单色光增加了越橘果实发育过程中花青素含量

背景

光照是影响水果类黄酮积累的最重要的环境因素之一。光谱的组成已被证明会影响水果成熟过程中酚类化合物的产生。然而，关于水果中类黄酮生物合成对不同波长光的响应的具体信息仍然很少。在本研究中，越橘(Vaccinium myrtillusL.)的果实富含花青素化合物，在果实成熟过程中被蓝色、红色、远红色或白色的光照射。在光照下，分析了果实成熟阶段花青素和其他酚类化合物的组成。

结果

三种单色光处理对成熟果实总花青素积累的影响均显著大于白光处理和暗置处理。花青素水平的升高主要是由于飞燕草苷苷的积累显著增加。在成熟的越橘果实中共检测到33种花色苷化合物，其中6种为越橘中新发现的花色苷(cyanidin acetyl-3-)O半乳糖,二甲花翠素acetyl-3 -O半乳糖,二甲花翠素coumaroyl-3 -O半乳糖,二甲花翠素coumaroyl-3 -O葡萄糖,飞燕草色素coumaroyl-3 -O半乳糖,飞燕草色素coumaroyl-3 -O葡萄糖)。

结论

结果表明，越橘果实发育过程中光的光谱组成对成熟越橘果实中黄酮的组成有显著影响。

花青素是一类类黄酮化合物，是许多花和水果中的主要色素，它们作为昆虫和动物的引诱剂，保护植物免受光氧化应激[1］．此外，这些代谢物是强大的抗氧化剂，因此被证明对人类健康有益[2］．若干报告着重讨论了它们在预防神经和心血管疾病、癌症和糖尿病以及促进人类营养方面的作用[2]、[3.］．

越桔(Vaccinium myrtillusL.)是北欧和东欧最重要的野生浆果品种之一。越橘果实富含酚酸、二苯乙烯和类黄酮，尤其是花青素，据估计，花青素占越橘果实中酚类物质总量的近90% [4]、[5］．花青素是通过苯丙烷/类黄酮途径生物合成的，包括一系列催化反应的酶促步骤，导致生产不同的花青素，包括飞蛾花苷(Dp)，花青素(Cy)，芍药苷(Pt)，芍药苷(Pn)和茉莉苷(Mv)1)．在越橘果实中，黄酮的定量和定性组成被认为受到果实发育阶段的强烈影响[6]、[7］．虽然遗传和环境因素也被报道会影响最终的成分，但在成熟期间，越橘果实的皮和果肉中各种花青素的产量都很高。8] - [10］．两个转录因子家族，bHLH和MYB蛋白，在花青素通路的调节中有很强的相关性[11]、[12］．苯丙素通路对温度、光周期、土壤肥力等各种环境刺激都有反应[10]、[13]、[14，特别是光[15]、[16］．

植物可以感知光信号的多个方面，包括光的量(量)、质量(波长)、持续时间(光周期)和方向[17]，它们可以通过至少四种不同的光感受器家族被感知，包括光敏色素(红/远红光感受器)、隐色色素和光促蛋白(蓝光感受器)和UV-B光感受器(UVR8)。这些蛋白质可感知可见光光谱的特定波长(380-740 nm)或紫外线(280-315 nm)，并转导信号以调节光合作用、光形态发生、向光性、昼夜节律以及次生代谢物的生物合成[18］．

