拟南芥核黄素结合蛋白的表达抑制线粒体电子转运基因的表达并促进开花

背景

最近我们展示了新创在转基因拟南芥中，海龟核黄素结合蛋白(RfBP)的表达增加了H₂O₂浓度在叶细胞内，增强了花调控基因的表达FD和花分生组织同源基因AP1在茎尖处，诱导提早开花。本文报道了rfbp诱导H₂O₂推测是由于线粒体电子传递链(METC)上的电子泄漏和H的来源₂O₂有助于早期开花表型。

结果

而增强的FD和AP1表达RfBP的19个METC基因中，有13个在叶面表达受到抑制⁺)植物。内部RfBP⁺叶细胞，胞质H₂O₂浓度的增加可能是由于电子泄漏，因为类似的反应也被已知的mec电子泄漏诱导剂诱导。当mec基因上的抑制被消除后，就不再出现早花现象RfBP基因沉默，恢复了RfBP⁺到野生型的水平FD和AP1表情,H₂O₂和黄素。外施核黄素延迟了开花时间，使基因表达和黄素恢复到稳态水平，但仅使H降低了55%₂O₂RfBP浓度⁺植物。rfbp抑制的METC基因表达修复了胞浆H₂O₂转录因子NFXLl的遗传破坏和补偿的妥协FD和AP1表达和开花时间。相比之下，RfBP类似于过氧化物酶体过氧化氢酶突变，增加了胞浆H₂O₂增强，加强FD和AP1表达和诱导早花。

结论

rfbp抑制的METC基因表达可能导致电子泄漏，这是H产生的细胞来源之一₂O₂具有促进开花的作用。对METC基因表达的抑制作用不是RfBP诱导H的唯一途径₂O₂目前未被重视的因素也可能在RfBP下发挥作用⁺背景。

核黄素(维生素B₂)是黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前体，是参与多种细胞过程的许多代谢酶的必需辅助因子，如线粒体电子传递链(METC)和其他细胞区室的细胞氧化还原调节[1]-[3.]。黄素介导的氧化还原对不同类型活性氧(ROS)的生成至关重要[4]-[6]，如超氧自由基O₂^{•- - - - - -}(7]、[8和过氧化氢H₂O₂(4]、[9]。H₂O₂是一种比O₂^{•- - - - - -}例如，因此经常作为细胞信号调节植物发育的多个方面[10]、[11]。

ROS可通过植物细胞内外的许多氧化还原过程产生[9]、[11]-[13]。细胞内ROS的来源是mec中氧化还原相关的电子载体蛋白复合物I至IV [14]。如果METC功能正常，则每个传递轮中的电子四元体(四个电子为一组)通过载体-蛋白质复合物转移到单个O上₂受体，减少O₂形成H₂O和辅酶NADH的质子₂(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸携带两个质子)和FADH₂(15]-[17]。在METC功能障碍下，单个电子转移到O上₂生成0₂^{•- - - - - -}，它进一步转化为H₂O₂(18]-[21]。这一过程被称为电子泄漏，并增加了H的胞质浓度₂O₂通过亚细胞运输[11]、[13]。电子泄漏和H₂O₂在包括植物在内的生物体中，可在蛋白质复合体I、II和III中产生[22]-[25]。电子泄漏和H₂O₂鱼藤酮(一种干扰METC的酮类化合物)抑制复合物I后产生的新一代已在动物中得到充分证明[20.]、[21]。因为FMN / FMNH₂和时尚/ FADH₂在配合物I和II中分别作为氧化还原中心，黄素可能在电子泄漏和H中起关键作用₂O₂由METC生成[13]、[21]、[26]。

与这一观点一致，最近我们证明了细胞质H₂O₂可以通过调节叶片中游离黄素(核黄素、FMN和FAD)的浓度来改变其浓度拟南芥(13]。黄素浓度由新创海龟的表情(中华Trionyx japonicus)基因编码核黄素结合蛋白(RfBP)。这种蛋白质含有一个硝基末端配体结合域，它与分子相互作用有关，还有一个羧基末端磷酸化域，它容纳核黄素分子[27]-[30.]。在RfBP表达(RfBP⁺)拟南芥植物，RfBP定位于叶绿体并与核黄素结合，导致游离黄素浓度显著降低。这种变化伴随着胞浆中H₂O₂。所有这些由RfBP引起的响应都可以通过在RfBP下消除RfBP的产生来消除⁺背景，以及RfBP基因沉默(RfBP⁻拟南芥系与野生型(WT)植物在黄素和H₂O₂浓度(13]。因此，黄素含量的改变是H₂O₂在植物细胞质中产生。然而，黄素含量的改变如何诱导H₂O₂一代人不清楚。

H₂O₂与开花时间控制有关[31]-[35]通过光周期途径，其中包括多个调节因子[36]、[37]。bZIP转录因子开花位点D (FD)是一种重要的调控因子，其功能是激活花分生组织身份(FMI)基因APETALA1（AP1)，标志着茎尖处花器官形成的开始[38]、[39]。在茎尖处，FD和AP1协调表达以促进花器官原基的生长[38]、[39]。昼夜节律钟是光周期通路的中心角色[36]和H₂O₂作为影响时钟转录输出和开花时间的输入信号[35]。当胞质H₂O₂例如，通过增强拟南芥中叶绿体脂氧合酶和抗坏血酸过氧化物酶的活性，使其含量增加[31]、[32]。

