小球茎形成和发育过程中碳水化合物代谢的转录组分析百合davidiivar。单色的

背景

球胚的形成和发育对植物的生长发育至关重要百合属植物属，因为这些过程与碳水化合物代谢密切相关，特别是淀粉和蔗糖代谢。然而，对这两个过程的转录调控知之甚少。为了深入了解参与小球形成和发育的碳水化合物相关基因，我们进行了比较转录组分析百合davidiivar。单色的鳞片繁殖后0 d、15 d(鳞片出现)和35 d(鳞片基本成型，鳞片有3 ~ 4个鳞片)的鳞片。

结果

转录组分析显示，共产生52901个unigenes，平均序列大小为630 bp。基于聚类同源基团(COG)分析，8%的序列与碳水化合物的运输和代谢有关。KEGG途径富集分析结果表明，3对文库中淀粉和蔗糖代谢是主要途径。母鳞片和鳞茎淀粉含量分别呈下降和上升趋势，与蔗糖含量的变化趋势基本一致。淀粉和蔗糖代谢的关键酶基因表达分析表明，主要水解蔗糖的蔗糖合成酶(SuSy)和转化酶(INV)在小球茎出现和膨大阶段在母鳞片和小球茎中有较高的基因表达，而蔗糖磷酸合成酶(SPS)在小球茎形态发育阶段有较高的基因表达。参与淀粉合成方向的酶如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(SBE)和颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)在母鳞片中呈下降趋势，在小球茎中表达量较高，而在解理方向的酶如淀粉去分支酶(SDBE)在母鳞片中表达量高于小球茎。

结论

对小球茎三个发育阶段的转录组分析为我们了解小球茎碳水化合物代谢相关基因提供了大量的新信息百合属植物在转录水平上，在分子水平上证明了小球茎出现和发育过程中碳水化合物代谢的基础性作用。这将有助于进一步研究百合和其他相关物种中这些过程的分子机制。

百合(百合属植物属单子叶观赏植物，是花卉工业中主要的球根花之一[1］．分类学的,百合属植物属由115种组成，其中约55种原产于中国[2］．l . davidiivar。单色的的突变。l . davidii杜鹃属是中国甘肃省兰州市的一个重要属，具有重要的经济价值和观赏价值。它以体积大、果肉白而厚、味道甜而闻名。3.]，其燃烧和华丽的颜色提供了它的观赏价值。此外，百合鳞片还含有丰富的蛋白质、碳水化合物、脂类、氨基酸和酚糖苷、甾体皂苷、生物碱等生物活性化合物[4］．此外,l . davidiivar。单色的鳞茎因其丰富的营养价值(11.46%的淀粉，10.39%的蔗糖，5.61%的果胶，3.36%的蛋白质)而被认为是保健食品，在中药中有不同的形式，如鲜鳞茎，干鳞片和粉末，用于治疗心脏和肺部疾病[5］．

繁殖的百合属植物属可以通过各种方法获得，包括鳞片扦插、茎上的小球茎、球茎、种子繁殖和组织培养[6］．在所有情况下，球根的形成和发育在这种植物的生命周期中都是至关重要的。尽管有大量关于园艺生产和组织培养的文献百合属植物但是，控制小球发育的遗传机制仍然未被探索和不清楚。的生长和发展百合属植物鳞茎与碳水化合物代谢密切相关[7]，因为碳水化合物可以作为基石和能量来源，以发展光合作用装置。作为碳水化合物的主要形式，淀粉和蔗糖对多种碳水化合物的平衡和协调至关重要[8]、[9］．淀粉-蔗糖代谢是植物生理生化研究的热点[10］．然而，淀粉和蔗糖的代谢是一个复杂的生理过程，因为淀粉和蔗糖与可溶性糖的关系密切，碳水化合物的代谢涉及数十种酶[11］．

