BIIDXI,At4g32460DUF642基因参与果胶甲基酯酶的调控拟南芥种子萌发与植物发育

背景

DUF642蛋白构成了一个高度保守的蛋白家族，与细胞壁相关，对精子植物具有特异性。转录组研究表明，该家族成员参与种子发育和萌发过程。之前的体外研究已经表明At4g32460 -和At5g11420-编码的蛋白质与果胶甲基酯酶3 (AtPME3)的催化结构域相互作用，该结构域由At3g14310)。PMEs在植物发育中起着重要作用，包括种子萌发。本研究的目的是评估DUF642基因的功能At4g32460并确定其与PME活性调控的关系。

结果

我们的研究结果表明，DUF642蛋白编码At4g32460和At5g11420可能是几个发育过程中PME活动的积极调节因子。过表达这些蛋白的转基因系在种子萌发过程中PME活性增加，种子萌发性能改善。在植物中表达At4g32460叶片中反义RNA、PME活性降低，叶柄极短且不含种子。SALK_142260和SALK_054867也存在这种表型At4g32460．

结论

我们的研究结果表明，DUF642家族通过参与植物发育过程中果胶状态的精细调控，提高了甲基化过程的复杂性。

DUF642蛋白构成了精子植物特有的高度保守的细胞壁相关蛋白家族[1]。尽管在多种植物和组织的细胞壁蛋白质组中已经检测到该家族的蛋白质，但迄今为止仅发表了一篇关于该蛋白质家族的功能研究。At5g25460在幼苗发育的早期阶段高度表达At5g25460-null突变体的根比野生型短，莲座比野生型小[2]。

转录组分析揭示了5个DUF642基因在大麦种子萌发过程中的差异表达，这表明该蛋白家族可能在萌发过程中发挥作用[3.]。此外，DUF642基因在萌发过程中不同种室间的空间表达差异也有报道拟南芥．一项基因表达研究表明At3g08030和At5g11420在睾丸破裂前，转录本在珠孔胚乳中富集At4g32460在睾丸破裂后在这个隔室中表达[4]。在芸苔属植物oleracea种子，表达了At5g25460基因同源性在萌发过程中增加[5]。At3g08030转录本存在于成熟后的种子中，并且转录本水平在土壤或水的控制下增加(基质激发和水激发的种子)。值得注意的是,At3g08030萌发率低的老化种子缺少转录本[6]。

DUF642蛋白已在多种组织的细胞壁蛋白质组中检测到[7]。对污名状乳头细胞的转录组分析显示，DUF642基因的转录水平很高。At4g32460和At2g41800以及编码其他细胞壁相关蛋白质的基因，包括果胶甲基酯酶。柱头细胞壁的重塑参与了传粉的成功，可能是通过调节花粉管通过传粉道的渗透来实现的[8]。在百合longiflorum，对柱头分泌物中蛋白质的分析发现了DUF642蛋白[9]。

由At4g32460和At5g11420在体外与果胶甲基酯酶3 (AtPME3)的催化结构域相互作用At3g14310) [10]。蛋白质相互作用组数据已被证明是制定和测试假设的有用资源[11]。编码的DUF642蛋白的一个潜在生理功能At4g32460和At5g11420与PME活动的调节有关。几项研究表明，果胶甲基化的程度是一个高度调控的过程，在各种发育过程中对细胞壁的生物力学特性进行微调至关重要[12] - [14]。果胶的去甲基化是由PME介导的，PME抑制剂(PMEI)蛋白调节PME的催化活性[15]。

未酯化的果胶，尤其是高半乳糖醛酸(HGs)，是聚半乳糖醛酸酶(PGs)的底物，PGs是由多半乳糖醛酸酶抑制剂蛋白(PGIPs)调节的酶，参与细胞分离过程[16]。在雌蕊、硅蕊和种子发育过程中，果胶甲基化的差异已被描述。在橄榄中，授粉过程中在柱头和传粉组织中检测到低甲基化的HGs [17]。在答:芥，硅酸生长与甲基化程度的降低有关[18]。在种子中答:芥，胚胎细胞壁中未酯化的果胶含量较低，胚乳细胞壁中含有大量未酯化的HG，而睾丸细胞壁中则富含高度甲基化的HG [19]。在答:芥,编码果胶修饰酶及其调控因子的基因在种子萌发的前24小时内受到高度调控[20.]。在黄杉种子中，PME活性与萌发性能呈正相关[21]。

