FAD7/FAD8和FAD3酶，都在所有植物物种中存在的PUFAs的产生中发挥核心作用。

了解编码这些酶的FAD基因，可以更详细地分析这些基因及其脂肪酸产物在植物脂质代谢和非生物胁迫反应中的作用。例如，已知omega-3脂肪酸在植物中增加以应对干旱[28]、[29]及低温[20.] - [23]，并且在各种转基因植物中过度表达omega-3去饱和酶已被证明可以提高耐旱性和抗寒性[30.] - [35]。内质网定位的去饱和酶FAD2和FAD3也参与了种子油中PUFA成分的产生[27]，考虑到这些脂肪酸对人体营养的重要性，以及在烹饪或其他食品应用过程中确定油的稳定性，这些基因的分子标记已被开发出来，用于评估种质和鉴定油成分改善的油籽品种[36] - [39]。

鉴于PUFA在植物适应寒冷和干旱中的重要作用，以及棉花幼苗对这两种环境条件的敏感性，我们试图鉴定和表征棉花中参与PUFA合成的基因。自几FAD2以前在棉花中已经报道和鉴定了基因[40] - [46]，我们选择集中分析omega-3 FAD基因家族，该基因家族的成员此前没有被研究过。在这里，我们描述了完整的-3基因家族在这两个四倍体g .分子以及现存的A和D二倍体祖先物种(g . herbaceum和g . raimondii就，这使得所有同源基因的明确分配。我们还描述了器官和细胞类型特异性基因表达模式，并确定了一个单一的FAD7 / FAD8棉花幼苗在低温和干旱条件下均可诱导的型基因。总的来说，这些数据定义了这个重要基因家族在商业陆地棉花中的含量和功能基因组特性。

棉花omega-FAD基因家族的鉴定与系统发育分析

omega-3 fad型基因g .分子(广告₁异源四倍体),g . herbaceum(一个₁二倍体),g . raimondii就(D₅使用数据库挖掘、基于退化引物的PCR筛选、基因组重测序和基于基因特异性PCR的克隆相结合的方法克隆和测序，如方法所述。所有克隆、DNA测序和RT-PCR引物序列在附加文件中提供1，2,3.,分别。在克隆过程中，基因组序列g . raimondii就(D₅)被释放[47]，这证实了我们在这种生物体中发现的omega-3基因的身份。我们克隆的基因序列与基因组数据库中的基因之间的完美匹配为这里采用的克隆过程的保真度提供了有用的检查。最近，一份基因序列草图g . arboreum(一个₂)被释放[48]，这将使未来的研究旨在比较含有基因组的物种之间的基因序列。

五个不同的omega-3 fad型基因被鉴定出来，并且所有的基因都存在于所研究的三种棉花中，这使得每个同源性的明确分配成为可能g .分子(表1;参见附加文件4获取GenBank的加入号和其他文件5，6，7，8和9基因比对)。其中两个基因编码内质网中定位的fad3型酶(FAD3-1和FAD3-2)和三个基因在叶绿体中编码fad7 /8型酶(FAD7/8-1，FAD7/8-2，FAD7/8-3)(图1;只有编码多肽序列来自g . raimondii就(为清晰起见)。后一组多肽含有较长的n端序列，预计可作为叶绿体靶向肽(图2)1）.所有的omega-3 FADs都共享多肽序列的保守区域，包括三个参与结合酶活性位点两个铁原子的“组氨酸盒”(图2)1;［49])。值得注意的是，由FAD7/8-3在第二个组氨酸盒中包含一个苏氨酸到异亮氨酸的替代(图2)1)，这在fad7 /8型序列中通常没有观察到(图2)1和[50])，在所有实验中均检测到这种替代FAD7/8-3三种棉花的序列(数据未显示)。鉴于各种fad7 /8型酶中组氨酸盒序列的高度保守性[50]，并且已知这些区域的改变会破坏或改变酶的活性[51，这些数据表明FAD7/8-3棉花基因可能编码酶活性降低或改变的酶。

