patatin相关磷脂酶plaii δ影响生长素应答细胞形态和器官大小拟南芥和芸苔属植物显著

背景

patin相关磷脂酶亚家族III (pPLAIIIs)的成员与生长素反应有关。然而，目前尚不清楚这些基因是否以及如何影响植物和细胞的形态发生。在这里，我们研究了patin相关磷脂酶plaiiδ在生长素应答细胞形态和器官大小中的作用拟南芥和芸苔属植物显著。

结果

我们展示了过度表达pPLAIIIδ对大部分器官的纵向生长有抑制作用，但对横向生长有促进作用拟南芥和芸苔属植物显著。与野生型植物相比，pPLAIIIδ-KO植株下胚轴细胞伸长增强pPLAIIIδ-OE植株下胚轴径向细胞生长变宽，叶片铺装细胞极性降低。为下胚轴表型pPLAIIIδ突变体，类似于乙烯的“三重反应”，我们检查了表达ACS和华参与乙烯生物合成的基因发现ACS4和ACS5在两个OE系中，与WT植株相比，平均上调2.5倍。内源生长素在植物体内的分布受到干扰pPLAIIIδ表达式。pPLAIIIδ-OE和KO植株在光照和黑暗条件下对吲哚-3-乙酸促进下胚轴伸长的敏感性不同。生长素诱导基因在黑暗环境下的表达分析表明，1 μM IAA处理12 h后，OE植株对生长素的响应高于WT和KO植株。光照条件下，10 μM IAA处理30 min后，两个OE植株的早期生长素诱导基因显著上调。

结论

这些数据表明PLAIIIδ基因通过参与植物生长素分布的调控，在细胞形态和器官大小方面发挥着重要作用。

基于序列相似性，patatin相关磷脂酶A蛋白可分为三个亚家族:pPLAI、pPLAII (α、β、γ、δ、ε)和pPLAIII (α、β、γ、δ)。1]。这组酶水解磷脂和半乳糖脂[2]。的植物pPLAIII亚家族与其他与patatin相关的磷脂酶在几个方面不同，包括与进化过程中内含子丢失相关的内含子/外显子结构，酯酶盒(GXGXG)的改变，以及pPLAI中缺乏富亮氨酸重复序列(LRR)基序[1]。

植物pPLAIII蛋白通过产生各种脂肪酸和溶血磷脂参与信号转导、膜重塑和脂质代谢。溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)通过增强细胞膜稳定性延缓番茄果实成熟和叶片衰老[j]。3.]。游离脂肪酸和/或溶血磷脂可能是西葫芦生长素信号转导的第二信使[j]。4]。治疗的拟南芥游离脂肪酸18:2和18:3或LPE和溶血磷脂酰胆碱(LPC)抑制生长素调节的初生根生长[5]。完整细胞中LPC的产生可以快速激活H⁺-泵，促进生长素诱导的玉米胚芽伸长[6]。溶血磷脂酸(LPA)刺激磷脂酶D (PLD)的激活产生PA，已被确定为病原体感染、干旱、盐度、伤害和冷胁迫过程中的重要信号分子[qh]7]。

pPLAIII蛋白可能在激素介导的植物器官发育中发挥重要作用。所有四个基因pPLAIII亚家族(α， β， γ， δ)已被证明可被生长素激活[8]。功能获得突变体(坚固的)pPLAIIIδ表现出更硬的花茎，更厚的叶子和更大的种子[5]，[9]。激素相关的表型在根生长、下胚轴光形态发生、侧根起始和根毛发育中也被观察到pPLAIIIδ- - -pPLAIIIβ-敲除突变体[5]，[8]。研究pPLAIIIβ认为这些异常器官可能是突变体细胞形状改变的结果[5]。

在植物中，细胞形状的控制依赖于细胞极化扩增，这依赖于通过细胞骨架动力学和囊泡运输建立和维持细胞内极性信号[10]。生长素作为一种主要的调控因子，对柔性细胞的形态发生具有直接和间接的多效性[j]。11]，[12]。生长素极性运输系统的功能依赖于生长素外排载体PIN- formed (PIN)蛋白的定向细胞定位[13]，生长素内流载体AUX1/ like -生长素(AUX1/LAX)蛋白[14]和atp依赖性多药耐药/ p -糖蛋白(MDR/PGP)型ABC转运体[15]。pin的囊泡运输、磷酸化和去磷酸化导致它们在不同细胞类型中的亚细胞分布不同[16]，如PIN1在茎和根的基部定位，PIN2在根表皮细胞的顶端定位，PIN3在茎内胚层细胞的侧极性[17]-[19]。pin的不同亚细胞定位引导生长素流动导致细胞多向生长[20.]。各种激素信号的整合发生在各种细胞类型的细胞形成过程中。乙烯被认为是调解根毛伸长过程中独脚金内酯和生长素通路的交叉连接[21]。在ACC治疗下，aPIN3功能丧失突变体对ACC下胚轴伸长的反应强烈减弱[22]。生长素和细胞分裂素信号通过ROP gtpase依赖途径在协调叶铺面细胞间指状格局的形成方面具有相反的作用[j]。23]。然而，调控这些表型形成的机制在pPLAIII变种人还有待确定。

