综合性荟萃分析，共同表达和miRNA嵌套网络分析识别柑橘中的基因候选者对黄龙疾病

背景

黄龙兵（HLB）是柑橘最毁灭性的疾病，与感染有关Candidatus.Libibacter asiaticus（CaLas）并由亚洲柑橘类氏植物（ACP）矢量。最近，已经使用转录组分析检查了柑橘-HLB相互作用的分子基础，这些分析鉴定了许多探针组和调节的途径CaLas感染在不同的柑橘品种中。然而，报道的发现中缺乏一致性表明需要一种综合方法。本研究旨在使用Meta分析和基因共表达网络建模鉴定柑橘-HLB相互作用中的候选探针组。

结果

使用LiMMA和QuidRa-Analysis的RankProd方法研究了包括18个易感性的柑橘-HLB相互作用的二十二个公开可用的转录组研究，包括18个易感性数据集和四种抗性（R）数据集。使用Teradata In-House结构化查询语言（SQL）脚本生成7,412个差异表达探测集的组合列表。我们鉴定了来自S和R数据集的不同组织中的65个最常见的探针组在HLB疾病中调节。这些探针的基因本体分析表明碳水化合物代谢，营养转运和生物应激是在柑橘中调节的核心途径CaLas感染与HLB发育。我们还鉴定了r特异性探针集，该探针集编码富亮氨酸重复蛋白、几丁质酶、构成性疾病抗性(CDR)、奇迹素和凝集素。对3499个探针集进行加权基因共表达网络分析(WGCNA)，鉴定出21个具有主要hub探针集的模块。进一步，我们创建了一个miRNA嵌套网络来检测3499个靶探针集的基因调控。结果表明，csi-miR167和csi-miR396可以分别影响离子转运体和防御反应通路。

结论

大多数潜在的候选轮毂探针集与赤霉素途径(GA)相关探针集共表达，这意味着GA信号在HLB抗性中起作用。我们的发现有助于整合现有的柑橘- hlb转录组数据，这将有助于阐明柑橘- hlb相互作用的整体图景。该分析中确定的柑橘探针集表明了一套强健的hlb响应候选基因，可用于进一步验证。

柑橘是世界上最受欢迎的水果作物之一，提供能量(碳水化合物)和营养，是世界上许多地方日常饮食的重要组成部分[35.］．新鲜的柑橘也是膳食纤维和维生素B和C.柑橘类水果和水果产品的良好来源来自营养和经济的观点的全球重要性[56.］．然而，对柑橘生产存在各种生物和非生物挑战，其中黄龙（HLB）或柑橘绿化疾病，是最毁灭的[5，25.，61.］．HLB在19世纪初期在中国报道，现已在许多柑橘生产地区建立，包括印度，中国，美国，印度尼西亚，菲律宾，阿拉伯半岛，巴西和非洲[24.，25.］．巴西和美国生产了世界上90％以上的橙汁供应，HLB是对美国和巴西柑橘行业的当前威胁。HLB首先在2005年在佛罗里达州发现了世界第二大橙色产区。从那时起，HLB达到了佛罗里达州的流行病比例，2005年至2011年之间造成了超过40亿美元的经济损失[27.］．HLB攻击所有重要的商业柑橘，包括橘子，葡萄柚和橘子[5，20.］．甜橙和橘子被认为是高度敏感，酸橙和葡萄柚是中度敏感。似乎有些柠檬对HLB有抗性，有些三叶橙(柑橘的近亲)对HLB病有抗性[20.］．

HLB是由革兰氏阴性和韧皮植物限制的无碱杆菌造成的细菌疾病，其被亚洲柑橘类柑橘类氏植物（Diaphorina Citri.Kuwayama) [21.，30.］．D. Citri.饲料新叶生长，渲染扭曲和卷曲的叶子[36.］．该疾病也可以通过患有患病的蒲蛋草的嫁接传播到健康树木[36.]. 在已知的三种导致HLB疾病的自由人中，Candidatus.Libibacter asiaticus（Ca拉斯)是最普遍的。其他两个物种受地理限制更大;加利福尼亚州。L. Africanus主要在非洲出现[30.),而加利福尼亚州。L. Americanus仅在巴西和中国发现[54.］．这种细菌寄居在韧皮部组织中，导致韧皮部坍塌，从而导致生产力下降。HLB病会导致树木迅速凋落，叶子呈斑点斑纹，果实小而畸形，颜色不规则，果实苦涩，种子夭折[11.，23.］．目前，除了使用HLB的斗牛犬进行植物繁殖外，没有有效的控制方法，除了使用HLB的牛油，除去感染的树木以最小化接种物，以及昆虫载体控制[5］．完全基因组测序CaLas (1.23 Mb)使得与HLB症状相关的毒力因子的基因组鉴定成为可能[15.］．然而，CaLas尚未培养，对柑橘与HLB相互作用的分子基础缺乏全面的了解[17.］．由于缺乏针对HLB的任何已知的抗性（R）基因，并且由于柑橘宿主的复杂生物学，因此难以通过常规育种产生HLB耐受柑橘品种。然而，通过转录组和蛋白质组分析检查柑橘基因组学，可以阐明差异表达的基因/蛋白质作为研究柑橘-HLB相互作用的潜在候选者。

到目前为止，已经发表了一些关于柑橘- hlb相互作用的转录组学研究[1- - - - - -3.，18.，19.，31.，34.，39.- - - - - -41.］．这些研究表明，碳水化合物代谢、营养物质运输、细胞壁合成和防御和激素反应途径的基因表达被重编程CaLas感染与HLB疾病发展。这些研究还表明，碳水化合物源库通路中断和韧皮部堵塞可能是HLB症状的主要原因[34.，39.，40］．已经在这些研究中鉴定了许多差异表达的探针组，但是在差异表达基因探针组方面只有有限的重叠水平，可能是因为技术，组织或基因型特异性效果。此外，一些研究仅关注全症状的植物，而其他研究则在HLB发育期间遵循时间的事件。该收集转录组研究的集体询问应该提供比分析个人研究的分析可以获得更好的理解。然而，关于数据可比性，标准化和分析工具的META分析存在重大挑战。微阵列的META分析已广泛用于动物系统中以定义鲁棒，调节探针组[42.，45.］．最近，也用于识别植物中的差异表达探针组的荟萃分析[4，9，50.，55.］．最近的研究介绍了柑橘中HLB响应探针组的META分析，但是该研究使用了少量的数据集（六），并且仅包括一个R基因型（US-897）进行比较[69.］．为了填补这种差距，我们使用较大的数据集（22个研究）进行了全面的META分析，该数据集（22个研究）包括组织特异性，易感和抗性特异性HLB响应探针组，并且我们进一步使用共同表达分析了这些探针组和miRNA嵌套网络方法。