为了进一步了解omega-3 FAD基因家族在棉花中的进化和功能，我们将3种棉花的omega-3序列与棉花的omega-3序列进行了比较Theobroma可可棉花是棉花的近亲锦葵科其基因组已被测序的家族[54]。系统发育分析显示，这些物种的omega-3 FADs分为三个明确的单系群，每个群含有一个可可和几个棉花基因(图2)2）.因此，这三个群体的建立早于棉花和可可的分化大约60万年前[47]。在棉花中，基因家族在分化后进一步扩大t .可可但在A和D基因组物种分化之前大约6-7亿年前[55]，有重复的基因对FAD3类型(FAD3-1和fad3 - 2.1),FAD7/8类型(FAD7/8-1和FAD7/8-3)基因在三个单系群体中的两个(图2;表格1）.这些重复与棉花谱系与可可分化后不久发生的基因组重复事件一致[47]。此外,fad3 - 2.1基因在A基因组物种(g . herbaceum)，但在D基因组物种(g . raimondii就)，这种进一步的复制在四倍体中持续存在g .分子．这些数据表明，后一种复制事件发生在二倍体祖先物种分裂之后，但在产生四倍体的种间杂交事件之前g .分子约1-2兆a [4]。的fad3 - 2.2该基因很可能是假基因，因为其编码序列包含多个帧内停止密码子和一个帧内移突变g . herbaceum和g .分子序列(附加文件)6）.综上所述，这些数据表明omega-3 FAD基因家族在棉花物种形成过程中经历了快速扩张，在种间杂交之前在A基因组物种中进行了额外的细化。

基因表达模式的RNA-seq分析

为了进一步了解omega-3 FAD基因的功能，我们基于RNA-seq实验评估了omega-3 FAD基因在棉花各种器官、细胞类型和处理中的表达模式。野生和驯化棉花纤维转录组学研究进展g .分子研究表明，驯化过程导致纤维基因表达的大量重编程，超过5000个基因在野生和驯化物种之间表现出显著的表达变化[56]。野生棉纤维短且呈棕色，而驯化的棉纤维较长且呈白色。研究了两个发育阶段，包括开花后10天(DPA)，代表初级细胞壁生长，以及20天(DPA)，代表向次级细胞壁合成过渡[56]。对omega-3 FAD基因家族的RNA-seq数据分析显示FAD3-1基因在初代细胞壁合成过程中主要表达，在次生细胞壁合成过程中表达减少(图2)3.）.所有其他omega-3 FAD基因的表达水平都很低。这种模式在野生和家养动物中都得到了一致的观察g .分子品种(图3.)，这表明FAD3-1表达涉及纤维生产的共享方面，而不是驯化特定的方面。值得注意的是，亚麻酸是伸长棉纤维中含量最多的脂肪酸[57]，以及一项单独的研究，研究了1和7 DPA纤维的基因表达g .分子表现出强烈的aFAD3型基因在原代细胞壁合成中的作用[57]。在该研究中鉴定的基因片段与此处描述的序列的比较表明，该基因片段对应于FAD3-1Dhomoeolog的g .分子(数据未显示)。综合来看，这些数据表明FAD3-1基因在指导高水平的omega-3脂肪酸的合成中起着重要作用，这些脂肪酸存在于拉长的棉纤维中。

驯化种子邻近发育组织转录本水平分析g .分子显示出与纤维非常不同的基因表达谱，在每个时间点观察到的所有omega-3基因家族成员的水平都很低(图2)4A).这可能解释了棉籽油中亚麻酸含量很低的原因，亚麻酸只占棉籽油脂肪酸组成的0.2% [58]。然而，对花瓣转录本的分析显示，这两种基因的表达水平相对较高FAD7/8-1和FAD7/8-2(图4B).对棉花叶片的分析显示了某种相似的模式，但是FAD7/8-1水平降低(图2)4C)。值得注意的是，在其他棉花品种和物种的纤维、种子、花瓣和叶片中也检测到类似的基因表达模式，这表明omega-3 FAD基因调控的机制是古老的(附加文件)10）.综上所述，这些数据揭示了棉花不同组织和器官中保守的、差异的基因表达模式。

对干旱处理的棉花植株进行了RNA-seq分析。的g .分子本研究选用的品种为Siokra L-23，因为该品种先前因耐亏水能力增强而被选择[61]。对照和干旱处理棉花叶片中omega-3 FAD转录水平的检测证实了这一点FAD7/8-2主要在叶片中表达，此外，该基因的表达在干旱条件下没有明显变化(图5A).根组织中基因表达分析显示FAD7/8-1基因显著表达，干旱处理对表达有中度诱导作用(图2)5B)。

综上所述，这些数据定义了器官和细胞类型特异性基因表达模式的各种成员的ω -3脂肪酸去饱和酶基因家族g .分子,FAD3-1主要在纤维中表达，FAD7/8-2在树叶中，FAD7/8-1棉花根系干旱诱导。

