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蔗糖在甜高粱茎中的积累是通过外质韧皮部卸载发生的，不涉及差异蔗糖转运蛋白表达式

BMC植物生物学体积15、物品编号:186（2015）引用本文

摘要

背景

高粱(高粱二色的L. Moench)品种储存的非结构性碳水化合物主要以淀粉的形式存在于种子(谷物高粱)或糖的形式存在于茎(甜高粱)。前期研究发现甜高粱茎中蔗糖的积累与蔗糖代谢酶活性无关，蔗糖积累过程可能涉及到一个质外转运步骤。然而，从茎韧皮部到储存薄壁细胞的蔗糖卸载途径尚不清楚。蔗糖转运蛋白(SUTs)跨膜运输蔗糖，并被认为在甜高粱和禾高粱之间的蔗糖分配差异中起作用。本研究的目的是表征甜高粱和粒高粱在碳水化合物积累方面的关键差异，确定蔗糖在高粱茎中的积累途径，并确定高粱SUTs在茎中蔗糖积累中的作用。

结果

蔗糖运输途径的染料示踪研究表明，甜高粱Wray和谷物高粱Macia的茎脉韧皮部均与周围细胞进行了同质分离，表明蔗糖是外质卸载的。一旦进入韧皮部浆质，一种可溶性示踪剂从静脉扩散到茎实质细胞壁，表明包裹静脉的木质化的肠壁鞘并没有阻止浆质向静脉外流动。为了描述Wray和Macia之间碳水化合物分配的差异，我们比较了Wray和Macia的生长、茎汁体积、溶质含量、SbSUTs基因表达和其他特征。与之前的研究结果相反，我们没有发现显著差异SbSUTs茎组织内的基因表达。

结论

甜高粱和谷物高粱茎中的韧皮部筛管与周围细胞对称分离;因此，韧皮部的卸荷可能发生在质外，从而确定了先前假设的蔗糖运输步骤的位置。此外，没有变化SbSUTs在甜高粱和谷物高粱茎中检测到基因表达，表明它们在SbSUT转录水平不能解释品种间碳水化合物分配的差异。本文讨论了蔗糖韧皮部卸载和向茎储存薄壁组织移动的模型，并强调了蔗糖转运蛋白在高粱茎中的作用。

背景

到2050年，世界人口预计将超过90亿;因此，粮食和能源安全方面的作物生产力必须大幅提高，以满足预期的需求[1- - - - - -3.]。由于可用于扩大作物种植的额外可耕地很少，这些增加将需要来自作物性能的改善。改善管理措施、提高非生物和生物抗逆性以防止作物损失以及加强同化物进入储存器官的输送以提高产量，可在一定程度上提高农业产量。然而，对于许多作物来说，光同化物从合成位点到储存组织中沉积的途径并不是很明确。在这种情况下，储存在草种子中的碳水化合物提供了人类每天摄入的大部分热量。此外，从植物生物量中提取的可再生能源正在开发中，利用甜高粱(高粱二色的L. Moench)和甘蔗(蔗糖officinarum)，或在生物能源高粱、柳枝稷(黍virgatuml .),芒草x巨草［4- - - - - -11]。因此，改善用于食物、饲料、纤维和燃料用途的营养物质输送到收获器官的策略取决于光同化物的运输路线，以及参与长距离分配的转运体[12- - - - - -14]。

碳水化合物分配是指光同化物从叶片的合成点分布到果实、种子、块茎和茎等贮藏产物的过程[9，15- - - - - -22]。在大多数作物植物中，蔗糖是一种可溶性碳水化合物，从光合作用的叶片运输到非光合作用的组织，非光合作用的组织进口这种固定碳进行利用和储存。输出固定碳的组织(如叶子)被称为碳源，而输入和储存碳水化合物的组织被称为碳汇。同化物在植物体内的运输发生在静脉的韧皮部组织中[23，24]。同化物的韧皮部运输速率可以由源组织或汇组织控制，这取决于植物的发育阶段和环境[24，25]。不同汇组织竞争光同化物进口和利用的不同能力，也称为汇强度，可以控制韧皮部的运输和碳水化合物的分配[j]。26- - - - - -29]。

在源组织内，蔗糖向韧皮部的装载可通过同质或胞质途径进行[21，30.]。在同质装载物中，蔗糖直接在细胞之间扩散，并通过胞间连丝(连接细胞间的细胞质)进入韧皮部的筛元/伴细胞复合体。在胞质装载者中，蔗糖可以在不同类型的细胞之间进行同质性移动，但最终在随后通过筛元/伴细胞复合体的质膜被摄取之前，被输出到韧皮部的细胞外空间(胞质)。除了大米(Oryza sativa L。)，有人认为这可能是利用同质韧皮部负荷[31，32]，但参见[12]，是蔗糖进入甘蔗、玉米等牧草叶片韧皮部的途径(玉米L.)，小麦(小麦L.)和大麦(大麦芽L.)，被认为是由血浆韧皮部负荷引起的[33- - - - - -37]。

胞质韧皮部负荷需要多种蔗糖转运蛋白使蔗糖穿过细胞膜。蔗糖转运蛋白(SUTs)是H+/蔗糖同质体，利用储存在质子动力中的能量将蔗糖运输过膜。系统发育分析将sut分为多个组或类型[38- - - - - -42]。不同的家族成员被认为在质膜上发挥作用，将蔗糖装载到韧皮部[15，39]，或在细胞质上将蔗糖从液泡转运到细胞质中[43- - - - - -45]。糖是另一类糖转运蛋白，它们被认为是促进糖沿浓度梯度移动的单转运蛋白，其中III支成员跨膜运输蔗糖。46- - - - - -50]。肌质体糖转运蛋白(TSTs，又称肌质体单糖转运蛋白)是第三类蔗糖转运蛋白，其功能为H+/蔗糖反转运蛋白将蔗糖转运到液泡中[51，52]。SUTs, SWEETs和tst都被认为在食物和燃料作物的碳水化合物分配和储存中起着重要作用[9，13，15，17，26，48，50，52，53]。