我们的目标是使用可用的转录组数据详细研究柑橘-HLB相互作用，并识别由其调节的柑橘中的鲁棒探针组CaLas感染与HLB发育。为此，我们使用Limma和RankProd方法分析了Affymetrix基因芯片柑橘基因组阵列中46个公开的柑橘hlb转录组微阵列数据集。我们鉴定了统计学上最重要的组织特异性探针集和通路，并利用MapMan和AgriGO进一步分析了这些探针集和通路，以丰富基因本体(GO)术语。此外，我们还确定了提供柑橘核心途径信息的常见探针集，以及为柑橘抗病反应提供线索的抗性特异性探针集Ca拉斯维加斯的感染。使用WGCNA共表达网络分析检查用肢体和rankProd鉴定的常见探针组之间的相关性。我们识别出显示最大数量的互连的潜在集线器探测器，并对柑橘-HLB相互作用贡献。我们还表征了miRNA介导的嵌套网络，以响应于Ca拉斯维加斯的感染。这些发现提供了潜在的候选探针组，可用于将柑橘-HLB的相互作用进行了详细描述。

hlb应答转录组数据的荟萃分析

我们使用了22个数据集，包括来自易感柑橘植物的18个数据集（S datasets，每个数据集，每个用于根和茎组织，八个用于叶组织，八个用于果实），来自HLB抗性柑橘植物（R数据集）的叶组织中有四种桌子1)．我们检索了用于上述数据集的基因表达式（Geo）Cel文件，该数据集包括46阵列样本，并使用R程序中的辅助包进行鲁棒的多芯片分析（RMA）归一成。使用两种统计方法，利姆马和ranchProd，在生物导体封装中识别差异表达的探针组。在利马方法中，基于受体化的探针组t统计的，P< 0.05，误发现率(FDR) < 0.1。我们没有使用FDR < 0.05，因为我们可能会错过一些数据集中的许多差异表达的探针集(特别是根的探针集)。RankProd方法在更严格的条件下(FDR < 0.01)用于检测具有更高统计学意义的探针集。因此，与Limma相比，RankProd识别的探针集更少。使用Limma方法可以识别更多的探针组，这也是因为我们添加了Fan等人的常用探针组[19.]和水果数据[34.，40使用内部的Teradata SQL脚本。我们使用Limma识别了7,412个探测集，使用RankProd识别了4,221个探测集(其他文件1)．上述研究报告总共7,326个差异表达探针组。其中，6,634次常见于利马结果，3,184族在RankProd结果中常见（图。1）;3,499组探针在Limma和RankProd中均有差异表达。

差异表达探针集的基因富集及通路分析

使用Mapman和Agrigo进行差异表达探针组的基因浓缩和途径分析（附加文件2)．Mapman本体专为植物设计了[59.]，其中探针集根据注释被分配到大量非冗余和分层组织的容器中。在用Limma鉴定的7412个探针组中，MapMan将5003个探针组映射到34个不同的箱子，2083个探针组归入“未分配”类别，其余2920个探针组映射到不同的代谢途径。信号(P<7.2E-7，细胞壁（P< 4.9 e⁻⁴)和碳水化合物代谢(P< 0.002)是最重要的MapMan类别之一。在用RankProd识别的4221个探针集中，有1703个“没有被分配”，其余的2518个被映射到不同的路径。RankProd分析表明，柑橘HLB病对碳水化合物代谢的调节最为显著。

AgriGO是专为农业物种GO分析而设计的网络工具[14.］．GO差异表达探针组的术语来自LIMMA和RANKPROD的术语分配给生物过程，分子函数或细胞组分。在生物过程中，“对刺激措施的反应”（Limma，FDR = 9.4E^-05；RankProd, FDR = 0.0013)是最显著的类。在分子功能和细胞组分术语中，“催化活性”(Limma, FDR = 0.00023;RankProd, FDR = 1.2e^-05）和“细胞外区域”（蕾丝，FDR = 8.7e^-08；rankprod，fdr = 9.8e^-08)是最重要的阶层。差异表达探针集的GO分析，采用超几何统计学与Yekutieli FDR多重检验调整(FDR < 0.01)，显示碳水化合物代谢、次级代谢、刺激反应、细胞壁代谢、营养转运、应激反应是柑橘最重要的代谢途径之一- - - - - -HLB互动。

为了研究这六种代谢途径（碳水化合物代谢，细胞壁代谢，激素代谢，信号传导，二次代谢和运输）的分布，我们在Pageman中使用了Wilcoxon测试[58.]. 结果分为一个S数据集（根和茎各一个，叶8个）、一个R数据集（抗性叶）和一个水果数据集（附加文件）3.:图S1，附加文件4:图S2附加文件5：图S3，附加文件6:图S4，附加文件7：图S5，附加文件8:图S6)。结果表明，果实前期碳水化合物代谢水平普遍呈下降趋势CaLAS感染在R和S数据集中。与淀粉劣化有关的探测器在水果数据集中上调，但在R数据集中下调。然而，淀粉合成相关探针组在抗性柑橘品种US-897和S数据集中上调，但在水果数据集中下调（附加文件3.:图S1)。共诱导细胞壁相关探针125组。大多数细胞壁相关探针在感染后17周被诱导CaLAS并在R DataSet中上调，在S DataSet中下调。与细胞壁合成相关的探针组，例如α-扩展蛋白3和果蝇酶在耐受柑橘品种粗糙柠檬（R1）中诱导，但在抗抵抗US-897中，细胞壁改性相关探针组上调（附加文件4：图S2）。在激素代谢中，芸苔类固醇和GA通路相关探针组在R数据集中上调。在S DataSet中用乙烯信号探针上调很少有水杨酸（SA） - 响应探针组（附加文件5:图S3)。在信号传递方面，除rl27 wai外，R数据集中所有探针均上调，编码为糖和营养信号传递、亮氨酸受体或壁相关激酶受体。钙信号相关探针集在S中下调，但在R数据集中没有下调(附加文件6：图S4）。我们找到了与运输有关的217座探针组。其中，仅在RL 17 Wai中进行了六种探针组，并且在S数据集中被下调。ABC运输算器编码探测集仅在S数据集中上调（附加文件7:图S5)。在防御和应激途径中，12个数据集诱导了19个PR蛋白或几丁质酶的探针集，并在R数据集(US-897和RL 17 wai)中表达上调。此外，还诱导了17个编码奇迹蛋白(Kunitz丝氨酸和胰蛋白酶抑制剂家族成员)的探针集。在rl17 wai中有5个奇迹蛋白编码探针上调，在rl27 wai中有6个下调8:图S6)。

