的肝松树基因家族:与不定根形成能力的成熟相关衰退相关的转录表达模式

背景

不定根是一种由分化的细胞诱导根的有机发生过程。在森林树种中，年龄和成熟是茎扦插不定根形成的障碍。完全分化祖细胞的重新规范背后的机制，这是不定根形成的基础，是未知的。

结果

在这里,肝本文对松木基因家族进行了特征分析，并报道了其中一部分基因在不定根过程中的表达。蛋白质结构的比较分析表明，松木的GRAS成员在被子植物中相对保守。相对较高的肝在非分化增殖胚性培养和胚胎发育过程中测量mRNA水平。假定的GRAS家族转录因子的mRNA水平，包括松果体放射虫纲稻草人，PrSCR，和稻草人(SCL) 6，PrSCL6，在不再具有不定根形成能力的成体组织中显著减少或不存在，但在有根能力的组织中，成体细胞重编程后保持或诱导。一个基因子集，SHORT-ROOT（PrSHR)，PrSCL1，PrSCL2，PrSCL10和PrSCL12，在不定根形成过程中也以生长素依赖性、年龄依赖性或发育依赖性的方式表达。

结论

通过分析蛋白质结构、系统发育关系、保守基序和基因表达模式，对松树的GRAS家族进行了特征分析。每个组中的单个基因都获得了不同的专门功能，其中一些可能与成体细胞形成不定根的能力和重新编程有关。

不定根形成是在茎插枝或完整植物中诱导的一种有机过程，由分化的细胞诱导根，而不是由指定的细胞发育根。在森林树种中，从异位位置的体细胞分化细胞再生新梢、根或胚胎的能力下降与树木年龄和成熟有关[1]。成熟是维管植物中与年龄有关的发育过程，影响形态、生长速度和其他生理发育特征[2]-[6]。成熟有四个阶段:(1)胚胎期，(2)胚胎后少年营养期，(3)成体营养期，以及(4)成体生殖期[1]、[7]。从茎插枝形成不定根能力的下降是限制成树成功无性繁殖的成熟特征。在发育早期，组织的再生效率要高得多。然而，完全分化的祖细胞在异位位置诱导根分生组织的机制，特别是与细胞发育年龄有关的机制尚不清楚[8]-[14]。基于松树幼苗下胚轴和上胚轴扦插对生长素响应差异生根能力的实验系统揭示了潜在机制的线索[10]、[11]、[15]-[18]。21日龄的下胚轴扦插迅速形成不定根，90日龄的下胚轴或上胚轴扦插迅速形成不定根松果体放射虫纲幼苗不生根或生根不良(图190日龄幼苗的下胚轴和上胚轴发育成一圈连续的成熟和活跃的形成层和一圈完整的次生木质部，上胚轴的初生叶-腋芽痕迹中断。然而，当成形层开始形成时，它在21日龄的幼苗的下胚轴中尚未分化或活跃[10]、[17]、[19]、[20.]。可形成不定根的细胞主要集中在成形层，成形层主要位于21日生幼苗下胚轴木质部两极树脂管的离心位置。这些细胞表现出快速分裂和分裂平面的重新定位，以直接组织根分生组织以响应外源生长素，而不成为发育未鉴定的愈伤组织细胞。90日生幼苗的下胚轴或上胚轴形成层细胞对外源生长素的存在有反应，但根分生组织直接组织所需的分裂平面的重新定向不发生或很少发生。因此，生长素诱导的不定根分生组织似乎独立于细胞重组和分裂而发生，并且能够单独重新进入细胞分裂周期[21]、[22]不足以重置非功能细胞的先前细胞状态[10]、[15]、[18]。德·阿尔梅达等人[23]将原形成层细胞描述为用于器官发生和体细胞胚胎发生的多能性和全能性干细胞样细胞的壁龛，Hutchison等人。[11]提出，与成熟相关的不定根形成的下降可能是由于成年细胞重新进入胚胎根形成途径所需的基因表达水平的抑制。体细胞分化成多能或全能细胞的机制尚不清楚，这些细胞可以发育根、芽或胚胎，或修复受损组织。

虽然生长素似乎并不是生根部位形成不定根能力的限制因素[10]、[24]-[26]，招募根分生组织或胚胎程序的能力，以及生长素和细胞分裂素信号通路对参与干细胞生态位组织的基因调控的影响似乎是影响干细胞分化的关键因素新创几种植物的再生[27]-[36]。细胞在生长素局部分布中产生极性变化的能力也会影响细胞的命运[37];或者，转录调节网络可以作为细胞命运变化的发育信号[33]、[34]、[38]、[39]。胚胎根分生组织的建立涉及到假定转录因子的GRAS家族成员，包括稻草人(SCR)，稻草人样(SCL)和SHORT-ROOT (SHR)蛋白。这些基因也参与根、下胚轴和气生器官的放射状形态。其表达与生长素在根尖分生组织中的分布有关[40]-[45]。一个P. radiata稻草人一样（PrSCL1)基因和像稻草人的板栗（CsSCL1)基因，该基因在根和根原基中表达，并在外源生长素存在的情况下，在不定根形成的早期阶段诱导于有根能力的细胞[16]、[17]、[46]。此外，Solé等。[17[词汇描述P. radiata短根（PrSHR该基因也在根和根原基中表达，并且在无外源生长素的情况下，在不定根形成的早期阶段，在根能力细胞中被诱导。这些作者得出结论，这些基因和转录因子的GRAS级联在不定根诱导的早期阶段通过生长素依赖和生长素不依赖途径发挥作用[18]。

为了研究与不定根成熟相关的衰退是否与GRAS转录因子有关，对松木中的GRAS家族进行了研究。此外，13名学生的成绩单肝在不定根形成的最初阶段，即细胞重组状态，在细胞分裂导致不定根分生组织形成之前，比较了有根能力和无根能力扦插对生长素的响应基因。表达分析也一直进行到组织根分生组织的快速细胞分裂开始之后。对生长素在同一时间内的分布进行了分析。我们还检查了肝体细胞胚胎发生过程中的基因[47]，在初始细胞形成、胚胎极化和胚胎分化阶段(图1A, b, c, d)。