在答:芥在相关胚乳物种中，萌发是一个两步的过程，需要睾丸和胚乳破裂以使胚根突出[22]。在答:芥在胚乳破裂前，PME活性增加，在胚乳破裂时活性降低。PMEI的过表达加速了胚乳的分解，提高了胚根的萌发能力。脱落酸导致的胚乳破裂延迟显著延长了PME高活性期[13]。相反，PGIP过表达抑制发芽，这一过程在pgip突变种子[23]。

本研究旨在研究DUF642基因的功能At4g32460在种子萌发和植物发育过程中。我们评估了BDX蛋白在PME活性调控中的作用，重点关注种子萌发和植物生长的时期。我们证明了两者的过度表达At4g32460或者它的同系物At5g11420增加PME活性，促进萌发，主要是通过加速睾丸破裂。我们还证明了总PME活性在At4g32460反义转基因植物，这些植物的形态变化包括没有种子的小角蕊。这种表型也在SALK T-DNA突变体中观察到。根据这些结果，我们命名At4g32460作为BIIDXI（BDX)，在萨波特克语中是“种子”的意思。我们的数据表明DUF642蛋白参与PME的调控，从而在植物发育的各个过程中重塑细胞壁。

BIIDXI在吸收的种子、根、叶、茎和各种花器官的胚胎中表达(bar.utoronto.ca)。以确定克隆区域(附加文件1(图S1C)足以以类似于前面描述的模式驱动表达答:芥我们制作了含有与绿色荧光蛋白(GFP)报告基因融合的克隆片段的转基因植物系。我们生产了三个转基因品系，并在其生长发育过程中监测了GFP荧光。由GFP驱动BDX启动子在主根和侧根的维管组织以及叶片、雄蕊和花瓣中高度表达(图2)1)。在萌发48 h和72 h的种子胚根维管组织中检测到GFP荧光(图2)1A和B)。在种子吸胀过程中，从6小时开始检测GFP荧光，直到萌发完成(附加文件)1:图S2)。在6日龄幼苗的初生根中，GFP荧光仅在分生区和过渡区的维管前组织中检测到(图2)1C)。在8日龄幼苗的根中，分化区中柱鞘细胞中检测到GFP荧光(图2)1D)。在22日龄植物的根中，成熟区特定区域的维管组织中检测到GFP荧光(图2)1E)。在完全展开的叶片维管组织中也检测到GFP荧光(图2)1F).在花发育的不同阶段，BDX启动子驱动的GFP表达仅在雄蕊花丝和花药的维管组织、花瓣和柱头乳头中检测到，如前所述[8)(图1G和H)。

接下来，我们分析了BDX不同阶段胚胎启动子活性;心脏阶段，鱼雷阶段和成熟胚胎(图2)。在成熟胚胎根分生组织区血管前细胞中检测到GFP荧光(图2)2A)和胚胎在鱼雷(图2C)和心脏分期(图2E).基因驱动下GFP的表达模式BDX在植物发育的不同阶段，启动子主要与维管组织相关，这与先前的报道一致。

转录组分析揭示了这一点BDX生长素诱导表达[24]和赤霉素(GA) [25]。对假定启动子区域(pBDX)的计算机分析揭示了至少两个生长素反应因子基序[26]和两个赤霉素反应元件(GARE) [27]。我们进行了激素诱导分析，以测试pBDX片段是否包含生长素和GA反应的信息。生长素和GA处理2 h或48 h后，效果发生改变BDX7日龄幼苗根部表达量。在两种治疗中，BDX与之前在对照苗中观察到的一样，在维管组织中也检测到表达，但在皮质细胞中也检测到表达(附加文件)1:图S3)。

了解…的生理功能BDX，我们生成过表达系(OEBDX;数字3.)，其中全长At4g32460编码序列在花椰菜花叶病毒35S启动子(附加文件)的控制下表达1:图S1A)。获得了几个独立的纯合子转基因品系。我们检测了两个品系的干种子，以确定它们的PME活性和BDX转录水平。

