在拟南芥初生根生长过程中，胞囊的不同发育活动使细胞快速伸长并决定分生组织的大小

背景

胞吐作用是根生长不可或缺的一部分:将控制生长的系统成分(例如，生长素运输蛋白)运输到质膜，并分泌将细胞壁扩展到外质体的物质。真核生物胞吐的时空调控通常涉及胞吐，胞吐是一种八聚体复合物，它将选定的分泌囊泡系在质膜上的特定位置，并促进其胞吐。我们评估了四种囊泡成分(SEC5、SEC8、EXO70A1和EXO84B)突变的拟南芥系，以探索囊泡在初生根生长中的功能。

结果

突变体的根生长速度是野生型的82%到11%。即使在缺陷最严重的品系中，根尖的静止中心和组织层的组织也与野生型相似，尽管分生组织、过渡区和伸长区较短。突变体的细胞生成速率降低是由于分生组织缩短，而不是细胞周期延长。此外，突变体在伸长区表现出各向异性细胞扩张的减少，但在分生组织区却没有，导致成熟细胞更短，形状与野生型相似。正如预期的那样，对brefeldin A的超敏反应将突变根生长缺陷与改变的囊泡运输联系起来。一些实验方法(例如，剂量-反应测量，信号成分定位)未能确定异常的生长素或油菜素内酯信号作为外囊突变体根生长减少的主要驱动因素。

结论

外囊参与了两个空间上不同的发育过程，其机制显然与生长素或油菜素内酯信号通路没有直接联系，以帮助确定根分生组织的大小，并促进伸长区细胞的快速扩增。

根生长在各种具有挑战性的当地环境中，它们必须从中获得植物生存所必需的水、营养和锚。所有根组织和未来生长所依赖的干细胞和分生组织位于根尖的脆弱位置。在多层根帽的保护下，根分生组织不断地被生长推进到未知的、潜在的破坏性的植物土壤环境的前沿。这种根结构允许分生组织接近土壤条件，以便它可以最佳地调整根的生长和发育，以满足植物的需要，同时响应当地环境的特定需求。这种生长的可塑性是通过在一个定义明确和强有力控制的根尖结构中调节细胞发育来实现的。在拟南芥的根尖上，细胞有序地分裂成一排;在这些文件中，单个细胞逐渐改变其生长机制，首先支持细胞分裂，然后加速细胞伸长，最后细胞分化和成熟，形成功能多样的根组织。从根本上说，根细胞的生长需要控制其细胞壁的松弛，以促进特定细胞表面的扩张，通过加强来平衡，确保细胞壁的完整性在扩张过程中不会受到损害。为了应对这些复杂的需求，复杂的相互作用和补偿机制网络已经进化出来，以控制、协调和维持原根的生长[1]-[7]。

在支持根生长的复杂的细胞基础结构中有一个分泌系统，通过这个系统，蛋白质、脂质和碳水化合物被包装成膜结合的分泌囊泡，并被输送到生长的质膜和细胞壁上。8]。分泌包括胞吐作用:分泌囊泡与质膜融合，囊泡内容物排出至外质体。胞吐作用将生长相关的膜蛋白传递到质膜，包括受体(如油菜素类固醇受体BRI1 [9])，信号蛋白(如CRK5 [10])、转运蛋白(如PIN生长素转运促进因子[11])和构建细胞壁的蛋白质(例如纤维素合酶复合物的组分[12])。对根生长同样重要的是向外质体分泌激素(如油菜素内酯[13])，修饰细胞壁的蛋白质(如扩张蛋白[14])，以及构建额外细胞壁的材料(例如果胶和半纤维素[15])。因此，分泌系统和胞吐过程对根生长和调节根生长的控制系统都是必不可少的。

在真核生物中，许多发育过程中胞吐作用的时空调节已被发现与胞吐有关，胞吐是由八种蛋白质组成的复合物。囊泡复合体的8种蛋白，SEC3、SEC5、SEC6、SEC8、SEC10、SEC15、EXO70和EXO84，具有盘绕的线圈结构，最终形成的蛋白棒在分泌囊泡和质膜之间形成系绳，在膜融合之前，由SNARE蛋白介导[16]-[19]。胞囊在胞吐过程中作用的分子细节尚不完全清楚，但人们的注意力集中在胞囊系留功能的两个方面:它作为胞吐位点的标志的作用，以及它作为胞吐促进者的作用。具有里程碑意义的功能涉及到胞囊定位到质膜上的特殊皮质区域，在那里，关键的膜成分被富集并准备组装成胞囊分泌的机制[20.]。在植物中，对于这一标志性功能特别重要的外囊成分，以及外囊如何定位到特定位置，都是不确定的。然而，皮层结构域的形成和囊泡的栓系被认为是受到小gtp酶和磷酸肌苷的控制，就像它们在非植物物种中一样[20.]、[21]。外囊的促进功能增加了囊泡对接和融合事件的发生率，据推测，这可能与外囊在局部SNARE组装中的作用有关[20.]-[23]。支持这种推测的是，在拟南芥蛋白的酵母双杂交筛选中发现了外囊成分EXO70B2和SNARE蛋白SNAP33之间的相互作用[24];类似的相互作用在酿酒酵母［22]。外囊的两种功能，即作为地标或作为胞吐促进者，可能是可分离的，正如观察到的那样，在非植物物种中，小的gtpase似乎对外囊的这两种作用有不同的调节[21]。

胞囊在植物中起复合体的作用[19]、[25]-[27]，在那里它与生长过程密切相关。花粉管胞囊成分突变与花粉管尖端生长异常有关[j]。27]、[28]，根毛极化生长减少[29]，暗生长的幼苗下胚轴伸长减少[27]，侏儒症[29]、[30.]，改变的根管状元件发育[31]和细胞质分裂缺陷[30.]、[32]、[33]。最近，在拟南芥根分生组织、伸长区和成熟区的表皮细胞中发现了囊泡复合物，这表明囊泡复合物的亚基在质膜上动态地对接和解对接，可能为囊泡系结和胞吐创造位点。34]、[35]。此外，在外囊突变体中，根中BRI1油菜素类固醇受体和PIN生长素转运蛋白的运输动态发生了改变，PIN转运缺陷被认为是突变体根中极性生长素运输受损的基础[36]。胞囊和生长素的另一个潜在联系来自于质膜定位支架蛋白的表征，构成活性rop1相互作用因子(ICR1)，它是维持主根分生组织所必需的[37]。ICR1与小ROP gtpase和囊胞亚基SEC3相互作用，也影响PIN生长素转运体进出拟南芥根质膜的运输[37]、[38]。因此，很明显，囊泡可能在根生长中发挥重要作用，目前的数据指向生长素和/或油菜素内酯信号传导的功能[36]、[38]。

因此，我们试图研究囊泡在调节和产生主根生长的综合机制网络中的作用拟南芥，重点研究了假设的生长素和油菜素类固醇相关机制。我们评估了在不同囊泡成分中携带T-DNA插入突变的幼苗，这些突变会导致主根生长速率的降低，有时甚至是严重的降低。令人惊讶的是，先前证明了胞囊在细胞质分裂中的作用，以及PIN蛋白和BRI1受体的运输，[30.]、[33]、[36]，似乎不能充分解释突变根生长表型。然而，对各种生长参数的详细分析表明，囊泡突变体在根细胞产生速度(由较短的分生组织引起)和成熟细胞长度(由较慢的细胞伸长率引起)方面都表现出缺陷，这意味着囊泡在这两种不同的发育过程中，可能通过不同的机制。

