驯化的副作用:与野生豆科植物种子相比，栽培豆科植物种子含有类似的生育酚和脂肪酸，但类胡萝卜素较少

背景

亲脂性抗氧化剂在食用种子中发挥着双重关键作用(i)通过防止脂肪氧化，作为细胞完整性和种子活力的防腐剂，以及(ii)作为人类和动物生命资源的必要营养物质。大量文献表明，植物驯化和驯化后的进化往往会导致种子大小和适口性的增加，以及种子休眠的减少。然而，令人惊讶的是，人们对农业选择和栽培如何影响种子的生理适合度和营养质量知之甚少。豆科植物是所有植物科中作物种类最多的一种，其种子营养价值高，可食用，因而受到栽培。在这里，我们评估了培育下植物的进化是否改变了由膜(脂肪酸)和亲脂抗氧化剂(类胡萝卜素和生育酚)形成的完整系统，在10种最重要的经济谷物豆类及其最近的野生亲缘，即:落花生(花生),中投公司(鹰嘴豆),甘氨酸(大豆),Lathyrus(野豌豆),镜头(扁豆)、Lupinus(卢平),菜豆(bean),Pisum(豌豆),野豌豆属(蚕豆)和豇豆属(豇豆)。

结果

出乎意料的是，我们发现驯化后，10个物种的类胡萝卜素(包括叶黄素和玉米黄质)含量都下降了(总类胡萝卜素含量平均下降48%)。此外，类胡萝卜素的组成也发生了变化，其中一些类胡萝卜素在大多数作物中丢失。生育酚和脂肪酸的含量发生了不定向的变化，在一些物种中含量增加，而在另一些物种中含量减少，与类胡萝卜素的变化无关。在某些物种中，多不饱和脂肪酸(尤其是亚麻酸)、α-生育酚和γ-生育酚在驯化后下降。

结论

类胡萝卜素、生育酚和脂肪酸的变化可能是对其他所需性状的选择的副作用，如种子休眠和传播机制的丧失，以及对种子贮藏性和口感的选择。本研究可作为拓宽作物适宜性和营养质量综合变化研究的基础。

人类对植物的驯化可能开始于大约13000年前的中东，尽管在地理上和暂时分开的事件发生在世界上大约13个地方，在现在1.3万到3000年前[1］．,最初驯化美国这篇驯化后进化影响作物的形态和生理特征[2］．最可能的情况是，口感、产量、贮藏性和所需性状的遗传力是早期农民决策的主要决定因素，与今天的偏好类似[2］．此外，对于某些作物，物理性状的无意识选择[3.或无形的营养特征，例如决定大脑血清素合成的高游离色氨酸含量，可能参与了史前人类选择农耕物种的决定[4］．与农业操作的盈利能力相关的驯化和作物进化的遗传变化已得到充分的记录，例如种子传播机制和种子休眠的减少，种子大小的增加和与农艺表现有关的其他植物性状[5] - [9］．

与此相反，驯化对种子营养价值的影响较少被关注。现有的稀缺文献集中在蛋白质和氨基酸的内容上[4]，[10] - [13而关于淀粉等其他重要营养性状的信息却很少[14或油[15］．类胡萝卜素、生育酚和脂肪酸(FAs)在可食用种子(我)作为人体和牲畜营养所需的必需膳食元素，包括维生素前体、抗氧化剂和必需ω-3 FAs，以及(2)对种子来说，它们需要支持膜的完整性，有助于种子的适合度。尽管这些代谢物在种子活力和营养方面发挥着关键作用，但尚不清楚这些代谢物是否为早期农民所选择，以及它们是否在驯化后的进化中发生了改变。