除了增加H₂O₂， RfBP对叶片黄素含量的下调也与促花基因的表达增强有关，从而诱导提早开花[13]、[40]。提早开花是一种偶然现象[13]，并被谨慎地定性为RfBP的恒定表型⁺植物(40]。当通过RfBP带回叶片黄素时，这种表型被消除⁻到稳态水平。rfbp诱导的早熟与促进花的光周期基因的叶面表达增加有关，但与春化、自主和赤霉素途径的基因无关[j]。40]，它们提供了替代光周期的开花调节机制[41]-[43]。rfbp上调的光周期基因编码红光/远红光受体光敏色素PHYA、蓝光受体隐色素CRY1和CRY2、CAB表达的生物钟振荡器(TOC1)和锌指转录因子CONSTANS (CO)蛋白[qh]40]。PHYA、CRY1和CRY2作为时钟的入口，将光信号传输到中央振荡器，中央振荡器部署aTOC1-配对转录反馈回路控制光周期基因表达的昼夜节律[44]-[46]和CO的产生作为时钟的输出和开花基因的激活剂英国《金融时报》在树叶中[45]、[47]。因此，rfbp诱导的提早开花可归因于光周期途径。rfbp诱导的早花也与FD和AP1在茎尖[40]，这表明RfBP在同时增强光周期、花调控和FMI类别的开花相关基因的表达方面发挥了作用。相比之下，的表达英国《金融时报》以及叶片中光周期基因的表达FD和AP1在茎尖处，当RfBP基因被沉默，RfBP蛋白的产生被取消，黄素浓度恢复到稳态水平[40]，证实了RfBP调制对序列反应的初始影响。这些结果表明，RfBP下调叶片黄素含量可诱导早花，同时提高胞浆H含量₂O₂以及通过光周期途径促进开花的基因表达的增强。然而，这些反应的因果关系尚不清楚。在这里，我们关注一个特定的问题:H₂O₂诱导影响RfBP下的开花时间⁺背景?

在植物细胞中，H₂O₂可由多种来源产生，如过氧化物酶体氧化还原[48]、[49]，叶绿体代谢[31]、[32]，与生长发育有关的转录调控[50]，以及METC [11]、[13]。然而，这些来源中哪一个与花期控制有关尚不清楚。在本研究中，我们阐明了RfBP对叶片黄素含量的下调作用[13]、[40诱导H₂O₂产生可能是通过mec和这个H源的电子泄漏₂O₂对拟南芥开花有促进作用

RfBP诱导植株提前开花和表达FD和AP1基因

之前我们测试了WT, RfBP⁺，以及RfBP⁻典型短日(8小时光照)、非典型短日(12小时)、典型长日(16小时)或诱导光期(植物由短日转向长日)下的植物[13]、[40]。为了简化本研究的实验条件，我们研究了在典型长日照条件下生长的植物，并在这种条件下进行了验证新创的表达式RfBPRfBP基因⁺和RfBP基因沉默⁻。该基因高表达(图2)1a)，产生了大量的RfBP蛋白(图2)1b)在RfBP的叶片中⁺而在野生型植物中则没有基因表达和蛋白质产生。RfBP的基因表达和蛋白产量明显降低⁻植物(图1a、b)。RfBP促进了开花⁺与WT或RfBP相比⁻植物(图1c). WT植株需要24天开花，有20片莲座叶(图2)1d)。RfBP⁻在开花时间和莲座叶数上与野生型相似⁺比WT提早6天开花，莲座叶减少了11片(图2)1d).然后，我们研究了花起始标记基因AP1以及它的调节基因FD因为这两个基因的表达增强很好地反映了rfbp诱导早花的分子基础[40]。我们发现FD和AP1在RfBP中表达水平较高⁺比WT和RfBP高⁻植物在分层后12天，RfBP前6天⁺在典型的漫长的日子里开花1e).因此，我们有必要进一步探索rfbp在典型长日照条件下诱导提早开花的分子机制。