在高等植物的非光合细胞中，从光合装置运输的蔗糖被裂解为其组成的单糖、己糖或磷酸化己糖，然后可用于代谢或生物合成反应[12］．蔗糖可由四种不同的酶促机制降解[13] - [15］．首先，它在外质体中被细胞壁转化酶(CWIN, EC 3.2.1.26)水解成己糖(葡萄糖和果糖)(见图1)1)．生成的己糖通过己糖转运体运输到细胞质中(图2)1)．其次，由蔗糖转运体从韧皮部运输胞质蔗糖(图3)1)也可能被液泡转化酶(VIN)带入液泡中水解(图中1′)1)．其余两种机制都发生在细胞质中。第三，蔗糖被细胞质转化酶(CIN)水解成己糖(图中1″)1)．己糖通过己糖激酶(EC 2.7.1.1)转化为己糖-6-磷酸(图4)1)．果糖-6-磷酸(F-6-P)通过葡萄糖-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)转化为葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)(图5)1)，但另一方面，F-6-P可以通过蔗糖磷酸合成酶(SPS, EC 2.4.1.14)合成蔗糖(图6)1)．第四，蔗糖合成酶(SuSy, EC 2.4.1.13)将蔗糖可逆地转化为果糖和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)(图7)1)．然后，在UDPG焦磷酸化酶(UGPase, EC 2.7.7.9)的作用下，UDPG进一步代谢为葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)(图8)1)．G-1-P，也可由G-6-P转化为磷酸葡萄糖酶(PGM, EC 2.7.5.1)(图9)1)，通过ADPG焦磷酸化酶(AGPase, EC 2.7.7.27)作为腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)的前体(图10)1)[16］．G-1-P和G-6-P都是通过磷酸盐转译进入淀粉体的(图11)1)，而ADPG则通过ADPG转运体进行转运(图12)1)．然后淀粉在淀粉体中进行生物合成。淀粉在化学上可分为两种均聚物:直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是一种几乎线性的α-1,4葡聚糖分子，由AGPase和颗粒结合淀粉合酶(GBSS, EC 2.4.1.21)合成，而支链淀粉是一种高度支化的葡聚糖，通过一系列协调的酶促反应实现，包括AGPase、可溶性淀粉合酶(SSS, EC 2.4.1.21)、淀粉分支酶(SBE) (EC 2.4.1.18)和淀粉去分支酶(SDBE, EC 3.2.1.10)。限速步骤是由G-1-P和ATP通过AGPase合成ADPG [17］．在ADPG催化反应之后，SSS催化一个葡萄糖单位从ADPG转移到葡萄糖链的还原端[18)(图中131)．在SSS使葡聚糖链伸长后，SBE通过裂解α， 1-4糖苷键并将释放的还原端转移到C6羟基上形成α， 1-6分支点生成支链淀粉。在淀粉分支之后，SDBE催化α， 1-4键的水解[19］．其中，GBSS主要负责直链淀粉和长支链淀粉链的合成(图14)1)．

到目前为止，一些关于淀粉或蔗糖代谢的研究已经报道了一些球根植物，包括剑兰hybridus［20.),郁金香［21］．这些研究表明，淀粉和蔗糖的代谢是小球茎形成和发育的关键。与其他鳞茎类似，百合鳞茎的发育可以通过利用光同化物进行形态发生和储备代谢物的积累来实现。孙等人[22的研究发现，蔗糖是植物韧皮部光合同化物的主要运输形式l . davidiivar。单色的从光合作用的叶片到鳞茎，占可溶性糖总量的大部分(约70%);鳞片扦插繁殖过程中，母鳞片淀粉含量下降，小球茎淀粉含量同步增加[9］．鳞茎鳞片中的淀粉被水解，糖的积累使鳞茎鳞片在低温(5℃)贮藏期间繁殖能力增强，这表明为鳞茎后期生长做准备涉及碳水化合物储备的调动[23]、[24］．这些文献线索表明蔗糖和淀粉代谢在小球茎的形成和发育过程中起着关键作用。尽管碳水化合物在百合球的形成和发育中具有重要作用，但关于碳水化合物代谢及其相关基因作用的信息非常有限。关于小球茎发育过程中碳水化合物变化的研究报道甚少[24]、[25］．对于蔗糖和淀粉分解酶，低温(4℃)可使再生球中α-淀粉酶、β-淀粉酶、SPS和SuSy(合成方向)活性升高，而转化酶(INV)活性降低在体外［26］．卡斯特罗和Clément [27]表明CWIN可能是可溶性糖在花药不同部分分配的必要条件。然而，调控小球发育的碳水化合物代谢的分子机制百合属植物仍是神秘的。与小球形成和发育的特定阶段相关的基因表达模式的分类和编码基因的功能表征是理解与小球发育相关的分子和生化事件的关键方面。