松肝基因家族:在网上的识别肝基因、基序预测和系统发育分析

继续我们之前对松木的研究肝基因及其在不定根形成成熟相关衰退中的作用[16]、[17]、[46),一个在网上进行了搜索，以确定松木GRAS家族的新成员。的初始BLAST搜索松果体和云杉Genbank数据库中的序列[48]，使用GRAS基序的保守序列，鉴定出31个EST序列，这些序列被分为13组，代表假定的单基因序列。p .放射虫纲我们实验室获得的序列被用于设计表达分析的引物(见下文)。

在使用Europine数据库进行第二轮搜索后[49]，共90条ESTs和基因组序列云杉glauca，云杉sitchensis，松果体albaucalis，松果体ayacahuite，松果体banksiana，白皮松，松果体cembra，松果体contorta，赤松，松果体flexilis，松果体gerardiana，松果体korainensis，松果体lambertiana，松果体monticola，松果体morrisonicola，松果体松树，松果体pinea，松果体辐射，松果体strobiformis，松果体sibirica，松果体有鳞目，抗旱性，松果体taeda，松果体thumbergii,松果体wallichiana被获得。此外，三个全长cdna来自p .放射虫纲［16]、[17和5个3 '端cdnaP. radiata, P. pinea和p .松树包括了我们数据库中可用的cDNA序列，共98条。的在网上这些序列的比较导致鉴定21个独特的成员肝松木基因家族。

之后的发布挪威云杉和p . taeda基因组序列，使用Congenie和Dendrome数据库进行第三轮搜索[50]、[51]被执行。一共36个p .冷杉属和65年p . taeda基因模型进行了分类，并与先前鉴定的基因模型一起鉴定出了32个独特的松木成员肝基因家族(附加文件1）.除了可控硅和月基因，预测基因的命名遵循我们之前工作的命名法[16]，SCL1来SCL30(附加文件1）.

32个中的25个肝基因，至少一个预测基因被确定在松树和云杉(附加文件1）.7个额外的预测基因被发现p . taeda其中没有假定的邻位p .冷杉属或其他松树品种(附加文件1）.对发现超过一个完整序列的25个成员的预测氨基酸序列进行两两比较，显示出高度的保守性。松树序列的同源性为89.7% ~ 99.5%，松树与云杉序列的同源性为84.7% ~ 97.2%，除AtSCL26相关序列(见下文)外，松树与云杉序列的同源性差异较大，为72.0 ~ 88.4%。

为了对针叶树的GRAS蛋白进行分类，使用包括保守的GRAS c末端基序在内的493个氨基酸片段对52个松树和云杉预测的GRAS蛋白序列进行了系统发育分析。为了避免可能的假基因，只包括完整预测的GRAS蛋白序列。每个针叶树的GRAS家族成员，无论是来自松树还是来自云杉，至少有一个序列被纳入分析。该树根据其与经典GRAS蛋白亚家族的同源性对序列进行了分组[52]，并揭示了另一个组的存在，该组主要包含松树序列，与AtSCL26同源(图2，附加文件2）.

利用100个序列的400个氨基酸片段，包括属于GRAS蛋白亚家族的52个针叶树和47个被子植物的序列，系统发育分析了针叶树和被子植物的GRAS蛋白的进化关系[52]。一个序列Physcomitrella金属盘被用作外组(附加文件2）.系统发育树显示，预测的松树GRAS蛋白并没有聚集成一个单独的分支，而是分布在被子植物的GRAS亚家族中(附加文件)2）.该分支的序列分布与针叶树的序列分布相似，表明AtSCL26分支确实是一个亚科，包括12个松树，2个云杉和1个拟南芥序列(附加文件)2）.

除了52个完整的假定的GRAS序列外，共有37个(p . taeda)及22 (p .冷杉属)编码部分GRAS蛋白的假设基因被鉴定出来(附加文件1）.这些可能是由于基因重复而产生的假基因，在植物的SCR、SHR、PAT和AtSCL26亚家族中较为常见p . taeda的PAT和DELLA亚家族中p .冷杉属(附加文件1）.

松木GRAS蛋白的保守基序和内在无序的n端结构域

将假定的GRAS序列与先前描述的蛋白质进行比较，发现它们包含具有GRAS蛋白特征的结构域。对预测序列的分析揭示了高度保守的VHIID基序的存在，成员之间的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸残基的变化，以及蛋白质c端区域的PFYRE和SAW基序的变化(附加文件)3.）.在C端也发现了两个亮氨酸重复序列(LHRI和LHRII)。此外，还鉴定了LXXLL基序和其他已知的GRAS蛋白家族成员(如RVER或LRITG基序)中保守的几个氨基酸残基。SAW基序包含对保守残基RX4E, WX7G和WX10W。获得了32个多基因家族成员的全长序列。GRAS蛋白的n端区域是可变的;然而，类似于PrSCL1和PrSHR中发现的重复疏水/芳香残基两侧富含酸性残基的区域[16]、[17]，也在松树的其他GRAS蛋白中发现(附加文件4）.分别在SCL5和SCL12中发现了脯氨酸和天冬酰胺的均聚拉伸，而在SCL21的GRAS区域发现了甘氨酸拉伸。

所分析的蛋白质的n端区域的一个共同特征是在促进紊乱的残基中富集，如脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸，或在与紊乱或结构无关的氨基酸中富集，如丙氨酸、精氨酸或天冬氨酸[53]。将这些蛋白与属于同一亚科被子植物的相应蛋白的无序谱进行比较，发现其n端区域具有本质的无序性。内在无序的概要文件在同一亚家族的成员之间是保守的(附加文件5）.