蔗糖一旦进入韧皮部，就会通过大流量远距离输送到组织中[28，54，55]。根据植物、组织和发育阶段的不同，蔗糖可以通过同质或外质方式排出韧皮部[12，24，54，56，57]。如果蔗糖沿着同质路线，它可以从韧皮部筛管通过胞间连丝进入邻近的细胞。蔗糖在甘蔗茎节间的积累被认为是利用同质韧皮部卸载途径，然后通过韧皮部后的间连丝运动到茎薄壁细胞内储存[26，58- - - - - -60]。另外，如果采用外质途径，蔗糖必须先通过筛管质膜流出，然后才能从外质吸收到邻近的细胞中，如玉米和高粱谷物[26，61，62]。

高粱是非洲和中国的一种重要的主要作物，它在种子中储存淀粉等碳水化合物[63- - - - - -65]。甜高粱是一种不同的品种，被选择在茎中储存大量的可溶性糖(主要是蔗糖)，并且已经作为从植物中生产乙醇的有价值的原料[5，9，66]。高粱和高粱在遗传上是密切相关的，都被分类为美国二色的。群体遗传分析发现，甜高粱和谷物高粱的差异，虽然对育种和表型分类有用，但不能通过分子标记沿着种族亚型区分[67- - - - - -70]。然而，籽粒和甜高粱不同的末端汇组织和碳水化合物沉积的储存形式使它们成为研究禾草中控制碳水化合物分配的基因和过程的理想比较系统[71- - - - - -75]。

先前对甜高粱茎中蔗糖积累的研究发现，蔗糖积累始于繁殖阶段开始，蔗糖代谢酶的活性与蔗糖浓度无关[76]。进一步的研究确定蔗糖积累可以在一些甜高粱品种中开始预繁殖，但再次发现与蔗糖代谢酶的活性无关[77]。基于这些数据，这两项研究的作者都认为，蔗糖进入茎实质的运输可能是茎蔗糖积累模式的基础。与蔗糖分解代谢酶活性缺乏相关性一致的是，另外的研究表明，蔗糖可以直接进入成熟的甜高粱茎薄壁细胞，而不需要先裂解成己糖并重新合成[78，79]。将不对称放射性标记的蔗糖注入成熟高粱茎中，也有报道称成熟高粱茎间的蔗糖运动包括一个胞浆运输步骤[79]，暗示了蔗糖转运蛋白的功能。

高粱基因组包含6个基因SUT基因(39]。SbSUT2是第4组/ III型分支的成员，预计定位于舌质体。另外五种高粱SUTs被预测定位于质膜，属于1、3或5组/ II型。SbSUT1与玉米是同源的，并且可能与玉米有保守的功能ZmSUT1基因的表达、生化活性和遗传分析表明，该基因在蔗糖韧皮部负荷中起作用。80- - - - - -84]。其他高粱的功能SUT基因仍然未知。从表情研究来看，SbSUTS在汇源组织中广泛表达，不同家族成员表现出不同的表达模式[75，85，86]。在比较SbSUT籽粒和甜高粱组织之间的表达水平，除了SbSUT3,其表达式未被检测到。这些表达差异是否导致了籽粒和甜高粱之间碳水化合物分配的差异尚不清楚。

在本研究中，我们采用形态、生化、光合、细胞生物学和基因表达的综合研究来了解甜高粱和谷高粱在全株碳水化合物分配、蔗糖在茎中的运输途径以及蔗糖在蔗糖中的作用等方面的主要差异SbSUTS在茎中的蔗糖积累。为了实现这些目标，我们比较了一种高生物量甜高粱品种Wray和一种谷物高粱品种Macia，前者茎高，含有大量可溶性糖作为碳水化合物的主要储存形式，后者较短，但穗大，有许多种子储存淀粉。栽培品种Wray的茎中含糖量非常高[68]，而品种Macia是为高产而开发的，并已进行了测序[87，88]。选择这些品种进行本研究是因为1)它们已在多个其他报告中使用[68，70，89]，因此有充足的背景信息;2)它们在表型水平上高度分化，因此在控制碳水化合物分配方面可能存在差异。我们特别调查了SbSUT表达模式，以确定这些基因是否与甜高粱茎中的糖积累有关。在此基础上，我们提出了蔗糖进入高粱茎贮藏薄壁细胞的途径和不同蔗糖转运蛋白的可能作用模型。

结果

全株表型、生物量和产量测量

为了了解Macia和Wray在生长、产量和碳水化合物分配方面的差异，我们在整个生命周期的多个阶段对植物生长、开花、生物量积累和茎汁中的总溶质进行了表征，茎汁主要由浆体液、细胞质和液泡液组成。Macia和Wray的早期幼苗生长情况非常相似(图2)。1)。然而，随着时间的推移，两个品种之间的一些形态差异出现了(图2)。1 b, c，以及附加文件1:表1)。从营养后期开始(种植后43天)，Wray的茎长比Macia高，植株高度的差异在整个季节都在增加并保持(图2)。1 b, c)。随着茎高的增加，雷伊的开花时间比马西亚平均晚5天。1 c)。此外，与Macia相比，Wray产生了更高的茎生物量(图2)。2)。具体来说，收割时收集的主茎总鲜重和干重在Wray显著高于Macia(图2)。二维)。除了顶部的1 ~ 2个节间外，这种差异也反映在每个单独的节间上(图2)。2 b, c)。Macia和Wray的节间重量分别显示出2倍和9倍的变异。尽管Wray表现出显著的茎生物量增加，但Macia表现出较短但较粗的茎(图2)。2a e f)。然而，除了最上面的两个节间外，Wray大部分节间的长度显著增加对每节间质量的贡献大于Macia茎粗的大幅增加(图2)。2a-c e f)。因此，Wray在生物量积累水平上优于Macia，这可以预测为甜高粱品种。