在此，我们通过对pplaii δ在植物发育中的作用进行了研究pPLAIIIδ丧失功能和获得功能的突变体。的改变表达pPLAIIIδ通过改变细胞的扩张和伸长来影响植物的生长和大小。这种表型变化与脂质谱的改变同时发生。因此，我们的数据表明pPLAIIIδ该基因在植物器官的生长发育、细胞形态发生和生长素信号转导等方面起着重要作用拟南芥它的近亲芸苔属植物显著。

的时空表现模式pPLAIIIδ

我们之前的研究表明pPLAIIIδ基因在各种组织中表达[5]。为了进一步了解如何pPLAIIIδ表达可能影响植物各器官的生长发育，独立存在拟南芥转化株的pPLAIIIδ：：格斯植物在整个植物发育过程中产生和检查。在早期阶段，幼苗中观察到GUS染色，特别是在根中(图2)1A-C, E)，下胚轴(放大图像见图1B)、叶片维管组织和茎尖分生组织(图2)1a - c)。GUS染色在花期逐渐减弱(图2)1D).主根尖端的横截面显示pPLAIIIδ在表皮、内胚层和中柱鞘细胞中特异性表达(图1F)，发育中的侧根显示强烈的GUS染色(图2)1G和H)。这些资料与genevinvestigator提供的微阵列数据一致(见附加文件)1）.开放的花朵(图1授粉48 h后，胚珠、气门、隔和柱头染色呈阳性(图2)1J).在发展的过程中，pPLAIIIδ主要表达于维管束，以及中隔、内果皮、中果皮和外果皮(图1K)，成熟叶柄除被毛和叶柄与花梗的连接点外，无明显染色(图2)1L,箭头)。定量PCR结果显示pPLAIIIδ根中的表达量显著高于叶、茎、花、茎和种子(见附加文件)1）.这些发现表明，pPLAIIIδ在植物器官的发育和生长过程中，该基因在各种组织中表达，并在发育早期的年轻组织中优先表达。这一结果与之前的实时分析一致pPLAIIIδ(5]。此外，我们对初代根和侧根中柱鞘细胞GUS染色的研究结果表明，plaiiδ可能在侧根发育中起作用。

的改变表达pPLAIIIδ影响植物的生长和大小拟南芥和芸苔属植物显著

研究了pplaii δ对植物生长发育的影响拟南芥基因敲除突变体pPLAIIIδ(KO)，两个独立的具有功能获得突变的细胞系pPLAIIIδ(OE线)，和互补线的pPLAIIIδ-KO (COM)观察形态学变化。与野生型植株(WT)相比，KO系在土壤中生长30天后植株大小没有差异，但所有OE系的生长在其整个生命周期中都受到抑制，莲座叶越来越少，越来越小(图2)2A和B)。由于节间缩短，8周龄的OE植株比WT和KO植株短约25%，导致植株茂密，但茎叶数量与WT相近(图2)2C,表1）.组织学观察显示，两种OE系茎直径的增加主要是由于髓细胞和束间细胞的增大(图2)2D). OE植物的花器官也更短，硅片更短，种子排列更密集，胚珠流产更多(图2)2E和F，表2）.总的来说，过度表达pPLAIIIδ抑制大部分器官的纵向生长，但促进其横向扩张。

为了证实pplaii δ对植物器官生长发育的影响，我们进行了过表达pPLAIIIδ公元572年，a芸苔属植物显著品种。4个独立的转基因株系(BnOE1 ~ BnOE4)表现出与转基因株系相似的形态变化拟南芥OE线(图3.显示了花器官和器官的变化)，证实了pplaiiδ在调节植物器官的生长发育中起着关键作用。

过度的pPLAIIIδ导致细胞极性生长缺陷

的下胚轴pPLAIIIδ-KO植株长15.6%pPLAIIIδ-OE系比WT系短23.5%(图2)4C)。WT与COM的下胚轴长度无明显差异(图2)4OE下胚轴的表皮、内胚层细胞和皮质细胞呈放射状扩张(图2)4B)。WT、KO、OE和COM的下胚轴表皮细胞数量相似(约为20个)4此外，与WT相比，KO组毛细胞分支长12.5%，OE组短44%(图2)4B和C)。

在WT系和KO系的叶片铺装细胞中都观察到典型的连锁拼图形状，但OE系的叶片铺装细胞发育较少的裂片和压痕，导致较少卷曲的叶表皮(图1)5A，正面和背面面板)。在WT和KO叶片的纵切面上，细长的栅栏状叶肉细胞在叶片正面紧密排列;圆形海绵状叶肉细胞松散地排列在背面。相比之下，OE植物的所有细胞都趋向于圆形，组织紧密，导致缺乏正面-背面极性(图2)5A，比较第三列中的面板)。