的结构肝松木多基因家族表明个体的不同作用肝构成或诱导过程中的成员。扩展我们之前对基因表达模式的分析肝基因(16]、[17]，并显示与不定根形成成熟相关的衰退相关的空间和诱导表达模式的可能差异，32个中有13个的相对转录丰度肝采用qRT-PCR方法测定了植物营养发育、体胚发育、胚后发育过渡、不定根诱导早期对生长素响应的基因含量p .放射虫纲。选择用于表达分析的基因是那些最初从Genbank的EST集合中鉴定的基因，其中包括除AtSCL3外的所有亚家族成员。PrSCL1和PrSHR在营养发育期间的器官和不定根形成期间的21日生幼苗的下胚轴扦插中，已测定了其表达水平[16]、[17]。

的本构转录谱肝基因在器官中的变化肝体胚发育和胚后发育转化过程中的mRNA水平

描述…的表达模式肝利用从35日龄松树幼苗的根、下胚轴、茎尖节段(包括顶端分生组织、幼针和茎段)和子叶中分离的rna进行营养发育过程中不同器官的基因分析。结果表示为相对于根中的表达水平的值(图3.A).此外，变化肝在体细胞胚胎发育过程中也研究了mRNA水平(图3.B)和胚胎-胚胎后发育转变(图3.C).为此，分析了不同年龄的幼苗发育中的体细胞胚胎以及胚胎起源和胚后起源器官中的mRNA水平。合子胚胎很难在特定的发育阶段分离出来，但是p .放射虫纲体细胞胚胎表现出非常相似的发育模式;因此，具体的发展阶段可以被定义和隔离。从增殖阶段的胚性块、成熟早期和晚期的体胚、21日龄和90日龄幼苗的下胚轴或上胚轴扦插中分离出的rna用于分析胚胎发育期间和胚胎-胚后发育过渡期间的表达模式。结果用在增殖培养基中7天后相对于胚性肿块的表达值表示。的表达式PrSCL16在所有测试的RNA样本中都没有检测到。

大多数肝基因在根中均表现出较高的mRNA水平PrSCL6幼苗下胚轴和茎尖含量较高。PrSCL13和PrSCL14在子叶中也有较高的表达量。在其他组织中的相对丰度取决于单个的GRAS基因(图3.一个)。

分析肝体胚发育过程中的转录谱(图3.B)显示了所有的转录水平肝基因,除了PrSCL10在胚性块中表现出较高的水平，在成熟后期的胚胎中显著高于其他阶段。mRNA水平PrSCR，PrSHR，PrSCL1，PrSCL6，PrSCL8和PrSCL12在胚胎早期成熟阶段增加了2到4倍(图3.B).分析肝从胚胎发育到胚胎后发育的发育转变的转录谱(图3.C)显示;PrSCR和PrSCL6在21日龄苗的下胚轴中维持相对较高的水平肝在较老苗的下胚轴和上胚轴中也保持相对较高的水平(图2)3.C)。

成绩单简介肝适能茎和非适能茎扦插不定根过程中的基因

可能的作用肝通过评估21日龄和90日龄幼苗下胚轴和上胚轴插枝对生长素响应的时间表达模式，分析了导致生根能力丧失的基因(图2)4）.用10 μM吲哚-3-丁酸(IBA)处理岩屑[16]、[17]。然后，在处理开始后24小时、48小时和5天，分析扦插基部的转录谱，并与切除时(时间0)的对照组织进行比较。数据以归一化后的mRNA水平表示核糖体18岁［16]、[17]，并作为相对于它们的切除时间(时间0)的折叠感应PrSCL16在所有测试的RNA样本中都没有检测到。

在21日龄幼苗不定根期间的下胚轴扦插中观察到几种表达模式(图2)4一个)。PrSCL2，PrSCL6，PrSCL7，PrSCL10和PrSCL12在外源性生长素存在的情况下，mRNA水平增加，类似于PrSCL1的表达模式[16]。PrSCL2和PrSCL12在无外源生长素的情况下，mRNA水平甚至升高PrSHR的表达模式[17]。PrSCR，PrSCL5，PrSCL8，PrSCL13和PrSCL14在根诱导过程中，mRNA的表达水平没有任何变化。没有肝基因在90日龄幼苗的无生根能力下胚轴扦插中，无论有无外源生长素，mRNA水平均有所增加(图2)4一个)。PrSCR和PrSCL6在根诱导条件下，未检测到mrna的下胚轴4一个)。

在90日龄幼苗不定根期间的上胚轴扦插中也观察到几种表达模式(图2)4B)。PrSCL2，PrSCL10和PrSCL12在外源性生长素存在时，mRNA水平升高PrSHR，PrSCL1和PrSCL2在无外源生长素的情况下，mRNA水平甚至升高。PrSCR和PrSCL6无论有无生长素，均未检测到mrna。PrSCL5，PrSCL7，PrSCL8，PrSCL13，PrSCL14和PrSCL16未检测上胚轴。PrSCL2在缺乏外源性生长素的情况下，21日龄幼苗的生根能力强的下胚轴扦插和90日龄幼苗的生根能力弱的上胚轴扦插的mRNA水平均升高。然而，在外源生长素存在时，转录水平的增加显著更高(图4A、B)。

两个基因的表达，PrSCL1和PrSHR，分别与生长素依赖和生长素不依赖的信号通路有关[16]、[17]，并用原位杂交在不合格的扦插中。在我们之前的工作中，研究表明，在诱导生根24小时后，21日龄幼苗下胚轴的生根能力组织中，这两种基因的转录水平都有所增加[17]。这些基因在无功能的下胚轴或上胚轴的形成层中不主要表达，在生根条件下也不主要表达(图)5A, B, C, D)。在不定根过程中，所有样品均未观察到特定的组织定位。当组织被杂交感官定向探针时，未观察到信号(图5E、F)。

