蛋白质组学分析gydF4y2Ba青蒿gydF4y2Ba-阐明抗疟前药青蒿素的生物合成途径gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

应用MS-based蛋白质组学技术对该药用植物进行分析gydF4y2Ba青蒿gydF4y2Ba，利用最近发布的配置序列数据库(GrahamgydF4y2Ba等gydF4y2Ba。(2010)gydF4y2Ba科学gydF4y2Ba327,328 - 331)和其他基因组和蛋白质组学序列数据库进行比较。gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba是青蒿素的主要天然来源，而青蒿素是基于青蒿素的联合疗法的前体，后者是世卫组织推荐的治疗gydF4y2Ba恶性疟原虫gydF4y2Ba疟疾。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

各种数据库包含的比较gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba序列(NCBInr /gydF4y2BaviridiplantaegydF4y2BaUniProt /gydF4y2BaviridiplantaegydF4y2BaUniProt /gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba,一个gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Batrichome三位一体配置数据库、以上配置数据库和另一种gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2BaEST数据库)显示了它们在蛋白质组学分析适用性方面的显着差异，这表明经过广泛管理的生物体特异性数据库，导致更长的配置序列，可以大大增加真阳性蛋白质鉴定的数量，同时减少假阳性的数量。与先前发表的数据相比，从富含毛滴虫的细菌中鉴定出了更多的蛋白质gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba样品，包括已知参与青蒿素生物合成的蛋白质，以及其他高度丰富的蛋白质，这表明毛状体内发生的其他酶促过程对青蒿素的生物合成很重要。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

新获得的信息使得利用过氧化物酶的酶促途径作为已知的非酶促途径替代青蒿素生物合成的最后阶段成为可能gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba双氢青蒿酸转化为青蒿素的研究。数据可通过ProteomeXchange获得，标识符为PXD000703。gydF4y2Ba

人们对蛋白质组学的应用越来越感兴趣，而不仅仅是那些生物医学上相关和重要的物种，如人类、小鼠或大鼠。然而，成功地将蛋白质组学应用于感兴趣的生物体的主要障碍之一仍然是可用性良好的注释和策划(基因组)数据库，该数据库可用于搜索(主要是基于ms的)蛋白质组学数据，以便在该生物体中进行蛋白质鉴定。因此，蛋白质基因组学领域正变得越来越重要，因为它能够通过利用蛋白质组学获得的信息来支持基因组序列数据的注释，从而识别和表征基因表达的实际产物[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

植物基因组可能非常复杂，而且一般来说，它们的特征不如动物王国的基因组，更不用说上文提到的哺乳动物了。对于许多植物，甚至是那些具有高度经济重要性的植物，可用序列数据库质量的可变性会对基于ms的蛋白质组学分析的能力和深度产生很大影响。因此，理解和克服上述限制是可取的，从而可以从通常从大规模MS-based蛋白质组学分析中获得的大量数据中构建更丰富的数据集。在这里，我们研究了有机体gydF4y2Ba青蒿gydF4y2Ba是中国北方特有的一种中草药。gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba对世界卫生计划至关重要，因为它目前是生物合成青蒿素的唯一来源，这种抗疟疾的前药几十年来一直是对抗疟疾的最后一道防线。gydF4y2Ba

倍半萜内酯，即青蒿素，是世卫组织推荐的以青蒿素为基础的联合疗法的前体gydF4y2Ba恶性疟原虫gydF4y2Ba疟疾(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。由于其独特的作用方式，人们发现青蒿素对疟原虫生命周期的无性(血液)阶段有效[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，它已经对老一代抗疟疾药物产生了耐药性。2005年至2013年期间，流行国家公共和私营部门采购的以青蒿素为基础的联合疗法治疗数量增长了36倍，2013年达到3.92亿人次[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

因此，青蒿素作为以青蒿素为基础的联合疗法活性成分的前体化合物的可靠供应对防治疟疾至关重要。然而，目前青蒿素的生产受到依赖于种植的事实的影响gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba。因此，在那些gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba与粮食争夺土地，粮食价格的上涨是否会导致农民/采掘者缺乏种植的动力gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba。此外，农民/提取者需要决定是否种植gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba大约14个月后药物才能生产出来。最后，像中国和越南经常发生的洪水使ACTs的供应变得不可预测[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。考虑到这些因素和其他因素，开发一种不依赖于青蒿素的生产方法是非常可取的gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba种植，可以在短时间内扩大规模，而且价格低廉。gydF4y2Ba