根据圆度和骨架端点的反比线性关系测量圆度、骨架端点和平均极性评分(APS)(见附加文件)2）.在WT, KO和OE植物中，沿纵轴的细胞长度没有显着差异(图2)5然而，OE株系的骨架端点(3.01)明显低于WT(10.99)和KO(11.24)株系，而OE株系的平均圆度(0.54)高于WT(0.24)和KO(0.25)株系(图2)5与WT(0.69)和KO(0.71)系相比，OE系的APS值(<0.27)较低，说明叶片表皮铺层细胞极性存在缺陷(图1)5E)。OE植物表皮铺路细胞颈变宽、叶变短表明，压痕区径向细胞扩张增强和叶伸展不足都是铺路细胞变形的原因(图5)5综上所述，这些数据表明情况发生了变化pPLAIIIδ表达影响细胞生长的极性。

OverexpressingpPLAIIIδ上调乙烯生物合成相关基因的表达

由于OE系中观察到的抑制下胚轴伸长类似于与乙烯相关的“三重反应”表型[24]，我们检测了参与乙烯生物合成限速步骤的关键基因的表达pPLAIIIδ-OE线[25]。这些基因包括五种ACS(1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶)基因华(1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶)基因RSA1(根系结构1)，其编码具有1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶活性的蛋白质XBAT32(XB3正交2英寸拟南芥)，介导ACS的降解。五个中的两个ACSS和…一样RSA1和XBAT32在幼苗中检测不到，而ACO2和ACO4在株系之间没有明显的差异(图6）.相反，的表达ACS4和ACS5在两个OE系中，与WT植株相比，平均上调2.5倍(图6)，表明OE植物中乙烯生物合成途径可能上调。

改变pPLAIIIδ表达改变了内源性生长素的分布

追踪生长素在变异系中的分布pPLAIIIδ表情,独立DR5:格斯在WT、KO和OE遗传背景下产生的植株。下胚轴GUS染色在WT、KO和OE系之间没有明显差异(图2)7A)。然而，与WT和KO植株相比，OE株系叶片上的GUS染色更强烈，分布更广(图2)7A)，提示生长素的分布受到pPLAIIIδ。

进一步研究了完整幼苗游离IAA含量。对WT、KO和OE1植株进行全苗评估时，观察到的游离IAA含量没有差异(图2)7B).然而，当分别测定植株地上部分和根系的游离IAA含量时，与WT植株相比，KO植株和OE1植株的游离IAA含量在两个组织中呈现相反的趋势:OE1植株的地上部分游离IAA含量较高，KO植株的含量较低;相反，OE1植株根系中游离IAA含量降低，KO植株根系中游离IAA含量升高(图2)7B).综合来看，我们的数据表明改变了pPLAIIIδ表达可以改变内源性生长素的分布。

的反应pPLAIIIδ对外源性IAA的诱导

据报道，生长素同时调控ROP2-actin和ROP6-MT通路，导致叶表皮细胞极化生长[26]，而生长素、乙烯和光的协调控制下胚轴的生长[22]。为了探讨plaii δ在生长素调控的极化细胞生长中的可能作用，我们分析了pplaii δ的启动子序列pPLAIIIδ。大约25%的调控元件基元被发现参与激素反应，包括4种生长素响应元件(见附加文件)3.和4）.这种调控模式在其启动子中，连同生长素的反应pPLAIIIδ(见附加文件)5)，表明KO和OE细胞系的细胞变形可能与生长素的响应有关pPLAIIIδ。为了验证这一假设，我们检测了转基因植物的GUS活性pPLAIIIδ::格斯当IAA浓度在0 ~ 1000 μM范围内处理48 h时，GUS活性在下胚轴、子叶和初生根中受到抑制，但在侧根起始区呈剂量依赖性增强(图2)8A)。随着IAA进一步增大(>10 μm)，pPLAIIIδ在所有组织中表达均被抑制(图2)8A). qPCR基因表达分析显示pPLAIIIδ随着外源IAA在光照下的增加，地上组织中8B)。

为了验证生长素在KO和OE株系下胚轴形态发生中的作用，我们比较了WT、KO和OE株系在不同外源IAA (0 ~ 10 μM)处理下的下胚轴伸长率。外源IAA处理在所有WT、KO和OE植株中均增强了下胚轴伸长，但这些品系对外源IAA刺激的下胚轴伸长的敏感性各不相同(图2)8B).与对照(0 μM IAA)相比，1 μM IAA处理下KO、WT和OE植株的下胚轴长度分别增加了1.7%、9.5%和28.1%;10 μM IAA处理下，KO、WT和OE1的下胚轴长度分别增加了11.7%、39.2%和59%(图2)8B)。