扩大我们的知识百合属植物全球基因表达谱和识别参与小球形成和发育的基因，这是第一个比较在小球形成和发育的基因表达谱的研究百合属植物利用下一代高通量测序平台Illumina GAIIx和HiSeq 2000对植物的转录组进行测序l . davidiivar。单色的小鳞茎。此外，本研究的分析首次确定了大多数调控球茎发育的碳水化合物基因和生物学功能，并强调了与球茎发育相关的重要生物学过程百合属植物．

小鳞茎的集合

的转录组l . davidiivar。单色的鳞茎发育期间进行了评估，包括生理和形态变化在一个三相过程。第一个阶段是球茎的出现，大约在25°C孵育2周后。母鳞片正面基部出现1-3个白色小肿块(图2B).第二阶段是球胚形成，2周后，球胚发育成基本形状的球胚2C).球茎发育的第三阶段，涉及到相当大的扩大和生长(图2D-F)，小球大小有明显的变化。

测序和组装

经过严格的质量控制，筛选出10 - 1700万(M)个Q20碱基~95%的高质量reads，用于后续分析(表20)1)．利用Trinity, reads被组装成52901个unigenes，平均长度为630 bp。N50 contig长926bp，序列较长10745个unigenes。平均而言，其中70%的基因被唯一地映射到参考基因组上2)．预测52,652个编码DNA序列(CDSs)的平均长度为526 bp。

基因注释与功能分类

将组装好的unigenes在Swiss-Prot和TrEMBL蛋白数据库中进行检索，进行验证和注释，得到37385个(70%)注释unigenes。其中，与Swiss-Prot和TrEMBL蛋白数据库中已知蛋白具有显著相似性的蛋白分别为27,098个(占总数的52.02%)和35,241个(占总数的66.62%)。为了进一步评估转录组的完整性，我们随机搜索带有COG分类基因的注释序列。结果，11,150个序列被分为24个COG类别(图3.)．在最顶端的集群是一般功能，复制，转录和翻译。此外，碳水化合物的运输和代谢在891个unigenes(即8%的注释COG)中处于中心位置。

根据BLAST2GO(附加文件)，有26333个unigenes可以成功注释1:图S1)。分子类分布主要为催化活性(13,128)、结合活性(12,572)、转运体活性(1,738)、结构分子活性(794)和核酸结合转录因子活性(633)。在细胞组分中，最常见的分布在细胞(18,672)、细胞部分(18,666)、细胞器(15,227)、膜(7,977)和细胞器部分(4,982)。生物过程类别中最具代表性的分布如下:代谢过程(17,756)、细胞过程(16,699)、对刺激的反应(8,332)、生物调节(7,006)和细胞成分组织或生物发生(5,153)。在所有的功能中，有许多过程涉及碳水化合物代谢2:表S1)。