图1
图1

晶粒生长的比较(简历。和甜(简历。高粱植物。在早期营养阶段从田间采集的植物的并排比较(一个)。成熟期植物(b)。种植后不同天的马西亚和雷属植物高度(以厘米为单位)曲线图(c)。数值为N = 10株的平均值±SE，星号表示两条线的平均值有显著差异p≤0.05，箭头表示每行的开花时间。Macia =黑色方块，Wray =白色方块

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图2
图2

马属和雷属植物茎秆生物量参数的差异。单株节间数及长度(厘米)一个)。单株节间鲜重(b)。单株节间干重(c)。茎干总鲜重(d)。主茎在不同高度处的茎周长(mm):顶部节间、中部节间和基部节间(e)。数值为平均值±SE，星号表示两条线之间的平均值有显著差异p≤0.05,N = 10(组)模拟)和N = 5(面板e)植物。Macia =黑条，Wray =白条。在测量周长的同一位置取节间横切面(f）

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正如对谷物品种的预期，与Wray相比，Macia的谷物产量更高。3.)。尽管Wray在每个主茎上产生了更多的穗数(图2)。3 c)， Macia产生更大更重的穗(图2)。3 d)，种子较大(图2)。3 b)，总种子重较高(图2)。3 e)，总种子数更大(图2)。3 f)在主穗上。因此，与Wray相比，Macia在穗部储存了更多的固定碳，这些固定碳最终储存在种子中。

图3
图3

马属和雷属植物种子产量参数的差异。全穗并排比较图像(一个)及单粒种子(b)。图表表示每个主茎的穗数(c)、全穗干重(d)、主穗总种子重(e)，主穗总种子数(f)的马西亚和雷属植物。数值为N = 6的平均值±SE，星号表示两条线在的平均值有显著差异p≤0.05。Macia =黑条，Wray =白条

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Wray在茎中积累的糖比Macia多

由于茎是一个强大的非结构性碳水化合物汇，我们分析了Macia和Wray节间的总溶质积累，以白利度百分比为单位。如图所示。4和附加文件2:图S1和附加文件3.图S2，与Macia相比，Wray在整株水平上积累的糖度含量要高得多，在大多数时间点上，绝大多数节间的糖度含量也是如此。开花时，两品种最低节间(IN1)的Brix含量差异不显著。然而，Wray在所有其他节间中显示出明显更高的白锐度百分比(图2)。4)。与Macia相比，Wray在所有节间积累的Brix百分比大约是Macia的两倍至三倍，其中in 3至6表现出最高的数量(图2)。4摄氏度)。茎汁体积的测量显示，在Wray中，从开花到成熟的总体积没有变化，而在Macia中，茎汁体积增加了37%(图2)。4 b、d)。然而，尽管Macia的茎汁量增加，但Wray茎的汁量比Macia高出约6至9倍。因此，总体而言，Wray茎的总溶质积累量明显高于Macia茎。

图4
图4

不同发育阶段马马属和雷属植物单株节间的白锐度百分比。单株节间数及百分数(一个，c)，单株节间数及果汁量(毫升)(b，d)在花期(a - b)，生理成熟时(c - d)。数值为N = 5的平均值±SE，星号表示两条线在的平均值有显著差异p≤0.05。Macia =黑条，Wray =白条

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高粱茎韧皮部组织与周围的贮藏薄壁细胞是同质分离的

蔗糖从源叶到茎汇组织储存的途径在高粱中还没有最终确定。为了辨别蔗糖从茎韧皮部转移到储存薄壁细胞的途径，我们使用韧皮部移动染料羧基荧光素(CF)进行了染料负载研究。可透膜、非荧光的双乙酸酯形式(CFDA)应用于源叶。进入细胞后，CFDA被转化为荧光的、不透膜的CF示踪剂，该示踪剂被限制在同质中。第三或第四叶的尖端，从穗部开始计数，用CFDA溶液浸泡1小时。另外5小时后收获植株，以使CF通过韧皮部转移到茎组织。如果蔗糖可以通过胞间连丝从韧皮部筛管进入茎薄壁细胞，我们预计CF也会沿着这条路线移动，因此可以在薄壁细胞的细胞质中检测到。另一方面，如果蔗糖在进入薄壁细胞之前必须通过筛管质膜出口到细胞质中，我们可以预测CF(一种可能缺乏内源性转运蛋白的外生化合物)将被限制在筛管中。对Wray和Macia的茎静脉的横切面的检查显示，在韧皮部细胞中检测到强烈的CF(图2)。5 a、b)。如紫外线照射所示，它通过细胞壁自身荧光勾勒出细胞解剖结构(图2)。5 d, e)，含cf的细胞明显为韧皮部细胞。茎实质细胞的胞浆内未检测到CF信号，细胞壁内仅观察到非常微弱的CF信号(图2)。5 a、b)。这个微弱的信号似乎不是由于CF在细胞内的定位，但更有可能的是，CF信号来自韧皮部组织内部，通过茎的细胞壁折射，也可能是由于CF在样品制备过程中从韧皮部释放并污染了邻近组织。因此，这个信号似乎是韧皮部特有的。未喂食CFDA的植物的对照切片显示，木质部细胞壁和叶脉周围的间质鞘细胞仅发出微弱的自身荧光(图2)。5 c、f)。这些数据表明，Wray和Macia高粱茎韧皮部组织与周围细胞是同质分离的，因此，蔗糖从茎韧皮部到储存薄壁细胞的运动路径需要一个胞浆运输步骤。

