脂肪酸-氨基酸结合物对水杨酸诱导的蛋白激酶的系统激活和茉莉酸在细胞中的积累是必不可少的野生烟草

背景

食草诱导有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的活化，茉莉酸盐和防御代谢产物在受损叶片和远端未受损叶片中的积累。以往的研究主要集中在个体反应和数量有限的系统叶片上，需要更多的研究来更好地了解植物不同部位对取食的反应。在野生烟草中野生烟草，FACS（脂肪酸 - 氨基酸缀合物）manduca sexta.口腔分泌物（OS）是诱导草食病特异性信令的主要eLitor，但它们在系统信号传导中的作用在很大程度上是未知的。

结果

在这里，我们表明模拟的草食病（添加M.Sexta.在受损叶片和某些（但不是全部）未受损的系统叶片中，SIPK（水杨酸诱导的蛋白激酶）活性和茉莉酸（JA）水平显著增加，而单独伤害没有可检测的系统效应；重要的是，FACs和创伤都是激活这些系统反应所必需的。与特定系统叶片中SIPK的激活和JA的升高相反，在模拟草食后的所有系统叶片中观察到一种重要的抗草食性防御，胰蛋白酶蛋白酶抑制剂（TPI）的活性增加，表明系统TPI诱导不需要SIPK的激活和JA的增加。叶片消融实验表明，在模拟除草后的10分钟内，一个或多个信号被产生并从处理过的叶片中传输出去，随后激活了系统反应。

结论

我们的结果显示N.Attenuata.具体地认识到损坏的叶片中的草食物衍生的FAC，并迅速向PhyLotacty连接的叶片迅速发出长距离信号，以激活MAPK和JA信号，并且我们提出穿透到伤口的FACS迅速诱导另一个长距离信号的产生）这是向所有全身叶子传播并激活TPI防御。

食草动物对植物构成重大威胁。为了应对这一挑战，植物已经进化出复杂的防御系统来感知伤害和草食动物衍生的激发子（所谓的草食动物相关分子模式，HAMPs）[1.]并激活下游信号事件的连锁反应，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的快速激活[2.]-[4.]植物激素的生物合成，如茉莉酸（JA）、JA-异亮氨酸结合物（JA-Ile）和乙烯[5.，并重塑转录组、蛋白质组和代谢组。

据信，通过移动到未解除的组织来防止昆虫抵抗昆虫逃离植物防御。系统防御首次在番茄中发现（Lycopersicon esculentum）：伤害后，发现信号移动到植物的其他部位，诱导产生重要的防御化合物，蛋白酶抑制剂I（PI-I）[6.］．在野外烟草，野生烟草除PIs外，转录和代谢组学分析表明，各种基因和代谢物在系统未损伤的叶和根中也表达上调[7.]-[9]. MAPKs和植物激素JA、JA-Ile都是植物的上游信号分子，在植物对食草动物的抗性调控中起着重要作用[3.],[4.],[10]-[13］．伤口或草食病在几分钟内激活Mapks [3.],[4.],[14],[15]迅速诱导JA的生物合成，在1-2小时内达到高峰[16],[17］．

在番茄中，培养烟草，牧草和草坪草，在伤害后，在某些全身叶片中也检测到快速MAPK活化[18]-[20];然而，模拟草食的伤害或治疗（伤口和伤口的伤害和应用）没有导致邻近全身叶中MAPK活性的变化N.Attenuata.[3.]表明MAPKs的系统激活可能是种特异性的或依赖于叶的位置。近年来，人们发现创伤能迅速诱导拟南芥叶片中JA的积累[21],[22］．相比之下，伤口治疗没有诱导全身茉满半制物的积累N.Attenuata.，但在模拟食草动物喂养后，在全身叶中发现了Ja和Ja-Ile水平的增加[23],[24］．因此，除了在系统叶片中诱导防御化合物的积累之外的长距离信号之外，另一个（或相同）信号或几个信号迅速地行驶到远端叶子并激活MAPK信号和JA生物合成。获得深入了解潜在的全身防御的分子机制的先决条件是对局部和全身叶子的空间和颞叶诱导的响应的彻底描述。