柑橘-HLB相互作用中的组织特异性基因表达

内部Teradata SQL脚本用于提取与所识别的7,412探针集对应的水果数据。根据组织特异性（根，茎，叶或果实数据集）进一步分类差异表达探针组（图。2，附加文件9)．根数据集包括92探针集（折叠变化> = 2或<= -2），其中45对于其他数据集是常见的，并且其余的47探针组特定于根数据。这些47个探针组中只有17种在柑橘中注释或拟南芥基因组数据库，它们编码Cu / Zn超氧化酶歧化酶，Ent-kaurenoic氧化酶，MyB转录因子（两个探针组）和多肢乳糖酶。阀杆数据集显示了672探头组的显着表达式，其中542探针组在其他数据集中是常见的，并且130探针组特定于阀杆数据集。这些探头集主要针对运输车（n = 9), protein signalling (n = 8), and the cell wall (n= 6)。编码蛋白质转运体的所有与转运相关的探针集(n = 6), peptide and oligopeptide transporters, and ABC transporters were up-regulated in HLB-diseased citrus. Cell wall-related probe sets coding for xyloglucan endotransglycosylase and expansin were down-regulated in the stem dataset. Among signalling-related probe sets, those involved in calcium signalling were down-regulated, but those related to sugar and nutrient physiology were up-regulated in stems. Most of the transcriptome studies for citrus–HLB interactions were performed using leaf tissues, and we retrieved 12 leaf datasets. A total of 7,182 probe sets showed differential expression in at least one leaf dataset, and 5,327 probe sets were unique to leaf datasets, showing no expression changes in other tissues. These 5,327 probe sets were further grouped into four R and eight S datasets; 318 probe sets were specific to the R datasets, 4,003 were specific to the S datasets, and 1,006 were common to both datasets. There were 288 probe sets present in at least one of the four R datasets, and 30 were present in more than two R datasets. From 4,003 probe sets in S datasets, 3,923 were from at least one dataset, and 80 were present in more than four datasets. For the eight fruit datasets, 1,345 probe sets showed significant fold changes in at least one dataset. Because we used fruit datasets only for comparison with our meta-analysis, no probe sets were specific to these datasets.

从荟萃分析方法中保守顶部常见探针组的表达

在RankProd中使用Topgene功能，我们识别前100个常见探头组（50个上调和50个下调）。我们在利用LimMA结果中搜索了这100个探测器集的状态，并仅考虑至少在四个数据集中显示差异表达的结果。因此，鉴定并分析了来自两种方法的65套。因为这些65探针组在大多数数据集中表示，是否以组织特异性或响应特异性的方式，这些探针组应表示柑橘-HLB相互作用中的核心途径。我们使用带有平均联动的Karl Pearson相关性的22个数据集执行了这些公共探测器集的层次结构。16.］．聚类揭示了数据集之间的关联，以表达常见的探针集。使用0.9的距离阈值，我们计算了差异表达的探测集和数据集之间的组/节点，从主要的层次集群中发现了5个探测集的垂直集群和4个数据集的水平集群。3.，附加文件10.)．群集我组成了21套探针组;其中11个是未知的功能，其他主要编码orcinol-O甲基转移酶(Cit.12172.1。韧皮部蛋白2(PP2)-B15 (citl .35955.1.S1_at)， NAC结构域含蛋白(citl .12214.1. s1_s_at)，葡萄糖-6-磷酸/磷酸转位器2(GPT2) (citl .9625.1。S1_s_at和Cit.22602.1.S1_at)。在21组探针中，只有4组在果实中诱导，且4个探针均表现出下调。除orcinol-外，其余探针在R和S叶片中均表达上调O- 甲基转移酶和PP2-B15，其未在任何R数据集中诱导。Cluster II由26个探头集组成，该组编码为Zn Transporter 5（Cit.11459.1.S1_S_AT，CIT.11460.1.S1_AT和CIT.28305.1.S1_AT），GASA1（CIT.10032.1.S1_X__AT），ADP-葡萄糖酸化酶大亚基（APL3）（CIT.13437.1.S1_S_AT），淀粉合成酶（CIT.9504.1.S1_S_AT），ATWRKY40（CIT.10816.1.S1_AT），CDR（CIT.28117.1.S1_S_AT），CU / Zn超氧化物歧化酶（CIT.28102.1.S1_S_AT），和2-氟（II）氧酶家庭蛋白（CIT.15355.1.S1_AT）。簇III由六件探针组成：β-淀粉酶（CIT.39675.1.S1_AT和CIT.36677.1.S1_AT），Nodulin（CIT.4972.1.S1_S_AT），熟化相关的蛋白质（CIT.18669.1.S1_AT）和膜蛋白 -编码探测集（CIT.16855.1.S1_AT）。簇IV由两种探针组成，其编码用于Chalcone合酶（Cit.13366.1.S1_AT）和氨基酸输送（CIT.18023.1.S1_AT）。群体V由10个探针组组成，主要编码ABC Transporter（Cit.6534.1.S1_AT），过氧化物酶（CIT.6534.1.S1_AT）和9-CIS-EPOXYCAROTENOID DIOxygen酶2（CIT.17235.1.S1_S_AT）。在群集V中，所有探测集都在S数据集中下调，但是在一个R数据集（RL 17 WAI）中上调了四个。

22个数据集（表1)分为四个簇和四个单节点。葡萄5号、葡萄27号、瓦伦西亚根和RL 27号不是任何簇的一部分，仍然是单个节点；US-897和瓦伦西亚13–17 wai聚集在一起。除Martinelli等人的成熟和未成熟水果数据集外，所有水果数据都聚集在一起[40]，与RL 5 Wai，RL 17 Wai和Stew DataSet聚集。剩下的数据集被聚集在一起。RL 5 Wai和RL 17 Wai显示出与茎数据集类似的基因反应，但普通探针组的US-897响应与瓦伦西亚13-17瓦相似。

不同表达的探针集特定于R数据集

在四个R数据集中的至少两个中识别了30个差异表达的探针组（图。2)．在距离阈值为0.9时，使用Pearson相关的层次聚类分析显示，30个探针集(7、10和13个探针集)有三个垂直聚类，两个R数据集(US-897和RL 17 wai)有一个水平聚类。另外两个R数据集(rl5 wai和rl27 wai)以单节点的形式出现(图1)。4A，附加文件11.)．包含簇I编码GA响应蛋白（CIT.18244.1.S1_AT），富含亮氨酸的重复（LRR）VIII-2（CIT.5979.1.S1_AT），萜烯合酶（CIT.38319.1.S1_S_AT），AQUAPORIN（CIT.8763.1.S1_S_AT），凝集素相关的蛋白质前体（CIT.35004.1.S1_S_AT和CIT.8609.1.S1_X_AT），并陷阱11（CIT.37265.1.S1_AT）。在RL 17 Wai中，这七件概率上调，并在RL 27 Wai中调节。然而，凝集素相关的蛋白质编码探针组在US-897和RL 17 Wai中有上调。在簇II中，在RL 5 Wai和R17 Wai编码肉桂酰-CoA还原酶（Cit.1800.1.S1_AT和CIT.28372.1.S1_AT）中，八个探针组中的8种探测器中的8种下调₂H₂Zn家族蛋白质（CIT.6562.1.S1_AT），DNAJ热休克家族蛋白（CIT.2424.1.S1_S_AT），推定ABC转运蛋白（CIT.23189.1.S1_AT）和未知功能蛋白（CIT.14457.1.S1_AT，CIT.17300.1.s1_s_at，和cit.28939.1.s1_at）。从氧化还原酶2的簇II中占据了氧化还原酶2- Fe（ii）氧酶的氧酶（II）氧酶的氧酶（Cit.940.1.S1_S_AT）中的一个探针在US-897和RL 17 Wai中调节。来自群体III的四个探针组，其编码了5-AMP活化的蛋白激酶β-1亚基相关（CIT.24484.1.S1_AT和CIT.14610.1.S1_S_AT），脱落应力成熟蛋白（CIT.8661.1.S1_X_AT），和未知的蛋白质（CIT.21210.1.S1_S_AT）在RL 5 WAI和RL 27 Wai上调。四种探针组，用于B盒Zn家族蛋白（Cit.18262.1.S1_AT），Jumonji转录因子（CIT.7734.1.S1_AT），Mutt结构域蛋白质（Cit.23890.1.S1_AT）和未知蛋白质（CIT。7734.1.S1_AT）在RL 5 Wai和RL 17 Wai上调。从剩余的探针组III，在所有三个时间点的粗柠檬中编制了一个未知蛋白质（Cit.23443.1.S1_AT）的两种，以及编码NADH脱氢酶亚基4的一个（CIT.29311.S1_AT）在US-897和RL 17 Wai中受到了下调。US-897和RL 17 Wai的群集建议两者都有类似的表达变化CaLAS感染这30个R特异性探针组。然而，RL 5 WAI和RL 27 WAI显示了R特异性探针组的明显调控模式。