可见光对植物类黄酮和花青素的诱导作用已被广泛研究，发现可见光的组成对植物中花青素的生物合成具有调节作用拟南芥［19),蔓越莓(Vaccinium macrocarpon河中的小岛。)20.]，非洲菊［21)、葡萄(葡萄l .) [22]、[23)、生菜(摘要以l .) [24)、草莓(草莓属x ananassa- weston - Duchesne ex Rozier) [25和萝卜(芸苔属植物显著l .) [26］．与生长在林冠下的植物相比，生长在阳光直射下的越橘中酚类化合物的含量显著增加[9]、[15]、[27]，但目前还没有关于特定波长的光对它们生物合成的影响的信息。因此，本研究的目的是分析可见光谱的单色波长对越橘果实中酚类化合物产生的影响。我们特别感兴趣的是研究浆果发育过程中特定波长的光是否会影响酚类化合物的生物合成和含量。为此，在越橘果实成熟过程中，分别用蓝色、红色、远红色或白光照射越橘植株，分析其成熟果实中积累的酚类化合物的组成。我们还研究了越橘类黄酮通路关键基因的表达，以便更好地了解越橘发育过程中影响酚类化合物生物合成的调控过程。

成熟越橘果实中酚类化合物的表征和定量研究

成熟越橘果实中除花青素外的酚类化合物通过早期优化的超高效液相色谱-质谱联用技术分析[28］．在成熟的越橘果实中发现的酚类化合物列于表1．其中最丰富的是羟基肉桂酸，即绿原酸和新绿原酸。柚苷(类黄酮的前体)含量在0.08 ~ 0.44 mg/100 g DW之间，以糖基化形式(柚苷7-)含量更高O-葡萄糖苷)，据我们所知，本研究首次在越桔中报道。在二苯乙烯类化合物中，(-)-涩苷是本研究首次在越桔果实中检测到。黄酮木犀草素7-O-葡萄糖苷仅发现微量。

成熟的越桔还含有黄酮醇，其中包括山奈酚3-O槲皮素衍生物(槲皮素3-O槲皮素3 -葡萄糖O半乳糖,槲皮素3 -O-葡糖苷)和杨梅素衍生物(紫丁香素3-O葡萄糖,syringetin 3 -O-半乳糖和杨梅素己糖)的含量与早期的越橘[29］．

检测到的原花青素包括儿茶素单体、表儿茶素单体、表没食子儿茶素单体和没食子儿茶素单体。在聚合物中，最丰富的是原花青素B3，伴随较低数量的原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2和/或B4(用目前的方法无法分离[28])。

成熟越橘果实中花青素的表征和定量研究

花青素是成熟越橘果实中含量最多的类黄酮。采用早期对葡萄进行优化的超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)方法分析成熟越橘果实中的花青素含量[30.］．该方法进行了轻微修改，以允许检测早期描述的越橘花色素半乳糖苷和阿拉伯糖苷(见方法)。

成熟浆果中花青素的总量在1860 - 3397 mg/100 g DW之间变化，这与早期报道的越橘的含量相当[6]、[8］．共检测到33种花青素2)，包括已知的15种花青素;Dp 's, Cy 's, Pt 's, Pn 's和Mv 's与葡萄糖，半乳糖和阿拉伯糖结合[8]、[31］．此外，乙酰化和p花青素，Pg 's和Cy 3-的- coumaryl结合形式O-sambubioside化合物被发现。据我们所知，一些乙酰化(Cy乙酰基3-O-半乳糖和Mv乙酰基3-O-半乳糖)和香豆酰化化合物(Dp香豆酰3-O-葡萄糖，Dp香豆油基3-O-半乳糖Mv香豆油酰基3-O葡萄糖，Mv香豆油酰基3-O-半乳糖)在本研究中检测到，此前没有报道在越橘果实中。乙酰化化合物的含量很低，检测到的单一化合物的平均浓度在0.05 - 0.72 mg/100 g DW之间2)．的数量p-香豆酰化花青素的含量普遍高于乙酰化花青素，尽管这些花青素在复制植株间的存在差异更大。含量范围从最低的Mv香豆油酰基3-开始O-半乳糖以Pn和Mv香豆油酰基3-最高O葡萄糖苷。然而，Pn和Mv香豆油基的浓度3-O-葡萄糖苷与包括Pt 3-在内的已知花青素在同一范围内OPt 3 -葡萄糖苷O半乳糖,Mv 3 -OMv 3 -葡萄糖苷O半乳糖,Mv 3 -O阿拉伯糖,Pn 3 -OPn 3 -葡萄糖苷O-半乳糖和pn3 -O阿拉伯糖(表2)．越橘果实中Pg衍生物含量较低，Pg 3-为0.36 mg/100 gO-葡糖苷和0.11 mg/100 g DW的Pg 3-O-半乳糖，而Pg 3-O-阿拉伯糖未检出。赛3-的出现O-sambubioside以前也被Du等人报道在越桔中。[32在我们的研究中发现了相似的含量。