外源生长素和极性生长素转运抑制剂存在时生长素在生根能力和非生根能力扦插中的分布

松树生长素依赖不定根的形成与生长素的定向流动以及邻近细胞对游离生长素的竞争有关[10]。组织特异性生长素梯度可以引起特定的细胞反应。通过分析吲哚-3-乙酸(IAA)的分布，探讨了内源生长素在不定根形成过程中在有根能力和无根能力组织中的分布作用。实验分别在切除时和24小时后进行，添加或不添加外源性生长素。通过免疫细胞化学方法分析IAA的分布，使用对抗IAA的抗体(图6,图7）.IAA主要位于能生根的下胚轴形成层区域，包括在切除后和根诱导的最初24 h内离心定位于树脂管的细胞(图6A, B, C, D)。用生长素转运极性抑制剂1- n -萘酞酸(NPA)处理有根能力的下胚轴，会导致内源生长素的错位，生长素也分布在髓、维管柱体和皮层(图)6E, F, G, H)。不发育的下胚轴和上胚轴形成层细胞无生长素积累。生长素主要位于下胚轴的木质部薄壁组织(图7A, B, C, D)和上胚轴皮层(图7E, F, G, H)。在缺乏抗体的情况下，组织杂交时未观察到信号(附加文件)6）.

植物在分化过程中并没有丧失其发育潜力，并保持一定程度的可塑性[54]，或通过维持成体组织中的前胚胎细胞或分生细胞，或通过重大的发育重编程以获得胚胎或分生状态[55]。植物组织的可塑性决定了除分生组织、侧根母细胞和合子外的其他细胞的再生能力。

异位位置的体细胞分化细胞再生能力的下降与树种的年龄和成熟有关[13]。人们努力鉴定与植物细胞命运开关相关的基因[34]、[38];然而，多能性或不确定性基因在未分化的胚胎细胞或发育早期高表达，在已丧失再生能力的成体组织中表达量显著降低甚至不表达，但在具有再生能力的组织中保留或在成体细胞再生过程中重编程后诱导[56]，尚未被描述。我们利用在非分化增殖条件下或经过分化的胚生培养物，以及对生长素反应具有不同不定根能力的不同年龄植物的成体组织，鉴定了与成体组织形成不定根的能力和重编程相关的基因、基因表达水平的变化和调控机制(图1）.

在我们之前的工作中，有两个成员肝基因家族p .放射虫纲，PrSCL1和PrSHR，均与适根扦插不定根的形成有关[16]、[17]。GRAS蛋白参与一系列不同的生理和发育过程，从光和激素信号转导到器官识别和组织分化[57]、[58]。其中，SCR和SHR参与根的模式形成，建立静止中心的身份，并维持根分生组织中初始细胞的干细胞状态[43]、[44]。此外，它们还参与了根尖再生[59]和细胞重编程[38]。在动物中，GRAS蛋白已被鉴定为与STAT蛋白同源的蛋白[60]，它们也与分化、重编程和再生有关[61]、[62]。

在松树中编码GRAS蛋白的基因家族很大。中至少有32个唯一成员被鉴定为支持cdnap . taeda(附加文件1)所述的数字，与p .冷杉属(附加文件1),拟南芥［63]-[65]，比中描述的数字高p .松树和p . glauca(附加文件1) [65]、[66]，并低于栽培稻，杨树trichocarpa和芸苔属植物拉伯［63]、[65]、[67]。有18名成员在p .放射虫纲(附加文件1) [16]、[17]。不同松树和云杉物种的每个GRAS成员的预测多肽的成对序列相似性证实，它们可能代表相同基因的种内或种间等位基因，类似于针叶树物种中其他基因家族的描述[68]、[69]。属于AtSCL26组的蛋白质具有较低的同一性，这可能与大量的重复事件有关，可能是为了获得新的功能(图2和附加文件2）.

系统发育分析表明，针叶树的GRAS蛋白不形成一个单独的簇(图2和附加文件2)，大部分都属于主要的GRAS亚科[16]、[17]、[52]、[57]、[58]。HAM家族包含AtSCL26亚家族，与被子植物相比，这可能是针叶树序列大量重复事件的结果。3亿年前针叶树从被子植物中分离出来[70]。针叶树和被子植物之间的系统发育关系强调了这个家族的古代多样化，这可能先于向陆地环境的过渡，正如Engstrom [71基于被子植物、苔藓植物和番茄植物的GRAS蛋白的比较，而不是裸子植物。针叶树序列的古老多样性和非聚类性表明这些蛋白质在主要的本构或诱导过程中的功能或作用方式[72]-[77]。

多肽序列的分析表明，在代表性的GRAS核心基序中具有高度的保守性(附加文件)3.) [52]、[57]、[58]，这表明在针叶树中，转录调控机制也是保守的。预测的GRAS蛋白的n端结构域在松树中高度可变(附加文件4)，与被子植物GRAS蛋白的n端结构域相似[57]、[58]。均聚拉伸，如被子植物GRAS蛋白的特征[63]、[64]、[78]，除了在PtSCL5和PtSCL12中发现的脯氨酸和天冬酰胺延伸外，在针叶树的GRAS蛋白中没有发现。来自松树的GRAS蛋白的n端氨基酸组成谱与内在无序蛋白的氨基酸组成谱非常相似，并且含有促进无序残基的富集(补充文件)4和5）.然而，正如其他GRAS蛋白所描述的那样，c结构域显示出与完全结构蛋白相似的组成特征[57]、[58]。无序蛋白质缺乏明确的三维结构，导致其具有极大的结构灵活性，使其能够与不同的蛋白质或核酸在可逆和短暂的低亲和相互作用中形成高度特异性的复合体，这取决于变化的生理、发育或环境条件[53]、[79]。已经描述了几个植物转录因子家族的内在紊乱，内在紊乱的蛋白质与关键的细胞和信号传导过程有关[80]-[82]。内在紊乱可能是一种增加生物网络功能多样性和复杂性的方法，而不增加家族的大小，甚至不增加基因组的大小，它被认为是参与GRAS亚家族功能分化的机制[57]、[58]。尽管n端序列高度可变，但与同一亚科被子植物物种的GRAS蛋白相比，松树中的GRAS蛋白表现出保守的无序分布(附加文件)5) [57]、[58]。这与先前的建议一致[83]、[84]，表明蛋白质紊乱的模式在进化过程中比n端氨基酸序列更为保守。哺乳动物Myc蛋白也得到了类似的结果[85]。因此，不影响一般失调模式的突变将允许特定蛋白质相互作用的保存，因此，功能。

