AtROP1负调控马铃薯对5种通过NADPH氧化酶介导的h₂O.₂

背景

小GTP酶是单体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白。在植物中，ROPS调节植物细胞极性，植物细胞分化和发育以及生物和非生物应激信号通路。

结果

我们使用GFP融合向烟草表皮细胞中的血浆膜中的ATROP1蛋白的亚细胞定位。另外，瞬态和稳定表达的主要负面形式（DN）拟南芥马铃薯中的AtRop1导致H₂O.₂积累与发展的减少有关5种Montagne:和感染马铃薯叶片上的小病变的表达式斯特伯-D用RT-PCR方法对马铃薯NADPH氧化酶同源基因进行了分析。在DN-AtRop1转基因植株中，该基因的表达在病毒感染后得以维持P. Infestans。在转基因薯系中，水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）标记基因的转录物水平（Npr1和液态氧,分别分析了。这氧合酶基因急剧诱导，而表达Npr1，通过SA上调的基因，在感染后DN-ATROP1转基因植物中略微下降P. Infestans.．

结论

综上所述，我们的研究结果表明，DN-AtROP1影响了马铃薯的抗性P. Infestans。这与增加的NADPH氧化酶介导的H相关联₂O.₂生产和JA信号。

土豆(马铃薯）是世界上第四大作物。由于高海拔，寒冷温度和有限的病毒矢量，内蒙古已成为中国最大的马铃薯生产省。但是，由于没有抗性基因P. Infestans.在大多数栽培马铃薯品种中，马铃薯晚疫病在内蒙古造成了巨大的产量损失[1]，[2]. 因此，马铃薯育种工作者面临的主要挑战之一是破译马铃薯的抗性机制P. Infestans.通过传统育种和分子育种相结合的方法培育抗病品种。许多研究调查了病原菌数量抗性的分子基础[3.]马铃薯显性抗病基因的鉴定[4.]，[5.]病原入侵机制[6.]，[7.]以及马铃薯抗性信号分子[6.]，[8.］．以前的研究还表明水杨酸（SA），茉莉酸（JA）和防御基因如公关,StPK1，和StLRPK1与马铃薯晚疫病的抗性有关[9.] - [11]. 然而，对小G蛋白如何调节抗药性的理解P. Infestans.缺土豆。

小GTP酶是单体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白[12］．Rho GTPase是小GTPase Ras超家族的一个分支，包含三个相关亚家族:Rho、Rac和Cdc42 [13]，[14］．在酵母和哺乳动物细胞中，Rho GTPases在植物中有多种作用，调节细胞骨架重组、细胞极性、细胞壁合成、过氧化氢(H₂O.₂)生产、细胞周期和分化[15] - [18］．植物已经进化出了一类独特的小GTPases，称为Rho-related GTPase (ROPs)，它与哺乳动物细胞中的Racs (Rho GTPase的一个亚家族)非常相似[19] - [21.］．植物ROP不仅与哺乳动物RHO GTP酶表现出高序列相似性，而且具有类似的功能[20.]，[22.]，[23.]. 与哺乳动物一样，ROPs通过鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）将GDP交换为GTP而被激活，而它们被GTPase激活蛋白（GAPs）灭活并刺激GTP水解为GDP。鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（GDIs）通过抑制GDP的释放，使ROPs处于非活性状态[19] - [21.］．ROPs在gtp结合形式和gdp结合形式之间循环，从而调节多种细胞反应[24.］．迄今为止，已识别出几种植物ROP基因，包括11个拟南芥ROP基因[19]，[25.]，[26.]，7种水稻和9种玉米基因[27.]. 由这些ROP基因编码的蛋白质调控多种信号通路，导致多种细胞反应，如细胞极性/顶端生长、细胞骨架重组、次生壁形成和植物防御[20.]，[22.]，[23.]，[28.］．