我们进一步分析了这些30探针组的相关网络（图。4B.，附加文件11.)．相关网络是一组探针组，其表达配置文件高度预测彼此。每对探针组涉及大于最小阈值（0.97）并且小于最大阈值（1.0）的相关系数相关的相关系数相关。7］．相关性网络分析导致六个紧密相关的子网，其显示了一个探针的正面或负效应，所述探针分别在所述对的另一个成员的表达上设置（红色和蓝线，图。4B.)．子网1由七组探针组组成，该探针组在编码未知蛋白质（三个探针组），肉桂酰CoA还原酶（两个探针组），热休克蛋白和C中₂H₂Zn手指蛋白。除了未知的蛋白质CIT.14457.1.S1_AT，它对其他六个探针组的表达产生负调节，这些探针集肯定地调节了彼此的表达。子网2由五个探针组组成（LRR-VIII-2，SNARE11、萜烯合酶、水通道蛋白和脱落胁迫成熟编码蛋白)。LRR-VIII-2正向调控细胞血管运输网罗11．但这两种探针集均受到脱落胁迫成熟编码蛋白的负调控。亚网络3由4个探针组组成，其中2个探针组编码未知蛋白，一个探针组编码mutT结构域蛋白样和肌醇-1-磷酸合酶。亚网络4包括编码5- amp激活蛋白激酶β -1亚基相关的三个探针集(两个探针集)和一个未知蛋白。亚网络5包含两个探针集，分别检测二酰基甘油激酶和一个未知蛋白，亚网络6包含凝集素相关蛋白的两个探针集。

基因共表达网络分析

使用WGCNA包[33.[我们构建了由Limma和RankProd识别的3,499探针组的加权共表达网络。该网络有助于阐明紧密共同表达的模块，并识别各个模块中的集线器探针集[33.，46.］．我们的网络施工产生了2,071个节点和134,217个边缘，具有0.85的Pearson相关系数和无垢拓扑基质。全球网络进一步使用基于拓扑重叠的平均分层聚类和分解阈值的27个共表达模块。（图。5)．我们计算模块特征基因(module eigengene, ME)，它是每个模块的第一个主成分，我们合并高度相关的MEs，得到21个模块。在合并之前和之后显示基因模块的树状图在附加文件中说明12.:图S7。生成了一个热图来可视化模块中共同表达的探测集对之间的拓扑重叠值(附加文件13.：图S8）。功能分析显示，21个模块中的六种具有探针组，具有来自途径的过度成因的生物学功能，例如碳水化合物代谢，应力，细胞壁，信号传导和次生代谢。这六个模块一起包含2,043个探针集（附加文件13.：图S8：蓝色= 715，红色= 439，黑色= 315，黄色= 245，magenta = 165和purple = 164），其中包括用于共同表达网络建设的所有探头组的58％。

HLB响应模块的功能性浓缩分析及集线器探头识别

为了了解共表达模块的生物学相关性，我们使用AgriGO工具和MapMan进行了GO和通路分析。从每个模块(附加文件14.)．在这里，我们详细描述了“蓝色”模块，因为它包含了最大数量的节点（探测器）和连接。Agrigo的功能注释显示碳水化合物代谢过程（GO：0005975，P = 1.7e^-10），对内源性刺激的反应（GO：0009719，P= 0.002)，水解酶活性(GO: 0016787，Pe = 6.9^-06）和细胞壁（Go：0005618，Pe = 9.3^-08)是“蓝色”模块中最重要的GO术语。通过MapMan分析，将节点划分为不同的代谢途径，包括细胞壁(51个节点)、RNA和转录因子(46个节点)、信号传导(45个节点)、次级代谢(42个节点)、激素代谢(33个节点)、运输(19个节点)(图)。6)．接下来，基于K的每个类别中识别顶部集线器探针组_之内，和K._提取>50和节点度>500从21个模块。中枢探针设置在次级代谢途径编码的生物碱，转移酶和O- 甲基转移酶。用于LRR-XI编码的信令路径中的顶部探头集。关于激素信号传导，集线器探针组编码的GA诱导的蛋白质，BHLH和胃蛋白酶是转录因子组的轮毂探针组。途径细节，k_之内，和K._提取对于其他模块，提供了附加文件14.．

我们还分析了共表达网络，以识别前65个常见和30个R特定探针组中的集线器探针集。所有Top 65常见探头组在网络中的不同模块之间连接。例如，脂氧合酶和探针组O-甲基转移酶在' black '模块中共表达;编码葡萄糖转运体(GPT2)的探针集与WRKY40在“灰色”模块中;验素蛋白（PP2-B8）的探针组和编码Zn转运蛋白（ZIP5）的三个探针组在“Paleturquoise”模块中共同表达。Cu / Zn超氧化物歧化酶，WBC11，Miraculin蛋白和CDR的探针组在“午夜”模块中（附加文件）共同表达14.)．有趣的是，“午夜”模块还含有六种探针组，其编码米科林蛋白和其他编码抗病蛋白，如NBS-LRR，几丁质酶和LRR跨膜蛋白激酶。与前65个常见探针组相比，仅30R特定探针组中的11个仅在网络中的模块中共同表达。凝集素蛋白激酶（两个探针组）和萜烯合酶编码探针组在“蓝色”模块中是共同的表达。编码核苷酸结合，Zn手指蛋白和NADH脱氢酶亚基编码的三种探针组在“温室”模块中是共同的。剩下的五个特定探针集在不同的模块之间分布（附加文件14.)．