囊胞成分的突变导致侏儒症和原发性根生长缺陷

为了探讨囊泡在初生根生长中的作用，拟南芥幼苗用本文分别对编码囊胞成分的基因的插入突变进行了评估，包括SEC8，SEC5a，EXO70A1,EXO84b．广泛的表型与exo70A1-2突变以前被描述过[29]。胞囊成分的许多突变不会导致可识别的单突变表型(例如:sec5a)，可能是因为编码大多数囊泡成分的基因有多个拷贝(例如，SEC5b)导致功能冗余。然而,一个sec5a突变与exo70A1-2突变导致下胚轴伸长的协同缺陷[27]，同一组合的根系生长缺陷比对照更为严重exo70A1-2单独突变体(图)1A，有三个EXO84拟南芥基因组中的相似物，但其中一个的突变体，exo84b，是严重矮化与戏剧性的短根[30.]。SEC8是一个单拷贝基因，T-DNA插入到该基因的5 '端(sec8-1和sec8-3)导致严重的花粉缺陷和完全的配子体不育，而在3 '端插入(例如:sec8-4和sec8-6)只产生轻微的表型[28]。为了在孢子体中表征零囊突变，一个包含野生型的结构体SEC8由花粉特异性基因驱动LAT52启动子变成了sec8-1和sec8-3杂合的幼苗。该构造挽救了花粉缺陷sec8突变体，允许产生突变的纯合子幼苗，这些被证明是极其矮小的(附加文件)1:图S1)。RT-PCR(数据未显示)表明LAT52启动子可以驱动孢子体中的低水平转录(Van Damme也证明了这一点，[39)，这样，这些sec8-1和sec8-3纯合子系可能并不代表SEC8基因完全为零。(为简洁起见，这些LAT52:: SEC8 SEC8线条今后将仅仅被称为sec8-1或sec8-3行)。的组合生成额外的行sec8-4或sec8-6在孢子体中不具有明显表型的突变exo70A1-2突变。这些组合也协同抑制下胚轴伸长[27]，并导致严重的侏儒症，其量级与侏儒症相同sec8-3线。值得注意的是，各种囊泡突变体和突变体组合通过不同的特征量来降低植物生长1:图S1)。

外囊成分突变的幼苗的矮化包括由于根系生长速度减慢而导致的根变短，而不是生长过早终止(图2)1A).在四种不同的胞囊成分中插入T-DNA的突变系表现出很大范围的初生根生长速率，从低至52微米/小时不等exo84b-1变异到391微米/小时exo70A1-1相比之下，478微米/小时哥伦比亚大学0(野生型)(图2A).这些突变体的初生根生长在发芽后5至8天内几乎以恒定的速率发生。我们的重点是这个发育时期，对应于分生组织早期扩张停止的时间，之后分生组织的大小几乎保持不变[7]、[40]。对所观察到的根生长缺陷的严重程度范围的一种解释是，不同的突变组合代表了等位基因的一系列种类，每个突变组合都以定量的方式减少胞囊复合体的功能，这随后表现为对根生长速度的定量影响。因此，评估这组突变体为囊泡功能丧失的微妙影响提供了潜在的敏感分析，即，当这些差异的大小与所有被评估突变体的根生长缺陷的严重程度一致时，突变体的微小差异可以被认为更可信。

外囊突变体的根生长缺陷与较短的生长带有关

对7天龄根的共聚焦显微图像进行了评估，以详细描述胞囊突变体的分生组织和细胞伸长根生长缺陷(图2)1和附加文件2)。具体地说，生长参数是通过测量沿皮层细胞档案的细胞长度来确定的，从静止中心附近的干细胞首字母到7天老根的分化/成熟区开始2)。这个区域横跨分生区(MZ)，细胞分裂，过渡区(TZ)，细胞不分裂，但继续以缓慢的速度延长，延长区(EZ)，细胞延长呈指数增长，直到达到成熟细胞长度，细胞进入分化区[5]、[41]。在囊泡突变体中，这三个不同生长区域(MZ、TZ和EZ)的长度明显缩短(图2)1B,2C,2F)。值得注意的是，在所检查的所有囊泡突变体中，根尖的整体细胞档案结构都保持不变，因此，先前在严重突变体中发现的细胞质分裂缺陷的后果exo84b突变体(30.]，在组织/器官水平上并不明显。此外，在突变体中，根尖的静止中心的特性和组织被稳定地维持了下来，这是由几条证据线所证实的。静止中心身份标记的野生型表达模式WOX5启动子驱动的GFP结构，[42])即使在最严重的突变中也没有受到干扰(图2)1G-J)。干细胞生态位的保存，以及分生组织的整体结构，与细胞的梯度有关过多转录因子,PLT1和PLT2［43]。在胞囊突变体中，yfp标记的PLT1和PLT2蛋白在其原生启动子的驱动下表现出核定位和与野生型幼苗相似的梯度表达模式(图2)1K和L，以及附加文件1(图S2)，但被压缩，这与突变体根分生组织的较小尺寸相一致。因此，尽管胞囊成分的突变导致生长区域变短，但胚发生过程中产生的突变体的整体根尖结构和组织模式与野生型相似。然而，MZ、TZ和EZ的大小明显对囊泡功能降低敏感。

植物根系的生长速度取决于分生组织中细胞产生的速度和根系内各向异性细胞扩张的程度。为了初步评估外囊突变是否会影响根分生组织的细胞分裂模式CycB1:格斯记者被介绍到sec8-3 exo70A1-1,和exo70A1-1 sec8-6突变体线。融合CycB1带有GUS和有丝分裂降解信号的启动子允许该报告基因只标记活跃分裂的细胞[44]。正如预期的那样，外囊突变根的GUS染色显示，与野生型兄弟姐妹相比，该区域的分生组织较短，分裂细胞较少(p < 0.001)。t-test, n > 22根，图3.)。然后通过分析从MZ到EZ的根皮质细胞的共聚焦图像来估计该细胞层的细胞生成速率和细胞周期长度([45]，参见方法)。对5个不同的外囊突变系(每个突变系7根)的根进行了详细的研究，代表了根生长速率缺陷的范围:野生型的11%exo84b-1为82%的野生型exo70A1-1．与pCYCB:格斯结果显示，囊泡突变体的细胞生成率降低与根生长速率降低相关(图2)2一个和2B).为了确定细胞生成速率的降低是否由于细胞分裂速率的减慢，从细胞生成速率和MZ中的细胞数量估计细胞周期的平均长度(附加文件)2;［46])。Brassinosteroid突变体,bri1和det2-1，已知能改变细胞周期进程和减慢细胞分裂速度[47]、[48]，作为对照，并验证了我们的方法能够检测到延长的细胞周期。令人惊讶的是，胞囊突变体的细胞周期长度没有延长(p > 0.05;t-test, n = 7)，并且在最严重的品系中明显比野生型短(即细胞分裂更快)。exo84b-1(图2因此，与囊泡功能丧失相关的细胞生成速率降低主要是由于较短MZ中分裂细胞数量减少(图2)2C)，而不是减慢细胞分裂。