BDX在wt干种子中未检测到转录本，但在过表达系中呈高水平表达(图2)3.A)。尽管在所有发育阶段，不同品系之间没有形态差异(结果未显示)，但在营养分生组织富集的样品和幼苗中，总PME活性增加(p<0.001)，与wt相比，叶片中PME活性在过表达系和wt之间没有显著差异(图2)3.B)答:芥在种子中，据报道PME活性在睾丸破裂前增加，在胚乳破裂开始时下降[13]。在此基础上，我们对2个OEBDX系和wt植株的基质种子进行了萌发分析。用空载体转化的植物被用作阴性对照(附加文件)1:图S4)。与wt相比，OEBDX系显示睾丸破裂的初始时间更短(p= 0.02,图3.C)，其种子到胚乳破裂起始时间(p= 0.004,图3.D)。

系统发育研究证明了这一点BDX和At5g11420它们各自编码的蛋白在体外与AtPME3相互作用[1]、[10]。而且，最近的研究表明At5g11420在睾丸破裂之前，微孔胚乳中的表达增加，提示可能的作用At5g11420在这个过程中[4]。评价评价…可能的作用At5g11420在睾丸破裂中，我们生成过表达系(OE11420，图)1B和4)。不同品系和wt之间没有形态差异(结果未显示)。At5g11420在干燥的OE11420种子中检测到高水平的转录本(图2)4A)。与wt相比，OE11420系在富含营养分生组织的样品和幼苗中PME活性显著增加(p=0.003)，但叶片中PME活性无显著变化(图3)4此外，与wt相比，OE11420基质处理的种子萌发率更高(图2)4具体而言，OE11420种子的睾丸和胚乳开始破裂的滞后时间比wt种子短(p= 0.004,p< 0.001)。OE11420系胚乳破裂率增加(p< 0.001)。对OEBDX和OE11420基质种子的萌发分析表明，在干种子中过表达这些基因可以提高种子的萌发率，可能是通过增强睾丸破裂性能来实现的3.和4)。

为了确定过表达基因对种子萌发和萌发过程中PME活性的影响，我们对未进行预处理的种子进行了测试。OE种子的初始睾丸破裂和胚乳破裂时间比wt种子短(p= 0.01,p< 0.01)。OEBDX和OE11420种子胚乳破裂率无显著差异，但两系种子胚乳破裂率均显著低于wt种子(p= 0.01,图5A和B)。对于wt种子，PME活性在睾丸破裂完成之前增加，之后下降，与之前报道的模式相似[13]。在OE11420种子中观察到相同的PME活性模式。萌发20 h时，OE11420种子的PME活性显著高于wt种子。然而，OEBDX种子的PME活性模式不同;PME活性在萌发34 h后没有降低。在种子萌发1 h和34 h时，OEBDX种子的PME活性高于wt种子(p< 0.001,图5C)。

果胶是果胶的主要成分答:芥种子粘液，可用钌红染色检测[28]。在水吸收的OEBDX种子中，粘液释放与水吸收的种子相似(另附文件)1:图5)。

接下来，我们使用反义RNA技术沉默BDX表达式。一个At4g32460由内源性同源启动子驱动的RNA反义转基因BDXBDX基因::BDX反义RNA转基因;额外的文件1:图S1D)转化为野生型答:芥生成ASBDX植株(图16)。通过卡那霉素选择获得5个独立的转基因品系。所有这些转基因系在T1后代中均表现出表型变异，分离分析显示wt表型与缺陷表型的比例为3:1。这一比例先前在水稻中具有同源启动子的反义结构中被观察到[29]。利用3条独立的反义细胞系对其形态和发育缺陷进行了分析。这3个品系均显示颖果大小减小，不产生种子(图2)6A, B, C和D)。对ASBDX花蕾13期横切面的分析显示心皮形态异常。柱头的大小减小，隔有被吞没的区域。在成熟胚珠中，不同组织不能分化(图2)6D，特写图像。ASBDX线1、2和3的平均硅片长度分别为3.3、3.1和4mm，相当于至少缩小了60%(图2)6E)。与wt相比，所有3个ASBDX系的叶片PME活性均显著降低(p= 0.014,p= 0.001,p=0.003，分别为第1、2和3行;数字6F)。定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析显示，所有三个ASBDX系的At4g32460转录本水平，与wt花序相比(p第1行和第2行<0.001p=0.004 =第3行;数字6G)。