MicroRNA-Probe集嵌套网络

最近，赵等人[68.在接种（WPI）后10和14周后，在10和14周后鉴定了敏感柑橘品种中的HLB响应MiRNACa拉斯维加斯。我们分析了这些经过功能性验证的mirna，并在3499个常见探针组中找到了它们的目标。有趣的是，10个miRNA类被识别为针对24个探测集(附加文件15.)．我们在共表达网络中搜索这24个目标探针集，并将它们作为种子节点与一级邻近节点连接，创建一个嵌套网络。因此，我们鉴定了五个miRNA类(csi-miR396、csi-miR166、csi-miR156、csi-miR167和csi-miR172)的嵌套网络(图1)。7)．

si- mir396的巢状网络针对四种探针集:胞质抗坏血酸过氧化物酶(Cit.8235.1.S1_at)、类papine半胱氨酸蛋白酶(Cit.26437.1.S1_s_at)、核基质组成蛋白(Cit.16271.1.S1_at)和半胱氨酸蛋白酶(Cit.18551.1.S1_at)。其中，半胱氨酸蛋白酶与编码LRR跨膜蛋白激酶(Cit13717.1.S1_at)和纤维素合成酶(cit3390.1 . s1_at)的两个大型hub探针集相连接，这些探针集与36个与应激和次级代谢相关的探针集相连接，聚类系数为0.6。si- mir396的表达在10和14 wpi时间点均降低Calas感染[68.];因此，应上调其目标探针组。除了细胞溶质抗坏血酸过氧化物酶外，其他靶探针组（n= 3)在至少一个S数据集(附加文件15.)．

CSI-MiR166的嵌套网络有针对性的五个探针组编码，用于未知蛋白质（CIT.12380.1.S1_AT），HD-ZIPIII蛋白（CIT.7481.1.S1_AT），精氨基合酶（CIT.14666.1.S1_AT），HD-ZIP蛋白（CIT.15346.1.S1_S_AT）和Homodomain-亮氨酸拉链蛋白（CIT.11989.1.S1_AT）。其中，前三个靶标与菌株，次生新代谢和激素相关的集线器，其在聚类系数为0.65。通过四个集线探针组（Cit.3648.2.S1_AT），RHM1 / UDP-Glucose-4,6-脱水酶（Cit.39620.1.S1_S_AT），Ferridoxin（CIT.6529.1.S1_AT）所示的最强连接。GA-COMUPLED蛋白（CIT.30950.1.S1_AT）。CSI-miR166的表达在14 WPI下调节[68.］．所有5个目标探针集在至少2个S数据集中表达下调，而未知蛋白(citl .12380.1. s1_at)在R数据集中表达上调(RL17 wai)。

CSI-MIR156的嵌套网络靶向两个探针组，未知蛋白质（Cit.14355.1.S1_AT）和Squamosa启动子结合蛋白（Cit.15466.1.S1_AT），其通过三个集线器探头组连接到发育途径。这些集线器探针组编码了含NAC域的蛋白质（CIT.26317.1.S1_AT），未知蛋白质（CIT.6138.1.S1_AT）和G蛋白信号传导（CIT.13023.1.S1_AT）。CSI-MIR156的表达在14 WPI上上调，我们的数据表明，在S数据集中，连接的目标探针组都被下调。

CSI-MiR167的嵌套网络有针对性的两种探针组：未知蛋白质（CIT.22035.1.S1_A_AT）和钾转运蛋白（CIT.22029.1.S1_AT）。未知蛋白质与氧化还原酶和2氧化氢酶氧酶蛋白质连接。编码探针组的钾转运蛋白转运蛋白是用许多传输相关的探针组，例如硫酸盐，磷酸盐（P），金属，肽，代谢物和ABC转运蛋白。CSI-miR167的表达在10wpi下调，并在14wpi溶解的柑橘中调节上调[68.］．我们的数据表明，在S数据集中，一个未知的蛋白质编码探针组被上调，而钾转运探针组被下调。

si- mir172的嵌套网络针对三个探针集:MYB转录因子(Cit.13801.1.S1_at)、gdsl基元脂肪酶(Cit.30073.1.S1_at)和一个未知蛋白(Cit.19822.1.S1_s_at)。MYB转录因子与三个编码糖异生的hub探针集(citr .18718.1. s1_s_at)、Rubisco (citr .20550.1. s1_at)和衰老相关蛋白(citr .17917.1. s1_at)连接，聚类系数为0.77。gdsl基序脂肪酶与编码丝氨酸型内肽酶和细胞壁果胶酯酶家族蛋白的两个hub探针集相连。柑橘两个时间点(10和14 wpi)均报道了csi-miR172的下调[68.］．在靶探针组中，MYB转录因子和未知蛋白在两个S数据集中显示上调，GDSL-MOTIF脂肪酶在一个数据集中显示下调。

开发抗HLB或耐HLB的柑橘品种将是管理HLB最有效、经济和生态友好的方法。到目前为止，没有针对HLB疾病的R基因的报道，并确定了功能解剖的最佳候选基因Ca柑橘行业的反应仍然是一个艰巨的挑战。已经进行了几项转录组研究，以确定潜在的抗HLB候选柑橘，并已产生超过8000个差异表达基因/探针集(DEGs)。然而，关于已鉴定的两种deg之间的相互作用的信息是缺乏的。我们对公开获得的柑橘转录组数据进行了全面的meta分析和网络共表达分析，鉴定出65个常见和30个耐药特异性hlb应答候选探针集。我们的研究旨在确定确定宿主反应和操纵目标的特定特征CaLas感染与HLB发育。在本研究之前，仅进行柑橘-HLB相互作用的一个荟萃分析[69.]，其中包括四个数据集。作者评估了早期和晚期hlb应答探针集，提示激素和防御途径在柑橘- hlb相互作用中发挥重要作用。在这里，我们使用22个数据集、一个miRNA网络和一个共表达网络进行了更全面的分析，以扩大我们对柑橘- hlb相互作用的理解。

我们使用了两种统计方法(Limma和RankProd)来识别该meta分析中的探针集，我们将研究限制在Affymetrix基因芯片上进行的实验，以减少转录组测量中潜在的技术偏差。鉴定出的差异表达探针组进行基因富集分析。我们的结果表明，碳水化合物代谢、韧皮部堵塞、运输、细胞壁、激素、防御和应激相关途径是受调控的最重要的探针组类型Ca柑橘中的感染。我们还发现，在柑橘根数据集中调节很少的探针组，并且那些不是来自任何特定途径的探针。此外，阀杆数据集中的传输相关探针组在茎数据集中具有丰富的探针，包括来自许多代谢途径的探针组。R DataSets用于叶子主要由细胞壁相关的探针组，胃肠杆菌素信号传导和水素转运蛋白组成;叶子的S数据集是通过对乙烯信号传导和ABC转运蛋白的CA信号和上调的缩小调节。我们还发现，大多数HLB响应探针组在中间阶段（17 WAI）而不是在感染的早期（5WAI）或晚期（27WAI）阶段。水果和叶数据集的特征是基因调控的相反方向;在叶数据集中上调的大多数探测器在水果数据集中下调，反之亦然。这些结果表明柑橘植物的不同组织以明显的方式响应CaLas侵染和柑橘进一步的感病和抗性反应增加了相互作用的复杂性。为了进一步探索这一点，我们确定了在最大数量的数据集中存在的65个最常见的探针集，它们各自的折叠值有更高水平的表达变化。65个最常见的探针组表明三个核心通路被Ca拉斯维加斯的感染。这些途径编码为碳水化合物代谢，转运蛋白和激素和应力相关的探针组，并且在22个柑橘数据集中的至少10个中占有丰富。65探头集的分层聚类显示，六个水果数据集和五秒的数据集分别聚集，表明在不同组织之间的这些核心途径的紧张调节。因为茎数据集与两个R数据集聚集，我们推测易感柑橘的干部组织可以比其叶组织更好地承受Ca拉斯维加斯的感染。此外，US-897与瓦伦西亚（13和17 Wai）聚集，表明17瓦可能是易感和抗性柑橘之间基因表达分歧的关键时间点。我们通过WGCNA共同表达和MiRNA嵌套网络在普通探针组中揭开了联系。这些探针集之间的集成连接尚未在早期的报告中表征，因此我们的研究表明了柑橘-HLB相互作用的新颖候选者。