胞囊有利于细胞在伸长区扩张

评估皮层细胞长度，以确定细胞伸长缺陷是否也导致了囊泡突变体的根生长缺陷。成熟皮质细胞长度(主要是EZ中细胞伸长的结果)确实在具有严重生长缺陷的突变体中减少(图2)2E, p < 0.001;t-test, n = 7)。胞囊突变体的细胞伸长减少可能是因为胞囊突变体的细胞在其较短的伸长区有较少的时间伸长，或者因为它们以较慢的速度伸长。为了评估这两种可能性，我们分析了每种突变基因型的14个细胞文件中皮质细胞长度谱的数据，以估计延伸率，以及在EZ中花费的时间(详细方法见附加文件)2)。与Col-0相比，具有严重根系生长缺陷的胞囊突变体的伸长率显著降低(p < 0.001, Potthoff分析)4H和附加文件2)。此外，除了温和exo70A1-1突变体(与野生型没有区别)，外囊突变体的皮质细胞在EZ中停留的时间实际上比野生型Col-0观察到的时间更长(图2)2G, p < 0.01;t-test, n = 7)。换句话说，囊泡突变体的成熟皮质细胞变短的原因并不是因为它们伸长的时间少。相反，囊泡功能的丧失与EZ中较慢的延伸率特别相关。

成熟的皮质细胞宽度也发现在囊泡突变体中显著减少(图2)2I, p < 0.015;t-test, n = 7)。宽度的减少与根生长缺陷的严重程度相关，并且毫不奇怪，与根的宽度有关(图2)2J细胞宽度测量在EZ)。细胞宽度数据，结合成熟皮质细胞长度数据，可以计算平均细胞体积，以及每个基因型的平均细胞长宽比(图2)2K和2L)。与野生型Col-0相比，囊泡突变体的成熟皮质细胞体积显著减少，而成熟皮质细胞的长宽比仅发生微小变化。因此，外囊突变体根生长速率的降低并不仅仅与成熟细胞长度的减少有关，而是反映了EZ中细胞扩张的减少，从而导致成熟的皮质细胞达到接近野生型的形状。值得注意的是，油菜素内酯(bri1, det2-1)和生长素突变体(pin2, aux1-7)也会改变细胞的扩增，但会产生皮层细胞长/宽比异常的细胞。

我们很想知道外囊突变体的伸长缺陷是否局限于伸长区，或者它是否代表了一种更普遍的缺陷(例如，改变细胞壁基本结构和整体可扩展性的缺陷)，这种缺陷也会影响分生组织中的细胞伸长。为了探讨这个问题，我们评估了分生组织中的皮质细胞长度，并估计了分生组织中的细胞伸长率(图2)4I和附加文件2)。与Col-0相比，胞囊突变体分生组织的平均细胞伸长率略快，而不是较慢(p < 0.05);t-test, n = 7)，除sec5a exo70A1-2，其中增加在统计上不显著。因此，在胞囊突变体中，根细胞伸长率的降低特别发生在EZ中。当测量MZ中沿细胞文件的细胞宽度并将其绘制为细胞从静止中心位置的函数时，得出了类似的结论。随着细胞沿着分生组织的长度向前发展，细胞宽度扩大，对col0和所有突变体进行了评估2)。胞囊突变体中细胞宽度扩张的过程与Col-0基本相同，尽管胞囊突变体中较短分生组织的细胞群中细胞较少。因此，胞囊的作用，使根细胞的扩张(长度和宽度)似乎主要体现在EZ。

综上所述，胞囊突变体根生长速率的降低在很大程度上可以解释为1)分生组织中分裂细胞数量的减少和2)EZ中细胞伸长率的降低。这表明，在根发育过程中，内囊对植物生长的贡献是不同的，其功能实现了两个明显不同的结果:确定生长区的大小，并使EZ中的细胞快速扩张。

外囊突变体的根生长对BFA处理非常敏感

为了探讨囊泡突变体根系生长缺陷反映分泌系统改变的假设，我们评估了囊泡突变体根系生长速率对真菌毒素brefeldin A (BFA)的敏感性。BFA抑制高尔基分泌和内吞循环，作用于鸟嘌呤核苷酸交换因子(如gnm)，改变膜系统的结构和功能[49]、[50]。经bfa处理的植物细胞分泌的改变与多糖和细胞壁松动因子向细胞壁的传递改变有关[51]-[54]，改变了根分生组织中细胞壁果胶的再循环[55]，根系生长速率降低[56]。虽然BFA是多效性的(例如，它影响PIN蛋白的再循环[56]、[57]以及细胞壁多糖的分泌，并伴随着肌动蛋白细胞骨架的重塑而改变根细胞蛋白质组[58])，根生长对BFA的超敏反应已被用作囊泡运输和分泌缺陷的指标[59]。胞囊亚基自身在质膜上的定位具有bfa抗性[34]、[36]，但囊泡突变体的根生长对BFA过敏(图2)5)，与Col-0相比，胞囊突变体的标准化生长率显著降低(p < 0.001);t-test, n = 18-24)，暴露于3.2 μM BFA。这一结果与预测的复合物在囊泡运输到PM中的功能一致，但鉴于BFA的多效性作用，不排除其他功能。

在含有10 μM BFA的板上生长的col0幼苗的根进行了评估，以确定它们是否表型上复制了与囊泡突变相关的根生长缺陷。选择该浓度与最严重的囊泡突变体进行比较，因为其对生长速度的影响与未处理的相似sec8-3和exo84b-1行。皮质细胞长度的测量表明，与囊泡突变体一样，bfa处理的Col-0幼苗生长速度的降低是由于成熟细胞长度的减少，并且与可比较的囊泡突变体相比，细胞生成速度的降低(以及相关的MZ缩短)的程度较小(图2)2B, C, E, p < 0.001;t-test, n = 7)。与囊泡突变体一样，bfa处理的Col-0根的较短EZ中，成熟皮质细胞长度的减少与较慢的伸长速率有关(图2)2F, H, p < 0.001;t-test, n = 7)。值得注意的是，这种皮质细胞伸长的指数速率常数与具有严重根生长缺陷的囊泡突变体几乎相同(p > 0.05;Potthoff分析;额外的文件2)。最终，bfa处理的Col-0根的成熟皮质细胞长度比严重外囊突变体短，因为bfa处理的Col-0根的细胞在EZ中的时间更短(图2)2G)。然而，经bfa处理的成熟皮质细胞的长宽比与囊泡突变体的长宽比截然不同(图2)2L)，可能反映了BFA作用的多效性。BFA结果与囊泡在根生长中的功能涉及分泌运输的假设是一致的，但指出了一些区别:囊泡在确定生长带大小方面似乎更重要。