RHO相关的GTP酶明确参与了植物防御的建立。在米饭中，OSRAC1积极调节辩护响应格里西大道H₂O.₂通过调节NADPH氧化酶活性来实现积累[29.] - [32.］．Osracb，OSRAC4和OSRAC5在建立对稻瘟病的抵抗力时起负调节器[33.] - [36.，但OsRac6以积极的方式调节水稻抗性[36.]. 在哺乳动物细胞中，ZmRac（从玉米中克隆）的显性正构象的过度表达也导致超氧化物和其他ROS分子的产生增加[37.]. 在拟南芥中过度表达GhRac13基因（来自棉花）和在大豆中过度表达HsRac1（来自人类）抑制H₂O.₂生产(38.]，[39.］．在拟南芥中，ATROP2和ATROP11转基因植物表现出增加的抗性两PV。番茄（太平洋标准时间）DC3000（第。丁香科）．但是，ATROP10对细菌的抗性有相反的影响[40］．在大麦中，HvRacB的沉默通过减少真菌吸器以细胞自主和基因型特异性的方式建立来增加对白粉病的抗性[41.］．然而，大麦的Ca-HVRACB，CA-HVRAC1和CA-HVRAC3（主动构象）的稳定过表达导致对粉末状霉变的易感性提高了[33.]，[42.]，[43.]. 在烟草中，过表达的MsRac1基因导致细胞死亡，从而导致褐色坏死病变的发展[44.]. 另外，利用RNA干扰沉默的方法进行研究Medicago Truncatula.植物表明MtROP9在ROS介导的早期感染信号中起着关键作用[45.]. 以上结果表明，ROPs对植物防御系统的建立起着积极和消极的作用。

活性氧(ROS)包括超氧化物(O^2-)、过氧化氢(H₂O.₂)、羟基自由基(HO·)和单线态氧(¹O.₂)由质膜产生的NADPH氧化酶在防御反应中起关键作用，被认为是诱导抗性反应的第二信使，如防御基因表达增加和诱导超敏细胞死亡，称为超敏反应（HR）[46.]，[47.］．ROS的快速生产是植物和病原体之间不相容的相互作用期间的早期事件之一[46.]，[48.］．在尼古利亚娜·宾夕法尼亚州抑制ROS累积导致阻力降低P. Infestans.[47.]. 大豆细胞中的ROS可能与一氧化氮相互作用，触发HR，从而有效地抑制病原菌的生长[49.］．在拟南芥中，ROS的诱导导致超敏细胞死亡反应，增强其对Pst和活体营养型卵菌[50.]. 水稻ROS产量的增加诱导HR样反应，极大地减少了稻瘟病菌强毒小种引起的病损大小，改变了防御相关基因的表达[51.］．

许多研究表明，SA (salicylic acid，水杨酸)和JA (Jasmonic acid，茉莉酸)是通过诱导一系列防御基因的表达来调节植物抗性的关键信号分子PR-1那PAD4那EDS1,和PDF1.2[52.］．SA在建立对生物养学病原体感染和全身获得的抵抗（SAR）的抵抗力方面发挥作用[53.］．Pr基因1的非富沸点（尼泊尔卢比1)在病原体感染过程中被SA积累上调，并被常规用作跟踪SA介导的信号通路的标记基因[54.］．最近的一项研究确定了SA是基础防御所必需的，如病原体引发的土豆中的免疫力（PTI）P. Infestans.；SA的减少使植物更容易受到P. Infestans.可能是由于较低公关基因表达(55.］．增加马铃薯中水杨酸的含量可提高其抗性P. Infestans.[56.]. JA还被认为在建立植物对病原菌的抗性和对各种胁迫的反应中起着重要的作用[57.]，[58.］．在植物中，JA是参与诱导系统抗性(ISR)建立的关键信号成分[59.］．脂氧合酶（LOX）是JA合成途径中的关键酶，以及表达氧合酶该基因与不同胁迫下JA的积累高度相关[6.］．拟南芥在JA信号通路中受损的突变体始终受到对病症的抵抗力的影响[60.]. 感染pstdc3000后，JA也有累积[59.］．沉默烯烯氧化物环酶（AOC公司）或OPDA还原酶3（OPR3)编码JA生物合成相关酶的基因也扰乱了马铃薯对Pep-13的反应，Pep-13是马铃薯的一种病原相关分子模式（PAMP）P. Infestans.通过减少ROS的积累和超敏细胞的死亡。在缺乏JA的植株中观察到SA积累[6.]表明在马铃薯抗性建立过程中，JA和SA信号通路之间存在着相互作用。

我们分析了AtRop1，一种小G蛋白拟南芥其在建立对土豆抗性枯萎的作用。我们的结果表明，ATROP1（DN-ATROP1）的非活性形式的瞬态或稳定过表达增强了马铃薯抗性P. Infestans.感染，一种与H₂O.₂由NADPH氧化酶同源物基因介导。这表明h₂O.₂在ATROP1介导的马铃薯抗性中起着至关重要的作用P. Infestans.感染。此外，初步结果表明，JA参与了atrop1介导的马铃薯对晚疫病的抗性。

AtRop1的亚细胞定位

为了确定AtRop1的亚细胞定位，在烟草表皮细胞中瞬时表达了mGFP:AtRop1结构，并在荧光显微镜下检测到GFP信号。如图所示1，绿色信号仅在质膜(PM)上可见，而单独的GFP(对照)主要在细胞质中可见。因此，AtRop1在PM处本地化。

AtRop1显性失活构象(DN-AtRop1)的瞬时表达增强了马铃薯的抗性P. Infestans.