野生烟草，N.Attenuata.，是一款二倍体年度植物，居住在北美西部的沙漠中。N.Attenuata.在它如何应对专业昆虫的草食病方面都被密深manduca sexta.[25］．喂养M.Sexta.诱使植物防御代谢物的生产不仅在局部叶子中，而且还在系统性叶片远离伤口部位[26]. 以往对拟南芥、番茄和烟草的研究表明，MAPK和JA信号参与了系统反应[18],[19],[22]-[24]; 然而，大多数研究仅集中在数量相当有限的系统叶片上，并在信号或代谢物水平上研究其响应。本文全面研究了创伤和模拟食草动物处理后茄科植物叶片MAPK活性、JA/JA-Ile积累以及胰蛋白酶抑制剂（TPI）水平的变化。我们发现，一个快速的移动信号诱导水杨酸诱导的蛋白激酶（SIPK）的激活和JA/JA-Ile的积累，在某些，但不是所有，系统叶片N.Attenuata.，该信号的生产高度依赖于脂肪酸 - 氨基酸缀合物（FACS）M.Sexta.在喂食过程中引入伤口的口腔分泌物（OS）;此外，单独伤害或FACS都不能诱导系统叶中的升高的SIPK活动和JA / JA-ILE水平。使用TPI活动测定和叶片消融方法，我们证明TPI诱导的模式与系统诱导的SIPK和JA / JA-ILE不同，并且我们提出了另一个信号以类似的速度行进到几乎所有系统叶子以激活TPI生物合成。

模拟M.Sexta.草食病治疗诱导JA积累的特定空间和时间模式野生烟草系统叶

鉴于JA在调节植物对食草动物抗性中的核心作用，我们首先研究了模拟食草动物取食是否诱导系统性JA的产生。因为JA-Ile是JA和异亮氨酸的结合物，而不是JA本身，起着茉莉酸激素的作用[27[还确定了JA-ILE的浓度。略微细长的植物（高度约10厘米，图1.a） 在节点0处受伤[局部叶片；此后，叶0和叶X用于命名节点X处的叶（X代表节点号）]，这是第二片完全展开的叶，20μl的1/5稀释液M.Sexta.在伤口上涂抹OS（W + OS）模拟M.Sexta.食草动物。采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）法测定局部和全身叶片中JA和JA-Ile的含量。在处理叶片中，JA和JA-Ile水平在10分钟后增加，在处理后1小时达到最高水平，在诱导后2.5小时下降到几乎基本水平（图1）1.b） 是的。相比之下，系统叶中JA和JA-Ile的水平表现出非常明显的模式。JA几乎只在+3叶片中积累，在诱导后90分钟达到最高水平，而其他系统叶片中仅含有少量JA（图1）1.c） 是的。重要的是，叶片+3中的JA水平非常高：在W后90min + OS处理，JA含量达6μg^-1新鲜质量（FM）JA，其在当地叶子中检测到的最高JA水平的两倍多。JA-ILE的全身分布与JA的全身分布类似，但叶+3的最高水平不超过在局部叶片中检测到的最高水平，尽管在W + OS治疗后90分钟叶+3中的JA-ILE含量也是2-折叠大于本地叶子的折叠（图1.C）。为了确定系统性JA累积是否限于较小的叶子，我们引发了W + OS的叶子0，并在叶子-4（比引发叶老的4个位置较大的4个位置的Ja和Ja-Ile水平留给叶+4（最年轻的叶子）W + OS Elicitation后90分钟（图1.d）。再次，叶+3累积高JA水平（约6.5μgg^-1−3 -2和+2叶的JA含量均显著增加，分别为1、0.45和0.4 μg g^-1分别为FM（图1.d） 是的。值得注意的是，这些叶片积累了相对较高的JA-Ile：叶片−3含225纳克^-1FM，和叶+3一样（图1.d）。