碳水化合物新陈代谢

碳水化合物代谢是柑橘-HLB相互作用的关键途径。HLB患者柑橘树的特征在于叶片中过量淀粉和蔗糖的积累，这破坏了源（叶子）和水槽（水果）组织之间的淀粉 - 蔗糖途径。有几个报告表明，编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGP酶）大亚基，淀粉合成中的速率限制酶的基因被上调，β-淀粉酶，淀粉降解中的速率限制性酶被下调在HLB患病柑橘植物中[1，3.，31.］．编码葡萄糖-6-磷酸/磷酸盐偶偶联器（GPT）的另一个基因介导葡萄糖-6-磷酸酯，在塑体中的淀粉合成的必需基材。GPT，如AgPase，与HLB影响植物中的特征淀粉积累相关[31.］．在这项研究中，这三个基因在65个最常见的探针集合中。共表达分析显示，淀粉合酶和AGPase探针集与“梅花1”模块中编码NAC结构域蛋白的hub探针集紧密相连(附加文件14.)．NAC域转录因子(TF)与植物发育有关，并被认为是调节次生壁合成的转录开关[70］．NAC TFS的过度表达拟南芥叶子导致次壁生物合成基因的激活，导致细胞中的次壁的广泛沉积[70］．我们的研究结果表明，这种NAC TF的上调可以控制柑橘次级细胞壁中的碳沉积，并随后由于叶子而增稠Ca拉斯维加斯的感染。这项研究还揭示了GPT与之联合表达WRKY40，myb15和“灰色60”模块中的乙烯信号基因。之前的报告还提出了这些基因的作用（WRKY40和MYB）HLB-症状柑橘叶子[1，3.，31.］．有趣的是，同样的MYB- 在感染的易感植物的症状叶子中诱导近200倍的基因CaLas，但在耐药(US-897)基因型中没有[1，3.，31.］．MYB据报道，基因是水稻糖饥饿过程中糖应答基因的关键调控因子[37.］．我们认为，在柑橘- hlb相互作用中，NAC结构域、MYB15和WRKY40转录因子可能在碳水化合物代谢的转录调控中发挥重要作用。

韧皮部堵塞和养分运输

柑桔韧皮部细胞淀粉过多积累的研究CaLas感染因血管堵塞而影响营养转运和其他转运基因，由胼舌沉积和韧皮堵塞引起。编码探针组的Phloem蛋白质（PP2-B15）从65个最常见的探针组中涉及韧皮堵塞[69.］．三个探针组编码BZIP5.与之联合表达PP2-B15在“Paleturquoise”模块中编码蛋白质的Ankyrin-Repeat系列。我们的调查结果与郑和赵同意[69.)，他认为Zn转运体和韧皮部蛋白在共表达网络中是相连的。PP2-B15仅在S数据集中诱导;此外，HLB症状类似于Zn缺乏引起的症状。因此，Phloem堵塞PP2-B15可能会破坏受感染的柑橘叶中的Zn运输，并可能导致Zn缺乏的症状。然而，需要澄清Ankyrin-Repep蛋白在Phloem堵塞中的作用。阳离子植物营养如Ca，K，Mg，Fe，Cu，Mn和Zn在柑橘-HLB相互作用中起重要作用[43.］．HLB响应性miRNA（miR399）在易感植物中的磷（p）饥饿期间上调[68.]. 我们整合的miRNA巢式网络显示，HLB反应性miRNA csi-miR167与编码钾（K）转运的中心探针集相连，后者又与硫酸盐、磷酸盐、金属、肽和代谢转运相关探针集的节点相连。缺钾植物比钾供应充足的植物更容易受到感染[49.，62.］．此外，有人认为叶面施用多种矿质元素(锌、铁、钙、钾和锰)可以减轻病树HLB症状[47.］．我们的研究表明，si- mir167的表达可以调节k转运体的枢纽基因，而k转运体的枢纽基因又可以调节其他转运调控基因的表达，如P转运体。

激素和压力反应

通过快速呼吸爆发和氧化还原为其基础防御的一部分引发基因对病原体的植物进行重编程[48.］．65个最常见的探针组显示氧化还原酶的富集，2- Fe（ii）氧酶，Cu / Zn超氧化物歧化酶，过氧化物酶和过氧化氢酶。以前的报道表明，这些探针组可以隔离自由基并在柑橘-HLB相互作用中保持细胞稳态[18.，43.］．目前的研究表明，在连接到编码CCCH型Zn手指蛋白的Hub探针组的“猩猩4”模块中，2G-Fe（II）氧酶。Cu / Zn超氧化物歧化酶用许多PR编码探针组共表达，在“午夜”模块中，其又连接到编码蛋白酶抑制剂的轮毂探针组。我们怀疑昆虫载体喂养后的蛋白酶抑制剂的上调可能上调这些自由基螯合系统相关基因，以限制HLB疾病相关的膜损伤Ca拉斯维加斯的感染。

柑橘-HLB相互作用中的特定探针组

我们鉴定了30个r特异性探针集，它们主要编码几丁质酶、凝集素、萜烯合酶、奇迹素、水通道蛋白、ga反应蛋白和锌指(C₂H₂和C₂C₂类型）家庭蛋白质。CaLas的特点是寄生性比致病性强[15.和缺乏III型分泌系统(T3SS)。细菌效应蛋白分泌到宿主植物中需要T3SS，这些效应蛋白与宿主R蛋白相互作用，诱导防御途径级联[8］．植物中最常见的r基因组是核苷酸结合位点 - 富含亮氨酸的重复（NBS-LRR）类的基因。CaLas也被认为能抑制植物的防御[61.］．在这里，8个nbs - lrr编码探针集中没有一个在R数据集中显示特定的表达模式。Aritua等也报道了类似的结果。3.，表明NBS-LRR和其他抗性基因探针集在之后都出现了下调Ca拉斯维加斯的感染。这CaLas基因组包含大多数鞭毛蛋白基因(佛罗里达州),包括FLG22.肽，可以作为病原体相关分子模式(PAMP) [71.］．LRR受体激酶XII识别鞭毛林，一种特征型PAMP，由LRR受体激酶XII识别（FLS2）在拟南芥［32.］．在这里，在由HLB调制的各种LRR激酶中，LRR-II和lrr-xii.在R数据集（RL17 WAI）中上调并在至少三个数据集中下调。这些LRR系列探针组也是“蓝色”模块中的集线器探针组中，并连接到编码HD-ZIP III蛋白的CSI-MIR166目标探针组。这些LRR探针集的作用识别Ca需要研究LAS效应分子。