RfBP下调黄素可抑制METC基因的表达

基于Affymetrix拟南芥基因组ATH1阵列的rfbp调控转录组分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE18417)， 19个METC基因中有13个在RfBP中的表达水平降低了2 ~ 4倍⁺与WT植物相比(图2)2)。其余6个基因编码:(1)NADH脱氢酶(辅酶)Fe-S蛋白;(2)铁硫蛋白A;(3)铁硫蛋白B;(4)铁硫蛋白C;(5)黄素蛋白和(6)替代氧化酶。rfbp抑制的METC基因编码的蛋白顺序为:(1)nadh -泛醌(NADHU)氧化还原酶相关蛋白;(2) NADHU氧化还原酶相关;(3) NADHU氧化还原酶B18亚基;(4) NADHU氧化还原酶19-kD亚基(NDUFA8)家族蛋白; (5) pridine nucleotide-disulphide oxidoreductase family protein; (6) ubiquinol-cytochrome (Cyt) c reductase (UCCR) complex 7.8-kD protein, putative; (7) putative UCCR complex CoQ-biding protein; (8) putative UCCR complex CoQ-biding protein; (9) Cyt c oxidase (UCCO) copper chaperone family protein; (10) UCCO subunit 6b, putative; (11) mitochondrial ATP synthase g subunit family protein; (12) mitochondrial ATP synthase g subunit family protein; and (13) mitochondrial ATP synthase episilon chain. In this list, the last three proteins function in the production of energy and the first 10 ones are all required for electron transport, initiated by NADH in complex I and finished by Cty in complex IV [16)(图2)。

通过对叶片基因表达的实时荧光定量RT-PCR分析证实了该阵列的结果。基于转录量与本构表达的比率EF1α作为对照，13个METC基因的表达水平显著(P< 0.01)， RfBP降低⁺比野生植物(图3.)。这种差异通过RfBP的呈现得到了更明确的认识⁺基因转录量的WT比(附加文件)1:图S1)。定量分析未发现RfBP中mec基因表达明显抑制⁻植物。相反，13个METC基因在RfBP中表达相似⁻和WT叶(图2)3.)。因此，METC基因表达的抑制是由新创的表达RfBP。

我们分析了RfBP在降低METC基因表达和黄素浓度的双重作用之间的关系。13个rfbp抑制基因在电子载体蛋白复合物I至IV中起作用，而I和II则使用FMN/FMNH₂和时尚/ FADH₂分别为氧化还原中心[14]。因此，对METC基因表达的抑制可能与RfBP降低黄素含量有关。药理学研究证实了这一假设，在实验对照组中，植物被喂食核黄素水溶液或用水处理。与对照相比，饲喂核黄素的所有植物以及饲喂核黄素的RfBP中，13个METC基因的表达程度都更高⁺所有的基因转录本都恢复到水处理过的WT植株的水平(图2)4)。与此同时，核黄素饲喂处理后，所有植物体内黄素含量均有所增加，核黄素饲喂的RfBP体内黄素含量也有所增加⁺在经过水处理的WT植物中，植物恢复到大约稳态水平(图2)5a)。RfBP⁻核黄素饲喂对黄素浓度的影响与WT相似(图2)5a).基于统计分析，RfBP与⁺和WT或RfBP⁻植物的METC基因表达水平和核黄素饲喂处理的影响是恒定且显著的(P<0.01)4和5a).因此，METC基因表达的抑制可归因于RfBP下调黄素含量。

mec基因表达抑制伴随H₂O₂产生可能是通过电子泄漏

如上所述，抑制METC基因表达可能会损害METC功能并导致H₂O₂通过电子泄漏产生。电子主要从电子载体蛋白复合体I或III泄漏，偶而从复合体II泄漏[24]、[25]、[51]。因为氧化还原中心是FMN/FMNH₂复合体I和FAD/FADH₂在复合体II ([14];数字2)，通过RfBP降低黄素含量可能会损害这两个复合物的功能并引起电子泄漏。为了验证这个假设，我们测试了H₂O₂在WT的叶中，RfBP⁺，以及RfBP⁻由于核黄素处理消除了RfBP对METC基因的抑制作用(图2)4)，并恢复RfBP⁺到WT的开花时间[40]。

荧光H₂O₂采用探针Amplex red (AR)和Amplex ultra red (AUR)对H₂O₂在拟南芥细胞中与H反应₂O₂， AR和AUR分别转化为间苯二酚和间苯二酚类似物，发出强烈的深红色荧光[9]。AR可以穿透质膜，从而探测H₂O₂而AUR不能穿透质膜，因此探测H₂O₂存在于胞外空间[9]。胞质和胞质H₂O₂AUR和AR分别报告的信号如图所示5b.无论核黄素处理还是水作为对照，所有植物的AUR染色信号都很弱且相似，表明外体H的稳态水平较低₂O₂不受RfBP或核黄素的影响。相比之下，水处理的所有植物的AR染色信号都强于核黄素处理，表明核黄素饲喂降低了胞浆H的数量₂O₂。尤其是RfBP⁺植物在水处理中表现出最强的信号，而核黄素饲喂处理则大大降低了该信号。因此，rfbp诱导H₂O₂主要积聚在细胞质中，可通过给植物喂食核黄素而减少。

叶H₂O₂测量了浓度。经水处理后，H₂O₂RfBP水平大约高出1.6倍⁺而不是在WT或RfBP中⁻(图5c).核黄素饲喂处理显著(P< 0.01)， H₂O₂所有植物的浓度。出乎意料地,H₂O₂核黄素喂养的RfBP的浓度⁺植物鲜叶重从831纳克/毫克降至372纳克/毫克，仅减少55%，但仍显著(P< 0.01)，低于经水处理的WT (573 ng/mg)或RfBP⁻(530纳克/毫克)植物(图5c).然而，在所有情况下，H₂O₂和黄素水平(图25a、b)与METC基因表达量相关(图2)4)。这些分析与H₂O₂影像学检查和两种证据均提示胞浆H升高的可能性₂O₂黄素依赖性mec中电子泄漏的结果。