因此，模拟M.Sexta.草食显著增加了JA在局部和系统叶片中的积累，但系统诱导的JA水平在不同叶片中呈现出不同的增加模式。

系统性JA累积需要伤口和FACS

在玉米叶子中，伤口只在立即损伤的遗传遗产中诱导JA积累，而昆虫菌株也在遥远组织中诱导JA积累[28］．以前的研究N.Attenuata.揭示了在模拟草本血症后，远端叶中的JA水平累积到局部最大值的少于10％[9],[23],[24[单独伤害后，检测到JA的增加[9］．为了深入了解系统叶片对机械伤害的反应，叶子0受到伤害，施加20μl水（W + W），并且在所有叶子中测定Ja和Ja-Ile累积。治疗后局部JA水平增加10分钟，达到高值30至90分钟（约550 ng g^-1FM），其显着小于W + OS Elicitation后检测到的FM;150分钟后，JA水平减少到几乎基础水平（图2.一种）。JA-ILE遵循JA图案，但在30分钟后累积到最高水平（137 ng g^-1FM）（图2.一种）。与W + OS相反，在处理后，W + W治疗不会导致任何系统叶中的任何系统叶中的JA和JA-ILE水平增加（图2.b） 其他检查时间（30、60和150分钟；这些数据未显示）。这些结果表明，全身JA的积累是OS依赖性的，单独的创伤对全身JA水平有不可检测的影响。FACs输入M.Sexta.已知操作系统是特定于操作系统的植物响应的eLitor，例如MAPK激活[3.]JA的爆发和防御代谢产物的积累[17],[29］．鉴于将OS应用于伤口（W + OS）诱导的系统性JA积累，我们接下来探讨了FACS是否负责这种全身反应。

二十个微升N-亚麻烯酰基-l - glu，其中最丰富的FACs之一M.Sexta.os [17]，浓度为27.6 ng/μl（类似于1/5稀释OS中的浓度），应用于新鲜伤口N.Attenuata.在治疗后90分钟收获叶0（W + FAC）和叶样品，当系统激素水平达到最高值时（图1.C）;并行地，我们将无菌OS应用于伤口（无论是无人间的OS）。在W + OS治疗后，局部和全身叶片的W + FAC诱导的JA和JA-ILE水平在很大程度上类似于那些（图2.c），并且类似于W + W，在局部组织中高度诱导的JA，但系统性JA仍然低于检测极限，表明FACS是必要的，以引发系统性JA（图2.d）。为了排除通过植物血管系统从局部向远端叶片运输FAC的可能性，因此诱导全身JA累积，将100μl的FAC溶液（27.6ng /μl）压在叶0中，并测量局部和全身（90分钟后留下+3）JA水平。FAC（0.05％TWEEN 20）的溶剂接种为对照处理，并未诱导局部或全身JA（数据未显示）。相反，FAC接种叶累积为4.6μgg^-1FM JA，W + FAC治疗后诱导JA水平的近3倍（图2.e）至关重要的是，Fac接种在系统叶子中没有诱发JA的强烈积累，与我们在W + OS处理的植物中看到的不同（图2.e）。

这些数据表明，FACs和伤害都是诱导JA在叶片远端积累的系统信号所必需的。

模拟草食治疗诱导全身叶子的MAPK活性

MAPKs是创伤或食草动物攻击诱导的信号级联的重要组成部分。在番茄中，损伤激活了MAPKs的局部和系统[18］．用碳化硅损伤烟叶可迅速提高其含量Wipk.(伤口诱导的蛋白激酶）系统叶片中的转录物，并切割烟草干燥系统地激活WIPK [19]. FACs是一种强的激发子，能增强创伤诱导的MAPK激活，增强JA的突入N.Attenuata.[3.],[17］．为了探讨这些组织中的MAPK活性是否相关系统，我们进行了一系列内凝胶MAPK活性测定。所有叶子的未出现植物中的基础SIPK活性相似地非常低（附加文件1.). 跟随W + 在0号叶片中诱导OS，SIPK活性局部和系统地增加，不同叶片中SIPK活性水平的分布与这些叶片中JA水平的分布非常相似（图1）3.a） 是的。沉默啜饮高度妥协草食诱导的JA积累[3.]这些数据表明SIPK活性可能也是系统JA诱导所必需的：SIPK活性在处理的局部叶片中最高，但在+3和+3叶片中约低50%−3和−2人的活动水平略高于对照组（另附文件）1.)．为了进一步了解系统激酶激活的调控，我们进行了一个时间过程实验，比较了局部和系统+3叶的激酶活性。在处理叶片中，SIPK活性在10 min内迅速增加，在30 min时达到峰值，直到诱导后90 min仍保持较高水平(图)3.b）。相比之下，未检测到叶子+3中的SiPK活性的增加，直至30分钟，并且在治疗后60分钟的瞬态非常瞬态（图3.b）。这种延迟的MAPK响应和随后的系统叶子中的JA累积可能反映移动信号从处理的叶子到远端的时间。

与JA水平缺乏缺乏，W + W没有增加全身性SIPK活动（图3.c） 是的。对SIPK活化动力学的更详细分析也表明，叶片+3中SIPK活性没有明显增加（图3）3.d）。