大量与发病机制相关的探针集在R组比S组更丰富。其中两个探针组编码1,3-β-葡聚糖酶和几丁质酶，它们也与黑锅植物的植物感染葡萄化动物[28.］．喜欢Calas，植物（Candidatus植物Bytoplasma Asteris.）是一种较少的细胞壁细菌，其促使植物韧皮筛筛细胞并缺乏细菌T3SS。共表达网络分析表明，在“黑色”模块中，Chitinase的五种探针组在“黑色”模块中是共表达的，并连接到WRKY23编码的集线器探针组。用于蛋白酶抑制剂的其他R特异性探针组，例如米科素和CDR。在柑橘中致响应诱导大量米拉林蛋白编码探针组（18）Ca拉斯维加斯。在粗柠檬叶中发现了类奇异果蛋白[57.];蛋白质组学研究表明HLB疾病后Miraculin蛋白的积累较高[18.]，奇迹素类蛋白在椴树中被植物原体上调[53.］．本研究表明，Miraculin的探针组编码在“午夜”模块中与PR4，MLO样蛋白质和几丁质酶编码探针组共同表达。米科素蛋白在HLB抗性中的作用需要调查。另一种蛋白酶基因，CDR，被认为参与美国-897的抵抗机制CaLas及其编码的天冬氨酸蛋白酶可以释放内源性多肽进行防御反应[64.］．我们的结果表明Calas诱导的si- mir396针对与LRR受体枢纽共表达的蛋白酶探针集，表明蛋白酶和LRR受体激酶在HLB防御反应中的作用。值得注意的是，si- mir396的表达随着Ca拉斯维加斯的感染。在转基因中还记录了miR396的表达减少拟南芥表达植物原体效应蛋白SAP11 [38.］．有研究表明，miR396在根和叶发育过程中是细胞增殖所必需的[38.］．MIR396在未来的研究中需要澄清MIR396在HLB防御机制中的作用。

柑橘防御HLB疾病似乎不被茉莉酸（JA）和/或水杨酸（SA）信号传导[31.，61.］．CaLas编码水杨酸羟化酶，水杨酸羟化酶将SA转化为儿茶酚，儿茶酚是一种不会引起耐药性的产物[60.］．在植物影响植物中研究了不同植物生长调节剂的影响[10.］．植物原体还可以抑制植物对昆虫载体的JA信号反应，并下调sa介导的对细菌效应蛋白SAP11的防御反应[38.］．植物原体通过抑制JA途径和通过触发磷饥饿反应调节磷酸盐稳态来调控发育和防御激素的生物合成[52.］．还记录了JA途径和P饥饿的下调Calas感染[31.，68.］．赵等人。［68.据报道，磷酸盐缺乏症状症状恶化，而外源性P的施用减少了症状。还提出，根据P饥饿，植物在树叶中累积糖和淀粉[26.］．在本研究中，使用GA信号通路相关探针组共表达LRR受体激酶和PR编码探针组。GA信号相关基因，如气体”和使惊讶R数据中表达上调，S数据中表达下调。我们的结果与Martinelli等人一致[41.]表现出相反的ga相关基因表达模式;在果实中下调，而在叶片中上调。作者(41.还怀疑果糖代谢的变化可能与GA途径的下调有关，这反过来调节能量和碳水化合物代谢。它还记录了这一点GASA5在抗性US-897中形成了更高的表达，并且响应感染而显着诱导表达水平[2］．GA缺乏症涉及植物体疾病[12.］．Ding等人[12.建议在番茄中的马铃薯紫色幽皮植物感染中，需要增加的GA信号来激活与防御相关的酶β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶。我们提出了GA信号传导可以在柑橘-HLB互动中统一防御反应。研究了不同植物生长调节剂对植物影响植物的影响[10.］．

我们发现凝集素前体探针组在US-897和RL 17 WAI中进行上调，但不在S数据集中。章参是一种独特的植物蛋白，可以识别和结合外部细菌表面上存在的乙二醇缀合物[44.］．Weintraub [63.据报道，植物在植物感染期间凝集素可能对昆虫载体产生直接影响。Snowdrop凝集素与昆虫胚胎结合，并且不会被中肠蛋白酶完全降解。因为CaLas是通过昆虫媒介柑橘木虱介导的，我们认为凝集素可能通过抑制昆虫对柑橘植物的取食发挥直接作用。具有这些凝集素基因的工程植物可能抑制柑橘木虱，进而抑制HLB的发病率。

在这里，我们在柑橘中组装了关于柑橘中差异基因表达的可用转录组数据CaLAS感染并通过同步和miRNA网络分析仅仅通过“列表”来升级为“互连”。通过整合转录组信息，我们鉴定了柑橘-HLB相互作用易感和抗性抗性的主要轮毂基因。我们的数据显示，碳水化合物代谢由编码MyB，NAC和Wrky转录因子编码的集线基因。通过调节CSI-miR167，可以通过调节CSI-MiR167来恢复进一步减少的离子输送。我们的分析确定了30个R特异性探针，作为针对HLB疾病的潜在候选者。我们假设柑橘中的基础防御抵抗HLB可以通过降解来介导CaLAS - 更长的纸浆如鞭毛蛋白或其他可以通过LRR家族受体蛋白和几丁酶识别的其他未知效果。r基因介导的抗HLB的防御可以由植物蛋白酶如米科林蛋白和CDR介导。分析还表明柑橘蛋白酶后由CSI-MiR396调节CaLas感染和CSI-MIR396可能在防御途径中具有作用。我们的研究表明，GA信令可以在HLB电阻中发挥重要作用。

微阵列数据采集和预处理

我们包括从NCBI基因表达式综合（GEO）数据库（GEO）数据库中获得的六次报告的14项研究（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）[1- - - - - -3.，18.，19.，31.］．所有这些研究都基于Affymetrix系统。GEO系列数据集用于5个报告的8个研究(GenBank: GSE33004、GSE33003、GSE33459、GSE30502和GSE29633)。其余6项研究来自Fan等[19.］．这14项研究包括一个根数据集(GenBank: GSE33004)、一个茎数据集(GenBank: GSE33004)和12个叶组织数据集(GenBank: GSE29633、GSE30502、GSE33003、GSE33459和Fan等[19.])。我们的研究没有包括水果组织的荟萃分析，但我们包括了来自两项已发表的研究的水果转录组数据[34.，40]并使用内部Teradata数据库SQL脚本与我们的数据集进行比较（http://www.teradata.com/products-and-services/database)．根据这些报告中提到的不同组合的不同组合，我们包括HLB-症状的水果探针，以防止其各自的健康对照组，以降低果实数据的复杂性。我们包括辽六的六个水果数据集和烧伤[34.和来自Martinelli等人的两个数据集[40］．因此，本研究分析了在包括八种关于水果数据集的八个研究之后从22个数据集的HLB响应探针组的转录变化。这22个数据集包括不同的时间点（之后的早期和后期时间点CaLas感染），不同的组织（根，茎，叶子和果实）和针对HLB疾病的不同宿主反应（易感性和耐受性/抵抗）。易感组由18个数据集组成，抗性组包括四个数据集。数据集的登录号在表中指示1．背景技术使用RMS在R中实现的RMA进行了原始数据集的校正和归一化。22.］．