生长素运输的改变并不能完全解释囊泡突变体的根生长缺陷

生长素转运极化和生长素梯度在静止中心(QC)的峰值浓度是分生组织结构和功能以及根生长速度的关键决定因素[j]。42]、[60]、[61]。分生组织的大小部分取决于生长素和细胞分裂素信号之间的拮抗相互作用，导致在根尖的特定位置从细胞分裂到细胞伸长的转变[40]、[62]-[66]。外囊成分EXO70A1的突变导致根尖(即根向)生长素运输缺陷和根表皮细胞中PIN生长素运输蛋白向质膜的循环改变[36]。因此，我们假设在囊泡突变体中观察到分生组织长度的减少，因为生长素运输的改变改变了生长素-细胞分裂素的平衡，有利于从细胞分裂到接近根尖的伸长。为了验证这一假设，我们在外囊突变体和野生型幼苗中尝试改变生长素-细胞分裂素平衡后，测量了它们的初生根生长，方法是将它们生长在含有一系列浓度的天然生长素:吲哚乙酸(IAA)、合成生长素:1-萘乙酸(NAA)、细胞分裂素:n- 6-苄基ladenine或生长素运输抑制剂:萘酞酸(NPA)的培养基上。此外，我们还测量了胞囊突变体对1-氨基环丙烷羧酸(ACC)(乙烯前体)的根生长反应。乙烯促进生长素生物合成和/或生长素运输影响表皮细胞伸长和根生长[j]66]-[69]，生长素相关突变体对ACC的根生长反应发生改变[70]、[71]。我们推断，如果外囊突变体的根生长速率降低主要是生长素运输缺陷的结果，那么外囊突变体应该表现出对这些激素操作的敏感性改变。

与预期相反，外囊突变体对外源性生长素、细胞分裂素或ACC的根生长剂量反应被证明与野生型Col-0没有显著差异(图2)6A、附加文件1:图S4)。的pin2-1突变体作为对照，与预期一致，其对IAA和NAA的敏感性不同于野生型。外囊和生长素突变体对NPA的反应对比更加明显(图2)6B).严重囊泡突变体(即:sec8-3, sec8-4和exo84b-1)对NPA浓度大于1微摩尔时的敏感性高于野生型(p < 0.01;t-test, n = 20-28)。然而，与之相反的反应是由aux1-7和pin2-1同一浓度范围内对NPA敏感性较低的对照组(p < 0.01);t-test, n = 23-24)。因此，外囊突变体根系对外源激素操纵和生长素运输抑制的反应与外囊依赖PIN运输是外囊突变体根系生长速率降低的主要驱动因素的假设不一致。

我们还研究了几种生长素转运体在囊泡突变体中的分布和极性定位。不同的生长素转运蛋白(PINs、AUX1和ABC转运蛋白)通过功能不同的分泌途径传递到质膜，从而实现其个体和极化定位[j]。10]、[72]-[76]，其中一个子集可能涉及外囊。因此，我们检测了含有标记的生长素运输蛋白PIN1-GFP、PIN2-GFP、PIN7-GFP、AUX1-YFP和ABCG36-GFP的囊外突变系，看看是否存在明显的错定位。在两个具有严重根系生长缺陷的胞囊突变系(sec8-3,sec8-4 exo70A1)似乎与野生型相似，就像之前报道的不那么严重的那样exo70A1突变体(36)(图7、附加文件1:图S5和附加文件1:图S6)。值得注意的是，这些生长素转运体在囊泡突变体中的表达范围比野生型小，但与野生型分布模式缩短的解释一致，这与它们较短的分生组织有关。

生长素运输的下游、生长素梯度的发展和生长素介导的信号传导是生长素诱导的转录调节，即生长素反应。为了进一步探讨外囊突变体由于生长素运输缺陷而导致根生长缓慢的可能性，我们检测了pDR5:绿色荧光蛋白和pDR5:格斯记者对生长素的反应。在QC区域中，生长素反应的一个微妙减少的区域达到峰值，并由pDR5:格斯先前在exo70A1突变体(36]。在4个根生长缺陷最严重的胞囊突变系中(Exo84b-1, sec8-1, sec8-3，和sec8-4 exo70A1的分布/模式将发生更深刻的变化DR5如果外囊突变体的根生长较慢是由于干细胞生态位或MZ中生长素反应的缺陷。然而,当pDR5:绿色荧光蛋白或pDR5:格斯在这些囊泡突变体的根中观察到表达，在根中与野生型相同的区域观察到报告基因，在静止中心区域表达高峰(图2)7G-J附加文件1(图S7)，尽管根尖的长度较短，这与较小的分生组织有关。绝对表达量的降低与根系生长缺陷的严重程度无明显相关性。当幼苗生长在黑暗中(减少生长素的产生和叶尖上的生长素运输)时，对生长素的反应进行了评估[77]、[78])，显著降低pDR5:格斯在根尖上的表达(与光生苗相比)和表达模式相似sec8-1突变体及其野生型同胞(附加文件1:图S7)。因此，在光照和黑暗生长的幼苗中，根系生长缺陷与生长素反应的改变无关。

干细胞生态位的维持和功能依赖于生长素，对根的生长至关重要。在生态位内，靠近静止中心的近端干细胞为MZ提供细胞，而远端干细胞产生分化为根冠小柱细胞的细胞，通过含有淀粉的淀粉质体的积累可识别。改变生长素水平或生长素运输从而影响根干细胞生态位的突变会导致淀粉定位异常，即淀粉存在于远端干细胞或静止中心，或者相反，静止中心和小柱细胞之间的未分化(即无淀粉)细胞层数量增加[42]、[78]。Lugol染色显示淀粉定位于exo70A1，sec8-3,exo84b-1与Col-0基因型相似的突变体(每个基因型的突变体数量为10 ~ 20个);额外的文件1:图S8)。这与NPA处理的根尖淀粉更分散的存在形成对比1:图S8B、C;［42]、[79])，其中淀粉染色区域延伸到远端干细胞和侧根帽。外泡突变体也没有显示出静止中心和分化小柱之间未分化的细胞层数量增加(附加文件)1:图S8G)，与PIN和生长素生物合成突变体所观察到的情况不同[42]。这些结果也区分了胞囊突变体和胞囊突变体icr1突变体，其中生长素运输的改变与萌发后6天小柱中淀粉的消失有关[38]。与Col-0相比，7天龄的胞囊突变体确实具有更少的分化淀粉染色小柱细胞层数(与根分生组织中更短的发育区域的总体观察一致);额外的文件1(图8- 1)，但不像icr1淀粉染色模式在突变体生长两周后仍然存在(数据未显示)。因此，生长素介导的根干细胞生态位稳定性和功能的改变在囊泡突变体中并不明显。这一结果与WOX5和glut转录因子的根尖表达模式一致(图2)1G-L)，被认为是调控生长素信号的下游以控制干细胞活性[42]。总之，在评估了与生长素相关的几个独立特征后，我们发现没有证据支持这样的假设，即外囊突变体的分生组织缩短与生长素运输缺陷或未能建立相对的生长素最大值有关。

胞囊突变体的根生长缺陷对油菜素内酯信号的改变很敏感

外囊突变体根生长速率降低的生长素相关基础的另一种选择是油菜素内酯信号传导缺陷，这与根细胞伸长密切相关。与囊泡突变体类似，br缺陷突变体和br信号突变体都表现出下胚轴伸长减少和根尖钩形成减少(与细胞伸长减少相关的表型)[27]、[80])，以及根部分生组织大小和成熟细胞长度的改变[47]、[48]、[81]。此外，在根表皮细胞中，胞囊向质膜的定位和油菜素内酯信号传导都很突出[34]、[49]，并且在胞囊突变体中，质膜上的油菜素类固醇受体BRI1的再循环受到干扰[36]。