低温诱导棉花幼苗FAD7/8-1表达

研究基因在冷处理中的表达模式g .分子幼苗，我们首先开发了基因特异性PCR引物，能够区分每个omega-3 FAD同源物。我们选择开发基于PCR的策略而不是RNA-seq来监测基因表达，因为本文开发的PCR引物也可用于未来的候选基因关联定位研究。这种定位研究的目的是测试候选基因的序列变异(例如，单核苷酸多态性，SNPs)是否在统计上与不同品系的特定性状(例如，耐寒性)相关[62]、[63]。为了开发同源特异性引物，我们首先对各自的omega-3 FAD基因进行比对，以确定每个基因特异性的snp和插入-缺失(indel)(附加文件)5，6，7，8和9）.我们设计引物的一般策略是，每个引物对应该扩增大约500 bp的mRNA片段，并且每个引物的3 ' -most核苷酸应该是每个同源物所独有的。利用梯度PCR退火条件和含有目标同源物或最密切相关序列的质粒DNA模板，对每个引物组的特异性进行测试和优化。在某些情况下，引物扩增了两个同源物，需要重新设计以提高特异性。能够区分每个同源物的最终引物集在附加文件中列出3.．引物优化实验FAD3类型基因在附加文件中给出11,FAD7/8类型基因显示在附加文件中12．

完全展开子叶转录物水平的半定量RT-PCR分析(附加文件12B)和幼苗13日龄叶片(图2)6A)表明FAD7/8-1和FAD7/8-2每个基因都被表达，每个基因的同源转录物都可以被检测到。值得注意的是，所有RT-PCR产物的大小与各自同源cdna扩增的预期大小相对应(附加文件)11和12)，而不是来自基因组DNA，并且在不包括逆转录步骤的Actin对照反应中未检测到PCR产物(图2)6）.存在相对相似水平的FAD7/8-1和FAD7/8-2然而，子叶和叶片中的RT-PCR产物有些出乎意料，因为相对较高的FAD7/8-2通过RNA-seq分析棉花叶片的表达量(图2)4C).由于后一项实验是在7上进行的^th真叶[59]，我们还测量了这个年龄的叶片中omega-3 FAD的转录水平，并观察到与年轻叶片和子叶相似的表达模式(图2)6B).虽然两种技术测量的相对表达水平差异的原因目前尚不清楚，但这两种方法的结果至少是一致的，因为它们都揭示了两者的可测量表达水平FAD7/8-1和FAD7/8-2基因。基因表达差异的可能解释包括所采用的两种技术的敏感性(例如在半定量RT-PCR中未考虑的引物扩增效率的差异)和/或植物生长条件的差异(室内与温室)。

以确定是否有任何ω -3脂肪酸去饱和酶基因被诱导g .分子在30°C的生长室中，以12 h/12 h的昼夜循环将棉花种子在花盆中发芽，并让幼苗建立13天。在14号的早晨^th第二天，将一部分植株移入10°C的不同生长室，然后在不同的时间点从对照植株和冷处理植株上收集叶片样品，并在使用前立即在液氮中冷冻。如图所示7A和B，棉花幼苗在低温下暴露6小时后表现出明显的萎蔫，这与之前观察到的情况相似[13]。低温适应过程中叶片脂肪酸组成的生化分析显示，冷处理植物的omega-3脂肪酸增加(18:3)，omega-6脂肪酸减少(18:2)(图2)7C和D)，这与omega-3 FAD酶活性增强一致[25]。利用RT-PCR对对照和冷处理植株中omega-3 FAD基因表达模式的测定显示FAD7/8-1基因表达在6和18小时显著增加(图2)7E和F)，这通常与18:3脂肪酸的时间增加相关(比较图2)7D和F)FAD7/8-2虽然没有明显的诱导作用，但与对照组相比，低温处理确实使表达水平有所改变。值得注意的是，基因表达模式FAD7/8-1和FAD7/8-2在A和D亚基因组拷贝中都观察到，这表明相对古老的FAD7/8-1作为棉花的冷响应基因。