图5
图5

从源叶中摄取CFDA的马属和雷属植物茎中CF的定位。CF定位于茎血管的韧皮部组织。一个)及雷(b)。未经国家食品药品监督管理局(c)。仅检测到微弱的自身荧光。相同切片的紫外线图像显示细胞解剖结构(d-f)。标尺= 100 μm

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为了评估溶质从静脉浆体空间移动到储存实质的能力，Wray和Macia植物从基础上饲喂了红花素，一种可染色木质素的水溶性染料(图2)。6)。最初在木质部元素和直接相邻的木质部薄壁细胞的细胞壁中检测到红花素，如亮场下的红色所示(图2)。6;箭头)和绿光下的红色荧光(图2)。6摄氏度)。在紫外线照射下，通过细胞壁自身荧光可以看到该区域内的细胞解剖(图2)。6 b)。在紫外光下，红花素也显示出一定的荧光。随着细胞质扩散的增加，藏红花素随后遍布木质部的细胞壁，并且在木质部附近的韧皮部细胞的细胞壁中也可以检测到(图2)。6 d-f)。Safranin最终存在于整个静脉的所有细胞壁中，重要的是，可以在静脉外的茎储存薄壁细胞的细胞壁中检测到Safranin。6胃肠道)。对照静脉未喂番红花素，未见红色显色和荧光(图2)。6 j-l)。从静脉到储存薄壁细胞的橘红色红素在Macia节间也有同样的胞浆分布(图2)。6 m-o)。我们在比较Wray和Macia的染料转运研究中没有观察到差异，这表明这些品种之间蔗糖积累的任何差异不太可能是由于所使用的卸载途径的差异。总的来说，CF和藏红花色素运输研究表明，蔗糖要从韧皮部转移到茎储存薄壁细胞，必须穿过筛元质膜流出，然后蔗糖能够在细胞质内扩散到茎储存薄壁细胞，在那里它可以通过糖转运体输入到同质中。

图6
图6

红花素在Wray和Macia花后茎静脉中的定位。l对应于各种组织，和m-o对应于Macia组织。左、中、右三列分别为明光、紫外光和绿光下的静脉横截面。在不同类型的照明下，每一行代表一个单一的静脉。藏红花素首先在木质部元素的壁和相邻的木质部薄壁细胞中检测到，如亮场下的红色(一个;箭头)和在绿光下的红色荧光(c)。在紫外光照射下，红花素也显示出一定程度的荧光(b)。随后，藏红花素在木质部的细胞壁中存在，在木质部附近的韧皮部细胞壁中也可检测到(d-f)。最后在整个静脉的细胞壁和周围薄壁细胞的细胞壁中观察到红花红素(胃肠道)。对照静脉未饲喂红花素(j-l)。在马可亚茎静脉中观察到相同的红花素分布(m-o)。标尺= 100 μm

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的表达模式SbSUTsMacia和Wray在成熟叶和茎组织中大致相似

基于染料传输研究的结果，我们开始调查是否SbSUT定量RT-PCR结果显示，Macia和Wray在叶和茎中的表达存在差异(图2)。7)。有趣的是，我们发现在两个品种和组织中的总体表达模式是相似的SbSUT3 SbSUT5,和SbSUT66个基因中表达量最低。这三个基因计算的Cq值均在31以上(附加文件)4表2)。高Cq值表明基因表达水平很低，这反过来又导致准确测量表达的差异很大，降低了结果的可重复性[90- - - - - -92]。因为表达水平SbSUT3，SbSUT5,SbSUT6在栽培品种和组织中都极低，随后的分析只关注SbSUT1, SbSUT2,SbSUT4,它们在这些组织中以明显且易于量化的水平表达(附加文件4表2)。

图7
图7

的表达水平SbSUT2-SbSUT6相对于SbSUT1在马西亚和雷伊成熟的叶和茎。一个，b给玛西亚看，还有c，d显示雷;一个，c是成熟的叶组织，和b，d茎。数值为N = 5的平均值±SE，星号表示两个基因在p≤0.05

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在西亚语中，…的表达SbSUT2类似于SbSUT1在成熟叶片中，但相对于SbSUT1在茎部(图2)7 a、b)。同时，的表达SbSUT4显著低于SbSUT1在两种组织中。类似地，在Wray中，的表达SbSUT2显著高于SbSUT1和SbSUT4在两种组织中，以及SbSUT4显著低于SbSUT1在茎中但不在叶组织中。这些数据表明SbSUT1，SbSUT2,SbSUT4可能在叶片的蔗糖韧皮部装载和茎的蔗糖回收中起作用(图2)。7 c, d)。另一方面，的相对表达SbSUT1在成熟叶和茎组织中均无显著差异(图2)。8)。而在茎组织中的相对表达量SbSUT2和SbSUT4的表达量在两个品种间无显著差异，但其在Wray叶片组织中的表达量显著高于Macia(图2)。8 b, c)。总之，没有变化的表达水平SbSUT1, SbSUT2,或SbSUT4在Wray和Macia干组织之间检测到SbSUT1这表明它们在RNA水平上的表达差异不会导致蔗糖分配的差异。然而,SbSUT2和SbSUT4在Wray成熟叶片组织中的表达量比Macia高2 ~ 2.5倍，这与这些基因可能在甜高粱和高粱源叶片之间的蔗糖分配和输出差异中发挥作用的假设一致。