确定ATROP1在马铃薯响应中的重要性P. Infestans.那农杆菌肿瘤术分别携带CA-AtRop1(构成活性)和DN-AtRop1(显性阴性)的菌株(LB4404)侵染马铃薯叶片。24小时后,P. Infestans.（5×10^5.Zoospore / ml）接种在浸润部位，并且在接种后在不同时间点测量病变尺寸。如图所示2A，接种24h后马铃薯叶片出现病变，并逐渐扩大。病变大小在72 hpi和96 hpi时有差异。瞬时表达DN-AtRop1的浸润部位病变远小于表达CA-AtRop1的浸润部位病变(图)2A).病变大小量化显示，与CA-AtRop1浸润部位相比，DN-AtRop1浸润后病变的扩张速度要慢得多(图)2b）．这些结果表明ATROP1可能参与马铃薯抗性P. Infestans.．

要理解为什么DN-ATROP1的瞬态表达抑制马铃薯叶上的病变扩张，开发P. Infestans.锥虫蓝染色首次检测到接种部位周围的菌丝。如图所示2C、 与CA-AtRop1表达位点相比，在DN-AtRop1瞬时表达的位点周围观察到较少的菌丝体（图1）2C).重要的是，CA-AtRop1表达位点和对照位点的菌丝发育显著，而DN-AtRop1表达位点的菌丝数量较少，说明过表达DN-AtRop1在一定程度上抑制了菌丝的发育。同时，利用实时荧光定量PCR技术对其生物量进行评价P. Infestans.．这表明,P. Infestans.CA-ATROP1和DN-ATROP1瞬时表达位点的菌丝体发育明显低于对照位点，DN-ATROP1表达位点显示最低生物质水平（图2D） 是的。总之，DN-AtRop1瞬时表达位点的小病灶大小可能与肿瘤生长受限有关P. Infestans.．

接下来，我们调查了抑制的可能机制P. Infestans.DN-ATROP1Expression后马铃薯的发展。最近的研究表明，ROPS和ROS积聚之间的紧密联系方式[37.]. 这促使我们分析H₂O.₂DAB染色在P. Infestans.感染网站。在DN-ATROP1表达位点，H₂O.₂在48hpi时观察到，在72hpi时急剧累积，在96hpi时仍处于高水平（图1）3.A） 是的。然而，在CA-ATROP1表达位点并非如此。在图中3.B、 DAB染色定量显示两种结构都导致H₂O.₂接种后的水平P. Infestans.．但是，H的积累₂O.₂在DN-AtRop1的表达部位明显高于CA-AtRop1的表达部位。我们提出高水平H₂O.₂DN-ATROP1表达位点的累积可以是增加抗性的原因之一P. Infestans.，通过抑制来说明P. Infestans.马铃薯叶片的发展和较小的病变大小。

DN-AtRop1增强了马铃薯的抗性P. Infestans.

为了验证瞬时表达系统的结果，我们制备了转基因马铃薯株系DN-AtRop1通过农介导的转换．叶片盘方法用于产生转基因素，通过南纹分析证实阳性转基因系（图4.A） 以及使用商业抗GFP抗体的western blot（图4.b）。选择DN-ATROP1转基因系6,8和11用于进一步的功能分析。

我们在接种后，首先检查转基因马铃薯叶上的症状开发P. Infestans.. A.s shown in Figure5.B，当控制线显示出变色症状96 HPI时，DN-ATROP1转基因马铃薯叶上没有出现病变。通过台盼蓝染色检测转基因马铃薯叶上的菌丝体发育。稀疏的菌丝体P. Infestans.在96 hpi的DN-AtRop1转基因马铃薯叶片中检测到，而对照叶片表达空载体，在显微镜下显示大量蓝色染色（图5.C） 是的。P. Infestans.采用实时荧光定量PCR (real-time PCR)方法检测转DN-AtRop1基因马铃薯(6、8、11)叶片的生物量。定量分析表明发育减慢P. Infestans.在三个DN-AtRop1转基因株系中与对照植株进行比较（图5.d），表明DN-ATROP1转基因抑制了开发P. Infestans.从而提高马铃薯对晚疫病的抗性。

H₂O.₂参与马铃薯ATROP1介导的抗性P. Infestans.