小球茎发育过程中的基因表达

基因表达水平是通过计算每个基因的reads数，然后归一化为RPKM来确定的。大多数unigenes表达水平较低，而一小部分unigenes表达水平较高3.:图S2)。利用IDEG6程序分析球茎发育过程中基因表达的变化，筛选出具有a的2倍上调和下调基因P值< 0.01。最终鉴定出3337个差异表达基因(DEGs)。如附加文件所示4:图S3，在35 - 0 d之间，基因表达模式变化稳定，但不明显(695个上调基因vs 668个下调基因)。35 ~ 15 d，共检测到1964个DEGs，其中上调基因675个，下调基因1289个。与0 d相比，15 d的基因表达变化最大。在15 - 0 d期间，共检测到2421个上调基因和652个下调基因。

DEGs的途径富集分析

通过KEGG途径富集分析对DEGs的生物学功能进行分类。我们把所有的基因都映射到KEGG数据库中。0 d与15 d比较，220个通路的基因特异性富集，15 d与35 d比较，198个通路的特异性富集，0 d与35 d比较，170个通路的特异性富集。附加文件中列出了库对之间的前15条丰富路径5S2:表。值得注意的是，淀粉和蔗糖代谢是3对文库的主要途径。淀粉和蔗糖代谢基因的表达在附加文件中显示6:表S3。其他途径主要参与次生代谢、能量代谢、剪接和蛋白质合成。这些结果与胚珠形成和发育过程中淀粉和蔗糖的代谢途径可能更加活跃。

淀粉和蔗糖的浓度

从0 d到70 d在母鳞片中测量碳水化合物储备的分解(图4)．在前14 d，母鳞片中的淀粉含量急剧下降，为小球茎的形成提供了能量;然后淀粉继续缓慢下降(图4A). 35 d以后，母鳞片淀粉含量再次急剧下降，提示小球的发育和增大需要淀粉水解提供营养和能量。同时，球茎淀粉含量在整个发育过程中逐渐增加，特别是在发育后期(35 ~ 70 d)。

蔗糖含量的变化主要发生在小球茎形成初期(图4B)母鳞片急剧减少，但鳞片鳞片同样急剧增加。此后，虽然淀粉降解速度加快，但母鳞片和小球茎中蔗糖含量分别呈稳定下降和上升趋势。

实时荧光定量PCR技术验证基因表达

为了验证RNA-seq方法获得的淀粉和蔗糖代谢相关酶的基因表达谱，采用实时荧光定量PCR方法对16个筛选的AGPase (AGP1，AGP2,AGP3)、发票(发票1,INV2),超对称性理论(SuSy1，SuSy2,SuSy3)、SPS (SPS1而且SPS2)、SBE (SBE), SDBE (SDBE1而且SDBE2), gbs (gbs)和SSS (SSS1而且SSS2)．琼脂糖凝胶电泳结果显示，所有16对引物都扩增了一个预期大小的单一条带7:图S4)。相关系数(R²)的值在0.9900到1.0000之间，PCR扩增效率在94到105%之间，从10倍序列稀释的cDNA生成的标准曲线(附加文件8:表S4)。基于不同库中的RPKM，GAPDH由于其表达量基本稳定(|log2Ratio|≤0.5)，|log2 (0 d/15 d)|值为0.4494，|log2 (0 d/35 d)|值为0.2227，|log2 (35 d/15 d)|值为0.2267，因此被选为内参基因。

实时荧光定量PCR分析的表达模式与在转录组分析中观察到的几乎一致6:表S3)。在小球茎出现(14 d)和形态建成(28-35 d)时，母鳞片中SuSy同源基因的表达高于小球茎，而在小球茎增大(42-70 d)时，小球茎中SuSy基因的表达高于小球茎(图)5A).在母鳞片和鳞茎中，显性SuSy基因均为SuSy1．然而,SuSy3小球的变化比其他两个SuSy基因更剧烈——近30倍。与此同时,INV2表现出较高的表达水平和母鳞片和鳞茎的剧烈变化INV1(图5B).相比之下，SPS基因在母鳞片和鳞茎中表达相对较低且稳定(图5C).在母鳞片中，SPS同源基因的表达在鳞片形成和增大过程中逐渐减少，在鳞片42 d时略有增加SPS1而且SPS2在35 d时达到峰值，对应于小球的形成。相比之下,SPS1，SPS2改变更尖锐。在淀粉代谢相关的酶中，合成方向的AGPase、SSS、SBE、GBSS等酶在母鳞片中呈下降趋势，在球茎出现和膨大期基因表达量较高(图5B,C和D)，而裂解方向的酶(SDBE)在母鳞片中的基因表达高于鳞茎(图5A和D)。