图8
图8

表达水平SbSUT1, SbSUT2和SbSUT4在雷属植物的叶和茎中，与马属植物有亲缘关系。的表达水平SbSUT1（一个）, SbSUT2（b),SbSUT4（c)星号表示两行之间的意思有显著不同p≤0.05,N = 5。叶子=带白点的黑条，茎=带孵化的条

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Wray表现出比Macia更高的光合性能

植株生物量、茎汁体积和糖度、种子产量和开花时间的巨大差异表明，两种高粱品种采用了不同的全株碳水化合物分配策略。造成这种差异的一个可能因素是，与Macia相比，Wray的源强度有所增加。为了研究这一假设，我们测量了一些与光合作用有关的参数，并在两个品种之间进行了比较(图2)。9、附加文件5:图S3，附加文件6:图S4和附加文件7表S3)。雷和马迪亚叶片净光合作用(A网)，气孔导度(g年代)，并测定瞬时水利用效率(iWUE)(图2)。9)。Wray和Macia在A网在77 DAP, Wray的发生率高于Macia(图2)。9)。同样，气孔导度在43和77 DAP时各品种间差异不显著，但Macia在82和91 DAP时的气孔导度高于Wray(图2)。9 b)。与Wray相比，Macia气孔导度的显著增加可能是由于气孔数量的显著增加5:图S3)。g的增加年代反映在Macia的iWUE下降(图2)。9 c)。值得注意的是，由于两个品种的开花时间不同(图2)。1 c)，在77 DAP时，Wray仍处于营养阶段，而Macia处于花期。但是，通过比较发育阶段的数据分析，两系在营养阶段没有差异，但Wray表现出更高的A网花期和软面团期的开花速率(图2)。9 d)。不同光照条件下不同品种间光合速率无显著差异(附加文件)6:图S4)或光系统II的最大光化学效率(附加文件)7表S3)。总的来说，我们的研究结果表明，与Macia相比，Wray在花后表现出更高的叶片光合性能，这种叶源强度的差异可能是Wray在生物量积累、茎汁体积和白糖度方面表现出的增加的原因。

图9
图9

Macia和Wray植物气体交换参数的差异。叶片净光合作用(A网） (一个)，气孔导度(g年代） (b)，以及即时用水效率(c)。不同发育阶段的叶片净光合作用:营养期、花期和软面团期(累积约50%粒重)(d)。数值为N = 15的平均值±SE，星号表示两条线在的平均值有显著差异p≤0.05。Macia =黑色方块，Wray =白色方块

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讨论

Macia和Wray在生长习惯和碳水化合物分配模式上表现出明显的差异。我们考察了植株高度、开花时间、茎汁体积、Brix百分比、成熟茎组织内的溶质运输路径、SbSUT以了解Wray和Macia在生物量和溶质积累方面的生理和分子差异。首先，我们想确定甜高粱如何在茎中积累大量糖的关键参数，并测试假设SbSUT基因表达水平是甜高粱与谷物高粱糖积累差异的原因。

Wray和Macia在茎生物量、汁液体积和溶质含量等性状上存在差异。Wray的营养生长期较长，源强度扩大，茎节间数增加。Wray的节间明显长于Macia，这是品种间株高差异的原因。虽然Macia有一个更短，更紧凑的身材，但它有更厚的节间，可能支持更大的穗重。Wray的节间鲜重和干重均显著高于Macia。Wray的节间长而重对茎汁量的贡献大于Macia的节间短而宽。有趣的是，在不同发育时期的糖度百分比和汁液体积的比较中，Macia在开花期和生理成熟期只有少量的汁液体积增加，糖度值没有变化，这反映了碳水化合物在穗部的分配。在这段时间里，Wray的果汁量也没有变化。然而，Wray表明，在开花期和生理成熟期之间，Brix百分比显著增加，表明碳水化合物分配到茎部的增加。总体而言，在每株植物的基础上，Wray表现出大约24倍的茎溶质丰度比Macia高(约6倍的Brix水平乘以约4倍的汁液)。 Hence, these data suggest that Wray accumulates higher stem solutes than Macia through a combination of increased internode number and length, higher juice volume per internode, and a greater sugar content per internode that occurs because of significant increases in sugar content during maturity, with the final component contributing the greatest effect.

优越的光合作用相关参数可能解释了Wray茎中更多的溶质积累

光合作用是驱动源叶片固碳的生化过程，可能是Wray和Macia之间碳水化合物丰度和分配显著差异的机制之一。在最佳生长条件下，如CO升高所示2浓度实验表明，增强光合作用导致碳供应增加，进而促进生长[27，93- - - - - -96]。因此，Wray茎中糖浓度的增加可能是由于，至少部分原因是与Macia相比，源强度增加了。为了验证这一假设，我们评估了不同DAP和不同发育阶段的一些光合作用相关参数。在营养阶段，Wray和Macia的光合性能没有差异。两个品种光系统II的最大光化学效率、净光合作用和光合作用对增加光强的响应也相似。相比之下，随着生殖阶段的开始，Wray表现出更高的光合作用速率，反映出更强的来源能力，这可能导致碳的可用性增加，并向汇(茎)组织出口。在77 DAP时，Wray茎的溶质浓度开始高于Macia，但顶部节间除外(附加文件)3.:图S2)。这一增长可能归因于Wray的光合作用速率比Macia高21%。后来的光合作用测量没有显示出两个品种之间的任何差异;然而，对处于相同发育阶段的植株进行比较发现，Wray在开花期和软面团期的光合速率分别比Macia高11.7%和12.6%。由于Wray茎中溶质浓度高，该品种光合作用的增加可能表明对糖对光合作用的反馈抑制敏感性降低，和/或叶片蔗糖输出率增加[qh]26，97，98]。更大的表达SbSUT2和SbSUT4在雷叶中增加蔗糖的输出速率(见下文)。