外源激素对囊泡突变体根生长缺陷的修复支持了囊泡在油菜素内酯信号传导中的假设作用。事实上，具有最严重的根生长缺陷的囊胞突变体，sec8-3和exo84b-1，在低浓度(1或3.16 nM)的培养基上生长时，表现出轻度的恢复，而野生型col0在相同的浓度范围内表现出生长速度下降，而油菜素内酯受体突变体，bri1，无反应(不敏感)(图2)8A).然而，救援的绝对规模很小(附加文件1:图S9)，部分获救的生长速度仍低于野生型，远低于在野生型中观察到的获救det2-1油菜素内酯合成突变体。相对而言，外源油菜素内酯显著刺激(p < 0.05);t-测试，n = 20-44)的生长速度比未治疗的对照组分别增加了27%和39%sec8-3和exo84b-1,分别为该假设提供了至少一些支持。

我们接下来过表达BSK3激酶sec8-3和exo84b-1以确定观察到的救援是否与典型的BRI1信号通路有关。BSK3被BRI1受体磷酸化，激活下游BR诱导的转录，其过表达可挽救BR的生物合成(det2)和BR受体(bri1-5)变种人[82]。在这两个sec8-3和exo84b-1突变体，过度表达BSK3结果非常轻微(分别为14%和9%)，但显著(p < 0.01)。t-test, n = 41-147)增加根系生长率(附加文件1:图S10)。相比之下，野生型兄弟姐妹的生长速率在添加或不添加胁迫的情况下没有显著差异BSK3结构比较。因此，与外源性外源性油菜素内酯处理的结果一致，BSK3过表达对囊泡突变表型有轻微的挽救作用。

我们还测试了油菜素内酯信号和囊泡之间的遗传相互作用。当双突变体具有比中性函数预测的更极端的表型时，可以确定定量协同遗传相互作用，中性函数预测两个突变不相互作用时的表型[83]。基于乘法或加性模型的中性函数已被用于研究遗传相互作用[84]、[85]，乘法模型被认为更适合预测函数关系[83]。具有囊胞突变(exo70A1-1或sec8-4，每一种都与轻微的根生长缺陷有关)和油菜素内酯相关突变(det2-1，影响BR合成，或bri1,影响BR信号)，以确定这两个突变是否对减少根生长有协同作用。在四种组合中，双突变体比单突变体表现出更严重的根生长缺陷(图2)8B, p < 0.01;t-test, n = 20-75)。双突变体的生长速率与加性模型预测的结果没有显著差异(p > 0.10, z检验，对于所有四种双突变体组合)，也没有显著差异sec8-4 det2和sec8-4 bri1突变体与乘法模型预测结果有统计学差异(p < 0.05, z检验)。然而，根系生长缺陷明显比乘法模型预测的更为严重exo70A1 det2和exo70A1 bri1突变体(p < 0.001, z检验)。因此，任何协同作用都不是非常稳健，因为它只能在乘法模型下识别，并且只能与exo70A1突变，表明胞囊介导的事件和油菜素内酯信号传导之间影响根生长的任何功能相互作用是有限的，可能是间接的。

油菜素内酯的生物合成受到反馈控制，因此通过BRI1、BSK3和下游转录因子的信号传导减少导致BR生物合成基因的合成增加[86]、[87]。如果囊泡突变导致油菜素内酯对受体的可用性、感知或通过该途径的下游信号的缺陷，那么可以预测囊泡突变应该表现出BR生物合成基因的表达升高。为了验证这一预测，我们对突变根的cDNA进行了qRT-PCR，以评估两个油菜素内酯生物合成基因DWF4和CPD的表达。在囊泡突变体中，这些基因的表达非但没有升高，反而略有下降(图2)8C)，表明BR信号并非在根中整体减少，尽管这并不排除在根的某些区域或细胞类型中信号减少的可能性。

为了更好地评估外囊突变体的根生长缺陷是否与油菜素内酯信号缺陷相关，我们对共聚焦显微镜获得的皮质细胞序列上的细胞长度进行了评估det2-1和bri1-2突变体，并与囊泡突变体进行比较(图2)1B,图2)。这表明，在细胞水平上，油菜素内酯突变体的根生长缺陷与囊泡突变体不同。油菜素类固醇突变体的根分生组织较短主要是由于细胞长度缩短，而外囊突变体的分生组织较短主要是由于细胞较少。油菜素内酯突变根的细胞产量下降与细胞周期延长有关(与先前的报道一致:[47]、[48])，这在囊泡突变体中是看不到的。油菜素类固醇突变体的成熟皮质细胞的长宽比明显大于Col-0或任何囊泡突变体(图2)2lt检验，p < 0.001, n = 7)。另一方面，与野生型相比，囊泡和油菜素类固醇突变体均表现出成熟皮质细胞长度的减少(图2)2E, p < 0.001;t-test, n = 7)，这种减少部分是由于两种情况下的延伸速度较慢(附加文件)2)。

为了确定外源BR对根生长速度的部分恢复是否可能仅仅是对EZ中囊泡依赖性细胞扩增的影响，研究了1 nM表油菜素内酯处理和不处理的根。测定了根的生长率，测定了成熟皮层细胞的长度。的增长率exo84b-1，sec8-4 exo70A1,sec8-3外源性油菜素内酯处理组的成熟皮质细胞长度比未处理组高35-49%(每个基因型/处理组n = 12-18根)，但外源性油菜素内酯处理的外囊突变体的成熟皮质细胞长度仅比未处理的对照组长12-19%。因此，对成熟细胞长度的影响仅占观察到的挽救量的三分之一左右，这表明添加的外延油菜素内酯不仅可以增加细胞的伸长，还可以提高细胞的生成速度。

连接胞囊与BR信号的另一种靶标是短根(brx)一种与质膜相关的蛋白质，受内吞循环的影响[88]、[89]，经生长素处理后，易位到细胞核[86在那里它可能介导生长素和油菜素内酯信号通路之间的交叉对话[90]。突变体brx幼苗的根生长较慢，分生组织较短，成熟细胞长度较短[91]。因此，我们测试了囊泡是否可能参与BRX到质膜的循环，从而影响根的生长，通过尝试使用已经被证明可以挽救的方法来挽救囊泡突变体的根生长缺陷brx突变体:BRX过表达;引入隐性空长下胚轴5 (hy5)突变[88];然后在pH值更碱性的培养基上培养突变体[92]。在每种情况下，囊泡突变体的表型都没有得到修复，这表明囊泡突变体的根生长缺陷与BRX活性降低无关(附加文件)1:图S11)。

囊泡在初生根生长中的作用发生在两种发育环境中

根冠后的根细胞的发育过程可以沿着从静止中心开始的细胞文件依次观察:分生组织内部分裂，过渡区缓慢恒定伸长，伸长区指数伸长，然后停止扩张和细胞成熟。通过对外囊突变体根系的研究发现，外囊在根系发育的两个不同阶段具有两种不同的作用。首先，胞囊通过帮助确定根分生组织的大小，从而确定正在分裂的细胞的数量，从而参与决定根细胞的产生速度。这与细胞分裂率的影响不同，细胞分裂率在胞囊突变体中没有降低(即细胞周期长度在突变体中没有延长)。其次，囊泡参与确定成熟细胞的长度，主要是通过使细胞在延伸区(EZ)呈指数速率伸长。