为了实现这些目标，现在描述了两种不同的方法(以及两者的混合)。其中一种方法是利用商业上可获得的原料，如单环单萜烯异戊二醇，化学合成青蒿素。然而，仅通过这种化学方法生产青蒿素是复杂和昂贵的，因此迄今尚未取代农业生产青蒿素作为首选的生产方法。化学合成的另一种选择是使用基因工程快速生长的生物，这种生物可以大量生产青蒿素。在这种方法中，青蒿素的生物合成途径需要在酵母等生物体中表达，通过对宿主进行遗传修饰，使其具有该途径的相关基因。这种生物工程方法有几个方面对其成功很重要，包括工程生物体的生存能力和快速生长，以及生物合成产物的区隔/分泌，这样一来，收获就变得很容易，仅举几例。尽管如此，对青蒿素生物合成途径的全面了解gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba是至关重要的，但不幸的是，这一目标尚未实现(特别是，生物合成的最后步骤仍未完全确定)。然而，尽管如此，已经取得了非常重大的进展，正如最近两份描述生产青蒿素的烟草的生物工程的出版物所证明的那样[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]和产生青蒿酸的酵母[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。而前者的结论是，目前烟草的产量仍大大低于可获得的干重百分比水平gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba(超过1000倍)，后者报告不完全生物合成为青蒿酸，然后需要将其化学转化为青蒿素。尽管最近使用后一种方法取得了很大进展[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba但是，在生产青蒿素的最后阶段仍然需要昂贵而复杂的化学合成步骤。gydF4y2Ba

另一方面，作物育种项目已经产生了新品种的玉米gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba例如青蒿素，其青蒿素的产量一直很高(1%);正在进行的项目旨在进一步提高这一收益率。然而，很明显，作物育种和发酵/化学合成策略都将受益于充分了解青蒿素的生物合成途径。gydF4y2Ba

青蒿素的生物合成被认为是在植物的腺状毛状体中进行的，这些毛状体位于叶子表面[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。毛状体是叶毛，起源于植物各部分(包括叶和茎)上特化表皮细胞的突出。通常，毛状体分为两类:非腺状和腺状。非腺毛参与水分吸收和种子传播等过程，而腺毛则参与次生代谢产物的合成、储存和分泌等过程[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。目前，人们对利用腺毛的生物合成功能来生产具有药物用途的化合物(如青蒿素)很感兴趣。gydF4y2Ba

毛:…的腺分泌毛gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba是一种由两个基底细胞、两个柄细胞和三对分泌细胞组成的10细胞双裂细胞。青蒿素的生物合成就是在这种多细胞腺状毛状体中进行的[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。通过比较从有腺体和无腺体生物型中提取的青蒿素的量gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba,杜克gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba结果表明，所有可提取的青蒿素均定位于头腺的皮下空间[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。经提取后，无腺体生物型中未发现青蒿素，说明青蒿素的生物合成定位于腺体分泌毛状体中[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

目前的研究主要集中在毛状体蛋白质组的分析gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba，利用最近发表的EST和Graham发表的单基因序列数据库gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。该数据集与其他四个数据库(三个蛋白质序列数据库和一个毛状虫特异性Trinity contig数据库)进行了比较评估[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba])进行蛋白质组学分析。此外，还与其他唯一的基于ms的蛋白质组学研究进行了比较gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Batrichomes，它使用了另一种不同的EST数据集汇编[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。更重要的是，本研究提供了一个显著扩展的蛋白质组学数据集gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba这可能有助于更好地了解毛状体机制及其在青蒿素生产中的作用。gydF4y2Ba

腺毛的分离gydF4y2Ba

用于分离腺毛的方案是基于先前描述的玻璃珠磨损过程[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。在这些早期的研究中，据报道，通过这种方法富集的大多数细胞物质代表腺毛，尽管非腺毛也有相当一部分[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。我们的简化方法，省略了蔗糖梯度分离，证实了环境扫描电子显微镜(ESEM)分析所显示的这些发现(见附加文件中的图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明从处理过的叶片中获得了主要的腺状毛状物质。然而，ESEM也揭示了玻璃珠磨损后叶片材料上留下的大量腺状毛(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。因此，我们假定在“毛状体枯竭”和“全叶”样本之间只有很小的差异。因此，这里提出和讨论的数据主要是基于对“富含毛滴虫”的材料的分析，并将其与“缺乏毛滴虫”的样品材料进行比较，因为这些样品的技术重复分析显示，在鉴定的蛋白质数量上，这些样品的相对标准偏差相似，约为2.5%。相比之下，对于“整片叶子”复制样本，这个数字约为8%(见附加文件中的表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