百合属植物鳞茎形成和发育的转录组

下一代测序平台Illumina GAIIx和HiSeq 2000的高通量转录组测序是在基因组水平上进行基因表达分析的一种强大而高效的方法。迄今为止，RNA-seq方法被广泛用于研究植物的转录组，这些植物的全基因组是已知的，但特别适用于缺乏基因组序列知识的非模式生物的基因表达谱。

尽管经济上很重要百合属植物，其基因组尚未公开，序列数据有限[28] - [30.］．此外，不同的细胞在倍性和遗传特性上存在着巨大的差异百合属植物基因型。据作者所知，这是唯一一份使用RNA-seq来识别与百合鳞茎形成和发育有关的大量基因的报告。在这项研究中l . davidiivar。单色的(2n = 24)，获得了52901个unigenes，证明了RNA-seq方法在一个没有完全测序的基因组的物种中成功地使用了基因表达谱。其中37385个unigenes被成功注释，但由于基因组信息的限制，在我们的转录组中约有30%的基因无法具有指定的功能百合属植物．

为了从RNA-seq数据中获得所有的DEGs，根据RPKM分析所有基因的表达。基于RNA-seq数据集和代谢途径的公共信息的比较分析，一个目标是缩小负责小球形成和发展的候选基因的数量。最后，我们检测到大量与淀粉和蔗糖代谢相关的DEGs，以及次生代谢、能量代谢、剪接和蛋白质合成。这些结果表明，小球茎的形态发生和生长除遗传物质外，还需要碳水化合物的参与。15 d时，小球茎从零开始形成，因此许多与小球茎出苗早期事件相关的基因表达量较高。相应的，与0 d相比，15 d的基因表达量变化最大，共有2421个基因上调，652个基因下调。这些基因的时间表达模式表明，小球茎出球期(15 d)是小球茎最活跃的时期。在GO类中分布转录本提供了小球形成和发展的分子快照。生物过程是最显著的氧化石墨烯类别(52%)，约24%的转录本属于分子功能。在所有的功能中，涉及碳水化合物代谢的过程较多，说明碳水化合物代谢相关的基因在小球的形成和发育过程中起着重要作用。 The bulblet is an energy sink tissue for plant reproduction in which starch and sucrose are mobilized for photosynthetic organs and are broken down to sugars, which function as a precursor to essential metabolites. According to COG classifications, carbohydrate transport and metabolism held a central position, indicating that the morphogenesis and growth of bulblets demanded the participation of carbohydrates. This was also the viewpoint supported by the transcript abundance of different KEGG pathways.

淀粉和蔗糖在不同植物中的代谢

淀粉和蔗糖代谢对植物的发育和对非生物胁迫的响应至关重要。首先，淀粉和蔗糖代谢在种子发育过程中具有重要意义。在水稻种子中发现了许多与淀粉/糖代谢相关的DEGs (栽培稻l .)含糖的突变体的数量多于野生型“新东津”。详细的途径解剖和实时荧光定量PCR结果表明，在灌浆期，大部分蔗糖淀粉合成相关基因表达上调，而AGPase小亚基表达被特异性抑制含糖的突变体(31］．在小麦(小麦l .简历。' Butte 86 ')籽粒，高温抑制了淀粉的积累，同时降低了AGPase、SSS、GBSS和SBE基因的表达[32］．