为了验证H₂O.₂在马铃薯DN-AtRop1转基因株系的抗性中起关键作用P. Infestans.，我们分析了H₂O.₂在转基因系中通过DAB染色。转DN-AtRop1基因的叶片在24 hpi时呈棕色，而对照植株中未检测到信号。H的积累₂O.₂DN-AtRop1转基因植株在48hpi时有较高的表达水平，在72hpi时有较高的表达水平，而对照植株的棕色仅略有增加（图1）6.A） 是的。H的定量₂O.₂水平（基于硫酸钛标准曲线法）表明，H₂O.₂在DN-ATROP1和控制线中遵循相同的时间模式，但DN-ATROP1转基因系中的水平显着高（图6.b）。与对照相比，测试的所有转基因素都有更高的H.₂O.₂结果表明，AtRop1通过H₂O.₂积累。

AtRop1负调控H₂O.₂马铃薯NADPH氧化酶同系物的积累

我们检测到H的积累₂O.₂接种后P. Infestans.在DN-ROP1转基因中。该数据促使我们检查膜位于膜是否（马铃薯中的NADPH氧化酶同源物）是H的主要调节器₂O.₂在这些转基因中的生产。使用来自的引物进行RT-PCR斯特伯-D，如图所示7.A和B;比较接种后不同时间点DN-AtRop1和对照植株中Strboh-D的转录水平(图7.b）。在对照植物中，表达减少了24 HPI，并在48 HPI下未检测到。但是，在DN-ATROP1转基因植物中，mRNA水平斯特伯-D基因在24 hpi时保持不变，在72 hpi时略有下降，在96 hpi时几乎是对照水平的一半（图1）7.这些结果表明膜是局部性的斯特伯-D基因可引起H₂O.₂在接种后的DN-ATROP1转基因系中P. Infestans.．

JA可能在DN-AtRop1转基因马铃薯的抗病性中起一定作用P. Infestans.

SA和JA是涉及植物抗原病原体的主要信号激素。检查JA-和SA依赖的信号通路是否参与了DN-ATROP1相关的抵抗力P. Infestans.，分析SA和JA标记基因的转录水平。这些标记基因Npr1，是SA信号通路的中心成分，并由SA积累上调，以及氧合酶，它们在JA生物合成途径中编码关键酶。如图所示8.A和B,氧合酶在对照植物中，转录水平在24 hpi时显著降低，在96 hpi时检测不到，而在DN-AtRop1转基因植物中，氧合酶mRNA在48 hpi前保持不变，随后逐渐下降。关于Npr1同时也进行了研究。表达数据的量化表明Npr1DN-ATROP1植物中的基础水平略低于对照植物（图8.C)，接种后进一步降低24hpiP. Infestans.．这些结果表明，JA信号可能参与了atrop1介导的马铃薯对晚疫病的抗性。

ATROP1蛋白的亚细胞定位

利用瞬时表达系统，利用GFP标记技术研究了AtROP1在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。我们的结果显示mGFP:AtRop1主要定位于PM（质膜）（图1）1). 在哺乳动物和植物细胞中，NADPH氧化酶负责产生H₂O.₂也位于PM [61.]，[62.］．这提出了ATROP1可以在PM处调节NADPH氧化酶同源物的可能性，从而促进H的积累₂O._2。在水稻中获得相同的结果，其中OsRac1也位于PM并调节H.₂O.₂生产，从而提高水稻的抗逆性m .盘菌[29.] - [31.]．PM被认为是小G蛋白向下游因子传递信号转导的平台，从而促进马铃薯防御反应的建立。