蛋白质基序和结构的保守、特定针叶树亚家族的缺失以及内在无序的n端结构域可以解释这些蛋白质在树木生物学中的多功能作用以及调节其表达水平和功能的分子机制。内在无序蛋白质识别多个分子伙伴的动态能力揭示了在功能适当的蛋白质之间需要同步时空连接肝参与特定功能的基因和蛋白质。

的表达式肝在不同器官中，在胚胎-胚胎后发育过渡时期以及不定根期间，对生长素反应的基因表现出独特和重叠的模式，表明具有不同的调节和组织特异性功能(图3.和图4）.每组中的单个基因可能获得了不同的专门功能，其中一些可能与能力和成年细胞的重编程有关，以形成不定根。许多松树肝在极化阶段(M1)到晚期成熟阶段(M3)的过渡过程中，基因的mRNA水平相对较高，表明它们在胚胎发育中发挥作用(图3.B)这些基因的一个子集，PrSCR，PrSHR，PrSCL1，PrSCL6，PrSCL8和PrSCL12，在早期成熟阶段增加它们的mRNA水平。在这一阶段，胚胎发生极化，但组织分化尚未完成;因此，这些组织，连同增殖的胚源性肿块，可能是与组织结构域建立相关的非决定性或多能性细胞的来源[47]。然而,PrSCL10在增殖7天后，即首字母出现时，其mRNA水平相对较高。因此，这些基因在胚胎组织结构域或激素梯度的初始建立中起着关键作用[86]。其中,PrSCR和PrSCL6在胚胎起源的器官如下胚轴、子叶和芽尖中高度表达。此外,PrSCR，连同PrSHR，PrSCL1［16]、[17]，PrSCL5，PrSCL7，PrSCL8和PrSCL12在营养发育过程中，根中的mrna水平高于任何其他器官，表明其在根中的作用(图3.A).这些结果表明，这些基因的表达不仅限于胚胎发育，而且扩展到其他过程。然后，我们分析了与胚形成早期阶段相关的基因表达水平是否在已失去生根能力的插枝中显著降低，甚至不存在，但在有生根能力的组织中保持或在成体有生根能力细胞重编程后诱导形成不定根。

PrSCL6和PrSCR在生根能力强的下胚轴中保持相对较高的mRNA水平，而其他肝基因在有生根能力的下胚轴和无生根能力的下胚轴或上胚轴中均有表达(图3.C).这些结果表明PrSCL6和PrSCR，除了在胚胎发育中的功能外，还与一种胚胎特征有关，该特征可能导致扦插中不定器官发生的能力。在正常和非正常组织中对不定根形成过程中这些基因的分析表明PrSCL6生长素只在有生根能力的下胚轴中诱导，并且在最初48小时内表达增加，这段时间是生长素起作用以及形成层细胞重组或去分化所需的时间[10]、[11]、[16]、[17]。PrSCL6在根无功能的下胚轴或上胚轴中检测不到(图4A, B).当PrSCR表达式分析;然而,PrSCR在有根能力的下胚轴中不被诱导，但其mRNA水平在这些组织中维持在高于无根能力的下胚轴或上胚轴的水平，其中PrSCR在生根的初始阶段是检测不到的(图4因此，这两种基因都可能与胚胎细胞或发育的早期阶段有关。它们的mRNA水平在已失去生根能力的较老、较成熟生根扦插中显著降低甚至丢失，但在不定根形成过程中，经过成体能力细胞的重编程，它们的mRNA水平在活性下胚轴中得以维持或升高。这将使它们成为生根能力和细胞重编程的候选基因。

其他基因的mRNA水平，如PrSHR PrSCL1，PrSCL2, PrSCL10和PrSCL12,在有能力和无能力扦插的不定根过程中以生长素、年龄或发育依赖的方式发生变化(图4A, b) [16]、[17]。局部的增加PrSHR和PrSCL1胜任组织中的mrna [17]，在无功能的下胚轴或上胚轴切屑中未检测到5)，表明它们参与了不定根。上胚轴的表达谱可能与扦插中分生组织的存在有关，如芽腋分生组织或形成层[46]、[87]。组织定位PrSCL2，PrSCL10和PrSCL12mRNA将有助于显示其mRNA变异在不定根中的作用。其他的松树肝基因似乎与不定根反应无关(图4一个)。

这些结果表明高水平的PrSCR和PrSCL6可能与组织形成不定根的决心程度、能力和/或重新编程能力有关，而其他也表达或诱导的基因，如PrSHR，PrSCL1，PrSCL2，PrSCL10或PrSCL12，可能以年龄或发育依赖的方式参与与生长素依赖通路和生长素不依赖通路相关的转录调节网络。因此，这些基因在决定细胞是否在有能力的组织中成为根时的参与是不能被丢弃的。的低表达水平PrSCR和PrSCL6可以使这些速率限制步骤在能力和生长素诱导的过程中。此外，所有这些基因都是在不定根形成的早期阶段表达或诱导的，在细胞分裂开始导致根分生组织形成之前。500个转录因子中的26个在早期事件中表达，在最初的24小时内发生，导致细胞的再生拟南芥来自原生质体的植物，在衰老过程中不表达[38]。