差异表达探针组的统计分析和识别

为了识别差异表达的探针集，两种meta分析方法应用于标准化的基因表达数据集。第一种方法，Limma方法(微阵列数据的线性建模)使用Bioconductor的Limma包[51.］．利马计算受体化t经验贝叶斯对共同价值的标准误差缩小的差异表达的差异和对​​数。探测器P < 0.05 (FDR < 0.1) and fold change were considered. Limma generated separate files for each study, and these files were combined using an in-house SQL script on the Teradata database (http://www.teradata.com/products-and-services/database)．第二个非参数元分析，RankProd方法，组合P从各个实验中识别探针集的值[6］．我们在Bioconductor包中使用了RPadvance函数[29.，这是专门为元分析设计的。RankProd输出是table形式的单个文件12(分别下调和上调hlb应答探针组)、基因表达、FC、P- 虚假预测（PFP）的值和百分比。置换测试的数量设置为250，并且使用PFP截止值<0.01的TOPGENE功能用于识别研究中的顶部差异表达的探针组。

差异表达探针组的功能性富集分析

我们使用了奇异的浓缩分析方法Agrigo（http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/)的默认设置t-测试 （P < 0.05) and FDR correction by the Hochberg method for the GO analysis. Probe sets were annotated against the拟南芥基因组，使用收获数据库鉴定柑橘原序（http://harvest-web.org.)．探针组的功能和代谢途径使用Mapman可视化素类映射文件（csinensis_154.txt）（http://mapman.gabipd.org/). 使用MapMan的PageMan分析插件，通过Wilcoxon检验、无校正和1.0的过度表征分析（ORA）截止值，观察HLB反应性组织特异性代谢途径之间的差异。采用皮尔逊相关法和平均连锁法对微阵列数据进行分层聚类，距离阈值为0.90(http://www.tm4.org/mev.html.)．

加权基因共表达网络建设

通过使用R版本1.27.1中的WGCNA包来考虑差异表达的探测组来推断加权基因共表达网络[33.］．成对皮尔逊相关性(r²计算用于所有样本的探针集以找到相关性并生成相似性矩阵。相似性（S._IJ.)两者之间的相关性我^TH.和j^TH.使用以下等式计算探针组[6]:年代_IJ.= abs |软木(X_我- X_j）|，在哪里，x_我和X_j= log(以2为底)的比值我th和jTh基因分别跨越样本;皮尔逊相关系数;abs =绝对值。Pearson相关系数的绝对值被用来生成一个无向的加权网络。将相似矩阵提高到邻接矩阵的幂(β)。利用WGCNA的PickSoftThreshold功能从各种软阈值功率中选择适合网络拓扑的功率。通过将软阈值功率(β)提高到14来实现无标度网络。在此阈值功率下，模型拟合r²< 0.85。将该相似性矩阵转化为邻接矩阵，邻接矩阵转化为拓扑重叠矩阵(TOM)相似性度量，这是一种对互连度的鲁棒度量[65.]. 将探针集的TOM矩阵与平均连锁层次聚类相结合，采用动态树切割算法（cutreeDynamic method；深裂 = 3、切割高度 = 0.993; 最小模块大小 = 40) [33.］．采用参数切割高度= 0.2对相似模块进行合并。共同表达网络使用Cytoscape 3.1.1版本进行可视化，并使用network Analyser插件进行分析[13.］．我们考虑了仅高于0.2的边缘，以简化和集中于共同表达网络的相关功能。由Puniya等人建议的构建网络中的集线器探针组。［46.］．

miRNA目标预测和嵌套网络建设

我们获得了从三个来源定位HLB响应探针组的miRNA列表：PMRD，工厂miRNA数据库[67.),素类注释项目（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/），并验证了Zhao等人的HLB响应MiRNA。［68.］．靶基因与来自Zhao等人的每个HLB响应性miRNA类相互作用。［68.]被搜查过素类注释项目（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)．我们确定了14个miRNA课程的64种靶基因。从我们的7,412个差异表达的探针组搜索这些64个目标基因的相应探针组拟南芥注释和NCBI BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/），得到10 miRNA类的24个目标探针组。使用Cytoskape 3.1.1中的嵌套网络插件推断出10 miRNA的嵌套网络及其24个目标探测集，默认设置。

机场核心计划:

亚洲柑橘类洋谷

AGPase:

ADP-glucose焦磷酸化酶

Ca拉斯：

Candidatus.Libibacter Asiaticus.

CDR：

组成性抗病性

FDR：

假发现率

遗传算法:

吉布林素

地理:

基因表达综合

走:

基因本体论

GPT：

葡萄糖-6-磷酸/磷酸易刻器

滴:

黄龙兵

JA：

茉莉酸

我:

模块eigengene.

NBS-LRR:

核苷酸结合位点富亮氨酸重复序列

病人:

磷

P：

概率值

PP2:

韧皮部蛋白质

PR：

病因相关

接待员:

抵抗的

RL：

粗柠檬

RMA：

健壮的多片分析

学生：

易受影响的

山:

水杨酸

SQL:

结构化查询语言

WGCNA：

加权基因共表达网络分析

该研究得到了柑橘研究与发展基金会(CDRF)的资助(项目编号为#108766和#105077)。我们感谢Ravi Pratap Singh(数据库管理员)编写定制设计脚本，并为Teradata数据库提供技术帮助。

从属关系

1. 佛罗里达大学食品与农业科学研究所，墨西哥湾海岸研究与教育中心，威茂马，佛罗里达，33598，美国

   Nidhi Rawat＆Zhanao Deng

2. Ocimum BioSolutions, Banjara Hills Road No. 1, Reliance Classic，海德拉巴，500039，印度

   Sandhya P. Kiran.

3. 佛罗里达大学，食品和农业科学院，柑橘研究和教育中心，阿尔弗雷德湖，FL，33850

   杜东亮&小弗雷德·g·格米特

通讯作者

对应于Zhanao Deng.．

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

NR和DD收集柑橘HLB转录组数据。NR和SPK对检索到的数据进行meta分析和共表达网络分析。NR构思、设计并撰写了这篇论文。SPK编写了自定义脚本，在分析过程中帮助排除故障。ZD和FG通过批判性地评估研究和改进手稿做出了贡献。所有作者都阅读并批准了最后的手稿。

开放访问本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。

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