METC基因表达和H₂O₂鱼藤酮是一种酮化学物质，可以抑制电子载体蛋白复合物I并诱导电子从该复合物中泄漏出来[18]、[19]。鱼藤酮溶解于乙醇中，作为含有0.1%乙醇的水稀释溶液处理植物，实验对照组用0.1%乙醇处理植物。无论基因型、WT还是RfBP，在鱼藤酮处理植株和对照植株中均检测到等量的13个转录本⁺(图6;额外的文件2:图S2)。在RfBP⁺然而，鱼藤酮处理在rfbp引起的抑制的基础上进一步降低了基因表达水平(图2)6)。这表明鱼藤酮和RfBP对METC基因的表达有相似的影响。与对METC基因表达的抑制作用相反，鱼藤酮处理增加了H₂O₂在所有植物中的浓度(图6)。H₂O₂鱼藤酮处理的WT和RfBP的浓度⁻处理过水的RfBP中植物的含量提高了约90%⁺表明鱼藤酮和RfBP具有相似的功能。此外，鱼藤酮似乎协同RfBP增加H的作用₂O₂浓度为H₂O₂在RfBP⁺与对照组相比鱼藤酮增加了近50%鱼藤酮和RfBP对METC基因表达和H₂O₂浓度(图3.，4，5和6)提示RfBP诱导H₂O₂可能通过电子泄漏产生。

RfBP-induced H₂O₂有助于提早开花

所有的植物都晚些开花，有更多的莲座叶₂O₂核黄素饲喂处理与对照水处理相比，核黄素浓度降低(图2)7a).延迟开花表型与基因表达减少一致FD和AP1饲喂核黄素的植物茎尖的基因(图2)7b)增加了METC基因在所有植物中的表达水平，特别是消除了RfBP对RfBP中METC基因表达的抑制作用⁺(图4)。在RfBP⁺，核黄素饲喂处理回收叶黄素(图2)5a)， METC基因的表达(图2)4)，FD和AP1基因(图7b)到WT水平的近似值，H减小₂O₂但并不能完全抵消rfbp诱导的量(图2)5c).本例中为RfBP⁺不再显示早花表型;相反，它们以WT或RfBP的形式发展⁻植物(图7a).这些分析表明rfbp诱导H₂O₂有助于提早开花表型与增强表达FD和AP1在茎尖的基因。

H的外在作用₂O₂促进开花

确认H的促进作用₂O₂在开花方面，我们进行了H处理植物的药理学研究₂O₂仅或与H结合₂O₂清除过氧化氢酶。这两种化合物在水溶液中浸泡种子，并处理在琼脂培养基上生长的10天的植物。我们首先用一系列的H₂O₂浓度，两天后我们发现4mm H₂O₂很好地增强了表达FD和AP1在茎尖处(图28a)提高了H的内在水平₂O₂叶片(图8b).我们进一步发现4 mM H₂O₂有效地诱导提早开花和减少莲座叶数(图8c, d)。然而,H₂O₂处理没有引起METC基因表达水平的明显变化(附加文件)3.:图S4)。然后，我们用对照水和4mm H处理种子和植物₂O₂或4mmh的混合物₂O₂加5 U/ml过氧化氢酶。我们发现显著的(P< 0.01)增加了内在H₂O₂内容(图9A)的增强FD和AP1表达式(图9b)，我们还观察到了早花表型(图2)9c,d)₂O₂和水相比。然而，这些影响被氢过氧化氢酶的存在所消除₂O₂治疗(图9模拟)。因此，外部施加的H₂O₂对开花有促进作用。越早开花，内在H值越高₂O₂而在FD和AP1观察RfBP的表达水平⁺与WT和RfBP相比⁻相同处理条件下的植株(图29模拟)。据推测，外在(人为施加的)和内在(rfbp诱导的)H₂O₂合作促进开花和提高FD和AP1在茎尖处表达。

H₂O₂不同来源对开花的影响是相似的

为了阐明H₂O₂不同细胞来源对开花的影响相似，我们确定了H₂O₂的浓度,FD和AP1基因表达与拟南芥开花时间的关系cat2和nfxl1突变体与WT和RfBP的比较⁺植物。由于过氧化物酶体过氧化氢酶2 (Cat2)的突变cat2突变体失去80%的过氧化氢酶活性，产生更高水平的胞浆H₂O₂与野生植物相比[48]、[49]。本研究通过测量叶片H值证实了这一点₂O₂浓度，高出43%cat2(536 ng/mg鲜叶)比WT (942 ng/mg)高[附加文件]4:图5a]。与WT相比，cat2显示出更高水平的FD和AP1表达，提前10天开花(附加文件)4:图S5b、c)。作为转录因子NFXL1中断的间接结果nfxl1突变体导致细胞质H降低20%₂O₂相对于稳态水平[50]。与WT相比，nfxl1有较低的胞浆H₂O₂和FD和AP1表达并显示晚花表型叶片(附加文件)4:图S5b、c)。这些分析表明，H₂O₂不同来源的Cat2或NFXL1脱位和RfBP对花期和表达的影响相似FD和AP1。