当Wray和Macia在不同DAP下进行测定时，两个品种之间的溶质浓度差异最大的是82和91 DAP。然而，在这些时间点上，两个品种的叶片光合作用没有发现差异。有趣的是，Wray在叶表皮表面的气孔数量明显减少，导致气孔导度降低，从而导致iWUE增加。因此，Wray系统中溶质浓度的差异可能归因于iWUE的增加，导致更高的水可用于运输和储存溶质。这种增长可能是最大的贡献者，大约6至10倍的茎汁量增加在Wray与Macia相比。

在分析的所有时间点上，Wray的iWUE与Macia相比均有统计学上的增加。从43 DAP开始，Wray也开始表现出增加的株高和生物量。通过监测Wray和Macia在生长季节根系的生长情况来确定Wray和Macia的茎部生物量差异是否反映在根系生物量的增加上，这将与更大的源强度和更多的碳分配给根系的假设相一致。如果是这样的话，在Wray中测量到的更大的茎汁量可以至少部分地解释为更大的根系和更高的iWUE从土壤中吸收更多的水。这个想法的一个推论是，在Wray，更大的根质量需要更多的蔗糖从叶片输出，以提供足够的固定碳到根，以形成更大的根系。再加上茎中含糖量高出24倍，这些数据表明Wray的来源强度要比Macia高得多。另一方面，如果Macia有更大的根系，则表明它在地下分配了更多的碳，而根:梢分配的变化可能有助于解释品种之间碳分配的差异。

高粱茎中染料转运研究及蔗糖运动路径

甜高粱茎在贮藏薄壁细胞内储存大量的可溶性糖;然而，蔗糖从韧皮部到末端汇组织的路径尚不清楚。先前对蔗糖分解代谢酶活性和茎注入放射性蔗糖积累模式的研究发现，蔗糖最初可能遵循同质途径进入生长的节间，但后来在成熟时转变为包括胞质运输步骤，尽管其沿运输途径的位置尚未确定[76，77，79]。为了描述蔗糖的运动路线，我们进行了染料运输研究，检查了蔗糖开始在茎内显著积累的节间伸长的阶段。我们将CF装载到源叶的韧皮部，并监测其转运到茎组织后的位置，确定了CF局限于韧皮部对质。这说明高粱茎韧皮部筛管与周围细胞是同质分离的，蔗糖不会通过胞间连丝从韧皮部扩散到邻近细胞中。因此，这意味着蔗糖必须通过筛元质膜出口，因此，成熟高粱茎组织的韧皮部卸载发生在质外。

假设的蔗糖在高粱茎中的移动路径与蔗糖在甘蔗节间的运输路径形成对比，蔗糖在甘蔗节间的运输路径是通过韧皮部的同质卸载，并通过胞间连丝完全通过同质移动到储存薄壁细胞[26，58- - - - - -60]。甘蔗和高粱是人猿科中关系密切的禾本科植物，它们被认为是在大约1000万年前从一个共同的祖先分化出来的[99]。因此，令人惊讶的是，蔗糖韧皮部卸载路径在它们之间会有所不同，尽管必须记住，两者都是驯化作物，经历了强烈的糖积累选择;因此，强大的选择压力可能导致甘蔗利用同质韧皮部卸载来在茎内积累高水平的糖，而甜高粱可能被选择利用非质韧皮部卸载来促进茎中的糖积累。研究与甘蔗和高粱有共同祖先但茎部不积累过多蔗糖的禾草的蔗糖韧皮部卸载途径，对了解这一性状的进化具有重要意义。

为了确定蔗糖在高粱茎中释放到韧皮部的途径，我们监测了藏红花素通过木质部的运输运动。木质部蒸腾流和韧皮部胞质是连续的[One hundred.- - - - - -102];因此，从木质部开始的橘红素运动表明韧皮部外质中的溶质能够扩散。我们观察到藏红花素能够通过茎静脉细胞壁扩散到储存薄壁细胞的细胞质中。这说明蔗糖可以直接从韧皮部细胞质扩散到贮藏薄壁细胞，而蔗糖到达贮藏薄壁细胞不需要蔗糖的摄取和同质转运。蔗糖到达薄壁细胞后，可被输入细胞并储存在液泡内[78]。红花素的运动数据表明，在高粱中，围绕静脉的肠壁鞘的木质化/钝化细胞壁并不是阻止溶质扩散的绝对屏障。类似地，先前有报道称，水、镧和亚铁离子能够沿着玉米叶片束鞘细胞的木质化/木质化放射状细胞壁的复合中间片层扩散，证明了水分从木质部向叶肉细胞和表皮细胞的蒸腾式运动路径[One hundred.]。这表明，像蔗糖这样的溶质在高粱叶脉的浆质液中，可能会从韧皮部浆质通过中间的鞘细胞壁移动到茎薄壁细胞的浆质，而不进入体质，从而减轻了SUT功能的需要。