为了排除光照对生长素反应的可能影响，我们比较了黑暗生长2 d的幼苗在黑暗中对不同IAA处理超过12 h的下胚轴伸长。在地上部分，范围为pPLAIIIδ低浓度IAA处理(1 μM和10 μM)抑制表达，高浓度IAA处理(100 μM和1000 μM)抑制表达pPLAIIIδ明显(图8C). qPCR基因表达分析证实GUS染色结果:表达pPLAIIIδ1 μM和10 μM IAA处理不显著影响pPLAIIIδ在高浓度IAA处理(100 μM和1000 μM)下，细胞凋亡率下降了50%(图8D)。以上结果表明，外源IAA处理下，WT和KO植株的下胚轴伸长受到抑制，且在1 μM IAA处理下，这种抑制在KO植株中尤为明显(图2)8综上所述，在光照条件下，当IAA浓度从1 μM增加到10 μM时，KO、WT和OE1植株下胚轴长度的差异逐渐减小，而在光照条件下，IAA浓度为1 μM时，不同株系间下胚轴伸长率的差异被逆转。

接下来，我们通过分析生长素激活基因在1 μM IAA暗处理下的表达来监测不同植物品系对生长素的反应。三组生长素反应基因国际宇航科学院的基因,阿富汗二月基因和销基因也是如此GH3.5研究了WT、KO和OE1植物对生长素的不同反应。在1 μM IAA处理下，阿富汗二月基因和GH3.5没有表现出明显的变化，而三国际宇航科学院基因在KO植物中的生长素反应减弱，而在OE1植物中的生长素反应增强，其中OE1的表达量比WT高3倍IAA2被检测到。5个PIN基因在不同植物品系中的表达也有类似的趋势:在1 μM IAA暗处理下，5个PIN基因的转录水平升高平快和PIN7在OE1中，植株的表达量增加了2倍，而WT和KO没有显著差异(图2)9）.

Labusch等人检测到生长素反应减弱pPLAIIIδ失去功能的突变体，但唯一观察到的生长素敏感表型是对根生长[8]。为了进一步验证OE系对生长素的响应是否增强，我们研究了生长素诱导基因对10 μM IAA处理30 min的响应。在8个早期生长素诱导基因中，IAA2，IAA11，SAUR9，SAUR23，SAUR28,GH3.5在OE1和/或OE2植物中显著上调(图10）.IAA2，IAA11，SAUR9,GH3.5在以前的报道中，它们对植物生长素的刺激反应较弱pPLAIIIδ突变体(8]。的阿富汗二月9号基因平均上调17倍，而相应的WT植株平均上调6倍(图2)10）.

为了确定外源生长素处理下生长素极性运输的变化，我们进一步分析了销基因。与之前的研究一致，PIN1和PIN3被上调，而平快在10 μM IAA处理下，30分钟内显著下调60%PIN6也增加了大约2倍。与野生型植株相比，PIN3在两条OE线中显著增加(图2)10)，提示生长素引起的反应改变pPLAIIIδ表达可能导致生长素极性运输的紊乱。因此，这些数据清楚地表明，pplaii δ正调控生长素反应。

改变pPLAIIIδ表达显著改变PA含量

为了更好地了解pplaii δ对细胞脂质组的影响，我们分析了膜磷脂和半乳磷脂的类别。主要的细胞磷脂包括PC、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)。与WT相比，KO突变体叶片中PE、PI、PS和PA的含量分别降低了6%、9%、14%和27%(图2)11）.OE突变体叶片中PC、PA和PG的含量分别比WT高35%、118%和35%。叶绿体中主要的细胞脂质是单半乳糖二酰基甘油(MGDG)和双半乳糖二酰基甘油(DGDG)。与WT相比，KO突变体的MGDG和DGDG水平分别降低了10%和14%(图2)11）.这些细胞脂质的分子种水平在KO突变体中趋于较低，在OE突变体中趋于较高，其中PA含量是受改变影响最大的分子种pPLAIIIδ表达式。

PA主要通过PLD-或磷脂酶C (PLC)-二酰基甘油激酶(DGK)途径产生。探讨植物PA含量变化的潜在调控机制pPLAIIIδ表达式，我们分析了的表达式骑士和PLC)基因。在12人中骑士其中11个基因在WT、KO和OE株系间转录水平无显著变化骑士β2在幼苗中检测不到。12个PLC)检测到的基因包括所有9个磷酸肌醇特异性磷脂酶基因(PI-PLC)和3个非特异性磷脂酶基因(全国人大）.9 .虽然表达量较低PI-PLCs在KO植物中观察到，而在OE系中检测到这些基因的较高表达，差异无统计学意义(见附加文件6）.因此，我们排除了PLD-或PLC-DGK通路可能受到改变影响的可能性pPLAIIIδ突变体在转录水平表达以产生更多的PA。

改变pPLAIIIδ表达导致不同的生长素反应表型

我们对KO和OE植物生长发育的表型、细胞学和分子分析为plaiiδ参与细胞形态发生提供了强有力的证据4和5）.观察到类似的形态变化后，改变pPLAIIIδ表达pPLAIIIβ突变体(5表明这些基因在一定程度上存在冗余功能。这些形态变化类似于先前研究中记录的生长素在不同器官中调节的变化，包括硅片的变化[27]，节间[28]，下胚轴[11]，[29]、花器官[30.]和叶形[31]，[32]。生长素对植物生长发育的多效性作用可归因于生长素对细胞分裂和/或细胞形态发生的调节[j]。33]。考虑生长素在下胚轴形态发生中的主导作用[29]，我们比较了WT、KO、OE和COM植物的下胚轴表皮细胞数量。所有植物系沿下胚轴长轴约有20个细胞(图2)4C)，这与以前的研究一致[34]。基于这一结果，KO和OE植物的下胚轴的不同表型不太可能归因于细胞分裂。此外，在KO和OE的下胚轴表皮细胞中观察到的极化细胞形态发生缺陷为这种改变提供了确凿的证据pPLAIIIδ表达诱导极化细胞形态的改变，导致在KO和OE植物的下胚轴中观察到的表型(图2)4A和B)。