淀粉和蔗糖代谢对果实发育也至关重要。基因集富集分析表明，泡芙的糖酵解和碳水化合物代谢发生显著改变柑橘类果实中INV和SBE基因表达较高，AGPase和SSS基因表达较低[33］．同时，在芒果的发育和成熟过程中，淀粉和蔗糖代谢较高(Mangifera籼林),水果(34］．在菠萝(菠萝comosus)果实发育过程中，蔗糖含量的大幅上升伴随着SPS的急剧上调，蔗糖在沉库组织细胞质中的分解周期可由SuSy和INV共同介导[35］．

在开花过程中，淀粉和蔗糖代谢占主导地位罗莎对“Pallida”(36]，也是增加蓝莓耐寒性的原因(Vacciniumspp。)37]以及百合lancifolium［29，因为可溶性糖的积累。此外，淀粉和蔗糖负责地下器官的形成，如红薯(番薯甘薯l .) [38和土豆(茄属植物tuberosuml .) [39］．目前的研究l . davidiivar。单色的转录组揭示了大量参与碳水化合物代谢的基因2:表S1)。根据KEGG通路分析，淀粉和蔗糖代谢是三个RNA-seq文库中的主要通路5:表S2)。所有这些事实都支持碳水化合物对球茎观赏植物球茎形成和发育至关重要的事实[8]、[9］．

球茎发育过程中的基因表达

SuSy可可逆催化蔗糖分解代谢，而INV则不可逆催化。然而，SuSy通常被认为参与蔗糖水解而不是蔗糖合成[10］．SPS通过调节淀粉生产和碳水化合物积累之间的碳分配，在碳水化合物代谢中起着至关重要的作用。在我们的研究中，SuSy和INV基因的表达相对较高，而SPS基因在母鳞片中的表达整体下降(图5A和C)，根据母鳞片中蔗糖含量的逐渐降低(图4B).这一结果说明母鳞片中的蔗糖主要在卵裂方向代谢，为鳞片的形成和发育提供能量。两种SPS同源基因虽然表达量相对较低，但在小球形成过程(28 ~ 35 d)中均表现出较高的活性，与SuSy和INV家族基因的显性表达一致，这表明蔗糖在小球形态发生中起着至关重要的作用。这是因为蔗糖是与细胞代谢状态相关的关键信号分子[40]，并作为调控microRNAs表达的信号，microRNAs是调节植物发育的转录因子[12］．当小球在42 d开始膨胀时，SuSy和INV的表达迅速达到峰值，导致蔗糖水解为淀粉合成提供碳骨架。SuSy和INV在不同阶段的表达模式表明SuSy和INV在切割蔗糖过程中具有协同作用。

直链淀粉含量的增加可以通过抑制支链淀粉合成的酶来实现[41]、[42的表达水平GBSSI［43]，或同时通过提高AGP以及gbs抑制的表达水平SBE［18］．而支链淀粉是百合淀粉的主要形式，占全部淀粉的70% [44］．这可以通过参与支链淀粉合成的酶，即SSS, SBE和AGPase的基因表达来证明5B,C,D)，显著高于直链淀粉合成酶的表达gbs(图5D).另一个证据是SDBE同源基因在母鳞片中高度表达。这是因为两个SDBE同源基因都在l . davidiivar．单色的属于PUL组，已被提出参与支链淀粉的分解[45］．小鳞茎中淀粉合成相关基因(AGPase, SBE, SSS, GBSS)的表达量明显高于母鳞茎(图)5B,C,D)，而淀粉水解相关基因表现出相反的趋势。淀粉代谢相关基因表达的变化与母鳞片和小球茎中淀粉含量的变化一致(图4A).在小球茎中，淀粉合成相关基因在小球茎发育的14 d和后期(35 - 70 d)表达最多，但在小球茎发育的35 d很少表达(图)5C,D)，说明淀粉对小球茎产生和发育至关重要。