基于亚家族的基因功能分析表明在决定和模式中可能发挥作用。可控硅和月参与根分生组织的确定[43]、[44并与其他转录因子一起参与了基因的重编程拟南芥［38]。此外,PrSCL1，可能与生根过程有关，与松、板栗的不定根和侧根分生组织有关[16]、[46]，并与板栗的芽腋生分生组织[46]。同时,PrSCL2和PrSCL12是两个GRAS亚家族(分别为Ls和HAM家族)的成员，它们与侧分生组织的测定有关[88]、[89]。虽然PrSCL10被包括在GRAS蛋白的PAT家族中，该家族与光反应有关[90]，该亚家族成员也与细胞防御有关[91]、[92]。因此，这个亚家族在功能上也是多样化的。总的来说，不定根能力、重编程和确定的作用可以被设想为松树的一个子集肝基因。

的不对称增长PrSCL1和PrSHR先前在形成层区和根能力细胞中描述的转录水平[17]在不合格的岩屑中未检测到(图5A, B, C, D)。在这些插枝中，表达扩散到皮层和分裂细胞。在不同发育阶段的相似细胞类型的不定根形成的早期阶段，mRNA的不对称增加表明，松树中存在特定的细胞信号通路或特定因子，可能分布在与生根有关的组织中的细胞类型和发育阶段特定的环境中，这可能对生根能力至关重要[18]、[46]。这些信号通路或因素的性质尚不清楚。新创器官形成和细胞规范是涉及组织极性重排的过程，生长素的时间和空间分布是一个非常重要的角色，有助于组织极化和模式[93]。扦插基部有生根能力和无生根能力的下胚轴和上胚轴在生长素的摄取、积累或代谢方面没有差异[10]。然而，在根茎切除后，生长素在有根能力的组织中呈不对称分布，并在根诱导的最初24小时内保持这种分布(图6A, B, C, D)在哪里PrSHR和PrSCL1表示为[17]。在无功能的下胚轴或上胚轴中未观察到不对称分布(图7）.抑制生根的NPA处理[10而不改变维管柱、皮层或髓中的细胞层数，改变了生长素的分布模式(图6E, F, G, H)，表明生长素极性转运，导致生长素在切割基部积累[10]，以及生长素在组织或细胞水平的定位和分布。这一结果表明，植根能力组织在切除后仍能保持固有的生长素维持或积累能力，这对生根至关重要。原始细胞产生生长素梯度的能力可能是一种机制，涉及分生组织的确定和维持，芽分生组织中外侧原基的诱导，以及侧根或不定根的形成[20.]、[94]-[96]。生长素的分布很大程度上取决于PIN生长素载体蛋白的动态表达和亚细胞定位[97]。然而，PIN活性可以被内源性或外源性信号调节，如其他激素、压力或组织特异性因素，从而触发发育决定，从而通过触发细胞命运或其他局部变化来启动再生[37]、[87]、[98]-[101]。在正常和不正常的岩屑之间，没有观察到损伤应力反应的差异[102];因此，其他依赖组织的信号也可以通过诱导细胞命运重新规范或重新建立生长素分布来触发重新模式。转录因子是调控模块的主要参与者，控制生长素梯度、位置信息和极性场的发展，从而形成涉及器官形成的交叉调控网络[103]-[107]。基因的差异表达，如PrSCR和PrSCL6在生根能力和非生根能力的插枝中，以及基因的差异反应，如PrSCL1或PrSHR(图4, (16]-[18可能表明特定的GRAS转录因子通过参与生长素的分配、控制细胞类型分裂或其他机制参与了局部的生根能力。生长素相关的增加PrSCL1根诱导24 h后各活性组织中mRNA的表达[17]可能与生长素在这些组织中的定位同时相关(图6A, B, C, D).生长素在时空分布上的重叠(图6A, B, C, D)和生长素无关的增加PrSHR信使rna (17]可能表明信号通路之间可能存在串扰，也许建立了反应域，激活了一系列其他信号通路肝恢复细胞分裂前的基因或根决定因素。萨巴蒂尼等人。[44提出可控硅- - -月-表达细胞能够获得静止中心身份，生长素分布是在SCR或SHR表达域内指定细胞子集的线索。然而，SHR通路通过转录调节网络调控根的发育，也通过影响细胞分裂素和生长素信号通路相关基因的表达拟南芥，导致荷尔蒙反应的微调[87]、[99]、[108]。此外，产生根的地面组织的形成分裂是由SHR控制的拟南芥其特异性调控参与细胞分裂的特定基因的时空激活，并通过SCR激活参与形成分裂的d型细胞周期蛋白[109]。

不定根形成处理诱导根分生组织模式基因，如肝基因，在能力细胞开始细胞分裂之前。相同的肝基因也可能在胚胎发生、初始形成和极化的早期阶段发挥作用。在草本和木本植物(包括森林树种)中，维持或吸收根分生组织或胚胎程序以响应特定刺激的能力似乎是将细胞转换为不同发育程序的关键。34]-[36]、[38]、[110]。然而，这种表达模式是否代表了维持、去分化或转分化到胚胎或根的身份，或者它代表了一种不同的成人发育程序，独特的再生，如在拟南芥［111，目前仍不清楚。