其他研究人员报道了NAA刺激对主根生长的抑制和侧根密度的升高pPLAIIIδ功能丧失突变体[8]。在本研究中，当pPLAIIIδGUS染色观察表达情况;pPLAIIIδ主要存在于初生根组织的中柱鞘细胞中(图1F)，据报道，在生长素的调控下，侧根的起始和发育过程中，它们会去分化并增殖形成侧根原基[35]，[36]。此外，外源IAA处理(1 μM和10 μM)不仅抑制了主根中的GUS染色，而且改变了其分布，侧根原基中出现了强烈的GUS活性(图2)8A)，表明plaii δ参与生长素调控的侧根发育。

plaii δ参与生长素依赖性极化细胞生长

抑制下胚轴伸长是乙烯反应的诊断标志，它使下胚轴的纵向生长向径向方向改变，类似于光生长的OE植物中观察到的情况[24)(图4）.我们的实时分析显示ACS4和ACS5OE幼苗幼龄组织中的基因显著上调(图2)6）.的表达已被证明ACS4和ACS5与乙烯产量呈正相关[25]，[37]。ACC生物合成的增强已被证明发生在pPLAIIIδoe线。我们进一步发现外源性乙烯利处理不影响pPLAIIIδ乙烯利处理并没有降低KO植株和OE植株的下胚轴伸长率(见附加文件)7）.因此，pplaii δ对下胚轴伸长的影响可能并不完全归因于乙烯产量的增加。

下胚轴的光形态形成在很大程度上与生长素和乙烯的作用有关[22]。生长素可以刺激ACC合成酶基因的表达[38]，[39]。考虑到生长素和乙烯利处理对KO和OE植物下胚轴伸长率的不同影响，我们推断生长素更有可能抑制OE植物下胚轴伸长和激活ACC生物合成。在本研究中，完整WT、KO和OE1幼苗中检测到的总游离IAA浓度没有明显差异，说明对这些植物生长素的生物合成没有影响(图2)7B)。然而，与WT和KO植株相比，OE植株的地上组织中检测到强烈的GUS染色和更高的游离IAA含量(图2)7A和B)，表明生长素在OE植物中的分布发生了显著变化。综上所述，这些数据表明OE植物下胚轴伸长的抑制与生长素运输的改变有关，而不是与生长素的生物合成有关。

我们的数据也显示了改变pPLAIIIδ表达影响叶片铺装细胞的极性(图2)5）.据报道，两个相互拮抗的信号通路ROP2-actin和ROP6-MT通路调节叶片路面细胞的发育，这两个通路的缺陷导致叶片路面细胞生长过程中的极性缺陷[20.]，[31]，[32]，[40]，与OE植物的表型相似(图2)5）.最近有报道称，生长素通过ABP1(生长素结合蛋白1)调控ROP2-actin和ROP6-MT途径，参与叶片路面细胞的极化生长，这取决于游离IAA沿叶片形成基本增加的纵向梯度[j]。11]。在叶片基部，较高的游离IAA水平伴随着较低的ABP1水平，表现出较低的生长素亲和力，促进细胞分裂。相反，游离IAA水平相对较低，同时较高转化在叶尖的表达表明生长素具有较高的亲和性，导致细胞极化生长。ABP1作为一种生长素受体，感知到统一浓度的生长素，激活拮抗的ROP2-actin和ROP6-MT通路，分别在叶片路面细胞的不同部位指导裂片和凹痕的形成[qh]26]，[41]。在本研究中，结果DR5:格斯染色和游离IAA含量测定显示，地上组织游离IAA浓度显著升高，证实了生长素分布受到干扰(图2)7A和B)。鉴于本研究在OE植物中观察到的叶片铺面细胞极性生长缺陷与在植物中观察到的相似转化突变体(12]，很可能是OE植物叶片铺面细胞中生长素的异常分布，扰乱了游离IAA沿叶片纵向梯度基本增大的形成，从而导致间指缺陷。

pPLAIIIδ参与植物生长素反应的调控吗

我们的研究结果显示生长素响应GUS活性pPLAIIIδ::格斯-明暗两种情况下的变压器(图18A和C)以及生长素响应元件的类型pPLAIIIδ启动子(参见附加文件)3.和4)，表明pPLAIIIδ很可能是生长素反应基因。我们的基因表达分析显示有轻微的生长素反应表达pPLAIIIδ(图8B及D)，与上一份报告一致[8]。在1 μM IAA和10 μM IAA处理下pPLAIIIδ在侧根诱导，但在主根抑制(图8A).以上数据提示外源IAA刺激可能调节了空间表达模式，并抵消了生长素响应的差异表达pPLAIIIδ在各种组织中可能是整体转录水平的原因pPLAIIIδ受IAA处理影响较小。