RfBP补偿了开花抑制nfxl1突变体

因为RfBP⁺和nfxl1是相反的，可能会抵消H₂O₂结果表明，两种植物均与RfBP杂交⁺nfxl1生成Hybrid用于进一步分析。METC基因在RfBP中表达相似⁺nfxl1和RfBP⁺植物(图10A，暗示nfxl1突变与METC基因表达无关。然而，杂种似乎是双亲细胞质H的中间产物₂O₂内容(图10B)层次FD和AP1表达式(图10c)，开花时间(图2)10d)，莲座叶数(图2)10e).显然是RfBP⁺补偿开花抑制nfxl1突变体。

本研究主要试图阐明H₂O₂是由RfBP诱导影响开花时间的，基于我们最近的证据，早期开花是由新创乌龟的表情RfBP与叶片H值的不断增加有关₂O₂的浓度和适时增强的表达FD和AP1在RfBP的茎尖处⁺短日照、长日照或诱导光周期下的拟南芥植物[40]。在这些条件下，增强的表达FD和AP1对茎尖的花器官形成至关重要[38]、[39]、[52]，很好地反映了rfbp诱导早花的分子基础[40]。在本研究中，我们简化了实验系统，只在长日照条件下种植植物，在这种条件下，我们将早花表型与基因的表达增强联系起来FD和AP1，花调控基因和FMI基因(图2)1)。通过多次重复实验获得的数据表明:(i) RfBP抑制19个METC基因中的13个基因的表达(图2)2，3.和4;额外的文件1:图S1和附加文件2:图S2)，诱导H₂O₂可能是由于METC的电子泄漏造成的(图5和6;额外的文件3.:图S4和附加文件5:图S3);(2) H₂O₂促进开花和增强表达FD和AP1(数据7，8和9);(iii)潜在的电子泄漏似乎是H生成的生化来源之一₂O₂对开花有促进作用(图2)10;额外的文件4:图5)。以前我们发现，外源RfBP蛋白能够调节游离黄素的内在含量，从而产生生理和病理后果。在RfBP内部⁺在细胞中，RfBP与核黄素结合，减少叶片中游离黄素的数量，同时提高胞浆中H的浓度₂O₂，它反过来调节对细菌病原体的防御反应[13]。因此，外源RfBP蛋白对黄素含量的下调具有发育和防御作用。

近10年来，对核黄素生物合成途径的基因改造改变了植物发育的某些方面，如由lumazine合成酶的COS1蛋白特征调控的叶片衰老，该酶催化了核黄素生物合成途径的倒数第二步[53]是茉莉酸信号通路的重要组成部分[54]。在植物中，外源核黄素通过激活乙烯信号通路促进植物生长[55]。外用核黄素还根据病原体的类型，以水杨酸依赖或不依赖的方式诱导对病原体的抗性[26]、[41]。这些发现表明核黄素含量的变化通过影响植物激素信号通路引起生理和病理反应。根据我们在这里详述的研究和之前的报道[40]，黄素的新功能已经从激素信号传导扩展到花期控制。

提前开花与19个METC基因中的13个基因的自发抑制表达有关(图2)2，3.和4;额外的文件1:图S1和附加文件2(图S2)和伴随升高的胞浆H₂O₂浓度(图5)在RfBP内⁺植物。对METC基因的抑制是由于叶片中游离黄素浓度的降低，可以通过RfBP去除⁻或在RfBP下进行核黄素饲养处理⁺背景(数据3.和4;额外的文件1:图S1和附加文件2:图S2)。基于RfBP的角色⁻和核黄素喂养恢复RfBP⁺核黄素饲喂和RfBP对黄素含量和开花时间的影响，以及核黄素饲喂和RfBP对H的影响程度₂O₂浓度(图5和7)，增加H₂O₂至少部分是由rfbp降低黄素含量引起的，并有助于早期开花表型。一方面，H的促进作用的直接证据₂O₂与H₂O₂过氧化氢酶(图28和9)。另一方面，三种黄素的水平同时下降(图2)5)符合黄素形式转换的动态。核黄素和FMN的转化是可逆的[56]，而FMN到FAD的转化是不可逆的[57]。特定黄素的积累与浓度有关，因此游离核黄素或FMN的量越少，FMN或FAD的量就越少[1]。因此，游离核黄素的下调是游离FMN和FAD浓度协同下降的一个初始原因，也是RfBP对开花时间的后续影响的一个原因⁺背景。在RfBP⁺核黄素饲喂虽然只增加了H₂O₂但不会将其检索到WT级别(图5)5)，则该处理启用RfBP⁺在黄素含量上与WT相似，METC的表达时尚,AP1基因，特别是开花时间(图1)4和7)。这一差异表明，下调黄素含量并不是RfBP诱导H₂O₂而且开花早。或者，外用核黄素作为内在产生的黄素影响细胞氧化还原不够有效。目前，我们无法在核黄素饲喂实验的基础上有针对性地展望黄素介导的氧化还原与花期控制的关系。