我们得出结论M.Sexta.草本植物，但没有伤害，移动信号从损坏的叶片迅速传播到特定的系统叶子以诱导MAPK信号，并且MAPKs的激活可能进一步触发JA生物合成。

胰蛋白酶抑制剂的系统诱导不需要增加MAPK活性或系统叶片JA含量

M.Sexta.攻击增加了级别TPI.成绩单和活动N.Attenuata.. 这种反应不仅局限于受攻击的叶片，而且会扩散到系统叶片[30],[31.］．TPI.表达依赖于JA信号转导COI1.- 和lox3.- 在JA感知和生产中有缺陷的植物具有很少的TPI活动，并且在W + OS elicitation之后不会累积TPI [32.],[33.]. 为了研究TPI在局部和系统叶片中的活性模式，并揭示其是否与MAPK激活和诱导JA/JA-Ile水平有关，我们用W + W和W + 诱导3d后，测定叶片局部和系统TPI活性。未经处理，幼叶的TPI水平最高，老叶的TPI活性很低（图1）4.). 伤后0叶、+2叶和+3叶的TPI活性增加，是对照的2-3倍。相比之下，W + OS处理诱导几乎所有叶片的TPI水平（图1）4.)．类似于W + W治疗，在局部叶子0和叶+2和+3中检测到最高值，其TPI活性水平是通过伤口诱导的TPI活性水平的两倍;尽管系统性叶子-3和-2中的W + OS诱导的JA-ILE水平相对较高，但是，尽管有相对较高的W + OS诱导的JA-ILE水平（图1.d） ，这些叶片仅表现出轻微的TPI活性（图1）4.)．

我们认为旧的叶子可能会降低JA委托后TPI的诱导性。为了响应茉莉酸盐诱导的不同叶片中TPI的诱导性，将茉莉酸甲酯施加到各个植物上的所有位置，并且TPI活性在3天后定量。TPI活动水平在最古老的叶子中最低 - 4，叶片中的更高增加，最小的叶子+4比叶子活动比叶子活动更多3.6倍（附加文件2.)证实JA诱导的TPI水平随着叶龄的增加而降低。

因此，不同于伤人，模拟M.Sexta.取食诱导了几乎所有叶片TPI活性的增加，但系统TPI活性在幼叶中增加更强烈。重要的是，具有高度诱导TPI活性的系统叶片不一定具有MAPK活性和JA含量的升高。

快速移动远程信号诱发系统防御反应

在W + OS诱导之后，系统叶中的MAPK活动，JA水平和TPI活性增加显示某些长距离信号从本地叶片传播到系统性，以激活这些响应。为了估计TPI诱导的系统信号从受伤的叶片出来的时间所需的时间，我们用W + OS处理叶子0，然后除去它们在处理后0,1,5和10分钟（通过从叶柄切除）;用W + OS处理的未经处理的植物和植物，其局部叶片被保留用于比较。在这些初步处理后三天，在系统叶中测量TPI活性（图5.a).立即切除处理过的叶片不会引起任何TPI活性的变化，同样，在1或5分钟切除受损叶片也很少引起系统性TPI(图)5.a).然而，当处理10 min后去除局部叶片时，系统叶片的TPI活性水平几乎完全升高，与保留处理叶片的植株相比(图)5.a） 是的。这些结果表明，系统性TPI诱导涉及到一个信号，该信号在5到10分钟之间离开受伤的叶片，并且假设叶柄长度约为3厘米，信号从处理过的叶片传播的速度约为0.3厘米/分钟。这些结果与早期的研究一致N.Attenuata.所示的情况下，在40秒内除去与W + OS治疗部位相邻的3mm宽的区域并未阻止剩余叶组织中的JA诱导[34.］．

为了调查触发MAPK激活和JA积聚从草食物受损的叶子的信号进行的速度快速，在治疗后在不同时间切除W + OS引发的叶子，并在JA含量达到90分钟后测量叶+3的JA积累最高值。单独的叶子切除没有增加全身的JA水平（图5.b），并在治疗后切除局部叶子10分钟导致JA含量增加30％;在治疗后，在叶子+3中几乎完全引发的JA水平，在治疗后，将当地的叶子切除15分钟（图5.b） 是的。同样地，叶+3来自于在W后10分钟局部叶被烧蚀的植物 + OS处理的SIPK活性水平与保留本地叶片的处理相似（图1）5.C）。似乎该信号的速度与激活全系统TPI的速度与信号的速度不是很大。