另一方面，WT、KO和OE植物在下胚轴伸长过程中对生长素的敏感性不同，光照和黑暗条件下对外源IAA刺激的基因表达也不同(图2)8B和D)提供了证据pPLAIIIδ在调节生长素反应中起积极作用。大多数生长素反应基因调节生长素信号环本身，因此在转录水平上的直接变化很难检测到，包括那些在GH3s, IAA和销基因(8]。然而，在胁迫条件下，不同植物品系之间的生长素响应差异被放大。在黑暗中，表情IAA2和IAA11在KO植物中较低，在OE1植物中较高，对1 μM IAA处理有显著响应(图9）.虽然没有直接证据表明这两个基因参与下胚轴伸长，但已经发现几个国际宇航科学院基因影响下胚轴的发育。例如,axr2-1（IAA7)植物在黑暗中显示较短的下胚轴[42];生长素敏感性降低shy2-1（IAA3)植物抑制下胚轴伸长[43];shy1-1（IAA6)植物在黑暗中表现出下胚轴伸长受到抑制[44];和iaa18-1（IAA18)植物的下胚轴长度增加[45]。此外，的双重上调平快和PIN7与WT和KO植株相比，OE1植株的检测结果(图2)9)也反映了WT、KO和OE1系细胞内生长素浓度的差异。因此，的微分表达式国际宇航科学院WT、KO和OE1植物细胞内生长素浓度的变化可能是不同植物品系在黑暗条件下对IAA处理的不同下胚轴伸长率的原因。此外，研究表明生长素诱导基因的差异表达在3 h内减弱[8]。然而，在深色生长的OE1幼苗中，Iaa2, iaa11, pin5和PIN7在IAA处理12 h后，生长素反应保持较高水平，证实了过表达诱导的生长素反应和运输增强pPLAIIIδ可能会持续一段时间。

先前的研究表明，生长素诱导的基因表达上调在apPLAIIIδ功能丧失突变体[8]。我们发现生长素诱导的基因表达显著上调pPLAIIIδ-过表达植株在10 μM IAA光照下处理30 min，进一步证实了pplaiiδ积极参与生长素响应和运输(图2)10）.在已确定的上调基因中，SAUR9在OE品系中平均上调17倍，而在WT品系中上调6倍(图10）.大部分的阿富汗二月在多器官形态发生过程中，基因可介导生长素诱导的细胞伸长[qh]46]，[47]。例如，过度表达SAUR32基因导致顶端钩开口和较短的下胚轴拟南芥(48和过度表达OsSAUR39不仅影响茎部，而且影响根的形态，外源生长素可以恢复这些影响[j]。49]。此外，与之前的研究结果一致pPLAIIIδ突变体，过度表达pPLAIIIδ也影响了反应PIN3到IAA刺激(图10）.PIN3在下胚轴中对细胞伸长起积极作用[22]，[50]，这是由于重要的横向生长素外排载体PIN3引导生长素流向表皮细胞层以控制生长[51]。因此，更高的表达SAUR9和PIN3在光照条件下，IAA处理30min内的生长素反应较强，且可能导致OE植株下胚轴伸长过程中生长素的超敏反应。

pplaii δ通过PA调控生长素反应

在pplaii δ-催化反应产生的产物中，PA可能是导致植物生长素反应变化的部分原因pPLAIIIδ表达式。Li等人进行了药理学实验(FM4-64治疗)，表明pld - ζ2通过其产物之一PA正向调节生长素反应[52]。在本研究中，我们观察到KO系的PA降低了27%，OE系的PA增加了118%(图2)11)，这表明生长素反应的改变可能是由于KO和OE系植物中PA含量的改变。这与生长素在OE植物中的广泛分布相一致(图2)7A)， PA处理后在根中检测到的扩大的GUS染色区DR5:格斯幼苗的生长素反应增强，这归因于更快的PIN2循环[52]。在PIN循环过程中，PA对于囊泡运输至关重要，以促进早期核内体与质膜融合并刺激肌动蛋白聚合[52]，[53]。PIN循环异常会导致多种生长素相关缺陷[54]-[56]。所有这些发现都支持了pplaiiδ通过PA积极调节生长素反应的模型。

在体内，PA要么直接通过PLD途径产生，要么间接通过PLC-DGK途径产生[7]。或者，这两种途径在转录后水平或转录水平受到调控[57]-[61]。我们的基因表达分析的转录水平骑士和PLC)基因没有显示出显著的变异(见附加文件)6)，排除了KO和OE植物系中PA含量的改变是由PLD和/或PLC-DGK通路的转录调控引起的可能性。关于转录后调控，pplaiiδ的水解产物(游离脂肪酸和溶血磷脂)已被证明在PLD的激活中起作用，导致PA的产生[62]，[63]。因此，PLD-和/或plc - dgk依赖性通路在KO和OE植物系中是如何被激活的问题值得进一步研究。