单色光对成熟越橘果实酚类成分的影响

为了研究光照质量对越橘成熟果实中类黄酮积累的影响，在果实发育过程中选择可见光光谱的波长(蓝、红、远红、白光)进行处理，或将其置于黑暗中，具体如图所示1．浆果发育过程中单色光处理对成熟浆果中酚类化合物的影响见表1．黄酮醇和原花青素类化合物在部分光照处理下差异显著(P < 0.05)。槲皮素3-的水平O-半乳糖在蓝光处理下显著(P < 0.05)低于其他处理。另一方面，在红光和远红光处理下，杨梅素己糖的含量显著升高。红光和远红光处理下原花青素A2含量较低，白光处理下原花青素B1含量高于其他光处理。

单色光对成熟越橘果实花青素组成的影响

单色光处理对花青素含量的影响最为显著。数字2为光处理对每一类花青素(Dp, Cy, Pn, Mv, Pt, Pg)总含量的影响，由单个花青素苷的总和计算而来2)．结果表明，光处理对果实中Cy和Pn的含量影响不大，而单色光处理的果实中Dp、Mv和Pt含量较白光条件下的果实显著增加(P < 0.05)(分别为33%、46%和38%)，表明光品质影响了类黄酮途径。Mv含量表现出不同于Dp和Pt含量的行为;黑暗处理浆果中Mv浓度显著高于光照处理(P < 0.05)2)．表格2显示了每种光照处理对特定花青素化合物积累的影响。红光和远红光处理增加了Dp、Mv和Pt化合物与葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的结合，但对酰基化和香豆酰化化合物没有影响。除Pt 3-外，蓝光也能引起同样的增加O半乳糖,Pt 3 -O阿拉伯糖,Mv 3 -O半乳糖和Mv 3-O阿拉伯糖。

类黄酮途径基因的表达VmCHS，5是什么,VmDFR VmF3”，为而且VmANR,转录因子VmMYB2在单色光处理下，在果实未成熟时进行测定。在研究的前12个小时里，在单色光处理的植物与在黑暗或白光下处理的植物相比，大多数被检测的基因表达增加，尽管样本和时间点之间的差异很大2)．然而,为单色光照射24和48小时后，表达量明显高于暗处理植株。相反，在白光下，表达量与暗光处理植株相比没有增加。单色光持续上调表达为在整个光照处理过程中，在蓝光、红光和远红光处理下，基因分别比暗处理增加了3倍、2倍和3.5倍。在白光下，与暗处理的植物相比，表达量仅轻微增加(高达1.3倍)2)．

最近的研究表明，生长在北纬地区的越橘种群比生长在南方地区的越橘种群含有更多的类黄酮，特别是花青素。8]、[9］．这种现象被认为是受强大的基因控制[9]尽管环境因素也可能与该规管有关。太阳辐射就是其中的一个因素，已知太阳辐射可以增加越橘叶中类黄酮生物合成基因的表达和类黄酮含量[15]、[31］．此外，在模拟北极夏季光照条件的24小时自然光照条件下，在植物激素控制条件下生长的越橘果实中发现了更多的花青素。10］．在本研究中，与白光处理或黑暗保存的果实相比，在蓝色、红色和远红色单色光处理下，成熟浆果中的总花青素含量显著增加(图2)．单色光波长对花青素生物合成的各种影响在其他物种中也有报道。例如，在萝卜下胚轴中，远红光对花青素生物合成的影响最为显著，与阳光下达到的含量相当[26］．在非洲菊时，蓝光对花中花青素积累的刺激特别大[21］．研究发现，蓝光可以显著增加水果中花青素的生物合成，比如草莓。25和葡萄果实[22]、[23，而在蔓越莓果实中，红光和远红光比白光增加了花青素的积累[20.］．