质/ MS分析gydF4y2Ba

三个重复的LC-MS/MS运行显示，对于所有三个重复，大多数蛋白质鉴定(使用York Artemis contig数据库)也在其他两个相应的重复中获得，表明可接受的技术可重复性水平。对于合并的三份LC-MS/MS数据的毛状体富集样品分析，总共有671个连续的“蛋白质家族”条目(见附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)显著匹配，而在毛状体和全叶样品分析中，这一数字略高，分别为774和749。gydF4y2Ba

通过搜索York Artemis contig数据库和该数据库获得最多的蛋白质鉴定gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Batrichome Trinity contig数据库。然而，由于这些数据库中没有提供功能性注释，因此还对UniProtKB数据库进行了检索，仅限于gydF4y2BaviridiplantaegydF4y2Ba。这些搜索结果为富含毛状体的样品鉴定了319个蛋白质(家族)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，而对于毛滴虫和全叶样品分析，这个数字再次略高，分别为417和408。gydF4y2Ba

使用Mascot(反向蛋白质序列)默认选项的诱饵数据库搜索显示，所有Artemis contig诱饵数据库搜索中，超过身份阈值的肽匹配的错误发现率(FDR)在1.5%至1.9%之间，而UniProtKB(分类:gydF4y2BaviridiplantaegydF4y2Ba)的样本数据的诱饵数据库搜索率为~ 9%(见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。有趣的是，相应的Trinity contig数据库搜索的FDR为3.2%(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

黄花蒿(Artemisia annua)富含毛状体的蛋白质组gydF4y2Ba

一般来说，先前鉴定的绝大多数蛋白质来自gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba由吴gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba在我们的数据集[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。值得注意的是，在富含毛状体的样品数据中，我们发现了同样大量的ATP酶/ATP合成酶和氧化还原酶(gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba四种铁氧化还原蛋白)，以及许多参与翻译和转录以及蛋白质水解和蛋白质小体的蛋白质。此外，还鉴定了几种激酶和磷酸酶。数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba显示了UniProtKB的粗略分子功能分类(GO术语)(分类:gydF4y2BaviridiplantaegydF4y2Ba)-在提交给Percolator并将“预期截止”阈值设置为0.05后，从富含毛状体的样品材料中鉴定蛋白质。gydF4y2Ba

重要的是，在搜索限于分类的UniProtKB数据库条目时，已经发现了几种已知和假定的生物合成途径上的酶gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba。这些包括:过氧化物酶1(UniProt # Q84UA9)，青蒿醛δ -11(13)还原酶(DBR2;unipro# C5H429)， amorpha4,11-二烯合成酶(ADS;unipro# Q9AR04)， 2-烯醛还原酶(unipro# C0LNV1)， HMG-CoA还原酶(HMGR;unipro# Q9SWQ3)和推测的血红素结合细胞色素P450 (unipro# Q2EPZ0)，如表所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。有趣的是，这些酶中的大多数并没有通过搜索整个进化支而被识别出来gydF4y2BaviridiplantaegydF4y2BaUniProtKB数据库。然而，它们中的大多数和其他几种与青蒿素生物合成途径相关的蛋白质都是在contig数据库中检索数据并使用BLASTx搜索实用程序进行功能注释后发现的。gydF4y2Ba

虽然本研究的首要目的是调查York Artemisia contig数据库和其他数据库在蛋白质组学分析中的有用性，但对毛状体富集和毛状体缺失样品材料的蛋白质丰度进行初步比较也被认为对以下两个方面都是有用的:(i)限制BLAST搜索的数量;(ii)为进一步研究提供了一些关注毛状体的方法，从而为潜在的途径特异性酶提供了一些方法。为了比较毛滴虫富集和无毛滴虫样品材料的蛋白质丰度，测定了各组的emPAI值。计算出的商数，见表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba分别给出了给出最高和最低值的20种蛋白质gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba从富含毛滴虫的样品材料中得到了10个emPAI值最高的蛋白质，而在没有毛滴虫的样品材料中没有检测到gydF4y2Ba反之亦然gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在表格中显示蛋白质的功能分类gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba根据它们的丰度水平(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:丰度较高的富毛状体样品材料;无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba:丰度较低的富毛状体样品材料)。gydF4y2Ba