在上述分析的基础上，我们提出了一个参与的模型pPLAIIIδ生长素调控的极化细胞生长:过表达pPLAIIIδ诱导PA含量的增加，从而导致生长素反应的增强。在未处理IAA的OE植株中，内源增强的生长素反应激活了乙烯的生物合成，影响了生长素的分布，导致下胚轴和叶表皮细胞极性缺失;在IAA处理下，生长素早期响应基因的上调和生长素运输的增强抵消了内源乙烯对下胚轴伸长的抑制作用，促进了下胚轴生长的增加。

这项研究表明pPLAIIIδ参与生长素响应的极化细胞生长，通过PA起作用，导致器官发育缺陷拟南芥和显著。尽管patatin相关磷脂酶亚家族III (pPLAIIIs)的成员与生长素反应有关，但尚不清楚这些基因是否以及如何影响植物和细胞的形态发生。到目前为止，对patatin相关磷脂酶亚家族III的生物学功能了解有限。探索pplaiiδ调控生长素应答细胞形态发生的机制，不仅有助于了解pplaiiδ的生物学功能，还有助于了解磷脂酶依赖的信号转导网络在生长素应答的极化细胞生长中的作用。

植物材料

纯合T-DNA插入突变体的分离pPLAIIIδ（pPLAIIIδ-KO)，以及生成补充行(pPLAIIIδ-COM)和过表达线(pPLAIIIδ-OE)pPLAIIIδ的报道[64]。质粒pPLAIIIδ过表达载体也转移到芸苔属植物显著简历。J572根据Zhou等人描述的方案。[65]。对转基因植株进行筛选和PCR鉴定。获得10多个独立的转基因品系，选择其中4个(BnOE1 ~ BnOE4)进行表型分析。

克隆…的启动子区域pPLAIIIδ的基因组序列pPLAIIIδ从colo -0中分离到启动子区至编码序列拟南芥使用附加文件中列出的两种引物进行基因组DNA分析8。将克隆的启动子融合到含有基因的二进制载体pMDC163中uidA植物转化基因。采用PCR技术对转基因植株进行筛选和鉴定，并利用T3代的4个独立纯合子转基因株系进行GUS检测。

植物生长和处理

表面灭菌的种子分别镀于0.5× Murashige和Skoog盐琼脂上。4°C黑暗分层2 d后，幼苗在22/21°C冷荧光白光(200 μmol m)下，在16 h光照/8 h黑暗周期的生长室内垂直生长在板上⁻²年代⁻¹）.土生植物的实验条件为:16 h光照/8 h暗，22/20℃，50%湿度，200 μmol m⁻²年代⁻¹光的强度。在激素处理中，将3天龄的幼苗转移到不同浓度IAA(0、1 μM、10 μM、100 μM和1 mM)的培养皿中48 h，将7天龄的幼苗转移到不同浓度IAA (10 μM)的培养皿中不同时间。

组织化学GUS活性

为了测定GUS活性，解剖样品用Hemerly等人描述的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β- d -葡糖苷(X-Gluc)溶液孵育。66]。幼苗在37°C的黑暗中孵育12 h。用95% (v/v)乙醇冲洗x -葡聚糖处理过的样品，然后转移到70% (v/v)乙醇。采用尼康ECLIPSE 80i复合显微镜对样品进行观察。

细胞学

7天大植物的下胚轴和3^{理查德·道金斯}和图4^th30日龄植物(≥15个样品)未展开的叶片在FAA(3.7%甲醛，5%冰醋酸，50%乙醇)中真空固定4小时，75%乙醇脱色。叶片在含有10:1:1.5:2.5水合氯醛:甘油:阿拉伯胶:ddH的霍耶氏溶液中进一步透明化₂使用尼康ds - ri1 CCD相机和Nikon ECLIPSE 80i差示干涉对比显微镜获得图像，并使用Image J软件进行测量。测定了叶片表皮下胚轴单细胞纵队的长度、宽度和细胞数，以及叶片中靠近中央主脉的4个区毛状体的长度。选择具有≥5个完整细胞且轮廓清晰的叶片中心区域进行路面细胞分析。利用周长和面积计算叶片路面单元的圆度(圆度= 4π面积/(周长))²）.将上述单元格轨迹进行填充、复制粘贴到一个新文件中，用于表示瓣数的骨架端点计数，并运行Image J软件的skeleton插件对阈值后的二值图像进行处理[67]。

扫描电镜，新鲜样品固定在含有1% Triton X-100的FAA中，通过分级乙醇系列脱水，并使用日立HCP-2临界点干燥器(日立，日本)干燥。然后将样品安装在扫描电子显微镜存根上，使用Eiko IB-5离子镀膜机(Eiko工程公司，茨城县，日本)溅射镀金，然后在JSM-3690/LV扫描电子显微镜(Jeol，日本)下观察。