有证据表明，在这两种发育事件中涉及外囊的具体过程(即分生组织大小的决定和EZ中的细胞扩增)是不相同的。值得注意的是，囊泡突变对这两个过程的影响是不同的。分生组织大小的减少与根生长速率的降低平行于整个范围内的囊泡突变体的评估。相反，只有根生长缺陷较轻的胞囊突变体的细胞伸长率与生长率平行降低;而根生长缺陷最严重的3个胞囊突变系(sec8-3，sec8-4 exo70a1,exo84b)具有相同的显著降低的细胞伸长率。换句话说，在评估的突变体范围内，这两种发育缺陷的严重程度不匹配(图2)9)，分生组织大小的减少似乎是一个持续的分级反应，细胞伸长受到囊泡活性的明显阈值的影响。

我们考虑了胞囊可能通过同一过程影响两种发育事件的两种方式。首先，胞囊在帮助确定生长带大小方面的作用可能导致胞囊突变体不仅由于分生组织缩短而细胞产量降低，而且由于延长带缩短而使成熟细胞长度减少(使根细胞延长的时间减少)。然而，我们的数据并不支持这样的解释:突变体的皮质细胞在伸长区停留的时间更长，但伸长的速度更慢。其次，囊泡作为细胞扩张的一般促进者，既可以影响细胞的伸长区，也可以影响分生组织。可以想象，这种作用可以通过减慢细胞分裂或根据细胞大小进入有丝分裂来减慢分生组织中的细胞周期和细胞生产速率。然而，事实并非如此:在胞囊突变体的分生组织中，细胞伸长率和细胞周期都没有减慢。这反驳了胞囊在细胞扩增中的一般作用，而是与一种解释一致，即胞囊是与EZ特异性相关的显著细胞扩增率所必需的。总之，这些结果支持这样的假设，即胞囊的功能不同，影响根生长区的大小，并通过不同的过程，影响伸长区的细胞伸长率。考虑到囊泡可能在促进囊泡运输到质膜方面的作用，这种差异效应的一个可能解释是基于发育阶段特异性货物的存在，这些货物依赖囊泡进行运输和随后的活动。在这种情况下，囊泡的多功能性是由于生物体使用它来正确运输不同的发育适宜的囊泡货物。

胞囊通过一种与生长素没有直接联系的机制影响根生长带的大小

植物激素通过控制和协调特定过程，在调节根分生组织和其他根生长带的大小方面发挥主导作用和相互作用(参见[3.]-[5]、[7])。例如，生长素作用于干细胞生态位[42]，促进分生组织的细胞分裂，并在向地性反应中以根过渡/伸长区伸长的表皮细胞为目标[68];细胞分裂素在石碑的过渡区起作用[62];表皮的油菜素内酯感知介导其对分生组织大小的影响[48]。在影响根生长的许多激素介导的控制途径中，生长素和油菜素类固醇信号被认为是最有可能参与外囊的候选者。胞囊亚基(EXO70、SEC6、SEC8、EXO84)的质膜定位在根表皮中较为突出[34]，与生长素和油菜素类固醇信号传导的重要位点一致。此外，在根中，囊泡与叶尖生长素运输，以及PIN1和PIN2生长素外排载体和BRI1油菜素类固醇受体到质膜的再循环有关[36]。因此，我们假设外囊突变体的根生长缺陷可能主要是pin介导的生长素运输和信号传导缺陷的结果，或者可能是油菜素内酯信号传导改变的结果。

我们评估了外囊突变根的生长素信号改变的指标，包括:(1)对外源性生长素、生长素运输抑制剂、细胞分裂素或ACC的敏感性改变;(2)生长素转运体的定位改变，用于静止中心身份的pWOX5::GFP标记，生长素调节的PLT转录因子，或dr5驱动的生长素反应标记hy5突变，这与生长素应答转录升高有关，(4)淀粉在小柱首字母中的异常存在。外源激素处理的囊泡突变体具有与野生型相似的剂量-反应曲线。生长素反应性标记的定位PIN、AUX1和ABCG36转运蛋白;静止中心同一性;PLT表达发生在较短的根区，与较短的根生长期一致，但在其他方面，外囊突变体的定位模式与野生型没有显著差异。的hy5突变未能发挥任何可检测的囊泡突变表型的挽救作用。在囊泡突变体中没有观察到小柱首字母淀粉染色增加，这表明干细胞生态位附近生长素信号的改变。虽然我们没有进行实验来解决囊泡和ABCB生长素转运体之间的可能联系，但ABCB转运体的突变导致的表型与我们对囊泡突变体的观察结果不一致(例如，更长的根毛[91]、[93]，增强的倾斜[94]、[95]，散发性根曲率[94]，侧根数量和生长明显减少[94]、[96]、[97])。必须承认，在囊泡突变体上进行的一系列实验中，没有解决由TIR复合物直接评估生长素信号的问题。然而，在囊泡突变体中观察到的严重的根生长缺陷不能令人信服地与生长素运输或信号传导改变的几个间接指标中的任何一个相关联。

dr dodo，等。[36研究表明，从brefeltin - a区室到质膜的PIN1和PIN2蛋白的再循环在两者中都是延迟的exo70A1和sec8-1突变体。我们的研究结果并不一定与这些数据相矛盾，但确实表明，胞囊活动在PIN贩运中的作用并不是影响根生长速度的主要驱动因素。在囊泡突变体中缺乏与生长素信号改变的明确联系也与Rop GTPase和sec3相互作用的支架蛋白ICR1的突变表型形成对比[37]，这极大地扰乱了根的分生组织模式(例如，无组织WOX5和DR5:格斯表达)和生长素运输(例如，PIN1和PIN2亚细胞分布的改变)[38]。因此，我们的观察也反对外囊作为ICR1和生长素之间的主要联系。然而，生长素调节了广泛的发育和生理过程，生长素的运输和信号传导也相应复杂[98]、[99]。因此，我们不能排除外囊突变体中生长素运输或信号传导的改变是其根生长缺陷的一个因素;但我们得出的结论是，胞囊不太可能通过目前所了解的生长素运输和信号传导过程与根生长直接相关。

油菜素内酯信号的增强可以部分补偿，但不能完全挽救外囊突变体的根生长缺陷

我们还研究了外囊参与油菜素内酯运输到质膜的可能性，在质膜上它们与bri1型受体结合[13]或这些受体在质膜上的位置，以影响油菜素内酯的信号传导[81]。与这种可能性相一致的是，外源外源性油菜素内酯确实对具有严重根系生长缺陷的囊泡突变体的突变表型产生了微小但具有统计学意义的拯救，并且改变了剂量-反应曲线。过度表达BR信号激酶BSK3，激活BRI1受体下游的BR信号传导，也导致外囊突变体的根生长略有增加，这在其野生型兄弟姐妹中未见。对双外囊-油菜素类固醇突变体的遗传相互作用的评估提供了一个有点模糊的结果:双突变体，exo70A1 det2-1和exo70A1 bri1这些突变体的生长缺陷比用乘法模型而不是加性模型预测的单个突变体的生长速度要严重得多。这些数据支持囊胞和油菜素内酯信号之间的功能相互作用，但这种相互作用是间接的可能性是一致的。