在棉花中鉴定出5个omega-3 fad型基因，其中2个编码er定位酶(FAD3-1和FAD3-2)和三个编码叶绿体型酶的基因(FAD7/8-1，FAD7/8-2和FAD7/8-3)(表1;数字1）.系统发育分析显示，这些基因可分为三个主要分支(图2)2)，其中第一个包含了所有内容FAD3类型的基因。功能分析显示FAD3-1基因主要在伸长棉纤维中表达(图2)3.)，并可能有助于合成亚麻酸，亚麻酸是纤维中含量最多的脂肪酸。的FAD3-2基因在所有条件下都以相对较低的水平表达，并在a基因组中复制g . herbaceum的亚基因组g .分子．后一个平行也包含几个帧内停止密码子(附加文件)6）.的低表达FAD3-2相比FAD3-1，似乎很有可能FAD3-1在棉花细胞内质网中，在亚麻酸的产生中起着更主要的作用。Clade 2包含FAD7/8-1和FAD7/8-3基因(图2)， RNA-seq和半定量RT-PCR显示FAD7/8-1是由非生物胁迫诱导的，包括根系的干旱处理(图5B)和棉花叶片的冷处理(图2)7E和F)FAD7/8-3基因在本文所述的所有实验中表达水平相对较低，并且在编码多肽序列的高度保守区域中包含替换突变(图1)1）.第三支包括FAD7/8-2基因，可能更多的是在子叶中产生18:3的管家角色(附加文件)12B)，树叶(图4和附加文件10D)，花瓣(图4和附加文件10C)。与FAD7/8-1,FAD7/8-2基因在两种干旱条件下均未表现出明显的非生物胁迫诱导(图2)5A)或冷温处理(图7E和F)，值得注意的是拟南芥FAD7和FAD8基因对低温处理也表现出不同的反应FAD7不受低温影响的表情[64),而FAD8低温诱导表达[65]。综上所述，这些数据确定了棉花中omega-3 FAD基因家族的进化和功能特性，并确定了与纤维生物发生和非生物胁迫反应相关的基因家族的特定成员。

基因克隆与注释

对于棉花中omega-3 FAD基因的初步搜索，我们采用了几种不同的方法，包括i) BLAST分析现存的Gossypium在不同的基因组数据库(如NCBI, CottonDB, Phytozome)中使用拟南芥Omega-3去饱和酶;ii)利用与omega-3脂肪酸多肽序列保守区域对应的“退化”PCR引物进行棉花基因组DNA和cDNA文库的PCR筛选;iii)使用基因特异性引物进行PCR扩增(见附加文件)1引物序列)。基因组DNAg . herbaceum，g . raimondii就，g .分子,g .取得作为PCR反应模板。随着二倍体祖细胞基因组序列的释放，获得了omega-3 FAD基因家族的额外见解g . raimondii就［47]。

我们的初步分析确定了棉花中五种不同的omega-3去饱和酶基因，包括两个编码内质网定位酶的基因(FAD3-1和FAD3-2)，以及三个编码叶绿体定位酶的基因(FAD7/8-1，FAD7/8-2，FAD7/8-3）.这五个基因中的每一个随后都被克隆并从两个祖先型棉花物种中测序，g . herbaceum(一个基因组;PI 175456)和g . raimondii就(D基因组;PI 530901)，以及现代陆地棉，g .分子TM1 (AD四倍体;PI 662944地图;［66])。为了保证克隆基因序列的保真度，采用了以下策略。设计基因特异性PCR引物，分别在起始密码子和终止密码子附近的5 '和3 ' UTR区域进行杂交，并用于包含从每个物种的单个植物中分离的基因组DNA的PCR反应。PCR反应被分成三个等分，每个等分都使用退火温度梯度进行PCR扩增，延长时间适合每个基因。使用高保真聚合酶“Phusion”(New England Biolabs, Ipswich, MA)进行扩增。PCR产物在DNA凝胶上溶解，使用GeneClean试剂盒(MP Biomedicals, Santa Ana, CA)提取和纯化预期大小的条带，并连接到适当的质粒载体上。在某些情况下，钝端PCR产物被亚克隆到pZero-Blunt (Life Technologies, Carlsbad, CA)，而在其他情况下，在基因特异性引物的5 '和3 '端添加独特的限制性位点，以允许定向亚克隆到pUC19。

对单个基因的三个初始PCR反应(共30个质粒)分别得到10个单独的质粒，进行DNA测序(Retrogen, Inc.， San Diego, CA)，并在正向和反向方向确定DNA序列(见附加文件)2用于测序引物)。利用载体NTI (v11.0;生命技术，格兰德岛，纽约)。将代表单个基因目标的所有30个质粒的序列进行比对，以帮助鉴定测序伪影、基于pcr的伪影和基于pcr重组的基因序列。后一种产物在扩增多倍体植物的基因时很常见，例如g .分子［67]，并且在PCR扩增过程中涉及同源序列模板的随机交叉。了解来自二倍体祖先物种的omega-3 FAD基因序列对于帮助确定四倍体的同源基因序列至关重要g .分子．内含子/外显子的配位是通过将基因组序列与棉花FAD cdna或ESTs(如果有的话)进行比对来确定的，或者使用以下网站提供的算法预测剪接位点www.softberry.com和特征序列的比较拟南芥ω- 3 desaturases。所有的基因序列，以及假定的mRNA序列，来自g . herbaceum，g . raimondii就,g .分子已存入GenBank，并在附加文件中提供了登录号4．