食草动物喂养不仅在当地袭击的叶子中诱导植物防御反应，也涉及到远端未损害的叶子中。植物如何规范这些防御响应仍然很清楚。在这里，我们证明了这一点M.Sexta.应用于伤口的OS引发MAPK活动和JA积累的系统诱导。我们的结果表明N.Attenuata.通过感知穿透伤口的FACs并在未受损的系统叶片中部署特定的反应，包括MAPK激活、JA积累以及随后增加的TPI活性，能够识别草食动物的取食。

食草但不伤人会引起早期的全身反应

研究N塔巴库姆莲座期植株的叶序为3/8，伸长期植株的茎序为5/13[35.]-[37.］．因此，在本研究中分析的全身叶片并不直接与处理的叶子连接，但在特定的角度距离中成长导致不同的分布血管阻力水平[30],[38.]. 尤其是在茎相对较短的情况下，由于血管阻力往往大于轴向阻力[38.]，处理叶片与系统叶片之间的角距离可能显著影响系统信号。在番茄中，系统TPI积累的强度与叶片间和叶片内的维管连锁程度相关[39.],[40］．水杨酸的转运也是如此N塔巴库姆[41.］．我们在叶子+3中检测到最高的JA水平，与叶子-3在节点0处的叶子 - 叶片的最小角度距离（45度）（图1.A和D）。还留下+2和-2，偏移约90度到节点0，在W + OS后90分钟显着增加了（图1.d）。相比之下，叶+1和-1具有约135度，+4和-4叶具有大约180度的叶子，局部叶子甚至没有显示出浓缩后150分钟的JA水平（图1.C）。显然，局部和全身叶片之间的角距离在确定这些叶子中的JA水平和引发的JA含量随着角度而减小的重要性。

进行了几项研究N.Attenuata.仅透露仅次要的系统性JA浓度，约占局部诱导的JA水平的5-10％[9],[23],[24],[42.]. 然而，我们的综合分析表明，系统反应取决于叶位和处理后的时间。此外，在拟南芥和Solanum nigrum.，系统性JA水平也增加到当地值的10％[21],[22],[43.]，暗示系统性防御信令可能是特定的物种。有人发现N.Attenuata.系统叶片-1在模拟后没有升高的SIPK活动M.Sexta.将草药治疗应用于叶+1 [3.];然而，这项综合研究指出，在W + OS治疗后，一些系统叶子确实具有高度升高的SIPK活动，并且应该更新先前提出的模型。

两条证据支持这一概念，即系统性JA水平的高度高度升高，不太可能从受损的叶片运输到系统性叶片，但JA是德诺维在全身叶子中合成：首先，W + OS诱导的叶子+3中的JA水平甚至超过了本地叶子的水平。其次，我们的叶片消融实验表明，局部诱导后10分钟，全身信号留下了处理的叶片，并且在此时间点W + W和W + OS处理引发了当地叶子中的类似JA（图1.乐队2.a） 但只有W + OS诱导全身JA积聚。这些发现也得到了本研究的支持N.Attenuata.和ra raidopsis是ja-ile和meja德诺维在全身叶子中合成，没有从受伤的叶子运输[9],[22],[23］．

在拟南芥，损伤足以提高全身JA水平[21],[22]，但在Zea Mays，Solanum nigrum， 和N.Attenuata.，单独伤人诱导JA积累在相邻的损伤部位，而昆虫菌诱导JA在远处组织中的积累[9],[28],[44.］．类似地，在一些植物物种中报道了伤口后的全身MAPK活化，包括大豆，番茄和烟草[18],[19],[45.];但是单独伤害未能诱导系统性MAPK活动N.Attenuata.(本研究)。通过在伤口中添加FACs和从OS中移除FACs，我们发现FACs是系统性JA反应的诱导因子;然而，FACs本身似乎不是系统信号，因为1)FACs进入植物组织后迅速降解[44.2）将FACS接种到局部组织中并未引发远端叶子的JA反应（图2.e）。FACS需要伤害激活全身JA累积的原因仍然是未知的，但是有可能在机械破碎的血管组织中有效地加载FACS的伤口是必要的。在渗透期间，FACS可以保留在置剂杆中，并且不能被运输到全身叶子。可放射可追踪的FACS可用于阐明FAC是否可以运输到系统叶子。