我们对SALK的两个品系SALK_142260和SALK_054867进行了表型分析，这两个品系的T-DNA都插入到dna的末端BDX编码序列。研究结果进一步证明BDX在生殖发育中发挥作用，并可能调节PME7)。SALK_142260系的T-DNA插入在第2外显子的末端，SALK_054867系的T-DNA插入在第3外显子的末端At4g32460轨迹(图7A)。两个SALK系的杂合植株的硅片长度减少，与ASBDX植株相似(图2)7(B和D)。然而，在SALK系中，单株含有较少的种子(平均4±1粒)。部分种子形态异常，不能成活(图2)7C).形态正常的种子可以产生杂合子或wt植株，但不能产生纯合子植株。qRT-PCR分析显示BDXT-DNA杂合植物的转录水平(p= 003,图7E)。

DUF642是精子植物特有的高度保守的细胞壁相关蛋白家族。该家族在不同的植物物种中显示出高度的氨基酸同一性，这表明DUF642的成员在植物细胞壁特性中起着重要的作用[1]。我们的结果表明BDX在胚胎、被吸收的种子、48小时的幼苗和整个成体植物中表达，其中它主要定位在维管组织中，如前所述At5g25460［2)(图1和2)。BDX在胚和初生根不同阶段的初始细胞中均有检测，主要存在于侧根出生前的中柱鞘细胞中;因此，它在其他器官维管组织中的表达可能与这些类型的细胞有关。

生长素信号传导促进侧根原基的出现[j]30.]。在本研究中，生长素诱导BDX根表达式(附加文件1:图S2)，以及BDX在12期花的柱头组织中高度表达(图1H)，其中生长素信号基因被过度代表[31]。生长素在柱头中的分布在传粉过程中起着重要的作用。在ASBDX植物中，角质部很短且不含种子;杂合T-DNA植株的角质部较短，但含有少量种子(图2)6和7)。的高转录水平BDXASBDX和T-DNA植株在柱头组织中存在的缺陷可能与种子产量低有关。有研究认为，细胞壁结构的调节，尤其是果胶状态的调节，是花粉管渗透的基础[32]。先前的研究表明，传粉通道的甲基化在传粉前和传粉过程中减少，而PME活性在花粉发育过程中增加[17]、[18]、[32]。而pme3-null突变体在硅骨发育中没有形态学变化[33]， PMEI5 OE植物长出短而皱巴巴的角质部，只含一到两个种子。在pme5 OE中检测到总PME活性降低[13]和ASBDX工厂(图6)。

BDX在胚胎发生过程中也有表达(图2)2)。3代未获得纯合的T-DNA植株，说明零突变植株存在胚胎发育缺陷。

过表达AtPME3的转基因植株的总PME活性增加，但其形态变化仅为根长、芽高。33]。在本研究中答:芥植物overexpressingBDX和At5g11420与wt相比，在生命周期的不同营养阶段没有形态学变化，尽管它们在分生组织、幼苗和吸收的种子中显示出更高的总PME活性(图3.和4)。PME活性的增加可能与OEBDX和OE11420种子萌发性能的提高有关。与wt种子相比，OEBDX和OE11420种子到睾丸破裂的初始时间更短，这与PME活性的增加有关(图1)5)。之前的一项研究表明At5g11420睾丸破裂前微孔胚乳中转录物富集[4]。在本研究中，在OE11420系中，在睾丸破裂前的几个小时内，PME活性水平很高，这表明At5g11420在发芽过程中起生理作用。