关于核黄素摄食效应，一个问题是外用核黄素是如何增加内源性黄素浓度的。在植物中，核黄素的合成及其向FMN的转化以及FMN向FAD的转化预计发生在质体中[56]、[57]。随着细胞的生长，质体分化为叶绿体[58]，其中RfBP定位于[13]。黄素通过亚细胞运输运输，并在METC等过程中发挥作用[59]。在动物中，RfBP介导核黄素的细胞易位[60]、[61]。动物直接从饮食中吸收核黄素[62]或通过摄入的FMN和FAD的转化产生这种维生素[63]。在这两种情况下，RfBP的作用是在细胞间、细胞间以及从一个器官到另一个器官之间重新分配核黄素[30.]、[60]。类似的运输机制可能负责外源性核黄素运输到植物细胞，但这一假设仍有待检验。

关于RfBP对黄素水平和METC基因表达的影响，一个重要的问题是RfBP降低黄素浓度是如何引起H₂O₂可能通过电子泄漏产生。因为电子载体蛋白复合物I和II涉及rfbp抑制的13个基因中的前5个，并使用FMN/FMNH₂和时尚/ FADH₂作为氧化还原中心(图22)，由于rfbp降低了黄素浓度，电子可能从这两个复合物中泄漏，导致细胞质H浓度增加₂O₂(图5)。这一假设得到了以下间接证据的支持:(i)鱼藤酮和黄素缺乏在抑制METC基因表达和增加H₂O₂(数据4，5和6;额外的文件5:图S3);(ii)核黄素饲喂提高内源性黄素和METC基因表达水平，降低H₂O₂浓度(图4，5和7);(iii)外部施加的H₂O₂对METC基因表达的影响(图26;额外的文件3.:图S4)。此外，(i)和(ii)中的一个关键点是H的增加₂O₂浓度是抑制METC基因表达的结果，而不是原因。这些分析表明，与鱼藤酮的毒性一样，RfBP下调导致的黄素短缺可能导致了抑制作用[21在METC上诱导电子泄漏。

根据鱼藤酮RfBP的性质以及METC的组成和功能，鱼藤酮和RfBP抑制METC基因表达的机制可能不同。鱼藤酮是一种广谱杀虫剂、杀虫剂和杀鱼剂，对METC有毒，损害电子载体-蛋白质复合物I的作用[64四元电子向单氧电子的传递₂受体，抑制O₂H型还原₂O和NADH的质子₂和FADH₂(15]-[17]。至于RfBP的影响，RfBP造成FMN和FAD的短缺[13]可能导致FMN在复合体I中无法从NADPH接收质子，而在复合体II中FAD无法为CoQ提供质子(图2)2)。电子泄漏和H₂O₂鱼藤酮抑制复合体I后的新一代已经在动物中得到了很好的研究[20.]、[21]、[64]，但人们对植物是否会产生类似的抑制作用知之甚少。由于络合物III与内膜相关的CoQ之间存在替代氧化旁路，鱼藤酮的抑制作用可能不会导致络合物III的电子泄漏，但电子仍有可能从络合物I或II中泄漏[15]、[16]、[63]。此外，抑制植物复合体I的影响远远超出复合体本身，因为与线粒体和其他细胞器相关的许多代谢途径也随之改变[65]。这也解释了一种可能的方式，替代减少黄素含量，RfBP影响H₂O₂积累和开花时间。抑制METC基因表达似乎是鱼藤酮作用于METC的一种方式，因此在鱼藤酮处理的WT和水处理的RfBP中，结果是相似的⁺植物(图6;额外的文件2:图S2)。然而，目前还没有证据阐明鱼藤酮抑制METC基因表达的机制。

除了METC的电子泄漏外，H₂O₂可以通过黄素介导的细胞质和过氧化物酶体氧化还原过程在植物细胞的不同部位通过许多其他机制产生[66]。表达水平被RfBP降低50%以上的细胞质和过氧化物酶体氧化还原基因编码单一alutaredoxin (At1G03850)、硫氧还蛋白(At1G07960)和过氧化物还蛋白2型(At1G60740)蛋白和三种glutaredoxin (At1G77370、At5G18600和At5G40370)蛋白(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE18417)。所有这些蛋白质都是H₂O₂并可能与潜在的电子泄漏机制同时起作用，以提高H₂O₂并影响开花时间。因此，如上所述，对METC基因表达的抑制作用并不是RfBP诱导H的唯一机制₂O₂并在RfBP下促进开花⁺背景。要验证这一假设，显然需要进行大量具有挑战性的遗传、生化和分子研究。在目前的研究中，我们只能提供间接的证据证明RfBP⁺和nfxl1植物在改变胞质H时相互抵消₂O₂浓度及其后续对开花时间和表达的影响FD和AP1在茎尖处(图2)10;额外的文件4:图5)。