有三条证据表明，囊泡并不直接与油菜素内酯信号相互作用来影响根的生长。首先，qRT-PCR分析表明，油菜素内酯合成基因在囊胞突变体根部的表达没有升高。这与油菜素内酯信号缺陷的预期相反，因为当BR信号减弱时，反馈控制指示BR合成基因的表达增加(86)。其次，尽管经BFA处理的外囊突变体的BRI1循环动力学与野生型相比发生了改变[36]，在根生长缺陷最严重的胞囊突变体中，BRI1-GFP在质膜上的最终定位没有明显改变(附加文件)1:图S9)。第三，皮层细胞长度谱的详细比较揭示了外囊和油菜素类固醇突变体之间的重要差异。外囊突变体的分生组织缩短是由于细胞减少(不是细胞周期改变)，而油菜素内酯突变体的分生组织缩短(det2-1和bri1-2)主要是由于细胞长度缩短(也与细胞周期延长有关)。囊泡突变体和油菜素内酯突变体均表现出成熟皮质细胞长度的减少和伸长区细胞伸长速度的减慢，但囊泡突变体细胞伸长速度的减少更为显著，并且最终细胞的长宽比也不同。外囊在运输上游调节蛋白BRX中的特定作用，在几个已知的拯救BRX的实验操作中被低估了brx突变体未能挽救胞囊突变体的根生长表型。总之，这些观察结果表明，囊泡根生长表型主要不是由油菜素内酯信号传导缺陷驱动的。

应用低浓度外型油菜素内酯部分修复生长速度缺陷值得进一步研究。最近的证据表明，除了通过激酶级联的典型细胞内BR信号传导外[9]、[81]，从根表皮到钢也有一个非细胞自主br诱导的信号[48]， br诱导的快速反应涉及质膜p - atp酶的激活[One hundred.]， BR诱导环状gmp介导的Ca^{2 +}信号级联[101]。胞囊在这些途径中的直接作用可以解释外源性油菜素内酯治疗比通过BSK3过表达特异性诱导激酶级联提供更强的拯救作用。或者，外囊表型的恢复可以通过BR诱导的过程间接完成，该过程可以部分补偿外囊功能的丧失。举个例子，in酿酒酵母SRO7(一种与t-SNAREs相互作用的Lgl家族蛋白)的过表达可以抑制多种囊泡突变体的生长缺陷[102]。如果囊泡活性降低，BR在拟南芥中诱导的类似基因功能将产生更大的影响，这解释了epi-BR和BSK3的部分挽救。

胞囊在根生长中的潜在替代作用

总的来说，尽管外囊在根表皮细胞的PIN和BRI1运输中发挥了作用(36)，但外囊突变体的根生长缺陷似乎不能简单地用已知的生长素/细胞分裂素和油菜素内酯的抑制机制来解释，这些机制有助于确定根分生组织和伸长区的发育活动。40]、[48]。然而，在囊泡突变体中观察到的根系生长特征的星座，明显独立于这些植物激素途径，并不是前所未有的。胞囊突变表型在过表达乐观转录因子的幼苗中被模仿[103]。过表达乐观会下调根伸长区III类过氧化物酶的表达，导致活性氧(ROS)平衡改变，从而导致根过渡区(即增殖和分化之间)的转移，从而降低根的生长。据推测，乐观可以直接作用(通过分泌到外质体的过氧化物酶的表达)和间接作用(通过ROS信号传导)来修饰细胞壁。胞囊参与ros介导的影响根生长的机制的可能性值得探索，例如，在根伸长区分泌过氧化物酶的作用。

外囊突变根表型(包括生长区大小减少和细胞伸长率降低，没有细胞周期持续时间延长，干细胞生态位改变，或生长素运输的显著缺陷)也与在含高浓度铵的培养基中胁迫生长的幼苗惊人地相似[104]。胞囊与铵代谢之间没有明显的联系，但胞囊与植物对非生物胁迫的反应之间可能存在联系。根细胞伸长的抑制是对各种环境胁迫的响应[104]-[106]，而生长带大小的设定被认为是根系生长适应环境条件的关键调控行为[107]。因此，受胞囊功能抑制影响的根生长的主要特征与受环境胁迫调节的根生长特征是一致的。胞囊可能参与根对非生物环境胁迫的生长反应，这是一个有趣的可能性。

环境压力诱发一系列不同的信号通路，包括激素调节系统[2]、[108]、[109]，细胞类型发育特异性转录模块[1]、[103]和ROS [110]、[111]。然而，根系生长响应的相似性表明，这些途径可能最终会聚为一套共同的下游机制，改变生长。下游机制的核心，特别是在根的过渡区和伸长区，是传递物质形成细胞壁基质的分泌过程(如分泌果胶和半纤维素)，和/或修饰基质以促进细胞壁松动和膨胀的蛋白质(如膨胀蛋白、木葡聚糖内转糖酵解酶/水解酶、内切-(1,4)-β- d -葡聚糖酶和过氧化物酶)。14]、[112]-[117]。调节胞囊活性以影响这些下游分泌事件和细胞壁扩张可能是最终实现发育协调和环境响应的生长机制的组成部分。在这里建立的生长根中囊泡功能的框架将有助于更好地定义未来的工作，以解决这一问题和上述可能性。

一个复杂的网络相互作用，重叠，反馈控制，通常是激素介导的机制已经进化到控制和维持初生根的生长[3.]-[5]、[118]。在这个复杂系统的中间，可能在多个位置，存在囊泡，这是一种假定的分子系索，促进两种植物的分泌囊递送融合到质膜上[19]、[34]、[35]及非植物物种[16]-[18]、[23]。外囊的一个组成部分发生突变，会导致根的生长率急剧下降，在某些情况下，其生长率仅为野生型根的11%。同时，该系统的弹性在胞囊突变体中得到了体现:它们保持了野生型根的整体分生组织、生长带和组织层结构，尽管这些区域的细胞数量在突变体中有所减少。对皮质细胞档案的评估显示，外囊突变体的生长速度较慢，是因为它们的分生组织细胞产生速度较低，并且它们的成熟细胞比野生型根短。这一分析提供了证据，表明囊泡在两种不同的发育环境下影响根的生长，似乎独立于生长素和油菜素内酯，影响生长带的大小和细胞伸长的速度。

植物材料和生长条件

哥伦比亚-0生态型系拟南芥T-DNA插入和其他突变体从SALK研究所获得[119]：exo70A1-2(At5g03540) SALK 135462;sec5a-1(At1g76850) SALK 010127;sec8-1(At3g10380) SALK 057409;sec8-3(At3g10380) SALK 026204;sec8-4(At3g10380) SALK 118129;sec8-6(At3g10380) SALK 091118;bri1(At4g39400) SALK 003371;det2-1(At2g38050) CS6159;pgm-1(At5g51820) CS210;arg-1(At3g68370) SALK 024542C。exo84b-1系是GABI-Kat系[120]，由Zarsky实验室提供(30)。通过测序验证了外囊相关SALK系的T-DNA插入位点。外囊突变等位基因的PCR分型如前所述[27]、[28]。纯合子胞囊突变体具有严重的根生长缺陷(即:Sec8-1, sec8-3, exo84b-1)实际上是不育的，并且在自交杂合植物的后代中获得。纯合子可以很容易地通过根生长和根毛表型进行鉴定，并通过PCR抽检得到一致的验证。突变体行aux1-7和pin2-1都是伊万琴科先生提供的。标记系pPLT1:gPLT1-YFP、pPLT2:PLT2-YFP和ppwox5:GFP由Y. Du和B. Scheres提供;pPIN7:PIN7-GFP由Purdue University的Wendy Peer提供;PIN1-GFP、PIN2-GFP和AUX1-YFP由S. Robert和N. Raikhel提供;ABCG36/PEN3-GFP由B. Underwood和S. Somerville提供;pDR5:GFP和pDR5:GUS来自M. Ivanchenko。标记BRI1-GFP由J. Chory提供;p35S:BSK3-YFP由Z. Wang提供;p35S:BRX-GFP由A. Amiquet提供。