在种子贮藏过程中，如果抗氧化系统失效，种子活力就会受到影响，从而导致活性氧(ROS)的积累。正在出现的证据表明，ROS有助于植物生长发育以及细胞死亡所需的氧化信号传导[16] - [18］．当ROS在临界数量或临界位置(如胚胎)发生时，可导致种子死亡[18] - [20.］．此外，ROS可与包括FAs在内的其他分子发生快速反应，导致脂质过氧化、磷脂降解和膜完整性丧失[19]，[21]，[22］．膜FAs的组成与种子的贮藏性有关[23］．多不饱和脂肪酸(PUFAs)对脂质过氧化特别敏感[24］．亲脂性抗氧化剂保护细胞免受脂质过氧化和膜损伤，高生育酚含量与种子活力呈正相关[25] - [27］．与它们在光合组织中的作用相比，类胡萝卜素对种子抗氧化活性的贡献知之甚少。在光合组织中，类胡萝卜素是具有抗氧化能力的辅助光合色素，参与过剩光能的热耗散和ROS清除[28］．在种子中，类胡萝卜素是植物激素脱落酸(ABA)的前体，ABA是种子休眠的积极调节因子[29]，[30.］．此外，作为五颜六色的分子，它们增加了对种子传播者的吸引力[31］．

对人类来说，生育酚和类胡萝卜素具有抗氧化剂的作用，就像它们在植物中发挥的作用一样，但对人类生理有广泛的影响。类胡萝卜素可防止眼黄斑氧化，缺乏类胡萝卜素可导致失明[32]，[33］．生育酚在抗炎过程中起着关键作用[34]，[35维生素d缺乏会导致一系列疾病，包括神经肌肉问题[36及冠状动脉疾病[37］．一般而言，相对于饱和脂肪酸，摄入较多的不饱和脂肪酸可预防冠心病[38］．

考虑到类胡萝卜素、生育酚和不饱和脂肪酸对人类健康的高度有益影响，并基于已经发现的其他营养相关性状的趋势[4，人们会直觉地认为，我们现存的作物比它们的野生祖先含有更高的含量。然而，与五颜六色的类胡萝卜素相比，FAs和生育酚是人眼看不见的。种子颜色是一种受定向选择影响的农艺性状[9］．因此，有色类胡萝卜素的选择性变化可能独立于不可见的生育酚和FAs的变化而发生。

我们选择了蚕豆科10个最重要的供人类和牲畜食用的物种及其最近的野生亲戚，研究了驯化后类胡萝卜素、生育酚和FAs的修饰。这个家庭被选中(我)，因为其在农业和经济上的重要性:豆科植物拥有41种驯化物种，是所有植物科中作物物种数量最多的植物，其中大多数因其营养丰富的可食用种子而被栽培[6]，[7];（2)因为豆类种子似乎比其他植物科的可食用种子含有更高水平的类胡萝卜素[39］．我们的工作旨在提供驯化和驯化后进化对类胡萝卜素、生育酚和FAs影响的基线信息，这可能是未来改善可食用种子作物营养价值和可储存性的关键因素。

植物材料

本研究选择了10个最广泛食用的谷类豆类植物及其10个相应的最近亲缘野生近缘种1)．这10个被选中的物种占豆类总产量的97%和世界种植Ha的94%(粮农组织2013年，http://faostat.fao.org)．详细信息，文献有关野生祖分配和供应商见附加文件1．所有种子批在分析前提交相同的方案。种子在低湿度条件下密封信封，从供应商(在低温和相对湿度条件下储存)运来。一旦进入实验室，种子材料被保存在硅胶上，温度为−20°C，直到使用。然后用液氮将种子用研钵和研杵研磨成细粉，再提取。每个种子批次生产5个独立的生物重复(每个重复2到10粒种子，根据种子大小，获得至少75mg的干物质)。分析每个重复的类胡萝卜素、托克罗罗曼醇和FAs含量(除中投arietinum而且镜头culinaris，使用一组单独的种子进行FA分析)。

类胡萝卜素的分析

每个重复使用大约20mg干质量(DM)(准确质量记录)的种子粉末用于类胡萝卜素分析。在含0.1 g L的95%丙酮250 μL中提取类胡萝卜素⁻¹的CaCO_3.在≤4℃时使用冷架(IsoPack, Eppendorf 022510258 IsoTherm®，美国)，以16,100 g离心10分钟。收集上清液，用100%丙酮重悬250 μL, 16,100 g离心10 min。将两种上清液结合在一起，通过0.2 μm PTFE过滤器(Teknokroma，巴塞罗那，西班牙)过滤。类胡萝卜素在反相C18色谱柱(Waters Spherisorb ODS1, 4.6 x 250 mm, 5 μm粒径，米尔福德，马萨诸塞州，美国)上用高效液相色谱(HPLC)分离(Waters，巴塞罗那，西班牙)，用光电二极管阵列检测器(Waters 996，巴塞罗那，西班牙)检测，方法为García-Plazaola和Becerril [40]，[41］．