这些发现有力地表明，一个快速的移动信号，这是由FACs引起的穿透伤口，而不是单独的伤害，激活SIPK，然后，SIPK激活JA生物合成系统叶片。

草食病，但没有伤害，强烈激活晚期全身反应，TPI积累

我们发现，与SIPK和JA仅在特定的系统叶中被激活不同，模拟草食诱导了TPI在所有被测系统叶中的积累，但伤害只提高了系统叶片+2和+3的TPI水平。早期（SIPK和JA）和晚期（TPI）反应的不同分布表明，触发系统TPI积累的信号可能不同于激活SIPK和启动JA生物合成的信号，系统性增加的JA水平对TPI活性的升高并不重要。另外，具有非常显著的JA积累（和MAPK活性）的系统叶+3可以通过诱导叶序位置接近的叶片和其他远端叶片在整个植株中作为茉莉酸分布的“枢纽”。此外，不能排除TPI蛋白本身在整个植株内重新分布，因此在没有JA诱导的情况下也在叶片中积累。应进一步审查这些可能性。

系统性SIPK和JA的空间分布的生物学意义尚不清楚。我们假设某些防御反应，如萜类，其中一些已知具有间接防御功能[46.[这些信号传导因子的下游还专门安装在这些全身叶片中，此外，SiPK和JA的全身激活也可以诱导植物的其他部位的传式信号，以进一步繁殖或加强全身防御（代谢物）。

在番茄中，JA生产和感知缺陷的突变体的接枝表明，全身TPI的诱导需要在伤害部位的茉莉酸生物合成和在全身叶片中感知茉莉酸群岛信号，但是全身叶子和JA中的JA生物合成在本地的感知对系统TPI诱导并不重要[47.],[48.]. 我们的叶片消融实验表明，在W + 局部叶的OS处理几乎完全诱导了系统叶TPI活性；此外，在10min内，局部JA水平仅升高到最高JA水平的10%左右，而W + W和W + OS处理过的叶子（图1.乐队5.b).因此，这些数据表明，局部叶片诱导的JA水平并不直接参与控制系统TPI的积累。我们认为，FACs诱导的信号被转运到系统叶片中，并与JA信号一起(而不是JA的生物合成)诱导TPI的产生。这一有趣的观察显然值得更多的关注。

移动信号的性质

一些研究表明，液压或电信号参与系统信号[22],[49.]-[52.］．鉴于我们的治疗方法W + W和W + OS可能会对系统组织产生类似的液压压力，可以排除液压是唯一移动信号的假设。在利马豆（phopololus lunatus.），FACS，但单独伤害，特别是诱导细胞膜极化的变化[53.］．拟南芥的最近数据表明，伤口激活表面电位变化和实验电流注入叶片导致JA生物合成和转录组变化的激活[54.］．检查表面潜力的变化是有价值的N.Attenuata.在地方和全身叶子。在N.Attenuata.诱导系统SIPK和JA积累的信号以0.3cm/min左右的速率离开处理叶片；在拟南芥中，诱导JA-Ile在系统叶中积累的移动信号的速度约为2cm/min[22];相比之下，在Solanum nigrum.，诱导系统防御化合物亮氨酸氨基肽酶的移动信号需要更长的时间- 90 - 240min才能离开局部叶子[44.］．阐明不同物种的移动信号的本质也将阐明这些信号传输速度的巨大变化。

除TPIs外，尼古丁和萜烯衍生的挥发物也是重要的植物诱导系统防御系统N.Attenuata.[55.]-[57.]. 考虑到不同的移动信号很可能诱导JA（和SIPK的激活）和TPI的系统性累积，可能其他类型的移动信号负责激活其他系统性防御；例如，最近发现N.Attenuata.JA感知和合成对于伤害引起的重要性是重要的putrescine甲基转移酶根中的转录水平和运输德诺维合成的尼古丁叶片，暗示根尼古丁的调节由不同于控制系统TPI的途径调节[58.]. 转录组重排和代谢物积累也在其他物种的系统叶中观察到，如拟南芥、番茄、杨树和大豆[6.],[22],[59.],[60.]. 这些可传递信号的身份，是相似的还是种特异性的，它们是如何运输和发挥作用的，重要的是，系统防御的生态功能都是非常有趣的问题。