与之前发表的其他大型蛋白质组学研究相比，本研究中从富含毛线虫的样品中鉴定出的蛋白质家族数量增加了7-8倍gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba由吴gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。如果将这些结果与早期研究中“非冗余”蛋白质命中的EST搜索结果进行比较，则增加幅度甚至更高(12-14倍)[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。蛋白质组覆盖率的这个数量级的增加可以说是由于采用了不同的技术方法(纳米高效液相色谱- esi质谱/质谱)gydF4y2Bavs。gydF4y2Ba基于凝胶的MALDI MS/MS)以及已使用的数据库。例如，吴的研究gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba局限于用pH梯度为4-7的2DE分离蛋白质[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。在本研究使用的数据库中，Mascot搜索到的York contig翻译数据库包含85,508,608个残基，相当于平均每个翻译的contig序列有~123个残基gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba使用内部EST数据库，得到49,389,486个残基和2,060,880个序列，gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba每个翻译的EST序列平均约有24个(少于5倍)残基。后者的数据库碎片化程度越高(序列数量越多)，对蛋白质鉴定的影响就越不利，这在两项研究中，个体离子分数的不同是鉴定或广泛同源性所必需的(p < 0.05)。对于目前的研究，这些必须只有>30，而在吴的研究中gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba据报道，该阈值>41 [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

使用不同资料库(gydF4y2BacfgydF4y2Ba。表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)证明了蛋白质组学分析中生物特异性(基因组)序列数据的可用性和质量的重要性。对NCBInr数据库进行检索时，分类限制为gydF4y2BaviridiplantaegydF4y2Ba，gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba与吴的作品相似gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，获得419个蛋白家族匹配，FDR为4.7%。搜索限于UniProtKB条目的自定义数据库gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba(创建于19年。2012年1月;118个序列，41707个残基)得到了17个蛋白质家族的匹配，其中11个肽段匹配超过了诱饵数据库的识别阈值。gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba罗斯福为6.2%。最高的FDR(~ 9%)来自UniProtKB(分类:gydF4y2BaviridiplantaegydF4y2Ba)诱饵数据库搜索。gydF4y2Ba

有趣的是，Trinity trichome contig数据库检索了富trichome样品材料的MS/MS数据(见附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)与York Artemis contig数据库搜索相比，产生了略高的蛋白质家族命中数(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，但在诱饵数据库搜索中，超过身份阈值的匹配肽少得多，FDR高得多(3.2%)，超过身份阈值的匹配肽多27条，潜在地抵消了略高的蛋白质家族命中数。因此，York Artemis contig数据库似乎是蛋白质组学分析的最佳序列数据库。gydF4y2Ba

总的来说，上述分析表明，使用大型常见蛋白质序列数据库，即使精心策划和/或用于仅限于特定生物或进化的蛋白质组学分析，也很容易导致对测序和表征较差的生物的高错误发现率。他们还表明，如果想要获得更大的蛋白质组覆盖率和更少的虚假蛋白质鉴定，那么这些生物体的高质量(基因组)序列信息将提供显著的优势。gydF4y2Ba

利用emPAI值对富毛状体和贫毛状体样品进行蛋白质丰度分析，发现富毛状体样品中过氧化物酶的丰度要高得多。这些数据可能与阐明青蒿素生物合成的最后(氧化)步骤有关(见图3中的第3阶段)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，这被认为是最有可能进行的gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba二氢青蒿酸及其衍生物叔烯丙基氢过氧化物的前体。研究发现，图中所描述的青蒿素生物合成最后阶段的所有反应。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba可以非酶促进行吗gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba有人认为，这也可能是事实gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。然而，过氧化物酶的过度表达可能表明酶参与了青蒿素生物合成的最后一步。gydF4y2Ba

此外，亲环蛋白通常催化多肽键异构化gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba到gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba发现脯氨酸残基的形式在毛状体富集的样品材料中具有更大的丰度。gydF4y2Ba

总的来说，在去除毛状体的样品材料中，似乎有相对较高水平的核糖体蛋白、ATP/谷氨酸合成酶以及具有转运蛋白和电子载体活性的蛋白质(见图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。这可能部分是由于上述蛋白质在富含毛状体的样品材料中占主导地位，这些蛋白质催化毛状体特异性的生物合成和代谢过程。如图3所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba对于前10/20个最丰富的蛋白质，在“氧化还原酶/抗氧化活性”和“其他催化活性”类别中，富含毛滴虫的样品材料的数量远高于缺乏毛滴虫的样品材料。gydF4y2Ba

最后，在毛滴虫富集和毛滴虫缺失的样品中，与光合过程相关的叶绿体蛋白的背景都很重要，这与之前的研究一致gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba转录组学研究，其中发现了大量与光合同源物匹配的转录物[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。在缺乏毛滴虫的样品中，光合作用相关蛋白相对较多，这可以简单地解释为在富含毛滴虫的样品中，含有叶绿体的细胞数量相对较少。gydF4y2Ba