Tocochromanols分析

每个重复大约20 mg DM用于分析生育酚(即生育酚和生育三酚)。tocochromanol在≤4℃(如上所示)条件下，以500 μL 99%庚烷萃取，16,100 g离心10 min。收集上清，500 μL 99%庚烷重悬，16,100 g离心10 min。将两种上清液结合在一起，通过0.2 μm PTFE过滤器(Teknokroma，巴塞罗那，西班牙)过滤。tocochromanol在Diol色谱柱(Supelcosil LC-Diol, 4.6 × 250 mm, 5 μm粒径，Supelco Analytical, Sigma-Aldrich, Bellefonte, USA)上采用改进的Bagci等[42］．该体系以庚烷:叔烷为操作反应物。-丁基甲基醚97.5:2.5 v:v作为洗脱液，流速为1ml min⁻¹和tocochromanol用扫描荧光检测器(Waters 474, Waters, Barcelona, Spain)检测，激发波长为295 nm，发射波长为330 nm。使用α-、β-、γ-和δ-生育酚以及α-、β-、γ-和δ-生育三烯醇标准品(Calbiochem, Darmstadt，德国)的校准曲线对生育酚进行定量。

总脂肪酸分析

如Li-Beisson等人所述，脂肪酸可衍生为脂肪酸甲酯(FAMEs) [43］．简单地说，用2.64 mL甲醇:甲苯:硫酸10:3:25 v:v:v，含0.01% (w:v)丁基羟基甲苯的冷冻干燥种子粉处理约20 mg。同时加入正己烷溶解的十七酸(C17:0) 200 μg作为内标。样品在80°C恒定搅拌下孵育90分钟，然后加入1 mL正己烷和3 mL 0.9% NaCl (w:v)。样品剧烈混合后，3000 g离心10 min。上清液转移到自动取样瓶中，如果不立即分析，保存在−20°C。FAMEs在30米FAMEWAX色谱柱(Restek #12497, Bellefonte, USA)上使用微量1300气相色谱仪(GC) (Thermo-Scientific, USA)进行分离，并使用TSQ 8000三四极检测器(Thermo-Scientific, Waltham, USA)在全扫描模式下(50 - 550 m/z)进行检测。首先设置温度梯度为120°C 1 min，然后每分钟增加9°C至200°C，最后每分钟增加3°C至230°C，在载气流量为1 mL min的情况下保持6 min⁻¹氦气。离子源温度设置为250°C，传输线设置为240°C。分割比根据总脂肪酸丰度从20调整到150。一个商业FAME混合(Sigma Aldrich ref. 18919, Missouri, USA)被用来确认FAs的身份。采用棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等外标与内标联合测定各脂肪酸的总含量。数据分析使用Xcalibur软件(Thermo-Scientific, Waltham, USA)。

数据处理与统计

驯养后类胡萝卜素、生育酚和FAs含量变化(Δ%)以野生种中含量的百分比[(驯养-野生)/野生*100]计算。采用双向方差分析(ANOVA)评估属和驯化状态(驯化或野生)及其随机斜率对类胡萝卜素、生育酚、油脂、SFAs、MUFAs和PUFAs总含量的影响。属为随机效应因子，驯化状态为固定效应因子。单因素方差分析，Dunnett C检验为锅的分别测定了各粒级豆科植物与相应野生近缘种之间总类胡萝卜素、总生育酚含量、FAs、总籽油含量以及SFAs、MUFAs和PUFAs含量的差异。利用pearson相关分析了籽粒豆类中亲脂性种子抗氧化剂与FAs含量的变化与野生近缘种之间的关系。采用SPSS 19.0统计软件包进行统计分析。