植物材料、根诱导和体细胞胚胎发生

松(p .放射虫纲D. Don)种子按照前面描述的那样发芽并培养幼苗[16]。每天用水处理，21天后每周用2 g/l的市用可溶性肥料(NPK 20-7-19 [w/w/w])处理。用于不定根诱导的扦插按[16]。简单地说，21天树龄的下胚轴插枝，包括完整的上胚轴，以及90天树龄的下胚轴或上胚轴插枝，通过切断其基部的下胚轴或上胚轴，并将其修剪到距离子叶(下胚轴)或顶端芽(上胚轴)2.5厘米的长度来制备。除了一根顶端的针簇外，所有的针都从上胚轴上除去，以获得与下胚轴相似的叶表面。将插枝连续暴露在10 μM的IBA中进行根诱导(图2)1E, F, G)。未经过IBA处理的岩屑作为对照。IBA从Sigma (St. Louis, MO, USA)以IBA- k的形式提取并溶于蒸馏水中。为了进行生长素免疫定位实验，21日龄幼苗的下胚轴也用NPA在生长素存在和不存在的情况下处理24小时。NPA从Duchefa (Haarlem, Netherlands)获得，溶解在DMSO中。用DMSO处理的下胚轴也作为这些实验的对照。诱导根的条件与幼苗生长的条件相同[16]。胚胎胚柄团和体细胞胚胎也被用于分析(图1A, B, C, D)。由Christian Walter博士(Scion, Rotorua，新西兰)提供的胚性系M95通过每两周将单个团块传代培养到EDM6培养基上进行增殖和维持[112]。体胚成熟时，500mg胚性组织悬浮在25ml EDM6液体培养基中。收集组织悬浮液，将5 ml等分倒入滤纸盘(80 g/m2 43 ~ 48 μm;ANOIA过滤实验室;巴塞罗那，西班牙)在Büchner漏斗。真空脉冲抽干液体，将附着细胞的滤纸放入直径90mm的有成熟培养基的培养皿中，培养皿以EMM1培养基配方为基础[112]，添加15 mg·L⁻¹脱落酸，30 g·L⁻¹蔗糖和6 g·L⁻¹Gelrite®。培养在23±1°C的黑暗环境中保存。在高压灭菌前，将介质的pH调至5.8。氨基酸和脱落酸溶液经过滤灭菌后加入冷却的高压灭菌介质中。

RNA提取，定量和cDNA合成

为了分析不定根期间的基因表达，从每个处理和每个实验指定的时间点收集30个1厘米长的下胚轴或上胚轴扦插，立即在液氮中冷冻，并保存在−70°C下，直到用于RNA分离。从扦插中分离和定量总RNA已在以前有过描述[16]。RNA也从植物幼苗的不同器官提取，在每个实验中指定。胚胎发生组织样本用于不同发育阶段的表达分析实验:最后一次传代到新鲜增殖培养基后7天和14天的增殖组织(图1A-B)，发育早期成熟阶段的体细胞胚胎(图1C)和成熟后期的体胚(图1D).将组织冷冻在液氮中，并储存在−70°C，直到用于RNA分离。按照制造商的说明，使用RNeasy®Plant mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取总RNA。在提取缓冲液中取50 - 100 mg胚性组织或胚胎，用杵在1.5 ml Eppendorf管中研磨。rna按照制造商的说明用RQ1 DNase (Promega, Madison, WI, USA)消化，然后用Amicon®Ultra色谱柱纯化(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)。RNA浓度和质量用ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies Inc.， USA)测定。RNA是从至少两个生物重复中制备的。用1 μg总RNA合成cDNA。定量RT- pcr使用200 ng随机引物，使用SuperScript™III逆转录酶(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)，根据制造商说明书进行RT反应。

系统发育分析

如前所述，将GRAS蛋白的保守c端区域，加上尽可能多的最短蛋白质序列的n端区域，用于系统发育分析[16]、[17]。多肽与Clustal Omega进行比对，随后在Mobyle门户网站上使用PHYLIP包(系统发育干扰包，3.67版，美国华盛顿州西雅图华盛顿大学遗传系)的程序进行分析(http://mobyle.pasteur.fr/) [113]。使用SEQBOOT进行了引导分析，并生成了1000个重复，使用Dayhoff PAM矩阵算法使用PROTDIST生成了一组距离矩阵。利用邻居连接法生成一组无根树，利用共识树得到一棵共识树。编码的假定SCLPhyscomitrella金属盘美国东部时间(114]作为外组。树是使用TreeDyn在Phylogenie门户(http://www.phylogeny.fr/version2_cgi/one_task.cgi?task_type=treedyn) [115]。

蛋白质内在失调的模式

使用蛋白质无序预测系统服务器(http://prdos.hgc.jp/cgi-bin/top.cgi) [116]和IUPRED方法(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/quick2_d) [117]。

定量RT-PCR

RNA的提取，定量和cDNA的合成已在之前的描述[16]。引物设计、效率分析和聚合酶链式反应如前所述[16]。一个18S rRNA基因(Ri18S)作为对照[16]。松肝设计了特异性引物p .放射虫纲我们实验室获得的序列(见下面的引物列表)。表达率由公式2得到^{^ -ΔΔCT}(应用生物系统，技术公报#2,P/N4303859B)。结果以至少3次生物重复的平均值±标准误差表示。

扩增引物鸭肝基因如下:PrSCR F: TGTCACGGGCTCAGACACAA, PrSCR R: GGAAGGAACCTCCATGGCTC, PrSCL1 F: TCAATGTCTGGCAAATCGTCC, PrSCL1 R: GCGCCCAGTCTCTTCAATTCT, PrSCL2 F: TCAGTGGCGTATTGTGATGGA, PrSCL2 R: AGAGAGAAACCCCGACGATTC, PrSHR F: GAACCAGTGCAAGGAGCATTG, PrSHR R: AAATCCTGCCTCCTTGAGCCT, PrSCL5 F: TCTAAACCCTTGCGCAGTAGC, PrSCL5 R: CCCATGTGCTGCAAGCCTA, PrSCL6 F: ACCCAGAGAATGAGAAAGGCC, PrSCL6 R: TCTTTCTTCAGACCCCATCCA, PrSCL7 F: CCTTGCCCGAGACATAGTGAA, PrSCL7 R: AAGCCTGCCATGGTCATTCTA, PrSCL8 F:gctggctttaccgacccc, PrSCL8 R: cccccttttctgcccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccl10 F: agaattagttgtgtggcscccccccccccccccc12r: acggcgtccatgttggccacatgt, PrSCL13 F: ccttgaggccgcccccacatga, PrSCL13 R: tgccccctatgccgcccttct, PrSCL14 F: ggccaatcacatgcatgct, PrSCL16 F: ttggagtagtgcgcccccc16 R: gttgcttctgcattccctc和PrSCL16 R: gttgcttctgcattcctc。