在本研究中，使用三个发育阶段的小球茎百合davidiivar。单色的我们使用RNA-seq在转录尺度上进行了基因的比较表达。转录组与Trinity组装，并用Blast2GO和KEGG进行功能注释。鉴定了一组可能参与淀粉和蔗糖代谢的基因，并讨论了这些基因与球茎发育相关的遗传机制。基因表达以及淀粉和蔗糖含量的变化表明，蔗糖对小球茎的形态发生至关重要，而淀粉对小球茎的出现和发育至关重要。研究结果对阐明植物鳞茎萌发和发育的分子机制具有一定的参考价值百合属植物和相关的物种。

植物材料及加工

新鲜的l . davidiivar。单色的球茎(周长12-14厘米)采自甘肃农业科学院兰州(103.4°E, 36°N)。从外部鳞片到内部鳞片，产生鳞片的能力下降[46］．因此，从母球上小心地取出没有疾病或宠物造成损伤的健康外部鳞片，在自来水中清洗以去除污垢，用0.01%高锰酸钾溶液浸泡20分钟对表面进行消毒，然后使用内部方案用蒸馏水清洗三次。表面灭菌后，鳞片(3个生物重复，每个重复150个鳞片)凹向上嵌入例体外进入预杀菌(180°C 5小时)的湿泥炭基质(鑫源园艺资源有限公司，辽宁，中国)，相对湿度60%，90鳞片/300厘米²(60厘米× 5厘米)。将繁殖体放入穿孔塑料袋(60 cm × 90 cm)中，25°C暗处培养。

样品收集

当小球形成一定的形状(球)和大小(周长2厘米，鳞片5-7)时，研究小球在泥炭中埋藏70天后的繁殖。为构建cDNA文库，分别在0、15 d(小球茎出现)和35 d(小球茎形成3 ~ 4个鳞片的基本形状)采集样本。在实时荧光定量PCR中，在0 d、14 d、28 d、35 d、42 d、56 d和70 d时随机收集母鳞片和鳞茎。使用来自3个重复处理的15个样品组成3个生物重复进行实验。样品在液氮中快速冷冻，并在- 80°C保存直到使用。

RNA提取，cDNA文库构建，测序和组装

Li等人分别从冷冻母鳞片和鳞茎中提取总RNA。[47］．使用Infinite®200 PRO (Tecan, Männedorf, Switzerland)和RNA凝胶电泳(甲醛缓冲系统)测定总RNA的纯度和浓度。按照制造商(Illumina, CA, USA)的说明，使用mRNA测序样本制备试剂盒构建0 d、15 d和35 d的cDNA文库。选择大小为200±25 bp的cDNA片段进行PCR扩增。最后在Illumina簇站和Illumina Genome Analyzer IIx测序平台上进行测序。然后将生成的干净读取用于所有后续分析。三一(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)用于将对端短读组合成contig。

基因功能注释

在NCBI Nr和Nt、Swiss-Prot和TrEMBL数据库中使用BLAST检索读取序列，e值为10⁻⁵．基因名称根据最佳匹配(最高分)分配给每个组合序列。使用EMBOSS软件包中的“getorf”程序预测开放阅读框(orf)。使用Blast2GO程序分析基因本体注释(GO，http://www.geneontology.org)．这些序列也与COG数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)来预测和分类函数。使用在线KEGG自动注释服务器(KAAS)将京都基因与基因组百科全书(KEGG)路径分配到序列(http://www.genome.jp/kegg/kaas/)．所有这些搜索都是以截断e值为10进行的⁻⁵．

差异基因表达分析

为了比较不同样本中的基因表达丰度，计算每个单基因对应序列的转录本计数信息，并归一化为外显子模型每千碱基的reads per million mapped reads (RPKM)值[48］．显著差异通过IDEG6软件中集成的一般卡方检验(http://telethon.bio.unipd.it/bioinfo/IDEG6/)[49］．该方法的P值经过调整，以考虑使用错误发现率(FDR)进行的多次试验。调整后的P值< 0.01，表达倍数变化绝对值log2≥1的基因为差异表达基因。计算样本间表达水平的折叠变化。