亲脂性的抗氧化剂

总体而言，驯化植物种子类胡萝卜素总含量显著低于野生植物(双向方差分析;P< 0.001,图1A).在分析的十个属的驯化植物中，总类胡萝卜素含量较低2)，其与野生祖细胞的差异程度是属依赖性的(P < 0.001，图1A).两两比较显示，这种差异在分析的10个属中的6个是显著的(单向方差分析;表格2)和最伟大的甘氨酸(图1A).相比之下，总生育酚在野生和驯化植物之间并没有表现出一致的差异(图1B和表2)．生育酚含量显著(P< 0.05)在某些粒级豆科植物(花生，Lens和Lupinus)，而在其他情况下，它们在野生近缘动物中含量较低(甘氨酸、中投、野豌豆属)(图1B).因此，没有发现总生育酚和总类胡萝卜素的变化之间的依赖关系(图1C)。

谷物豆类中单独的类胡萝卜素和生育酚的组成也不同于它们的野生近亲(图2)．在所有物种中，叶黄素是主要的类胡萝卜素，其次是玉米黄质和β-胡萝卜素(图2A)，除了the豇豆属野生相对。在所有生育酚中，γ-生育酚是最丰富的亚型，除了豇豆属而且落花生monticola， δ -生育酚和α-生育酚分别为主要异构体。在所有种子批中均未检出生育三烯醇。作为总种子类胡萝卜素的比例，叶黄素在谷物豆类中高于其野生近缘种，除落花生。当存在时，环氧叶黄素、新黄质、紫黄质和蒽黄质在驯化豆科种子中占总类胡萝卜素的比例较低2A).作为总生育酚的比例，在驯化植物中α-生育酚较低，而γ-生育酚较高(图2A).谷物豆科植物叶黄素的绝对含量低于野生豆科植物，这是它们总类胡萝卜素含量较低的原因，而在单个生育酚方面，谷物豆科植物与野生豆科植物之间没有发现一致的差异(图2)2B,额外的文件2额外的文件3.)．

脂肪酸

正如发现的生育酚，种子总油含量在谷物豆类和它们的野生近缘种之间没有一致的差异(图3.一个额外的文件4)．总含油量在驯化后趋于较高(高达1.65倍)中投公司，甘氨酸、Lathyrus菜豆,而且Pisum,驯化程度略低Lupinus在其他四个属(附加文件4)．除亚麻酸外，绝大多数谷粒豆科植物FAs含量较高，除亚麻酸外，其他所有属植物FAs含量均较低中投公司而且Pisum(图3.B).野生和驯化植物的脂肪酸组成也没有显示出所分析物种之间的一致差异(图3.额外的文件4)，并且在驯化后的种子类胡萝卜素和生育酚含量与FAs的变化之间没有相关性(图4)．总生育酚与PUFAs的相关性不显著(Pearson相关系数为0.59;P = 0.07，图4C)。

农业的出现导致了人类社会从狩猎-采集者向早期农民的转变，但驯化如何影响可食用种子的营养性状还不完全清楚。通过将作物与其野生近亲进行比较，最近的研究为种子和整个植物水平上的生物特征和生理变化提供了新的见解[44]，[45］．我们使用这种方法研究了10种经济上最重要的豆科植物，它们的种子可食用，占豆科植物驯化物种的24.4%(豆科植物41种驯化物种中的10种[7])。这十个物种在几个独立的驯化中心被驯化[1]，现在全球有1.9亿公顷的土地在耕种(http://faostat.fao.org)．驯化意味着一个复杂的进化过程，尽管我们在这里没有讨论环境对种子属性的影响，但我们的数据表明，驯化导致了类胡萝卜素、生育酚和FAs的意外变化，这些变化将从种子质量和未来育种机会的角度进行讨论。