原位杂交

以90日龄幼苗下胚轴和上胚轴扦插1 cm的基部为材料，用10 μM IBA处理24 h，并进行相应对照。将基部1厘米的插条嵌入并冷冻在干冰中的Jung组织冷冻介质(Leyca Microsystems, Heildelberg, Germany)中。将基底5mm的样品切成10 μm的横切面，收集在3-氨基丙基-三乙基硅胺载玻片上。低温器切片在40°C的热板上干燥，并在3:1 (v/v)乙醇:冰醋酸中固定10分钟，然后在70%乙醇中固定5分钟。生成PrSHR特异性探针中，有一个350 bp的片段对应于基因的3 ' -未翻译区PrSHR[缺少poly(A)尾]克隆到PCR®II载体(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)并扩增。根据制造商的说明(DIG RNA标记试剂盒SP6/T7, Roche Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)，将两侧有SP6和T7启动子的PCR片段作为模板，分别用T7或SP6聚合酶合成有意义和反义digg标记探针。通过碱处理，探针部分水解至平均长度为200个核苷酸。的原位如Sánchez等所述进行杂交。[118]。1 μg·mL蛋白酶K处理各切片⁻¹在37°C下放置30分钟。蛋白酶K预处理后，切片与RNA探针在含40%去离子甲酰胺的杂交溶液中43°C孵育过夜。在37℃的2XSSC (1XSSC 150 mM氯化钠和15 mM柠檬酸钠)中洗涤4次后，用RNase A (5 μg·mL)处理玻片⁻¹)在37°C下浸泡30分钟，然后用0.1XSSC在37°C下洗涤两次。杂交信号由DIG核酸检测试剂盒(Roche Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)按照制造商的说明在黑暗中检测12小时。切片通过乙醇系列(v/v)脱水(50%和70%分别为30秒，99%为1分钟，两次)，风干并安装在Eukitt (O. Kindler, GmbH & Co, Freiburg, Germany)。照片是用奥林巴斯数码相机和尼康显微镜在亮场照明下拍摄的。

生长素immunolocalization

取21日龄和90日龄幼苗用10 μM IBA处理24 h后的下胚轴或上胚轴基部1 cm的片段和对照，在4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中4℃固定过夜。取21日龄幼苗下胚轴1 cm基部，用10 μM IBA + 10 μM NPA处理24 h，并取相应对照固定。然后在PBS中洗涤三次，每次10分钟，并在0.1%多聚甲醛的PBS中4°C固定直到使用。冷冻切片用5%牛血清白蛋白(BSA)在PBS中孵育5分钟，然后用抗iaa小鼠单克隆抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)在4°C的湿室中用1% BSA稀释1/100过夜。在1% BSA中洗涤5次，每次5分钟后，用ALEXA 568偶联抗小鼠抗体(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)在黑暗中以1:25稀释PBS 45分钟显示信号。切片在PBS中洗涤后用DAPI反染色，在Mowiol中安装，在徕卡SP5共聚焦显微镜下观察。采用LAS AF共聚焦扫描采集共聚焦光学切片。对照用PBS代替第一个抗体。

支持数据的可用性

支持本文结果的数据集包含在本文及其附加文件中。的核苷酸序列p .放射虫纲GRAS基因已存入GenBank数据库，登录号如下:PrSCR, KM264388;PrSCL2 KM264389;PrSCL3 KM264390;PrSCL4 KM264391;PrSCL5 KP244290;PrSCL6 KM264392;PrSCL7 KM264393;PrSCL8 KP244291;PrSCL9 KM264394;PrSCL10 KM264395; PrSCL11, KM264396; PrSCL12, KM264397; PrSCL13, KM264398; PrSCL14, KM264399; PrSCL16, KP244292; and PrSCL18, KM264400.

国际宇航科学院:

Indol-3-acetic酸

IBA:

Indol-3-butyric酸

NPA:

1-N-naphthylphthalamic酸

存在:

定量逆转录pcr

sci:

SCARECROW-LIKE

可控硅:

稻草人

月:

SHORT-ROOT

这项工作得到了西班牙经济和竞争力部的资助(AGL2011-30462 RootPine to c.d - s)。的松果体pinea用于比较分析的GRAS序列是在马德里地区政府资助的一个项目中确定的(S2009AMB-1668 REGENFOR-CM to c.d - s)。胚胎系M95由Christian Walter博士(Scion, Rotorua, New Zealand)提供。

从属关系

1. 生命科学系，Alcalá， Ctra。de Barcelona Km 33.600, Alcalá de Henares，马德里，28805，西班牙

   Dolores Abarca, Alberto Pizarro, Inmaculada Hernández, Silvia P Solana, Alicia del Amo, Elena Carneros & Carmen Díaz-Sala

2. 植物生理学研究所Agrobiológicas de Galicia (CSIC)， Apartado 122，圣地亚哥德孔波斯特拉，15080，西班牙

   Conchi桑切斯

相应的作者

对应到卡门Diaz-Sala。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

DA执行在网上松木GRAS多基因家族的鉴定、蛋白结构分析、系统发育分析、基因克隆及特征分析肝基因松果体放射虫纲协调基因表达实验工作，分析表达数据;AP进行了生根实验，克隆和测序肝基因p .放射虫纲器官、不定根和生长素免疫定位过程中的表达实验;IH进行了胚性培养物的维持，克隆和测序肝基因p .放射虫纲胚胎发生和胚胎-胚胎后发育过渡时期的表达实验;秘书主任执行原位杂交实验;SP-S对p . pinea和具体的黄樟肝基因比较分析;AM促成了克隆肝基因p .放射虫纲， EC有助于胚胎发生过程中胚胎发生培养和RNA提取的维持;CD-S设计实验，分析结果并撰写手稿。作者已经阅读并批准了手稿的最终版本。

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