AtRop1负调控马铃薯对晚疫病的抗性通过H的积累₂O.₂

RAC/ROP家族的小gtp酶在植物防御反应的建立中起着重要的作用[48.]，[63.］．在水稻中，过表达OsRac1型通过增加H₂O.₂水平[29.]，[51.];在水稻中沉默这个基因会导致在感染稻瘟病菌后比对照植株发育更大的病变[64.］．进一步研究OSRAC1Function揭示了osRac1的组成型活性形式（CA-OsRac1)促进H₂O.₂生产(29.]，而俄罗斯奥克拉克的主要负面形式（DN OsRac公司1)抑制H₂O.₂[51.]. 另外，表达人的显性否定形式RAC1.(DN -hRac1)在大豆或OsRac1型在水稻细胞中，悬浮液也导致H的抑制₂O.₂响应激发子处理的生产。这表明H介导的小G蛋白对植物抗性存在正调控机制₂O.₂积累[39.]，[51.]，[65.]. 然而，小G蛋白可能发挥更为复杂的作用，表现为显性阴性形式的OsRac1(DN-OsRac1)在烟草中。这导致了H₂O.₂感染后积聚烟草马赛克病毒(TMV) (66.]和过度表达NtRac5公司（RAC5克隆烟草）在烟草中导致H较低的H₂O.₂[67.]我们据表明，拟南芥的主要负面形式的瞬态和稳定表达ATROP1.（DN-AtRop1）马铃薯的基因导致了下降的发展P. Infestans.在感染部位。说明AtRop1对马铃薯抗晚疫病的负调控机制。H₂O.₂被发现是与ATROP1介导的马铃薯抗性相关的信号通路中的关键球员。ATROP1的阴性形式的过表达导致H的积累₂O._2，提高了马铃薯的抗病性P. Infestans.感染。H₂O.₂在植物抗性的建立过程中起着关键作用[48.]，[63.］．h的快速生产₂O.₂在被非寄主或无毒病原菌侵染的植物中观察到了在侵染区域触发HR的现象。在我们的研究中DN-AtRop1促进H的积累₂O.₂后P. Infestans.感染，可能引发了感染地区的HR，从而限制了发展P. Infestans.，并导致较小的病变（图2和数字5.）。因此增加了h₂O.₂积累可提高转基因马铃薯品系对晚疫病的抗性。我们的数据与在烟草品系中观察到的过度表达完全一致DN-OsRac1在TMV感染后也表现出较小的病变[66.］．

H₂O.₂DN-AtRop1转基因株系的积累是由NADPH氧化酶介导的

一般来说，H的产生₂O.₂既可以通过有氧呼吸过程中的线粒体电子传递实现，也可以通过氧化还原酶和金属催化氧化实现。与膜相关的NADPH氧化酶的激活是H的主要来源₂O.₂积累[68.]，[69.］．StRBOH是NADPH氧化酶的同系物，不仅在马铃薯叶片中有很强的诱导作用，而且在马铃薯侵染后的块茎中也有很强的诱导作用P. Infestans.[70]. 在我们的研究中StRboh在接种后观察到马铃薯转基因素P. Infestans.．然而，在对照植物中其表达被显著抑制。这说明H₂O.₂在转基因株系中可能是由膜定位的持续表达引起的StRboh．同时，AtRop1和StRboh的质膜定位表明，PM可能是连接AtRop1和的平台StRboh有利于H的积累₂O.₂. 过氧化氢酶是一种主要的H₂O.₂清除植物细胞内的酶，水解H₂O.₂在H₂O和O₂保护植物细胞免受对H的有害影响₂O.₂[71.］．然而，我们没有观察到对照和转基因株感染后过氧化氢酶的转录水平的差异P. Infestans.(数据未显示)，表明H₂O.₂积累主要是由马铃薯pm定位的NADPH氧化酶同源物引起的。

JA参与了AtRop1调控马铃薯抗性的过程

SA和JA是植物对病原体的重要信号分子。检查它们是否参与了DN-ATROP1转基因系的抗性增加P. Infestans.RT-PCR检测两条通路中标记基因的转录水平。我们的数据显示氧合酶在此过程中，转基因株系DN-AtRop1的基因表达被诱导P. Infestans.说明过表达DN-AtRop1激活了JA通路，而本研究部分抑制了SA信号通路。