类胡萝卜素，种子休眠和扩散

虽然人们可能会直觉地认为，对人类健康有益的化合物在作物中比在其野生亲本中更集中，但在所有10个研究属的驯化后，总种子类胡萝卜素下降(图1、表2)．这一意外发现有两种可能的解释与作物管理要求有关。首先，种子作物经常选择自扩散机制缺陷的基因型[1]，[2]，[9]，即:在许多谷类豆科植物中，驯化涉及对缺乏荚果粉碎机制的基因型的选择，随后依赖人类进行传播[46］．其中，内动物行为和外动物行为是豆类用于种子传播的重要机制[47]，[48］．类胡萝卜素衍生物是挥发性气味和香气成分的前体，如香叶酮和β-紫罗兰酮，可以吸引动物[49]，[50]和类胡萝卜素也可能是潜在的种子捕食者和分散者成熟的信号[51］．按照这样的推理，类胡萝卜素含量较低的种子对种子传播者的吸引力较小。

其次，种子休眠阻止了种子群的同步和均匀萌发，这显然是作物不想要的特征。休眠是指在最佳的环境条件下无法发芽，从而使土壤种子库能够保持较长一段时间，之后只有在环境条件有利于建立新一代植物时才完成萌发[52］．种子休眠的丧失是豆类作物驯化过程中最常见的事件之一[2］．脱落酸(ABA)是种子休眠的正向调节因子，由类胡萝卜素前体合成[53］．在拟南芥中，植物烯合酶基因的过表达导致类胡萝卜素和ABA的积累，并导致萌发延迟[54］．因此，类胡萝卜素在驯化过程中的减少可能与种子休眠外育种通过下调ABA合成途径有关。综上所述，人类对种子传播和休眠的改变可能导致作物中类胡萝卜素含量降低。

此外，应考虑到驯化意味着植物从自然环境转移到农业生态系统，那里的资源通常是丰富的，植物生命更好地缓冲环境风险，如干旱，营养缺乏或病原体。从这个意义上说，种子上的类胡萝卜素减少可能是因为氧化应激减少，因为改善的、更可预测的水和营养供应可能放松了它们代谢途径上的选择压力。

亲脂抗氧化剂，脂肪酸和种子活力

在光合组织中，生育酚和类胡萝卜素的比例明显向较高的生育酚含量进化[55］．除了其他作用外，生育酚和类胡萝卜素都是亲脂抗氧化剂。因此，生育酚和类胡萝卜素相互补充，起协同作用。在某些情况下，已经证明，植物倾向于通过一种作物的过度生产来弥补另一种作物的缺乏。例如，在拟南芥中，玉米黄质的缺失可以通过较高水平的生育酚来弥补[56),反之亦然［57］．因此，我们有理由认为，农作物中发现的类胡萝卜素水平较低1A)被较高的生育酚水平所补偿。然而，我们没有发现任何证据表明生育酚在驯化过程中的变化与类胡萝卜素的变化相关(图1C)。

膜FAs的组成和饱和度决定了膜FAs的氧化敏感性。在种子中，类胡萝卜素和生育酚是主要的脂溶性抗氧化剂，保护膜和油体免受氧化。在难处理(即干燥敏感)种子中，高水平的C18:3和低水平的生育酚与氧化损伤和较低的贮藏性相关[22］．在正统的(即耐脱水的)种子中，比如这里研究的那些种子，人们认为双不饱和FAs可以通过改善膜特性、增加其弹性、促进折叠而不丧失完整性来促进干燥状态下的生存[58]，[59］．在分析的大多数驯化物种中，我们观察到总FAs、MUFAs和双不饱和FAs(亚油酸)的增加，而亚麻酸的减少(图2)3.B,额外的文件4)．总的来说，FAs成分的这些变化可能使膜不太容易氧化(由于亚麻酸的减少)，从而缓解了选择较高生育酚水平以弥补较低的类胡萝卜素含量的压力，因此，MUFAs和亚油酸的增加可能有助于膜流动性的维持。

亲脂抗氧化剂和脂肪酸作为营养

水果、蔬菜和种子是类胡萝卜素(包括维生素原A)和生育酚(维生素E)的主要膳食来源，它们在预防炎症过程以及冠状动脉、神经肌肉和视觉障碍方面发挥着关键作用。然而，食用最丰富的主要作物种子中的维生素A水平不足以满足最低的营养需求[60如果没有从水果和蔬菜中摄入类胡萝卜素来补偿的话。目前正努力通过基因工程提高种子作物类胡萝卜素的合成[61] - [63］．另外，与野生亲本杂交可以作为提高可食用种子类胡萝卜素含量的一种补充工具。