本研究全面地展示了植物如何在多个水平上响应叶草食，包括当地和全身叶片中的信号和防御性代谢物积累，并突出了昆虫衍生的植物系统防御中的重要性。

植物生长和样品治疗

野生烟草托尔。前W.（最初从DI RANCH，Santa Clara，UT）（Solanaceae）种子来自秃头实验室中维护的自交系，并且种子可以通过I.T分发。Paldwin，Max Planck化学生态研究所，可应要求。优惠券标本N.Attenuata.可以在康奈尔大学植物标本馆（1989，i.t.Baldwin）访问。

种子萌发和植物培养遵循Krügel等人[61.］．种子在培养皿中发芽以使其发芽同步，并且在10天后将幼苗转移到土壤中。四到5周龄植物用于所有实验。

收集M.Sexta.口腔分泌物（OS），M.Sexta.幼虫被饲养在N.Attenuata.植物直到第三到第五龄。如Roda等人所述，OS收集在冰上.[62]储存在氮气中−20摄氏度。在模拟除草处理中，用花纹轮将0处的叶片打伤，并立即将1/5稀释的OS涂在每个打伤的叶片上（W + 操作系统）；在伤后处理中，用花纹轮将叶片打伤，每片叶片涂20μl水（W + W） 是的。茉莉酸甲酯溶于7.5mg/ml的热液化羊毛脂中；将20μl得到的羊毛脂糊剂涂在叶子底部，并将纯羊毛脂作为对照。工厂(N-linolenoyl-l-glu）在内部合成[17]，其以27.6ng /μl的浓度溶解在0.05％吐温20中（与1/5稀释的OS中类似）。通过通过填充琥珀溶液IRA-400树脂（Sigma-Aldrich）的旋柱通过OS四次来制备无参数型操作系统。17］．将二十个微升每种试验溶液施加到每个叶子上。特定时间后，切除叶片，立即在液氮中冷冻，并在-80℃下储存直至使用。

JA和JA-ILE浓度分析

一毫升乙酸乙酯中加入200 ng D_2.-JA和40 ng¹³C_6.-将JA-Ile分别作为JA和JA-Ile的内标添加到每个短暂粉碎的叶片样品中（~150 mg）。然后在FastPrep均质器（热电电子）上研磨样品。在4℃下以13000 g离心10 min后，将上清液转移到新鲜试管中并在真空浓缩器（Eppendorf）上蒸发至干燥。将每个残余物重新悬浮在0.5 ml 70%甲醇（v/v）中，并在4°C下以13000 g离心15分钟以去除颗粒。上清液在HPLC-MS/MS（LCMS8040，岛津）上分析。

凝胶内激酶活性测定

从4个复制叶片收集的叶组织在液氮和200μl蛋白质提取缓冲液（100 mM HEPES，pH 7.5，5 mM EDTA，5 mM EGTA，10 mM Na）中粉碎_3.vo._4.加入10mM NAF，50mMβ-甘油磷酸，1mM苯基甲基磺酰基，10％甘油和EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche诊断）]加入到100mg组织中。然后通过涡旋完全悬浮叶组织。在最大速度下在4℃下离心20分钟后，将上清液转移到新鲜的管中。使用牛血清白蛋白作为标准的Bio-rad蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度。Zhang＆Klessig后，凝胶地图活动测定进行了[63]以髓鞘碱性蛋白（MBP）为底物。凝胶图像是在FLA-3000荧光成像系统（Fujifilm）上获得的。

TPI活动分析

用Van Dam等人描述的径向扩散测定分析TPI活性.[31.］．

支持数据的可用性

支持本文结果的数据集包含在文章及其附加文件中。

我们感谢Mario Kallenbach博士合成Facs。这项工作得到了中国科学院战略优先研究方案资助的，XDB11050200，最大普朗克社会，云南人才招聘计划的批准（授予2012HA016），以及1000名年轻人才招聘。

隶属关系

1. 中国科学院昆明植物园研究所，昆明，650201

   基督教海湾豪森＆建强吴

2. 马克斯普朗克化学生态学研究所，汉斯克诺尔大街8号，耶拿，07745，德国

   Maria Heinrich＆Ian T Baldwin

通讯作者

对应于吴建强.

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

CH、MH和JW参与了研究的设计。CH和MH进行了实验工作，并对数据进行了分析。CH，ITB和JW写了手稿。所有作者都阅读并批准了最后的手稿。

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