我们的数据与先前的报道不同，表明SA信号通道被激活，并且在某种程度上被抑制了JA信号通路P. Infestans.马铃薯抗病品种紫花白的入侵[72.］．此外，没有发现SA不仅要规范土豆的基础防御P. Infestans.但也参与了BABA诱导马铃薯系统获得性抗性的建立[55.]，[73.]. 然而，Rosah和他的同事发现马铃薯的PAMP反应需要SA和JA，表明JA是马铃薯抗性建立所必需的[6.］．因此，ATROP1过表达可以激活粘合性诱导的电阻途径，从而提高马铃薯抗性P. Infestans.. A.recent study established that JA and SA signaling pathways act antagonistically in potato [72.]. 减少了Npr1成绩单水平和接种后Ja的伴随增加P. Infestans.表明SA和JA的拮抗作用具有保护作用。除了SA和JA，还有其他激素参与植物抗性，如乙烯(ET)、油菜素内酯(brassinosteroids)、细胞分裂素(Cytokinins)和生长素。其中油菜素内酯和油菜素内酯通过NPR1增强了植物对病原体的抗性[74.] - [76.]是SA信号通路的主要调节因子。乙烯对SA信号通路具有拮抗作用[52.]，而生长素可能通过影响SA生物合成而增强对生物营养性病原体的敏感性[77.］．我们的数据显示，表达DN-ATROP1导致降低Npr1感染后的转录水平P. Infestans.表明AtRop1可能正调控马铃薯NPR1的表达。

结果表明，AtRop1可调控马铃薯对晚疫病的抗性。DN-AtRop1通过激活膜相关NADPH氧化酶，促进H₂O.₂积累。我们建议那个₂O.₂依次累积限制P. Infestans.开发，导致较小的病变尺寸，并提高马铃薯抗性。我们的结果还表明JA可参与ATROP1介导的马铃薯耐药性P. Infestans.．

质粒建设

构建的pLG-CARop1、DNRop1和Rop1以及pbi121空载体由赵燕博士(中国科学院遗传与发育生物学研究所北京)提供。构念用EcoR我和囊我，然后钝端并用空载体pbi121连接到构建三个表达载体：pbig-carop1，pbig-dnrop1和pbigrop1。PCR鉴定A. Tumefaciens.含pBIG-CARop1、pBIG-DNRop1、pBIG-Rop1的GFP引物5’-GAC GTA AAC GGC CAC AAG TT-3’和5’-GAA CTC CAG CAG GAC CAT GT-3’。

AtRop1的亚细胞定位

农杆菌肿瘤术(菌株LB4404)含有表达载体(pBIG-CARop1/pBIG-DNRop1/ pBIG-Rop1)和空载体(只含GFP)，在含有10 mM MES (pH 5.7)、20 μM acettosyone和100 mg/L利福平的5 ml LB培养基中培养约48小时。收集农杆菌，在5%的蔗糖浓度下重悬₆₀₀= 2.0，然后使用无针注射器渗入烟叶。通过共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM-510)检测烟草表皮细胞中GFP信号。

玉米游动孢子悬浮液的制备P. Infestans.

5种交配型A1是由张若福教授（内蒙古大学土豆工程中心）提供的。在18°C的灭菌燕麦籽粒培养2-3周后，孢子囊P. Infestans.用无菌水冲洗，并在4°C下保持4–6小时，以促进游动孢子释放。游动孢子经1-2层消毒纱布过滤，显微镜下用血细胞仪测定浓度。将游动孢子溶液稀释至5 × 10^5.所有接种的游动孢子/mL[3.］．

马铃薯叶片接种20μL游动孢子悬浮液（5 × 10^5./mL），并在20°C和85%湿度下培养，以进行抗性评估和测定H₂O.₂积累[78.］．用无菌刷子将游动孢子悬浮液涂抹在转基因马铃薯叶片背面，20℃保存检测H₂O.₂菌丝体生物量的生产和测定。

农杆菌肿瘤术介导的瞬态表达

农杆菌肿瘤术(菌株LB4404)携带AtRop1突变体(CA-AtRop1和DN-AtRop1)，在含10 mM MES (pH 5.7)和20 μM乙氧丁酮的LB培养基中培养约48 h。离心后，将细菌重悬在含有10 mM氯化镁的渗透培养基中₂，10 mM MES（pH 5.7）和150μM乙酰丁香酮（OD浓度）₆₀₀ = 0.5 (optical density 600 nm). The bacteria were infiltrated into detached potato leaves using a syringe without needle. Twenty-four hours later, 20 Μl of the zoospore suspension(5 × 10^5./mL)接种于浸润部位。马铃薯对P. Infestans.使用不同时间点的接种叶片的病变区域评估。通过计算病变的长度×宽度估计病变区域。每次实验都重复三次。