系统发育分析

本研究鉴定的22个全长omega-3 FAD基因序列，以及3个同源序列t .可可基因组(附加文件)4)与T-Coffee (v10.0;［68])，使用默认参数。随后使用Gblocks清理多序列比对[69]去除排列不良和主要含有间隙的区域，使用以下参数:保守位置和侧翼位置至少需要15个序列，不限制连续非保守位置的数量，保守区域至少需要两个核苷酸，并且在给定位置上最多允许14个分类群存在间隙。利用PhyML程序的在线版本实现的最大似然法生成了无根系统发育树(http://www.atgc-montpellier.fr/phymlv3.0;［70])使用BioNJ [71]初始树和GTR + γ核苷酸替代模型，其参数从数据中推断。采用aLRT方法估算支撑力[72]。使用FigTree (v1.4;http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree）.为了可视化的目的，树是中点根的。

利用RNA-seq和半定量RT-PCR评估基因表达

基因表达的RNA-seq测量是从几个棉花RNA-seq研究中挖掘出来的[56]、[59]、[60采集纤维、叶子和花瓣组织的样本。FAD基因在发育种子中的RNA-seq表达水平来源于R. Hovav和J. Wendel (personal communication)。干旱试验的RNA-seq数据来自[61]。本研究中鉴定的omega-3 FAD基因与d基因组参考序列比对[47使用GSNAP [73]，以识别相应的基因模型，并从已发表的数据中提取相应基因模型对应的RPKM(每千碱基每百万映射读取的reads数)测量值。

对于半定量RT-PCR，基因特异性的引物是通过比对从omega-3去饱和酶同源序列g .分子来识别每个基因特有的snp和indel(见附加文件)5，6，7，8和9）.然后使用PCR和含有目标基因或最接近同源基因的质粒模板来评估引物结合的特异性。采用梯度退火PCR条件确定每个引物对的最佳退火温度。在某些情况下，在所有退火温度下，使用两种质粒模板都可以观察到扩增，然后重新设计引物以结合其他基因特异性区域并测试特异性。在指定的最佳退火温度下，所有最终引物组均显示来自质粒DNA模板的同源特异性扩增(见附加文件)11和12）.

为了利用RT-PCR评估转录物的丰度，使用Spectrum Plant total RNA Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)从冷冻叶片组织中提取总RNA，然后按照制造商(Bio-Rad, Hercules, CA)的描述，用1 μg的总RNA和iScript Kit构建cDNA。用iScript RT超混合培养基进行附加反应，但不加逆转录酶，以控制潜在的基因组DNA污染。采用Extract-N-Amp PCR Ready Mix (Sigma-Aldrich)，分别用1 μl cDNA模板(对应50 ng RNA/cDNA)和FAD基因引物对，或0.1 μl cDNA模板(对应5 ng RNA/cDNA)和actin基因引物对进行半定量PCR。这些质粒DNA模板的数量，以及周期的数量，对每个基因进行经验确定，以确保扩增在线性范围内。PCR包括以下程序条件:98°C初始保存30秒，然后在95°C变性30次，10秒，在适当的温度下退火_米每个引物对(如上所述确定)30秒，然后在72°C下延长每个PCR产物确定的时间。30岁之后^th循环，反应在72°C下再孵育5分钟以完成延伸，然后在4°C下保存，然后在- 20°C下保存。在20 μl PCR反应中加入4 μl的6X上样染料，每个样品10 μl琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色。使用FUJI as -4000成像系统捕获凝胶图像，使用MultiGauge V3.1软件定量波段强度。

植物生长条件和样品收集

将棉花种子种植在24×16×16塑料罐中(每罐1粒种子)，盖上塑料圆顶，置于生长室中，在30°C、60%相对湿度和2.14 Kfc光强条件下进行12 h/12 h日夜循环。每周浇两次水，每周用20-20-20施肥一次。13日龄植株在14日开始进行10°C的冷却处理^th光/暗周期。对照组的植株在30°C的温度下保持14^th周期。处理组和对照组分别在冷处理开始后0、1、3、6、12、18和24 h采集第一片真叶，立即用液氮冷冻，并在- 80℃保存待用。每个时间点采集3个生物代表。