我们的数据表明，DUF642蛋白编码由BDX和At5g11420对PME活动的积极调节是什么答:芥．它们可能直接影响PME活性，也可能通过改变细胞壁性质间接影响PME活性。植物发育过程中细胞壁修饰的相关性已被广泛研究，PMEs已被证明在调节果实发育和萌发过程中的甲基化过程中发挥重要作用[qh]34]。在本研究中，线条过度表达BDX和At5g11420在种子萌发过程中PME活性增加，这是一个与PME活性变化高度相关的两步过程。我们推测PME的激活可以通过提高睾丸破裂的能力来更快地完成萌发。先前的研究表明，细胞壁果胶甲基化反应的减少可以改善PG降解果胶的途径，促进细胞在试验中分离。此外，PGIP对PG活性的调节被证明可以抑制萌发[23]。

在藻类和植物发育过程中，许多形态发生事件都与果胶化学有关。34]、[35]。在轮藻最纯粹，果胶去酯化反应促进细胞扩张[36]。分生组织中果胶状态的调节决定了叶根形成和器官形成[j]。37]。在花粉管伸长过程中，果胶甲基酯化的空间梯度被证明是由PMEs和PMEI蛋白精确控制的[38]。

甲基化过程复杂性的进化是植物多样化和适应不同环境的重要过程。果胶和PME在细胞壁的表达首先发生在绿叶植物中。PMEs的抑制结构域出现在陆地植物的PMEI家族中，是在苔藓与蕨类植物分化的过程中出现的[39]。线虫的纤维素结合蛋白(CBP异皮线虫属schachtii通过与AtPME3直接作用增加植物PME活性;除上述例外情况外，并无其他正面调节空气污染物的资料[33]。我们的研究结果表明，DUF642蛋白是一个精子特异性家族，通过参与植物发育过程中果胶状态的精细调控，促进了甲基化过程的复杂性。

植物材料

野生型哥伦比亚(Col)生态型答:芥植株(wt)和过表达株系(OE)At4g32460和At5g1120在盆栽土壤中播种，或在培养皿中的Murashige和Skoog (MS)培养基(pH 5.7)上播种。这些植物在21°C的室内(E-15, Conviron, Manitoba, Canada)中生长，长时间的光周期(16小时光照/8小时黑暗)。收集5天大的幼苗、营养分生组织(包括幼嫩器官原基和茎尖分生组织)和莲座叶(来自18天大的植株)，在液氮中冷冻，并在- 80°C下保存，直到用于PME活性和RNA分析。

确定…的表达模式At4g32460和At5g11420在吸胀期间，50mg wt答:芥将种子播种在1% (w/v)的琼脂板上，置于生长室(Lab-Line Instruments Inc.)。Melrose Park, IL, USA)，在21°C下，光照16小时/暗光照8小时。在吸胀后2、4、6、8、12、24和48 h采集种子，液氮冷冻，- 80℃保存至RNA提取。

DNA提取，RNA提取，种子cDNA合成

根据制造商的说明，使用苯酚氯仿异戊醇法(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从莲座叶和花序中提取基因组DNA。根据制造商的说明，使用Trizol方法(Invitrogen)从莲座叶和花序中提取总RNA。

从0.05 g中分离总RNA答:芥wt和OE种子根据其他地方描述的协议[40]。纳米滴分光光度计;热科学;www.thermoscientific.com)用于定量RNA。在半定量RT-PCR中，利用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)和oligo (dT)引物，用DNase-I (Qiagen, Valencia, CA, USA)处理过的100 ng RNA合成cDNA。我们使用引物对FAT32460(正向，5 ' -GTGTCCCAAAGCCATTATTC-3 ')和RAT32460(反向，5 ' -AGCGACGAATCTCAATGAC-3 ')进行扩增At4g32460，引物对11420LSF(正向，5 ' -TCTAGAATGAAAGGAGGCAGCCTCT-3 ')和11420LSR2(反向，5 ' -GGATCCCGGCTTACGAGCACTGAGGAGTT-3 ')进行扩增At5g11420。肌动蛋白（ACT7)被用作内部控制。