通过结合两次UniProtKB数据库搜索的信息，已经检测到大量已知的青蒿素生物合成途径上的酶(见表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba) -使用分类法gydF4y2BaviridiplantaegydF4y2Ba和gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba，分别见图2。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。目前对青蒿素的生物合成了解最多的是图中所示的三个阶段。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，催化每一步的酶在每个箭头上方用黑色表示。每个箭头下方红色部分所示的酶是在gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba分类搜索(另见表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和蓝色部分的酶gydF4y2BaviridiplantaegydF4y2Ba对于后者，如有需要，可使用BLASTp以“Artemisia”作为生物进行同源性搜索(E值< 10)gydF4y2Ba^{−47gydF4y2Ba};例如搜索UniProt # q84u4 (α-humulene/(−)-(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-ß-石蜡烯合成酶)、unipro# P93665 ((+)-δ- caddiene合成酶)、unipro# Q2EPZ0(细胞色素P450)、unipro# Q42799(细胞色素P450)和unipro# Q9ZPB7(醛脱氢酶))。gydF4y2Ba

在生物合成青蒿素的第一阶段，HMGR [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]催化甲羟戊酸途径的第一个转化过程，该过程在生理条件下是不可逆的，因此是高等植物细胞质中倍半萜(以及三萜)生物合成的关键步骤。广告(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]在第1阶段结束/第2阶段开始时再次催化一个既定步骤，将代谢通量引向非晶倍半萜(青蒿素就是其中一种)gydF4y2Ba瑞士gydF4y2Ba-非晶烷)和远离三萜和替代环倍半萜骨架gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba（gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba葎草烷/石竹烷和石竹烷)。gydF4y2Ba

几年来，人们已经知道，将非晶藓-4,11-二烯转化为青蒿酸(gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba中间体青蒿醇和青蒿醛)在第二阶段的生物合成中，由单个细胞色素P450催化，命名为CYP71AV1 [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。从本研究中鉴定到的细胞色素p450，作为加入号Q42799和Q2EPZ0，可能代表相同的酶。最近，人们发现双氢青蒿酸[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，而不是青蒿酸[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，是生物合成第三阶段开始时青蒿素的真正前体。有人提出DBR2将青蒿醛转化为替代产物二氢青蒿醛[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。本研究中发现的2-烯醛还原酶(COLNV1)应该催化同样的反应，可能参与了这一步骤，或者仅仅是由于其与DBR2的同源性而被发现。然后需要乙醛脱氢酶如Q9ZPB7将二氢青蒿醛转化为二氢青蒿酸[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

对于参与青蒿素生物合成第三阶段的中间体的特性，以及这些转化的酶促或非酶促性质，仍然存在相当大的不确定性。已知的是，二氢青蒿酸可以通过与相应的叔烯丙基氢过氧化物的初始氧化，然后是Hock裂解，然后是对所得烯醇中间体的第二次氧化反应，以非酶的方式转化为青蒿素[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。然而，目前尚不清楚是否会发生类似的一系列自发氧化gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba或者是否存在酶来催化该途径中的某些步骤(或者是否发生了一系列替代的氧化)gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba)。在这方面，注意到过氧化物酶1的高毛状体特异性表达确实非常有趣，它必须是一个强有力的候选催化剂，作为第一个(也可能是第二个)氧化反应的催化剂，如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba如果有一种酶参与其中的话。gydF4y2Ba

的例子gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba，我们提供了进一步的证据，表明序列数据库的选择是成功的蛋白质组学分析的关键。与之前发表的蛋白质组学数据相比gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba，我们现在已经为药用植物的例子展示了使用经过广泛管理的生物体特异性数据库，导致更长的EST序列，可以大大增加真阳性蛋白质鉴定的数量，同时减少假阳性的数量。gydF4y2Ba

最重要的是，所提出的结果大大增加了(毛线虫特异性)蛋白质组数据gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba。在富含毛状体的样品中发现了更多数量级的蛋白质，包括已知参与青蒿素生物合成的蛋白质，以及其他高度丰富的蛋白质，这表明毛状体内的其他酶促过程对青蒿素的生物合成很重要。特别是，毛状体中过氧化物酶的高特异性表达表明毛状体中有很强的酶促氧化活性，可能允许在青蒿素生物合成的最后阶段进行有效的氧化反应，而迄今为止人们一直认为这是非酶促的。gydF4y2Ba