脂质提取和GC/FID分析

用改良的Bligh和Dyer法从叶组织中提取总脂质[74]。简单地说，将冷冻的叶子放入装有3 ml预热(75℃)异丙醇的玻璃管中，培养15分钟。样品冷却至室温后，加入1.5 ml氯仿和0.6 ml水。用力摇动样品，在室温下提取脂质1小时。将提取液转移到干净的玻璃管中。在这些样品中加入1.5毫升氯仿和1.5毫升1毫升氯化钾，并用力摇晃样品。在3000转/分离心3分钟后，丢弃上层相，用2毫升水洗涤一次有机相。在3000转/分离心3分钟后，有机相(底部)转移到一个干净的管中，在温和的氮气流下干燥，用于FA转甲基化。将1 ml甲醇HCl (1.25 M)加入到干燥的脂质提取物中。将样品在80°C下涡流孵育1小时。将试管冷却至室温，用1 ml 0.9% NaCl水溶液终止反应。加入1ml己烷后，摇匀样品，1000 × g离心1min，便于相分离。含有FAMEs的上相(有机)被转移到GC小瓶中。 FAME samples were analyzed using an Agilent HP 6890 Series GC system equipped with 7683 Series Injector and autosampler. FAME samples were injected on BPX70 (SGE Analytical Science, Ringwood Victoria, Australia) capillary column (10 m 0.1 mm × 0.2 um) with 50:1 split ratio and separated with constant pressure 25 psi and a temperature program: hold at 145°C for 5 min, 145–175°C at 2°C/min, hold 175°C for 1 min, 175–250°C at 30°C/min. Integration events were detected between 9 and 20 min and identified by comparing to GLC-10 FAME standard mix (Sigma).

加入数据

本研究中描述的所有基因的加入号在附加文件中提供4．

支持数据的可用性

支持本文结果的序列数据可在GenBank [GenBank;Gossypium品种:KF460111-KF460114、KF460117-KF460154、KF572120-KF572121;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/]和Phytozome [Phytozome;拟南芥: at2g29980.1, at3g11170.1, at5g05580.1;Theobroma可可: cc1eg041603t1, cc1eg021677t1, cc1eg042487t1;http://www.phytozome.net/)存储库。系统发育数据集可在LabArchives存储库中获得[http://dx.doi.org/]10.6070 / H4WS8R7Q]。

这项工作得到了美国能源部BER部门的支持(批准号:DE-FG02-09ER64812/DE-SC0000797)资助KDC和JMD, USDA-NIFA/DOE生物质研究与发展计划(BRDI)资助编号为2012-10006的MAG和MAJ, NSF(0817707)和Cotton Inc.(09-559)资助JAU, Cotton Inc.(09 - 157)资助JMD。作者感谢Saumya Bollam、T.J. Lentz、Judy Nguyen和Lauren Tomlin在基因克隆方面的帮助。

从属关系

1. 美国干旱农业研究中心，美国亚利桑那州马里科帕北卡登巷21881号，85138

   Olga P Yurchenko, Sunjung Park, Jay J Inmon, Jon C Millhollon和John M Dyer

2. 北德克萨斯大学生物科学系植物脂质研究中心，丹顿76203，美国

   Sunjung Park & Kent D Chapman

3. 康奈尔大学综合植物科学学院植物育种与遗传科，美国纽约州伊萨卡14853

   丹尼尔·C·伊鲁特和迈克尔·A·戈尔

4. 杨百翰大学植物与野生动物科学系，美国犹他州普罗沃84602

   扎克·利奇蒂，贾斯汀·T·佩奇和约书亚·A·尤德尔

5. 西弗吉尼亚大学植物与土壤科学系，美国西弗吉尼亚州摩根敦2650

   马修·A·詹克斯

相应的作者

对应到约翰·M·戴尔．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

OPY对棉花植株进行了冷温分析，包括植物脂质的生化分析和基因表达的测定。SP、JJI和JCM进行了所有基因的克隆和DNA序列分析。DCI进行进化分析。ZL、JTP、JAU进行RNA-seq分析。MAJ, KDC和MAG参与了实验的设计和协调，并帮助撰写了论文。JMD构思了这项研究，协调了项目，并撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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