定量rt - pcr

利用应用生物系统StepOne平台(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)，用SYBR Green Master Mix用反义、T-DNA和wt花序合成100 ng RNA的cDNA样品进行扩增。PCR条件为:50°C 2 min DNA聚合酶激活，95°C 10 min, 95°C 15 s, 60°C 1 min, 40个循环;最后，样品在95°C下加热15 s，在60°C下加热1 min，在95°C下加热15 s，进行熔化曲线分析。分析3个独立的生物重复和3个技术重复。ACT7作为内源性控制。为了分析反义植物花序中的基因转录水平，正向引物由来自UTR 5 '区的序列(5 ' -CTCTCGCTCACTCTTCTCCAA-3 ')组成，反向引物由来自第二外显子开始的序列(5 ' -CGACAAAGCCTGAGAGTTCCC-3 '， BDXR)组成。为了分析T-DNA系，我们使用了BDX正向引物(5 ' -GCTTCAATGATGGACTACTACC-3 '， BDXF)和BDXR。样品与C_T和斜率值，并采用Pfaffl [41]，得到相对表达比。在学生变换之前，数据是经过自然对数变换的t以及。

质粒构建

为At4g32460(GENE ID 829381)的表达分析，一个1983-bp的片段At4g32460从叶片提取的基因组DNA中扩增以ATG结尾的基因间区，使用以下引物:PRO32460F(正向，5 ' -AAGCTTGCATGGGAGAATTGACCACT-3 ')和PRO32460R(反向，5 ' -GGATCCTTGGAGAAGAGTGAGCGAGAG-3 ')。将该PCR片段克隆到pGEM-T Easy中进行测序。然后用HindIII和BamHI酶切部分片段，然后克隆到pBIN-m-GFP-ER质粒(PRO32460: ER-GFP，图1)。

对于过度表达At4g32460和At5g11420从叶片mRNA合成的cDNA中，利用F32460se1(正向，5′-GGATCCATGAAAGAGATGGGAGTGATAG-3′)和R32460se1(反向，5′- gagctctcacggcctccgaggagccat -3′)引物扩增其编码区;和F11420se1(正向，5 ' -GGATCCATGAAAGGAGGCAGCCTCT-3 ')和R11420se1(反向，5 ' -GAGCTCTTACGGCTTACGAGCACTGA-3 ')。将这些PCR片段克隆到pGEM-T Easy中进行测序。经BamHI和SacI酶切后，片段被亚克隆到pBIN质粒中，在CaMV 35S启动子的控制下表达(图5)1为了进行基因沉默分析，我们构建了一个质粒At4g32460同源启动子控制的反义转基因。

植物转化

Wt坳答:芥采用花浸法转化植株根癌土壤杆菌C58 [42]。将收集到的种子播种在含有卡那霉素的MS培养基(pH 5.7)上进行筛选，绿色幼苗在花盆中移栽到土壤中。至少选出了10个独立的转基因品系。采用纯合子T3种子代进行萌发实验(2个独立系)或共聚焦显微镜(3个独立系)。对于反义转基因植株，至少选择了10个独立的株系。表型分析采用5个纯合子(T3)系，其中3个系进行PME活性和qRT-PCR分析。

本文分别行

利用T-DNA左缘引物LBb1(5′-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3′)和特异性引物对目标区域进行测序BDX,R32460se1，位于第二外显子的末端．对于SALK_054867，反向引物由位于第三外显子末端的序列组成。

激光共聚焦扫描显微镜

为了标记细胞壁，幼苗在碘化丙啶溶液(1.7 mM)中孵育30秒，然后进行共聚焦成像分析。使用aFV100激光共聚焦扫描显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)在485 nm和545 nm分别对碘化丙啶和绿色荧光蛋白进行成像。所有没有荧光的植物组织图像作为对照。使用Photoshop, v. 5.0 (Adobe Systems, San Jose, CA, USA)对图像进行组装。

基质启动处理(M)

答:芥将种子包在玻璃纸中，埋于2 cm深的灌满田间容量湿润土壤(- 0.027 MPa水势)的花盆中。盖上铝箔，在22°C下孵育24小时。种子在黑暗中挖出，在室温(25°C)下风干。随后，将种子用于发芽试验或冷冻于液氮中，保存于- 80°C。