建议的职能SbSUTs在叶子和茎上

通过qRT-PCR表达实验，我们确定SbSUT1，SbSUT2,SbSUT4在成熟叶和节间表达，而SbSUT3，SbSUT5,SbSUT6在这些组织中的表达水平非常低。这些数据表明SbSUT3，SbSUT5,SbSUT6不太可能对蔗糖韧皮部在源叶中的装载或蔗糖在茎中的分配起主要作用。我们对SbSUT3类似于该基因在各种组织中观察到的不可检测的表达，如先前报道的[75，85，86]。同样的，Qazi et al.和Milne et al.也没有检测到SbSUT5分别在节间叶和源叶中，而Shakoor等人只观察到极低SbSUT5在整个发育过程中在甜高粱和谷物高粱的多个组织中表达。感兴趣的是，目前的结果为SbSUT5和SbSUT6与Milne等人之前的报告在几个方面有所不同。[85]。这些作者报告说SbSUT5在花期的细长茎中表达，表明它可能在该器官内的蔗糖韧皮部卸载或恢复中起作用。他们还报告说SbSUT6在源叶中表达，在长节间中表达量较低，提示其可能在叶片中进行蔗糖韧皮部装载。有几种可能性可以解释基因表达的微小差异(低与不可检测)以及本研究结果与先前研究结果之间的少数差异。首先，Qazi et al.、Milne et al.和Shakoor et al.所研究的甜高粱和谷物高粱品种与本报告分析的品种不同。因此，基因型的差异，我们的品种和他们的品种可以解释SbSUT表达差异[75，85，86]。其次，我们从田间种植的植物中收集成熟的叶片和茎组织，而其他研究使用的是温室种植的植物。因此，环境差异也可以部分解释不同的结果[85，86]。Milne等人是唯一使用qRT-PCR进行测量的研究SbSUTs基因的表达。不幸的是，这些作者没有报告Cq值，因此有可能两项研究的原始表达水平相似，但本研究中的值被认为低于生物学意义的阈值。我们认识到，通过全组织测量，不可能确定一个基因是否可能在组织内有限数量的细胞中高度表达和功能，这可能导致高Cq值。未来的基因实验，以确定这些生物功能SbSUTs通过对丧失功能突变植株的表征，需要确定这些基因是否在高粱叶片和茎组织中的蔗糖分配中起重要作用。

根据他们的表达水平，SbSUT1，SbSUT2,SbSUT4被认为可能在成熟的叶片和茎组织中具有生物学作用。这三个基因在雷叶中的表达都比在马西娅叶中的表达高，两者的差异有统计学意义SbSUT2和SbSUT4。虽然这三个基因在Macia茎中的表达也比Wray茎高，但差异没有统计学意义。这些结果表明，基因表达的差异SbSUT2和SbSUT4，但不是SbSUT1，可能导致Wray和Macia成熟叶组织中蔗糖韧皮部负荷的差异，而这三个基因可能不会导致茎中蔗糖分配的差异，至少基于RNA表达水平。

我们对这三个基因的表达数据与之前的研究结果有所不同。不幸的是，由于混淆的命名法，我们把这些基因称为SbSUT2和SbSUT4,基于与水稻序列的同源性[39]，在Qazi et al.和Milne et al.的参考文献中，它们的名称相反。为了清晰地比较数据，我们使用我们的命名方案来引用这些基因(参见附加文件)8:基因加入数见表S4)。由于Qazi等人没有进行qRT-PCR，我们无法直接将他们的表达数据与本研究结果进行比较。然而，基于35个RT-PCR循环，这些作者报道SbSUT1和SbSUT2在灌浆前期，其甜高粱品种节间的表达量略低于籽粒高粱。在SbSUT4表达式。同时，Milne等人发现SbSUT1与甜高粱相比，在源叶中表达量更高，在成熟籽粒节间中表达量略高，而SbSUT2在源叶中无差异表达，在成熟节间中几乎不表达。SbSUT4在高粱叶片中，RNA仅增加了约两倍，在甜高粱节间中也有类似的升高。他们的发现与我们的发现之间存在差异的可能原因如上所述。

的潜在函数是什么SbSUT1，SbSUT2,SbSUT4？在玉米、ZmSUT1已被证明在叶片的蔗糖韧皮部负荷中起作用[82- - - - - -84]。高粱同源基因缺乏表达差异;SbSUT1这表明它在蔗糖韧皮部负荷中的功能是保守的，并且它不可能是品种之间碳水化合物分配差异的基础。的生物学功能SbSUT2和SbSUT4仍有待确定。基于与水稻OsSUT2和大麦HvSUT2相关蛋白的同源性[43，44]，以及在编码蛋白中存在保守的tono质体靶向基序[42]，我们假设SbSUT2定位于液泡膜，并发挥将蔗糖从液泡输出到细胞质的功能。的表达有统计学意义SbSUT2与Macia相比，Wray在成熟叶片中的蔗糖含量更高，这可能表明Wray能够更好地排出储存在叶片细胞液泡中的短暂蔗糖。然而，这一假设需要通过实验来评估。SbSUT2在Wray和Macia的茎组织中，该基因的表达没有差异，这表明该基因的表达差异不能解释两个品种之间茎糖储存的差异。

SbSUT4通过在酵母中的异种表达已证明具有蔗糖转运活性[85]和构成性地表达[75]。该蛋白被假设定位于质膜上，相关的3组/ IIa型SUTs被认为是糖传感器或低亲和力/高容量蔗糖转运体[15，17，39，42，103]。同源基因的功能缺失突变拟南芥没有任何明显的形态或碳水化合物分割相关的表型[104]。基于RNA表达，SbSUT4在雷伊叶中比在马西亚叶中表达得更高，这可能有助于更大的蔗糖韧皮部负荷能力。因此，总而言之，SbSUT2和SbSUT4只有高粱表达丰富吗SUT这些基因在成熟叶片中表现出不同的RNA表达，可能导致Wray与Macia在源强度上的差异。没有高粱SUT基因在Wray和Macia的茎组织中表达有显著差异。这些数据表明，基于RNA表达SbSUT基因不太可能解释这些品种之间茎糖积累的差异。