H的定量和定性测定₂O.₂生产

染色方法3,3'-二氨基苯甲酸（DAB）用于检测H的积累₂O.₂. DAB溶液是新制备的，以避免自动氧化。叶段在0.1%（w/v）DAB溶液（ph3.8）中漂浮，并在25℃黑暗中保持。8小时后，将叶片转移到95%乙醇中，煮沸漂白30分钟。然后将叶片储存在甘油-乙醇（1/4 v/v）溶液中直到拍照。由DAB聚合形成的棕色代表了H的积累水平₂O.₂[79.］．DAB的颜色量化数据由数量（Bio-Rad，American）工具评估。

采用硫酸钛标准曲线法测定H₂O.₂．H.₂O.₂硫酸钛生成黄色过氧化物-钛化合物沉淀。用硫酸处理解决了这一问题;颜色代表H的浓度₂O._2，. 在OD时收集数值_415.与H呈线性相关₂O.₂专注 [80]. 生成H的标准曲线₂O.₂， 30%标准H₂O.₂(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μM)与5%硫酸钛(w/v)在含氨和丙酮的缓冲液中反应，再用2 M硫酸溶液溶液。回归方程为:Y = 0.8144X + 0.025, R² = 0.9953 by using values collected at OD_415.通过分光光度法(TU-1901)测定nm，并作为标准曲线。取0、24、36、48、72和96 hpi的马铃薯碎叶0.1 g，置于液氮中，然后将粉末转入含有1ml预冷丙酮(4℃)的1.5 mL离心管中提取H₂O.₂. A.fter centrifugation for 10 min at 6000 rpm, the 100 μL supernatant was used to react with 5% titanium sulfate (w/v). After the mixture was solved in 2 M sulphuric acid, the H₂O.₂紫外分光光度法测定0、12、24、36、48、72和96 hpi浓度_415.纳米。

台盼蓝染色检测菌丝发育

台盼蓝染色法检测肿瘤的发展P. Infestans.菌丝体。将被感染的土豆叶片转移到95％乙醇中，并煮沸30分钟以漂白叶子。然后在25℃下用0.5％（w / v）台盼蓝溶液渗透叶4小时。用水洗涤样品三次后，在显微镜下可视化菌丝体[81］．

量化发展P. Infestans.在马铃薯叶上

施用定量实时PCR以确定生长P. Infestans.在马铃薯植株上使用lightcycler 480II（美国罗氏公司）和qPCR试剂盒SYBR Select Master Mix（美国ABI公司）。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取DNA[82]. 用引物PIO8-3-3F（5-CAA-TTC-GCC-ACC-TTC-GA-3）和PIO8-3-3R（5-GCC-TTC-CTG-CCC-TCA-AGA-AC-3）扩增和检测aP.infestans-特定重复DNA序列[83]和底漆STEF-1-F（5-GTG TGT TAC GAG AAC TTG CTT TAC T-3）和STEF-1-R（GGA作用ATG TTT GCC ACC GTC CTG）用于扩增马铃薯EF-1α基因作为内源性控制。

植物材料与转化

土豆植物马铃薯“Shepody”生长在Murashige和Skoog（MS）培养基上体外在光束密度为3000-4000 Lx，60-85％的相对湿度，25°C的16 h / 12 H日和夜间周期。在含有卡那霉素（100mg / L）和利福平（100mg / L）的10ml LB培养基的振荡器培养物中培养了一块农杆菌Lb4404的殖民地，并在28℃下保持220rpm 48小时。3〜4周的叶子静脉切割叶片，然后漂浮在含有细菌悬浮液的MS液体介质中（细菌浓度是OD₆₀₀ = 0.5），并在黑暗中保持2-3天。叶片在无菌滤纸上干燥后转移到MS固体培养基上。2天后，将叶片转化到含有0.5 mg/L吲哚乙酸（IAA）、2.0 mg/L 6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、2.5 mg/L赤霉素（GA3）、25 mg/L潮霉素和500 mg/L头孢噻肟的MS培养基上诱导不定芽。4周后，在含25 mg/L潮霉素和500 mg/L头孢噻肟的再生培养基上进行马铃薯再生芽的筛选。通过Southern杂交和Western杂交对转基因植株进行鉴定。