溶剂和溶液gydF4y2Ba

所用溶剂均为hplc级，均购自英国Poole的Sigma-Aldrich公司，除水通过英国拉夫堡Fisher Scientific公司获得外。分离缓冲液由200 mM山梨糖醇(Fluka Biochemika, Buchs, Switzerland)、2 mM蔗糖(Sigma-Aldrich)、5 mM丁二酸(Sigma-Aldrich)、5 mM二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich)、1 mM乙二醇-双(2-氨基乙醚)-组成gydF4y2BaN, N, N ', N 'gydF4y2Ba-四乙酸(Sigma-Aldrich)， 0.5 mM NagydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba(Sigma-Aldrich)， 0.1 mM NagydF4y2Ba_4gydF4y2BaPgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_7gydF4y2Ba(Sigma-Aldrich)， 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich)和5 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(Sigma-Aldrich)在水中。沉淀溶液由10% (w/v)三氯乙酸(Fiedel-de Haen, Buchs, Switzerland)和0.07% (w/v) 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)在冷丙酮(Sigma-Aldrich)中组成，而冲洗溶液仅含有0.07% (w/v) 2-巯基乙醇在冷丙酮中。该增溶溶液由7 M尿素(Sigma-Aldrich)和2 M硫脲(Sigma-Aldrich)组成。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

分支机构gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba田间品种Artemis(种子来源:Mediplant, Switzerland)收获并汇集，收获后30分钟内取叶并在- 80°C冷冻。gydF4y2Ba

腺毛的分离gydF4y2Ba

取200 mL分离缓冲液，加入200 μL蛋白酶抑制剂(Calbiochem, Nottingham, UK)，置于500 mL Schott瓶中，静置1小时。这段时间之后，20克冷冻gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba将叶片与20g直径0.5 mm的玻璃珠(Thistle Scientific, Glasgow, Scotland)一起放入缓冲液中。摇瓶5分钟后，依次通过1 mm、250 μm、106 μm和45 μm分子筛(Endecotts, London, UK)。液体在氮气压力下通过106 μm和45 μm的筛子。将所有植物材料与新鲜的200毫升隔离缓冲液和新鲜的微球一起返回Schott瓶中，重复该过程两次。将所得滤液分离到50 ml的试管中，离心20 min (2500gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4℃)。处理上清，将微球转移到4个1.5 ml的微离心管中，再离心20分钟(2500gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4℃)。再次丢弃上清，留下组成富集腺毛样的颗粒，每个重约0.2 g。保留了初始1 mm筛保留的叶片材料，并将其作为腺毛状体耗尽的样品。gydF4y2Ba

环境扫描电子显微镜gydF4y2Ba

从1毫米钢筛中收集的植物材料在Quanta 600f仪器(FEI, Hillsboro, OR, USA)上进行收集、干燥和ESEM分析。为了比较，从富集的腺毛分离物中获得的物质也被干燥并用ESEM分析。gydF4y2Ba

蛋白质的提取gydF4y2Ba

每个富含腺毛状体的颗粒用微杵粉碎。2克冷冻全叶(gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba未经过毛状体分离程序的叶片和2g腺毛状体耗尽样品(如上所述制备)分别在液氮中快速冷冻，并用杵和臼研磨以获得细粉末。然后在富含毛滴虫的样品中加入1.5 mL的沉淀液，在全叶和无毛滴虫的样品中分别加入18 mL的沉淀液。所有的样品都经过彻底的涡流处理，然后在- 20°C下保存1小时。将富含毛滴虫的样品在10000下离心10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba(4℃)，全叶和去毛状体样品在4000℃离心10 mingydF4y2BaggydF4y2Ba(4°C)。丢弃所有样品的上清液，将富含腺毛颗粒的样品溶解在1.5 mL的漂洗液中，将全叶和无腺毛颗粒的样品溶解在18 mL的漂洗液中。所有样品在- 20°C下保存1小时，然后离心10分钟(富含毛滴虫的样品在10000下)gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4°C，全叶和毛状体样品在4000℃gydF4y2BaggydF4y2Ba(4℃)，然后丢弃上清液。对所有样品重复两次上述步骤，包括加入漂洗液、离心和丢弃上清，并保留每个步骤产生的微球。将浓缩毛滴虫颗粒真空干燥30 min，每个浓缩毛滴虫颗粒中加入200 μL的增溶溶液。然后将样品旋转离心10分钟(10000gydF4y2BaggydF4y2Ba25℃)，保留上清液。将去毛状体和全叶微球放置于台上1小时，待微球干燥后加入3ml增溶液，然后对样品进行涡旋离心10分钟(4000℃)gydF4y2BaggydF4y2Ba25℃)，保留上清液。gydF4y2Ba