关于H₂O₂在植物细胞的不同位点产生和功能，一个关键的问题是有关H的细胞易位₂O₂或者线粒体H₂O₂是否招入花期控制?与胞浆-胞质易位相比[13]， H细胞内易位₂O₂不同细胞室的后代可能在调节多种生理过程中发挥更重要的作用[11]。假设的H₂O₂易位可能不依赖于自由扩散，相反，它可能符合某些选择性模式[67]、[68]。在一项备受关注的研究中，最初分配给水运输的水通道[69]-[71]与其他小化合物的细胞易位有关[72]、[73]包括H₂O₂(67]、[74]。特定的水通道蛋白可能介导H₂O₂易位为其招募进入花期控制。这一假设需要验证。

我们已经证明rfbp诱导H₂O₂推测是由于RfBP下调黄素导致的METC电子泄漏₂O₂是开花的积极调节剂，假设的电子泄漏似乎是H₂O₂具有促进开花的作用。事实上，提早开花是一种偶然现象，与植物的生长有关新创的表达RfBP但我们并不确切知道它在黄素介导的氧化还原和开花时间控制方面意味着什么。

植物材料和生长条件

的RfBP表达拟南芥线先前指定为REAT11 [13]，最近更名为RfBP⁺(40]。的RfBP-在RfBP下产生的消声线RfBPi11⁺(REAT11)背景[13]更名为RfBP⁻(40]。的cat2和nfxl1突变体以前是通过T-DNA插入到Cat2基因(48]、[49]和NFXl1基因(50]。他们的种子是从拟南芥信息资源(http://www.arabidopsis.org)，股票编号分别为SALK_076998和SALK_001399。其他植物的种子保存在这个实验室里。植物在装有盆栽土壤的花盆中种植[75]或在环境控制条件下的Murashigie和Skoog (MS)培养基上:22±1°C, 55%±2%湿度，长时间(16小时光照和8小时黑暗)，光照强度为200 μM量子/m²/ s。分层后为第0天。每个基因型各50株，在7个独立的重复实验中，以莲座叶数和开花天数来表征开花表型。

基因表达分析

总RNA是从直接切除的两片最年轻的膨大叶片的组合样本中分离出来的，或者是从在双目显微镜下切除的茎尖上分离出来的，这些样本来自15个植物，每次重复三到六次实验。分离的RNA进行Northern (RNA)印迹或定量实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析，使用组成性表达EF1α吉恩作为参考。Northern印迹杂交于RfBP-特异性探针标记地高辛(EMD Biosci。Inc.， Madison, WI, USA)。使用特定引物进行实时RT-PCR(附加文件)6:表S1)，并遵循先前描述的方法[76]、[77]。在25 μl反应溶液中，模板浓度增加0.5 ng和0 ~ 3.0 ng，以选择所需的剂量，扩增基因<26个循环。25 μl反应混合物由1 μl稀释为1:10的第一链cDNA、2.5 μM引物和1 × SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa Biotech)组成。中国大连有限公司)。在每三个重复的实验中，所有的反应都是用缺失cDNA的零模板对照进行的。被测基因的相对表达量被量化为被测基因与被测基因的转录量之比EF1α。相对表达水平直接显示或转换为百分比，药理学处理与对照(水处理)或RfBP⁺和RfBP⁻与野生植物相比。

蛋白质分析

在转化构建中，在RfBP的c端添加了组氨酸(His)标签，用于镍层析纯化植物蛋白[13]、[76]。两个最年轻的膨大叶片被切除，并从10毫克新鲜叶片中分离总蛋白质，如前所述[78]。根据制造商的说明(Amersham Biosciences Corp.， Piscataway, NJ, USA)，将分离的蛋白质结合到镍聚苯乙烯珠上，用咪唑水溶液分别在100、150和300 mM处洗脱。用Novagen Enterokinase Cleavage Capture Kit (EMD Biosciences Inc.， Darmstadt, Germany)对200-mM咪唑洗脱液进行处理，去除His标签，用三辛十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析[76]。用comasassie G-250凝胶染色观察蛋白。

药理研究

对盆栽植物进行核黄素饲喂试验。核黄素(EMD)在0.1 mM的水溶液中加入0.03% (v/v)的Silwet-L77作为表面活性剂，用雾化器喷洒在10天的植株上[79]。实验对照组采用0.03% Silwet-L77水溶液处理。2 d后，按上述方法切除茎尖，用于分析FD和AP1基因表达，并切除两个最年轻的展开叶，用于检测H₂O₂，以及METC基因的表达。

鱼藤酮(Sigma-Aldrich, St. Luis, WA, USA)对METC基因表达和H₂O₂对核黄素饲喂试验进行了浓度分析。在100% (v/v)乙醇中制备40 mM的鱼藤酮溶液，加水稀释，在含0.1%乙醇的40 μM水溶液中对10日龄植株进行喷施。同样，对照用0.1%乙醇处理植株。