从类黄酮途径基因的表达分析中可以找到可能的解释。基因的表达VmCHS, VmF3 5是什么，VmDFR而且VmANR受光处理的影响较小(附加文件2)，这与不同光照处理下浆果中黄酮、黄酮醇、二苯乙烯和原花青素的检测水平一致(表1)1)．此外，在早期的研究中已经表明类黄酮途径基因，例如CHS，可有昼夜节律[33]、[34］．这是影响不同时间点间基因表达结果变化的一个因素。相反，表达为该基因是花青素生物合成的关键基因，在单色光处理下呈明显增加趋势，而白光和暗处理不受影响。蓝光、红光和远红光都上调了为在光治疗开始后的6小时内，以及在整个2天的治疗过程中(附加文件2)．根据Jaakola等人。[7]，为仅在越橘果实发育早期表达，表达量极低。然而，在本研究中，浆果发育的早期阶段似乎对光照处理有反应。单色光处理通过增加花青素的表达来影响花青素的积累为已经在浆果发育的早期阶段了。

在单色光波长下，越橘果实中总花青素含量较高是由于Dp 's和Pt 's的产量高于Cy 's和Pn 's(表2)2,图2)．在本研究中，越橘植物起源于北纬65°，单色光处理的植物产生的Cy 's和Dp 's的数量与在相似纬度的自然环境中生长的浆果的研究相似(64°N [9和北纬66度[10])。在白光和黑暗条件下，植物的Dp含量显著下降，表明光的光谱组成参与了这类花色素的积累。考虑到在北纬地区，夏夜的特点是黄昏时间长，蓝光和远红光比例高[35]，本研究强调，北极光环境通过诱导成熟果实中花青素含量的定性和定量变化，促进了已处于果实成熟早期的越橘中花青素的积累。

我们的研究表明，在可见光光谱的单色光波长下处理越橘，即使在果实成熟期很短的时间内，也足以诱导成熟果实中花青素含量的显著增加。此外，光的质量尤其影响飞蛾苷苷的生物合成。我们的研究结果表明，光的光谱组成调节了果实中花青素的积累，表明类黄酮生物合成途径与植物接收的光谱组成之间存在相互作用。

植物材料

越桔(Vaccinium myrtillusL.)植物从I- iii三个不同的地点收获(I: 65°06 ' N, 25°5 ' E;Ii: 65°04′n, 25°31′e;III:北纬65°03′，东经25°28′)。假设该区域内的植物具有相同的遗传背景，在10米x 10米范围内的每个位置收集植物[36从而代表了特定的生态类型。采集植物时，果实小而绿，处于发育阶段2(图2)1)．植物连同根系一起收获，并被放置在含有森林泥炭土的盒子(50厘米× 70厘米)中。

授粉后，浆果通常需要六到七周在芬兰的自然林分成熟。根据Jaakola等人的研究，确定了越橘果实的成熟阶段。6]，如图所示1．发育阶段2代表3 - 4毫米大小的绿色小未成熟浆果，大约在授粉后两周(6月底)。成熟(发育第6阶段)大约发生在授粉后的6周(7月底)，浆果的直径为6至8毫米，并变成深蓝色。