对于半薄切片分析，样品在真空条件下固定在FAA中4小时，在乙醇系列(30、50、70、85、95、100和100%)中每步脱水1小时，然后按照制造商的方案浸入Technovit 7100树脂(Heraeus Kulzer, wehheim, Germany)。采用Leica Ultracut R超微切片机(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)制作半薄(2 μm)切片，用甲苯胺蓝(0.5%甲苯胺蓝和0.2 M柠檬酸钠缓冲液，pH 4.5)染色30 s。使用尼康ECLIPSE 80i复合显微镜获得图像。

脂质分析

从2周龄的土生蔷薇中提取脂质，并通过电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)进行分析，脂质分析如前所述[68]，[69]。

RNA提取和Real-Time PCR

使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)从各种组织中制备总RNA样品，并根据制造商的说明使用DNase I (Fermentas，美国)处理。每个样品用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)将2 μg RNA转化为cDNA。基因特异性引物使用在线软件(http://www.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR）.引物序列在附加文件中列出8。使用TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒(TransGen，中国)进行实时PCR，如前所述[70]，并使用Bio-Rad CFX96实时系统(Bio-Rad)。采用比较周期阈值法进行相对定量，设计引物组扩增的PCR产物相对量归一化为对照基因ACT7。数据以mean±SD表示(n =3个技术重复)。

HPLC-MS / MS分析

7天大的新鲜植物组织(200 - 600毫克)拟南芥幼苗被精确地称重，然后冷冻并在液氮中磨成粉末。将IAA馏分溶于1 mL 80%甲醇/H中₂O，在4℃下提取24小时。然后将样品在4℃下离心10 min，将上清转移到新鲜管中。以80%甲醇/H 300 μl快速重复提取₂O加热1小时，用氮气蒸发器(Organomation Associates Incorporated, USA)干燥两种提取物的混合物。用300 μl的80%甲醇/H溶解IAA组分₂O并注入高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)(美国安捷伦科技公司)。用于数据归一化的外标区域分别为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 ng/mL IAA。该方案是基于Sugawara等人的描述。[71]、潘湘青等。[72做了一些修改。

的时态表达式和根表达式模式的数据pPLAIIIδ可于genevestiator网站(http://www.genevestigator.com/）.关于时间进程的数据pPLAIIIδ可从AtGenExpress可视化工具网站(http://jsp.weigelworld.org/expviz/expviz.jsp?experiment=development&normalization=absolute&probesetcsv=At3g63200&action=Run）.

pPLAIII:

patatin相关磷脂酶亚家族III

销:

生长素外排载体PIN-FORMED家族

远程雷达:

富亮色重复图案

简述:

Lysophoshatidylethanomine

LPC的:

Lysophosphatidylcholine

摘要:

Lysophosphatidic酸

骑士:

磷脂酶D家族

坚固的:

的功能获得突变体pPLAIIIδ

AUX1 /宽松:

AUX1 / LIKE-AUXIN蛋白质

MDR / PGP:

atp依赖性多药耐药/ p糖蛋白型ABC转运体

柯:

一个拟南芥的T-DNA插入突变体pPLAIIIδ

OE行:

的两个独立的功能增益突变系pPLAIIIδ

COM:

的补线pPLAIIIδko

WT:

野生植物

BnOE1至BnOE4:

四个独立芸苔属植物显著转基因系pPLAIIIδ

APS:

平均极性分数

ACS:

1-aminocyclopropane-1-carboxylate合酶

华:

1-aminocyclopropane-1-carboxylate氧化酶

RSA1:

根系结构1蛋白

XBAT32:

XB3正交2英寸拟南芥

MT:

超小型电子管

国际宇航科学院:

吲哚乙酸

PC:

磷脂酰胆碱

体育:

磷脂酰乙醇胺

PI:

磷脂酰肌醇

PS:

磷脂酰丝氨酸

PA:

磷脂酸

答:

Phosphatidylglycerol

MGDG:

Monogalactosyldiacylglycerol

DGDG:

Digalactosyldiacylglycerol

PI-PLC:

Phosphoinositide-specific磷脂酶

全国人大:

非特异性磷脂酶

转化:

生长素结合蛋白

DGK:

二酰基甘油激酶

X-Gluc:

5-bromo-4-chloro-3-indolyl -β-D-glucuronide

质/女士:

电喷雾电离串联质谱法

HPLC-MS /女士:

高效液相色谱-串联质谱法

我们感谢拟南芥提供T-DNA插入突变体的生物资源中心。感谢国家自然科学基金(基金号30900787和31371659)的资助。M.L.和X.W.得到了美国国家科学基金会(MCB-0922879)的资助。我们也感谢两位匿名审稿人提供的有用建议。

从属关系

1. 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，中国武汉

   董燕妮，张鹏，范楚川，周永明

2. Donald Danforth植物科学中心，圣路易斯，密苏里州，美国

   李茂音，王学敏

相应的作者

对应到Chuchuan风扇或永明周。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

YD、CF、YZ设计实验;YD、ML、PZ、CF进行实验，YD、CF、YZ进行数据分析;YD, CF, YZ和XW撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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