每个样品中的蛋白质含量用布拉德福德法测定。gydF4y2Ba

蛋白质消化gydF4y2Ba

分别消化210 μL的富含毛滴虫物质、227 μL的缺失毛滴虫物质和139 μL的全叶蛋白质提取物，每种蛋白质含量约为150 μg。在每个提取物中加入适当体积的100毫米二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich)溶液，以获得10毫米二硫苏糖醇的最终浓度。然后将每个提取物在45°C下涡流保存45分钟。随后将提取物在室温下放置5分钟冷却，然后加入适当体积的90 mM碘乙酰胺(Sigma-Aldrich)溶液，以获得最终浓度为30 mM的碘乙酰胺。在每个提取物中加入50毫米碳酸氢铵(Sigma-Aldrich)溶液，以便将尿素浓度稀释到约2m。所有提取物都被涡流并在黑暗中再放置45分钟。使用pH值条检查每个提取物的pH值，以确认pH值保持在7.5-8的范围内。将序列级胰蛋白酶(Promega, Southampton, UK)原液(200 ng/μL)加入到每个提取物中，使蛋白与胰蛋白酶的比例为100:1，所有提取物都被涡流并在37°C下放置过夜。加入0.1%三氟乙酸(TFA) 10 μL，停止各提取物的消化;Sigma-Aldrich)。gydF4y2Ba

质/女士gydF4y2Ba

每个消化的样品用0.1% TFA稀释3倍。将每种样品的等分液1 μL注入UHPLC-MS/MS系统，该系统由Dionex 3000RSLC UHPLC系统(Thermo Scientific, Hemel Hempstead, UK)和LTQ Orbitrap XL质谱仪(Thermo Scientific)组成，如上所述[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。样品一式三份注射。gydF4y2Ba

UHPLC系统包括一个Acclaim PepMap100 C18 100 μm × 2 cm的陷阱柱(Dionex, Thermo Scientific)和一个75 μm × 25 cm的分析柱(Dionex, Thermo Scientific)，保存在40℃。以0.1%甲酸为溶液a, 80%乙腈/ 0.1%甲酸为溶液B，流速为0.3 μL/min，线性梯度洗脱，流动相为4% B (0 ~ 4 min)， 7% B (5 min)， 50% B (120 min)， 90% B (150 ~ 160 min)， 4% B (160 ~ 200 min)。gydF4y2Ba

对LTQ Orbitrap XL进行MS/MS分析，使用轨道rap的AGC(自动增益控制)目标值为500000 / 500 MS，离子阱的AGC目标值为10000 / 200 MS。在60000分辨率的orbitrap质谱分析仪上获得了MS谱(m/z 400-2000扫描)。每次MS扫描的5个电荷态≥2的最强离子按信号强度顺序被分离(最高强度优先，信号强度阈值为5000，隔离窗口为m/z 3)，并在线性离子阱中被碰撞诱导解离(CID)破碎，归一化碰撞能量为35%，激活q值为0.25，激活时间为30 MS。在100 - 2000 m/z范围内记录了碎片离子。动态排除使冗余测序最小化。在30秒内出现一次以上的MS峰被排除在60秒的碎片选择之外(排除列表限制为500个条目)。gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

所有MS/MS谱图均使用Mascot Distiller软件(Version 2.3.2;Matrix Science, London, UK)将每种样品类型(毛状菌富集、毛状菌枯竭和全叶样品)的每个技术重复的原始LC-MS/MS数据转换为Mascot通用文件(。mgf文件)。然后使用Mascot Daemon (Matrix Science)对序列数据库执行搜索，该数据库将来自每种样本类型的所有三个技术复制的数据库搜索结果结合起来。Mascot(服务器版本4.2)对UniprotKB数据库(于24日下载)进行了搜索。2012年4月;535,698个序列，190,107,059个残基)，NCBInr数据库(于2007年下载)。2012年6月)，纽约gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba(Artemis) contig，最近发布的trichome Trinity contig数据库和内部污染物数据库。在纽约gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba(Artemis)基因组数据库是作为约克大学转录组shotgun组装项目的一部分建立的[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，并从NCBI网站下载gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/39657gydF4y2Ba(2012年1月)，由来自Artemis品种的116,303个RNA序列组成。最近发表的trichome Trinity contig数据库来自Soetaert等人。[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。进行了污染物数据库搜索，以评估由于蛋白质(如角蛋白)和实验室中经常使用的普通蛋白质标准而导致的样品污染水平。使用以下参数进行搜索:肽质量公差，10 ppm;MS/MS公差，0.8 Da;肽电荷，+2 +3 +4;缺失的卵裂，2;固定修饰，氨基甲酰(C);可变改性，氧化(M);还有胰蛋白酶。v的分类gydF4y2BairidiplantaegydF4y2Ba搜索时指定的gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Bacontig和UniprotKB数据库。gydF4y2Ba

同时，利用融合后的数据库搜索结果与去除毛缕虫样本和全叶样本的合并结果进行比较，并将去除毛缕虫样本的emPAI值分别除以去除毛缕虫样本和全叶样本的emPAI值，计算出每个contig/protein的比例倍数差异。为此，Mascot搜索结果首先提交给内置的Percolator软件，通过应用0.05的“预期截止值”进行过滤，并使用Mascot内的Report Builder使用至少2个“显著序列”过滤器导出为。csv文件。gydF4y2Ba