光源

paltta (BMI供应，Queensbury, NY, USA)的Selador led灯被用于用蓝光(400-500 nm)、红光(600-700 nm)、远红光(700-800 nm)和白光(400-800 nm，图)照射植物3.)波长。蓝光照射下植株的光子通量率为8.10 μmol m⁻²年代⁻¹，红下7.8 μmol m⁻²年代⁻¹，远红7.6 μmol m⁻²年代⁻¹白下43.04 μmol m⁻²年代⁻¹．暴露在白光下的植物被认为是阳性对照。一组完全黑暗的植物被认为是阴性对照。光测量使用USB RAD+光谱仪(海洋光学公司，达尼丁，佛罗里达州，美国)。

光照处理和样品采集

在越橘果实成熟期间，用不同波长的光对越橘进行处理，如图所示1．每个地点(I-III)的越橘植物池被用于处理。第2阶段的果实，先置于黑暗中14 h，然后暴露于连续的蓝、红、远红、白光诱导或置于黑暗中48 h1)．根据初步分析(数据未显示)，选择果实发育阶段2进行试验，结果表明，在所有越橘果实成熟阶段中，2期对光照响应的类黄酮通路基因表达最为活跃。光照处理在控制温度(21±1℃)和湿度(60%)的生长室内进行，以消除温度对类黄酮生物合成的影响。光处理后，在控制温度(21±1℃)和自然光周期的温室中生长。当完全成熟时(第6阶段，图1)，采收后在- 80℃下储存，然后在6个月内冷冻干燥。光照处理不影响果实的成熟过程。冷冻干燥的浆果储存在- 20°C的干燥器中，直到分析代谢化合物。

代谢分析

用1.5 mL 80%甲醇振荡1小时提取每个样品的研磨材料(从3 g中提取100 mg)。样品在12000 g的条件下离心2分钟(Sigma 3-30 k, Osterode，德国)，收集上清。重复提取，混合上清液，取至5 mL。过滤(0.22 μm PVDF过滤器)后转移到玻璃瓶中，采用UPLC-MS/MS对样品中的花青素、黄酮醇、原花青素、二苯乙烯和其他酚类化合物进行随机分析。

酚类化合物的分析

黄酮醇、黄酮、羟基肉桂酸、原花青素和二苯乙烯的分析如Vrhovsek等所述。[28］．色谱、质谱条件和多反应监测(MRM)跃迁可在参考文献中找到。定量是通过外部校准曲线，注入真实标准的每种检测化合物在不同浓度。

花青素的分析

花青素的分析采用Arapitsas等人描述的UPLC-MS/MS。[30.］．花青素通过MRM检测，通过筛选MS/MS过渡和使用附加文件中描述的参数3.．对于一些化合物，没有可用的标准，但可以根据已知化合物的MRM跃迁和相对保留时间，并考虑到以前的结果，初步确定它们[37］．例如，蓝花苷和芍药苷的半乳糖苷衍生物的标准是可用的，这些化合物似乎洗脱之前，但接近各自的葡萄糖苷衍生物(峰1,2和22,23在附加文件3.)．因此，在显示相同MRM转变的茉莉苷苷前0.15秒洗脱的峰很可能是茉莉苷苷半乳糖(附加文件中的峰15)3.)，这一推理也可以应用于其他半乳糖苷和阿拉伯糖苷衍生物。

为了定量，通过注入不同浓度的每种化合物的真实标准制备外部校准曲线。在没有真实标准的情况下，花青素相对于malvidin-3-进行定量O-葡萄糖，使用malvidin-3-O葡萄糖校准曲线(附加文件3.)．

统计分析

用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验光照处理对果实中各代谢产物的影响。Tukey HSD的事后测试进行了多次比较。使用STATISTICA版本12进行测试。

辅助分析

为了研究花青素含量的增加是否与越桔类黄酮途径基因的表达有关，还进行了一项补充研究1)．采自地点I和II，果实发育阶段2的越橘植株，先在黑暗中放置14 h (0 h样品)，然后在连续的蓝、红、远红或白光诱导或黑暗中放置48 h。在光处理期间，在处理0、6、12、24和48 h后收集越橘样品进行RNA分离。样品立即保存在−80°C，直到分析基因表达。