拟南芥种子表面消毒，在4°C下分层3-5天，种植在生长培养基(1x MS, 2% (w/v)蔗糖和维生素)或土壤上，如前所述[28]。制备一系列稀释的激素，并在浇铸板前将其加入冷却至50°C的培养基中。植物激素:3-吲哚乙酸(IAA)、萘烯乙酸(NAA)、n -6-苄基腺嘌呤、24-表油菜素内酯、1-氨基环丙二甲酸(ACC)、萘酞酸(NPA)和brefeldin A (BFA)均从Sigma-Aldrich中获得。植物在22°C的气候室中长时间生长(16小时)。每天的光)。

显微镜

根据第6天和第8天观察到的根长度差异计算生长第7天的根生长率，并使用佳能Power Shot A710IS数码相机或连接蔡司Stemi SV 11解剖显微镜的Moticam 1000相机进行拍摄。为了分析GUS活性或淀粉染色的根尖，将幼苗在0.3%甲醛中固定在0.33 M pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，室温下30分钟，然后在50 mM pH 7.2的磷酸盐缓冲液中冲洗3次。固定苗在37℃下染色过夜，然后按照Malamy和Benfey的描述进行清除，分析GUS活性[121]，由Ivanchenko等人修改[122]。在Lugol染色液[0.34% (w/v) I]中放置固定根尖对淀粉进行染色₂H中KI含量为0.68% (w/v)₂15分钟。在蔡司轴向显微镜下对根尖进行GUS活性或淀粉染色。在俄勒冈州立大学基因组研究和生物计算中心和环境与健康科学中心的共聚焦显微镜设备上，用碘化丙啶(10 μg/ml)染色或含有荧光标记物的活根使用蔡iss LSM510 META和Axiovert 200电动显微镜(版本3.2 LSM软件)进行成像(美国国立卫生研究院资助号1S10RR107903-01)。使用ImagePro 6.2软件(MediaCybernetics，http://www.mediacy.com)。

皮层细胞档案分析

四个可区分的发育区域-分生组织，过渡区，延伸区和成熟区[5]、[41-是通过沿着细胞档案检查皮层细胞长度来识别的。从尖端分析，在两倍范围内观察到的细胞长度被认为是分裂的，并被鉴定为分生细胞。在分生组织之后，一个过渡区(有些人称之为远端延伸区)被确定为细胞长度不再分裂产生两个较小细胞的区域，而是随着细胞文件的增加而显示出缓慢稳定的长度增加。过渡区结束，加速伸长区开始，一系列细胞的长度呈指数增长。当细胞大小不再呈指数增长，而细胞长度在成熟细胞的平均长度周围变化时，这个伸长区结束，成熟区开始，而在邻近的细胞层中经常观察到根毛或侧根的形成。从皮质细胞长度剖面分析生长参数在附加文件中有详细描述2．简单地说，用根生长速率除以平均成熟细胞长度来计算细胞生成速率[123]、[124]。细胞生成速率除以分裂细胞的数目(即分生组织中的细胞数目)，再乘以ln(2)，就可估计出细胞周期的长度。[46]。每个皮质细胞离开分生组织进入过渡区和延伸区之间的平均时间间隔估计为细胞生成速率的倒数[123]、[125]、[126]。对对数变换后的细胞长度数据进行线性回归分析，为确定伸长区伸长指数速率常数提供了依据，并为基因型间伸长曲线的比较提供了手段。

中存在

在垂直定向板上生长于MS + 2%蔗糖培养基上的8日龄幼苗中收获整根，立即在液氮中冷冻，并保存在- 80℃的冰箱中。每个基因型收集了三个生物重复(每个50-100 mg组织=最多~100根)，每个生物重复由来自一个独特亲本植物的特定种子种植的汇集根样品组成。用研杵和研杵在液氮下研磨，加入TRIzol试剂(Invitrogen Cat No. 15596-018)，收集冷冻组织中的RNA，并收集氯仿萃取物的水相。加入异丙醇从水相中沉淀RNA，离心成球，用75%乙醇洗涤，并短暂干燥。每个颗粒重新溶解在无rnase的水中，并用QIAGEN RNeasy MinElute Cleanup Kit(编号74204)按照制造商说明进行纯化。使用Agilent生物分析仪2100 (RIN: 9.8-10.0)验证纯化RNA的质量和数量。RNA先用DNaseI (Invitrogen, Cat No. 18068-015)处理，然后使用Superscript III第一链合成系统(Invitrogen, Cat No. 18080-051)按照制造商的协议合成cDNA。

采用BioRad CFX96循环仪进行qRT-PCR。引物(在附加文件中列出)3.)，根据以下标准扩增选择的序列:Tm为59-61℃，引物长度为20-25个核苷酸，鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40-55%，在转录本的3 '端附近扩增，产生长度为55-150 bp的PCR扩增子，如果可能的话，覆盖外显子-外显子连接。对每个植物基因型评估的每个基因进行3个生物重复，每个重复进行3个技术重复，获得qPCR的定量循环值。每个qPCR反应的效率是通过与样品在同一板上运行的稀释系列的评估来确定的(效率包含在附加文件中3.)。TIP41(At4g34270),沙子(At2g28390)和一个蛋白质编码基因(At4g33380)被选为内参基因，基于它们的表达稳定性和在根系qRT-PCR研究中的成功应用[127]-[131]。通过将每个囊胞突变系的Cq值与Col 0对应的Cq值进行比较，将Cq值转换为相对量。这些相对数量的计算考虑了qPCR效率，利用qBase框架[132]。

MZ:

分生区

TZ:

过渡区

易之:

伸长区

ABFA:

Brefeldin

还要感谢E. Harvey和M. Moreno，他们通过ASE在实验室的工作也帮助推进了这个项目。我们感谢C. Chan、B. Park、H. Pham和A. sughhua对基因分型和植物维护的帮助;Z. Velupkova提供频繁的帮助和患者实验室支持;以及俄勒冈州立大学(OSU)中央服务实验室进行测序。我们感谢V. Žárský实验室的成员，特别是L. Synek, E. drdov和M. Fendrych，他们在囊泡研究方面的实际贡献和讨论。我们也感谢俄勒冈州立大学V. Dolja的合作和支持，并感谢基因组研究和生物计算中心的共聚焦显微镜设备以及俄勒冈州立大学环境与健康科学中心为这项工作提供的资源。

这项工作得到了美国国家科学基金会拨款IOS-0920747和MCB- 1244633的支持。本出版物中的共聚焦显微镜数据部分是由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的拨款号1S10RR107903-01提供的。

从属关系

1. 美国俄勒冈州立大学植物学与植物病理学研究所，2082 Cordley Hall, Corvallis, OR, 97331

   雷克斯·A·科尔，萨曼莎·A·麦克纳利和约翰·E·福勒

相应的作者

对应到约翰·福勒．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

RC参与了研究的设计，实施了所有的实验，并撰写了论文。SM对根尖进行Lugol染色，并分析小柱细胞层数与根龄和NPA处理的关系。JF帮助构思了这项研究，参与了它的设计，并编辑了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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