H的作用₂O₂和过氧化氢酶(Sigma-Aldrich)₂O₂在MS培养基上生长的植物在玻璃瓶(直径为5 cm高、2 cm宽和1.5 cm宽)中测定浓度和开花时间。4、8和12mm H的水溶液₂O₂过氧化氢酶5 μU/ml, 0.22 μm纤维素过滤杀菌。对种子进行了灭菌，并进行了两种实验。第一类是用来估计H的功能剂量₂O₂在0(仅限无菌水)、4、8和12毫米的范围内分别浸泡种子。第二类实验是检验H₂O₂和过氧化氢酶。灭菌后的种子用4mm H浸泡₂O₂实验对照组分别取过氧化氢酶或其混合物5u /ml，用无菌水浸泡。种子在室温下浸泡6小时，然后在无菌条件下用无菌水冲洗5次。将洗净的种子播种在300毫升无菌塑料瓶中。10天后(植株生长7 d时)，加入5 μM H的培养基₂O₂5 μU/ml过氧化氢酶，或两者并用无菌水处理。再孵育两天后，植物被用于分析FD和AP1茎尖表达量和两个最年轻展开叶中黄素含量。记录开花时间和莲座叶数。

H₂O₂检测

H的亚细胞定位₂O₂荧光H₂O₂如前所述，探针Amplex Red (AR)和Amplex Ultra Red (AUR) (Invitrogen, San Diego, CA, USA) [9]、[13]、[80]。使用这两种探针是因为先前的观察表明AR和AUR在与H反应时被氧化₂O₂发出强烈的深红色荧光[9]、[81]。取两片最年轻的膨大叶片，立即浸入含有10 μM AR或AUR的pH7.4磷酸盐缓冲液中，在真空泵和钟罩提供的低压下，在溶液中黑暗孵育3小时。探针样品在蔡司LSM700激光扫描共聚焦显微镜下观察。在543 nm氩激光激发下，观察了氧化后的AR和AUR在585 ~ 610 nm范围内的荧光发射。

H的含量₂O₂通过定量测定叶片H值来测定植物的H值₂O₂用分光光度计提取。H₂O₂从15日龄植株的第一和第二年轻叶片中提取，并通过监测A₄₁₅过氧化钛配合物与氢形成₂O₂提取(26]。H的含量₂O₂根据A₄₁₅过氧化钛配合物在标准H范围内形成的曲线₂O₂源自商业来源[26]。

生成RfBP⁺nfx1混合动力

RfBP⁺和nfx1植物在开花后10天通过授粉进行杂交atnfx11雌蕊具RfBP⁺小孢子。RfBP⁺携带一个IPT二世基因(13),而nfnxl1携带IPT二世和T-DNA插入物(http://signal.salk.edu/tdna_protocols.html)。因此，RfBP⁺nfxl1通过在含卡那霉素的MS培养基上的生长和PCR分析，鉴定了杂交菌株RfBP以及插入侧翼序列(附加文件6:表1)。本研究利用该杂种自交，其同源F3后代。

数据分析

所有实验均采用完全随机设计，重复至少3次，结果相似。定量数据采用商用IBM SPSS19.0软件包(IBM Corporation, Armonk, NY, USA;http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/)。数据的方差齐性采用Levene检验，数据的形式分布模式采用Kolmogorov-Smirnov检验和P-P图[82]。然后，采用Fisher最小显著性差异检验对数据进行方差分析[83和Tukey-Kramer测验[84]，使用SPSS19.0商用软件包。

支持数据的可用性

支持本文结果的微阵列数据可在NCBI基因表达综合库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，登记号为GSE18417。

AP1:

APETALA1

基于“增大化现实”技术:

Amplex红

与:

安倍超红

cat2一个t - dna索引的拟南芥突变体CAT2：

基因和减少的H₂O₂内容

公鸡:

泛醌

Cyt:

细胞色素

时尚:

黄素腺嘌呤二核苷酸

FMI:

花分生组织同一性

FMN:

黄素单核苷酸

METC:

线粒体电子传递链

NAD:

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

nfxl1一个t - dna索引的拟南芥突变体NFXL1：

基因和减少的H₂O₂内容

RfBP:

Riboflavin-binding蛋白质

RfBP⁺：

表达rfbp的转基因拟南芥系

RfBP⁻：

在RfBP下产生的RfBP沉默拟南芥系⁺背景

ROS:

活性氧

我们感谢张树建博士(实验室以前的学生)最初的实验。国家重点基础研究计划(973计划2012CB114003)、国家自然科学基金(31171830和31272072)和新型转基因生物育种项目(2013ZX08002-001)资助。

作者指出

从属关系

1. 南京农业大学植物病理学系/作物病虫害综合治理教育部重点实验室，江苏南京210095

   李亮，胡丽，韩丽萍，季洪涛，朱月月，王小兵，葛军，徐曼玉，沈丹，董汉松

相应的作者

对应到丹沈或Hansong董。

相互竞争的利益

作者宣称不存在竞争利益。

作者的贡献

LL和LH进行了实验并共同撰写了论文。LPH分析了数据。HJ, YZ, XW, JG, MX进行实验。DS和HD共同设计实验并共同撰写论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

梁立、李虎对这项工作也有同样的贡献。

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