发芽试验

在萌发试验中，干燥成熟的种子成熟后在20°C下保存3个月。将种子播种在1% (w/v)的琼脂板上，在20°C下转入植物生长室(Lab-Line Instruments Inc.)，光照6小时/暗光照18小时。萌发试验设5个重复，每个重复30粒种子。用不同的wt种子数量和不同的过表达系进行了生物重复BDX和At5g11420．用奥林巴斯解剖显微镜对发芽进行评分。具有可见胚乳的种子被认为已经达到了睾丸破裂。具有胚根尖端穿过胚乳的种子被认为已经达到胚乳破裂。使用Table Curve 2D v.3软件(aisis, software, Chicago, IL, USA)拟合具有种皮和胚乳的种子随时间破裂的百分比到s型模型。从这些模型中，我们得到了发芽滞后时间和经过反正弦变换后的发芽率，以满足试验的假设。结果采用方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验(Sigma Plot v.11, Systat Software Inc.， San jossan, CA, USA)进行分析。发芽率也进行了反正弦变换，以满足试验的假设。为了比较wt线和OE线的斜率，我们将睾丸和胚乳的拟合包括在内。

PME活性测定

PME活性根据先前描述的方法测定[28将8-20 μg等体积(5-20 μl)的蛋白质装入50 mm培养皿(而不是6 mm直径的孔)制备的凝胶基质中。凝胶由0.1% (w/v)≥85%酯化柑橘果胶(Sigma-Aldrich)、1% (w/v)琼脂糖、12.5 mM柠檬酸和50 mM Na组成₂HPO₄(pH值6.5)。不同组织的PME活性归一化为相应的野生型平均活性(=100)。使用Mann-Whitney评估显著差异U种子吸胀的检验和双向多元方差分析(MANOVA)。

组织学分析

将含有反义结构的植物硅胶样品固定在FAA(按体积计，4%甲醛，2%乙酸，50%乙醇)中。样品通过分级乙醇系列脱水并包埋在石蜡中。切片(1-2 μm)用旋转切片机切片，并用甲苯胺蓝染色。在奥林巴斯显微镜下观察组织切片并拍照。

支持数据的可用性

本文的支持数据包含在附加文件中。

BDX：

BIIDXI

DUF642:

域未知函数642

中外职业:

果胶甲基酯酶

AtPME3:

果胶甲基酯酶3来自拟南芥

PMEI:

中外抑制剂

硫化汞:

Homogalacturanans

答:

聚半乳糖醛酸酶

PGIP:

聚半乳糖醛酸酶抑制剂蛋白

阿坝:

脱落酸

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

遗传算法:

Gibberelic酸

码头:

赤霉素反应元件

OE:

超表达

OEBDX:

BDX过度

ASBDX:

反义BDX

海关与边境保护局:

纤维素结合蛋白

上校:

哥伦比亚生态型

wt:

野生型

女士:

Murashigee和Skoog

国际宇航科学院:

Indole-3-acetic酸

这篇论文构成了部分实现的波斯格拉多en Ciencias生物化学，国立大学Autónoma de msamico (UNAM)。E. Zúñiga-Sánchez感谢Tecnología (CONACyT)和DGAPA-UNAM提供的奖学金和财政支持。

这项工作得到了200912年(国立大学Autónoma)和SEP CONACyT基金155074号项目Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT)的支持。索里亚诺博士获得中国科学院博士后奖学金。

我们感谢G. Cassab在工作过程中的讨论，感谢K. jimsamnez在共聚焦研究上的协助，L. Márquez在DNA测序上的协助，M.K. psamezeco在组织学研究上的协助，R. psamezRuíz在qPCR分析上的建议，以及M.M. Garciadiego San Juan在PME活性分析上的建议。没有宣布利益冲突。

从属关系

1. 墨西哥联邦莫姆西科区莫姆西科市大学邮编70-275邮编04510墨西哥国立大学Autónoma莫姆西科研究所Ecología

   Esther Zúñiga-Sánchez, Diana Soriano, Alma Orozco-Segovia和Alicia Gamboa-deBuen

2. 墨西哥国立大学Autónoma墨西哥莫姆西科学院，墨西哥莫姆西科联邦区，墨西哥04510

   以利亚撒Martinez-Barajas

相应的作者

对应到艾丽西亚Gamboa-deBuen．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

EZ和DS进行了分子遗传学研究，并参与了发芽分析。EMB和AOS参与了研究的设计。AGB构思了这项研究并参与了其设计和协调。EZ, DS, EMB, AOS和AGB撰写了文章。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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