南方印迹分析

采用CTAB法提取马铃薯基因组DNA [82］．对于DNA提取，在液氮中研磨0.2g新鲜收获的叶片。将粉末悬浮在1ml DNA萃取缓冲液（50mM Tris-HCl pH 8.0,10mM EDTA，700mM NaCl，1％CTAB溶液，0.5％PVP）中，并在65℃下孵育30分钟。通过用相等体积的氯仿混合萃取DNA：异戊醇（24：1），并在4℃下以12,000rpm以12,000rpm离心10分钟。将上清液除去向新鲜管中并用相等体积的冰冷异丙醇和0.1体积3m乙酸钠沉淀过夜。将混合物在4℃下以12,000rpm离心10分钟。将沉淀用70％乙醇洗涤两次，然后完全干燥并溶解在Te缓冲液中。用RNase纯化DNA并通过UV分光光度法量化。

根据其序列，根据挖掘DNA标记和检测试剂盒II（Roche，American）的指令产生的用于Southern印迹的GFP探针。用EcoR I和Sac I消化基因组DNA后，将产物分离在1.0％琼脂糖凝胶上，然后转移到尼龙膜上。用2×SSC（0.3M NaCl，30mM柠檬酸钠，pH7.0）洗涤膜，然后用0.1％SDS（5分钟）两次，然后用0.5×SSC洗涤两次，用0.1％SDS（15min）在65°C。将膜在80℃下烘烤2小时，以将DNA与尼龙膜交联。将膜与标记的GFP探针的杂交在杂交缓冲液中进行过夜（通过DIG DNA标记和检测试剂盒II）在42℃下进行过夜。杂交后，用洗涤缓冲液（0.1M马来酸，0.15m NaCl，0.3％Tween 20，pH 7.5）洗涤膜5分钟;然后用阻塞溶液孵育（通过DIG DNA标记和检测试剂盒II提供）30分钟。然后将膜与抗Digoxigenin-AP（1：5000稀释液）一起温育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤膜两次，并在检测缓冲液（0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5）中平衡5分钟。 The membrane was stained with 1 ml CSPD, and incubated at 25°C for 5 min, then analysed ueing a Chemi XT4 (Syugene, American).

西部印迹分析

将转基因马铃薯叶片在液氮中研磨，然后将粉末转移到含有5mmM K的1mL蛋白质分离缓冲液（pH6.0）中_3.阿宝_4.、2.5%蔗糖、0.1% β-巯基乙醇和0.5 mM苯甲基磺酰氟。粗提物4℃，12000 rpm，离心20 min，收集上清，与上清液混合。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂奶粉在PBST(磷酸盐缓冲盐水吐温-20)缓冲液中封闭硝化纤维素膜，用抗gfp单克隆抗体(1:5000稀释，中国生工)和hrp标记抗大鼠二抗(1:3000稀释，中国生工)孵育，用Chemi XT4 (Syugene，美国)检测信号。

rt - pcr

采用RNA iso Reagent (TaKaRa, Japan)从转基因马铃薯叶片中提取总RNA。用1.2%的琼脂糖凝胶检测RNA的质量。RT-PCR用AMV转录酶(TaKaRa，日本)根据制造商的说明生成cDNA。用于RT-PCR分析的特异性引物如下:

• StRboh-D-F（5-AGC TGC AGA ATA CGC AGC GTT GA-3）

• Strboh-D-R（5-GGC att Gaa Acc GGT Gag CTT GT-3）

• Npr1-F（5-TGC TGC CAT GCG TAA CGA ACC A-3）

• NPR1-R（5-TGG ACC AAA ACT TGG CCC CAC A-3）

• Lox-F(5-AGA ACT TTG CTC TTC TTG CAA G-3)

• Lox-R（5-GGT AAT ATT CAT TGT GTC CCG-3）

• GAPDH-F（5-TGG ACA ATG GAA GCA CCA TGA GC-3）

• GAPDH-R（5-TGC TTG ACC TGC TGT CAC CAA-3）。

感谢张若芳教授（内蒙古大学马铃薯工程中心）的热情提供P. Infestans.压力。国家自然科学基金资助项目(no . 30760132, no . 31260425)。

从属关系

1. 内蒙古农业大学农业部，内蒙古惠文，010019

   张志伟、杨凡、任娜、张小罗、杨树清、高静、范明寿、赵军

2. 中国科学院遗传与发展生物学研究所，北京100101

   赵妍

通讯作者

通信小君赵．

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

JZ构思和设计了实验。ZZ FY RN XZ执行了实验。SY JG分析了数据。YZ MF有助于试剂/材料/分析工具。ZZ写了这篇论文。所有作者阅读并认可的终稿。

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