大多数动物和人类需要从膳食中摄取植物脂类作为热量和必需FAs的主要来源[64］．饮食中未饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的高比例有助于预防心血管疾病[37］．出乎意料的是，我们发现UFAs与sfa的比例在驯化后有所下降。然而，FA成分也会影响种子的口感。脂质过氧化的副产物，导致酸败，有令人不快的气味或味道[65]，[66］．因此，随着谷类豆类的驯化，PUFAs(最易被氧化的物质)的减少(图3.)可能是人类对储存后更好的味道的定向选择的结果。

总之，谷物豆类的驯化伴随着类胡萝卜素含量的减少，包括对人类营养至关重要的分子。此外，对许多被分析的物种来说，驯化也伴随着亚麻酸含量的下降。这些变化可能是对其他所需性状的选择的副作用，如种子传播机制和休眠的丧失，以及对种子贮藏性和口感的选择。反过来，野生祖先可能仍然提供未开发的潜力，未来改善可食用种子的营养价值。这项新工作可能为未来其他类群和植物器官的研究提供基础，以拓宽我们对作物植物的营养价值和适应性驯化后果的认识。

支持数据的可用性

支持数据包括种子供应商的详细信息(附加文件)1)，按属划分的类胡萝卜素和生育酚的组成(附加文件2)和它们在驯化后的变化百分比(附加文件4)，以及脂肪酸与种子干质量和总含油量的比值(附加文件3.)．所有支持数据都包含在附加文件中。

阿坝:

脱落酸

D:

驯养的

糖尿病:

干燥的质量

费尔南多-阿隆索:

脂肪酸

饥饿:

脂肪酸甲酯

MUFA:

单一不饱和脂肪酸

PUFA:

多不饱和脂肪酸

ROS:

活性氧

国家林业局:

饱和脂肪酸

乌法:

不饱和脂肪酸

W:

野生

这篇论文献给我们亲爱的同事和朋友路易斯·巴拉格博士，他是非常想念。凭借他杰出的科学和人类技能，他启发了这项工作，并在这篇论文的作者之间架起了桥梁。我们将永远感激他。

我们感谢所有提供种子的种子银行和商业公司(完整列表在补充附加文件1)．BFM获得了来自UPV/EHU研究副校长的两项博士后奖学金，以及来自欧洲FP7-PEOPLE的Marie Curie IEF (328370 MELISSA)资助。这项工作也得到了西班牙教育和科学部[BFU 2010-15021]，巴斯克政府[UPV/EHU-GV IT-299-07]，马德里地区政府(授权redinal -2)和min生态-西班牙(授权AGL2010-10935-E, CGL2011-28778, FPI对NMR的研究)的资助。

从属关系

1. 巴斯克地区大学(UPV/EHU)植物生物与生态系，西班牙毕尔巴鄂，阿普多644,48080

   Beatriz Fernández-Marín, José María Becerril & José Ignacio García-Plazaola

2. departmento de Biología y Geología， Área de Biodiversidad y Conservación, Escuela Superior de Ciencias Experimentales y Tecnología, Rey Juan Carlos大学，c/Tulipán s/n, Móstoles, 28933，西班牙

   Rubén Milla & Nieves Martín-Robles

3. 奥地利因斯布鲁克大学因斯布鲁克植物研究所和分子生物科学中心，Sternwartestraße 15，因斯布鲁克，A-6020，奥地利

   Beatriz Fernández-Marín, Erwann Arc & Ilse Kranner

相应的作者

对应到Beatriz Fernandez-Marin．

相互竞争的利益

作者声明他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

本研究由BFM、JIGP和RM设计。BFM、JIGP和JMB进行了高效液相色谱分析。NMR和RM准备了植物材料，并参与了手稿的起草。EA、IK进行气相色谱-质谱分析。BFM做了统计分析。所有作者都参与了结果的讨论，并批准了手稿的最终版本。

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