对于每次比较，都创建了两个不同的列表:蛋白质/contigs在所有三个副本的两个样本中都存在，蛋白质/contigs只在一个样本的所有三个副本中存在，而在其他样本中都不存在。在第一个列表中，蛋白质/contigs根据其emPAI值的比例差进行排名，而在第二个列表中，它们根据其绝对emPAI值进行排名。gydF4y2Ba

中缺少注释gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba通过BLASTx搜索，e值临界值为0.01，将contigs翻译为已知的蛋白同源物。在此搜索中，非冗余蛋白序列被指定为数据库，青蒿作为生物体。这是针对上面详细介绍的Mascot数据库搜索结果比较中排名最高的配置执行的。利用Uniprot Protein KnowledgeBase对BLASTx搜索得到的蛋白质功能进行验证。根据UniProt数据库(gydF4y2Bahttp://www.uniprot.orggydF4y2Ba):离子结合、小分子结合、氧化还原酶/抗氧化活性、其他催化活性、水解酶活性、结构分子活性、电子载体活性、异构酶活性、转运蛋白活性、蛋白质/肽结合。上述类别是更具体的氧化石墨烯分子功能的总称，许多蛋白质参与了不止一种氧化石墨烯分子功能类别，这取决于它们的(多个)氧化石墨烯注释。gydF4y2Ba

MS蛋白质组学数据已作为Mascot .dat文件存入ProteomeXchange Consortium (gydF4y2Bahttp://proteomecentral.proteomexchange.orggydF4y2Ba）gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba欧洲生物信息学研究所的PRIDE(蛋白质组学鉴定数据库)伙伴库(gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/pride/gydF4y2Ba), PXD000703。gydF4y2Ba

支持本文结果的数据集可在欧洲生物信息学研究所的PRIDE(蛋白质组学鉴定数据库)合作存储库中获得，PXD000703 (gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/pride/gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

AACT:gydF4y2Ba

Acetoacetyl-CoA硫解酶gydF4y2Ba

行为:gydF4y2Ba

以青蒿素为基础的联合治疗gydF4y2Ba

广告:gydF4y2Ba

Amorpha-4, 11-diene合酶gydF4y2Ba

自动增益控制:gydF4y2Ba

自动增益控制gydF4y2Ba

ALDH1:gydF4y2Ba

醛脱氢酶IgydF4y2Ba

CID:gydF4y2Ba

Collision-induced离解gydF4y2Ba

CYP71AV1:gydF4y2Ba

Amorpha-4, 11-diene 12-hydroxylasegydF4y2Ba

DBR2:gydF4y2Ba

青蒿醛δ -11(13)还原酶gydF4y2Ba

emPAI:gydF4y2Ba

指数修饰的蛋白质丰度指数gydF4y2Ba

整体:gydF4y2Ba

环境扫描电子显微镜gydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

帧:gydF4y2Ba

法尼基焦磷酸合酶gydF4y2Ba

HMGR:gydF4y2Ba

β-还原酶gydF4y2Ba

邮政编码:gydF4y2Ba

（gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba) 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa合酶gydF4y2Ba

MVAK:gydF4y2Ba

甲羟戊酸激酶gydF4y2Ba

MVAPK:gydF4y2Ba

Mevalonate-5-phosphate激酶gydF4y2Ba

MPD:gydF4y2Ba

Mevalonate-5-pyrophosphate脱羧酶gydF4y2Ba

骄傲:gydF4y2Ba

蛋白质组学鉴定数据库gydF4y2Ba

组织:gydF4y2Ba

三氟乙酸gydF4y2Ba

人:gydF4y2Ba

世界卫生组织gydF4y2Ba

我们要感谢BBSRC的支持(授权BB/H001948/1)，雷丁大学化学分析中心的Orbitrap仪器，雷丁大学高级显微镜中心的ESEM分析，以及PRIDE团队的帮助，他们将蛋白质组学数据存储到proteomeXchange公共存储库。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 英国雷丁白骑士化学系，RG6 6ADgydF4y2Ba

   Laura Bryant, Brian Flatley, Chhaya Patole, Geoffrey D. Brown和Rainer CramergydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaRainer克莱默gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

RC构思并监督了该项目。LB、BF和CP分别进行试验。LB, BF, GDB和RC分析数据，并组装图表。CP将数据提交给proteomeXchange。LB、GDB和RC撰写并定稿。所有作者都对手稿的最终编辑做出了贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。gydF4y2Ba

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如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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