淀粉和蔗糖测定

测定母鳞片和鳞茎中的碳水化合物含量。淀粉含量用碘比色法测定，蔗糖含量用高效液相色谱法分离[9］．通过三个独立的实验测定母鳞片和鳞茎中碳水化合物的含量。两个实验都进行了三个独立的生物重复。

实时定量rt - pcr

为了验证RNA-seq结果并确定蔗糖和淀粉代谢中关键酶的作用，采用SYBR®green (CWBIO，北京，中国)和ABI 7500实时PCR系统(Life Technologies, CA, USA)进行实时定量PCR。使用M-MLV逆转录酶(Promega, Madison, USA)从2 μg DNase - i处理的总RNA合成第一链cDNA。采用Primer Premier 5.0软件设计用于定量实时RT-PCR的SYBR®绿色引物。Tm引物长度为17-25 bp，扩增子长度为85 - 300 bp8:表S4)。为了保证目标特异性，将基因序列与NCBI数据库进行比对，以确定与其他序列的交叉同源性。引物特异性在2%琼脂糖凝胶电泳中得到确定的单个产品的预期尺寸。定量实时PCR总体积为20 μl，包含0.8 μl模板，0.2 μl各引物组合，1× UltraSYBR混合物(含ROX)。采用以下扩增程序:95°C变性10min, 44个循环扩增(95°C 30 s, 60°C 30 s, 68°C 1 min)和熔化曲线程序(95°C 15 s, 60°C 1 min, 95°C 30 s, 60°C 15 s)。所有PCR反应均在96孔PCR板(Corning, NY, USA)上生物三拷贝进行。相对mRNA水平计算使用2^——ΔΔCt方法针对内控甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。为了估计PCR效率，从汇集的cDNA中提取10倍稀释序列的标准曲线来计算基因特异性PCR效率和回归系数(R²)。

支持数据的可用性

支持本文中使用的基因的序列数据集可在NCBI上获得，登录号从KP179405到KP179417。

ADPG:

腺苷二磷酸葡萄糖

AGPase:

ADPG焦磷酸化酶

信用违约互换:

编码DNA序列

CIN:

胞质转化酶

齿轮:

正交基团的簇

CWIN:

细胞壁转化酶

F-6-P:

Fructose-6-phosphate

G-1-P:

Glucose-1-phosphate

G-6-P:

Glucose-6-phosphate

gbs:

Granule-bound淀粉合酶

GAPDH:

Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶

走:

基因本体论

发票:

转化酶

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

子:

开放阅读框

的PGM:

Phosphoglucomutase

RPKM:

每千碱基外显子模型每百万映射的读取数

SBE:

淀粉分支酶

SDBE:

淀粉de-branching酶

SPS:

蔗糖磷酸合成酶

瑞士:

可溶性淀粉合酶

苏西:

蔗糖合酶

UDPG:

尿苷二磷酸葡萄糖

UGP:

UDPG焦磷酸化酶

文:

在液泡转化酶

基金资助:国家自然科学基金(No. 30972023,31171981)和辽宁省大学优秀人才培养计划(No. 30972023,31171981)资助;LR2013029)。

从属关系

1. 沈阳农业大学园艺学院，辽宁沈阳110866

   李雪岩，王春霞，程锦云，张静，刘小雨，段鑫，李天来，孙红梅

2. 邮编:日本香川郡，3011-2，邮编:761-0799

   Jaime A Teixeira da Silva

相应的作者

对应到太阳红煤．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

XYL、JATS、TLL和HMS对实验进行了构思和设计。XYL, CJY和XiaoYu Liu参与了样品的收集和RNA的制备。CXW设计了实时定量PCR引物。XYL, CXW和JZ分析了序列数据。XYL、CJY和XD进行实时定量PCR。XYL, CXW, JATS和HMS起草并修改了手稿。所有作者阅读并批准了最终稿件。

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