RNA的分离和cDNA的制备

在光照处理开始后0、6、12、24和48 h收集第2阶段的越橘果实，从果实中分离总RNA。RNA按照Jaakola等的方法分离。[38除了在E.Z.N.A.®总RNA Kit I (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA)中用RNA纯化方案代替酚-氯仿提取。通过使用NanoDrop N-1000分光光度计(NanoDrop Technologies, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)和1% (w/v)溴化乙胺染色琼脂糖凝胶测量吸收光谱来验证分离RNA的质量。按照制造商的说明，用RevertAid Premium逆转录酶(Thermo Scientific)将RNA转化为cDNA。每组植物的RNA提取(和进一步的基因表达分析)重复两次。

基因表达分析

基因的转录积累VmCHS，VmF3的5是什么，VmDFR，为而且VmANR和转录因子VmMYB2使用LightCycler SYBR Green qPCR试剂盒(Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN, USA)检测。用于扩增的引物列在附加文件中4．

用LightCycler 2.0仪器和软件(Roche)进行qPCR分析。PCR条件为95°C 10 min, 95°C 10 s, 60°C 20 s, 72°C 10 s, 45个循环。VmACT基因(附加文件4)作为相对定量的参考基因。将各处理与处理0 h进行比较，计算差异基因表达水平。

UPLC-MS /女士:

超高效液相色谱串联质谱计

Dp:

花翠素

Cy:

花青色素

Pt:

矮牵牛配基

Pn:

Peonidin

Mv:

二甲花翠素

答:

天竺葵色素

Glu:

葡萄糖

加:

半乳糖

Ara:

阿拉伯糖

Coum:

Coumaroyl

DW:

干重

VmCHS：

越桔查尔酮合成酶

VmF3‘5’H：

越桔黄酮3 ' 5 ' -羟化酶

VmDFR：

越桔二氢黄酮醇4-还原酶

为：

越桔花色素合成酶

VmANR：

越桔花色素还原酶

VmMYB2：

薇金苗MYB2转录因子

VmACT：

Vaccinium myrtillus肌动蛋白

MRM:

多反应监测

我们特别感谢Matti Rauman，感谢他的专业精神，以及他通过设置灯光系统对这个项目做出的巨大贡献。科恩基金会(LJ)、芬兰植物生物学博士项目和成本行动FA1006 (PlantEngine) (LZ)内的STSM(短期科学项目)项目获得了财政支持。

从属关系

1. 奥卢大学生物系，芬兰奥卢FI-90014

   Laura Zoratti, Marian Sarala, Katja Karppinen & helly Häggman

2. 植物分子科学，系统与合成生物学中心，伦敦皇家霍洛威大学，Egham, TW20 0EX，英国

   Elisabete卡瓦略

3. 埃德蒙·马赫基金会，研究和创新中心，经过E.马赫1，米歇尔阿蒂格，38010S, TN，意大利

   伊丽莎白·卡瓦略，斯特凡·马丁斯和劳拉·金戈

4. 挪威北极大学北极与海洋生物系气候实验室，特罗姆瑟，NO-9037

   劳拉Jaakola

5. 挪威农业与环境研究所，挪威特罗姆瑟诺霍尔特生物福斯克，NO-9269

   劳拉Jaakola

相应的作者

对应到劳拉Jaakola．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

LZ完成了大部分的实验工作和数据解释，参与了工作的设计，以及大部分的写作和编辑;MS参与了实验和基因表达分析;EC对代谢分析提供了支持，并对数据的解释作出了贡献;KK、SM和LG对数据的解释做出了贡献;LJ和HH为作品的构思和设计做出了贡献。所有的作者都参与了手稿的写作，并阅读和批准了最终的手稿。

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