另一种解释Wray和Macia之间碳水化合物分配差异的可能性是韧皮部运输和卸载的不同汇控制。在开花阶段，甜高粱和谷粒高粱的两个主要竞争汇是茎和正在发育的穗。我们没有分析SbSUT基因表达在发育的穗，因此我们的讨论仅限于成熟的茎组织。在这里，我们发现Wray和Macia在茎组织中的糖积累有显著差异。在Wray中，从开花到生理成熟，茎中溶质含量增加了约24倍，表明茎库组织在积极积累糖。此外，虽然我们没有观察到差异SbSUT在干组织中的表达，我们发现SbSUT2和SbSUT4与Macia相比，在Wray源叶中表达上调。同样，我们观察到，相对于后者，前者在77 DAP时源叶片的光合作用增加。这些数据表明，Wray的强茎汇可能上调了叶片内的碳同化和韧皮部蔗糖负荷，从而增加了蔗糖向茎节间的输送。这一假设的先例是由实验提供的，在这些实验中，汇强度的改变导致了变化SUT基因的表达。例如，在甜菜的叶片蒸腾流中添加蔗糖(甜菜属L.)模拟了碳汇需求的减少，导致了碳汇需求的减少BvSUT1表达与活动，这将导致源叶中韧皮部蔗糖负荷减少[105]。同样，人们发现，不断增加的碳汇需求也能起到调节作用SUT表达从而控制蔗糖的运输。Zhou等人验证了一个假设，即对碳骨架的汇需求调节了豌豆发育过程中蔗糖转运体的活动。Pisum一L.)子叶[29]。研究人员发现，进入发育中的豌豆子叶的蔗糖是一种上调的信号PsSUT1表达，从而将同化物的汇需求与蔗糖进口联系起来。最后，在甘蔗中，通过遮蔽除一个源叶外的所有源叶以增加相对汇强度，发现茎部蔗糖浓度的降低与叶片韧皮部运输的增加和光合作用速率的提高相关[27]。这些发现表明，Wray中强大的茎汇组织可能使用类似的机制来控制韧皮部运输和碳水化合物向茎的分配。

高粱茎韧皮部蔗糖向贮藏薄壁细胞转移的模型

从染料装载和SbSUT我们提出了蔗糖在高粱茎组织中的卸载和储存模型(图2)。10)。由于韧皮部筛管与周围细胞是同质分离的，这表明蔗糖一定是通过筛元/伴胞质膜外排的。我们假设这种功能是由SWEET外排蛋白介导的，因为筛元质膜上的pH梯度，以及蛋白质的拓扑结构和H+SUTs /蔗糖共转运活性预测蔗糖从质中摄取而不是释放。因此，我们得出结论SbSUTs不太可能在Wray或Macia茎中的蔗糖韧皮部卸载中起作用，而是在韧皮部筛管中恢复蔗糖，以帮助维持远源和汇组织之间的渗透梯度，和/或在蔗糖摄取到周围细胞中起作用。在流出到细胞质后，蔗糖能够迁移到储存薄壁细胞的细胞壁中，如藏红花素扩散所示(图2)。10)。sweet、SbSUT1和/或sbsu4的作用可能是沿着韧皮部后卸载路径(例如，肠鞘)或直接进入茎储存薄壁吸收蔗糖。如果蔗糖被韧皮部薄壁细胞或间质鞘细胞吸收，它可能通过胞间连丝转移到茎储存薄壁细胞(图2)。10 b)。重要的是，从韧皮部脂质到茎储存薄壁细胞，存在藏红花素和潜在蔗糖的质外转运途径，但这并不表明该途径对茎组织内蔗糖的总体积累有重要贡献。例如，筛元/伴生细胞复合体外的细胞的立即摄取可能占细胞质摄取的大部分。除了评估蔗糖沿细胞质路径转移到茎薄壁细胞的速率外，未来的研究还需要确定1)不同品种高粱茎中蔗糖韧皮部卸载是否存在异质性[1062)从一条道路到另一条道路的发展转变[12，573)甜高粱茎中蔗糖积累的一个途径优于另一个途径。

图10
图10

高粱茎韧皮部蔗糖向贮藏薄壁细胞转移的模型。韧皮部伴细胞(CC)和筛元(SE)为绿色;韧皮部薄壁(PP)，橙色;红色为肠鞘(MS)细胞;储存薄壁细胞(SPC)为白色。淡蓝色的背景表示出离体空间。SPC中的液泡显示为灰色。间连丝为细的白色矩形。红色虚线(一个)表明蔗糖的全胞质途径。黑色虚线(b)表示蔗糖最初通过细胞质，然后进入PP或MS细胞，黑色虚线表示蔗糖的同质运动。SUT蛋白用蓝色圆圈表示，箭头表示蔗糖摄取的方向，数字表示SbSUT1和/或SbSUT4(1;4)，或SbSUT2(2)。绿色矩形带箭头表示SWEET蔗糖外排物，紫色菱形带箭头表示位于细胞质上的TST蛋白

全尺寸图像

对于储存薄壁细胞，我们预测蔗糖是通过TSTs转运到液泡中[52，107，108]，因为这些转运蛋白先前已被证明在高粱茎组织中表达[75，109]。如果蔗糖从液泡中输出，SbSUT2可能会发挥这一作用。基于这一模型，一种诱人的可能性是甜高粱茎中蔗糖积累的关键步骤是由TST控制的，正如最近报道的甜菜中蔗糖储存的控制[52]。虽然甘蔗和甜高粱可能被选择利用不同的途径从茎部卸载蔗糖韧皮部，但研究甜高粱和甘蔗中TSTs的功能，以确定在世界主要糖作物的驯化过程中是否已经收敛地选择了相同的基因功能，将是非常有趣的。未来的研究将调查这种可能性。

结论

甜高粱与普通高粱相比，其茎内的糖积累不是由于韧皮部卸载途径的差异。此外，茎韧皮部组织与周围细胞是同质分离的，这表明蔗糖是在胞浆外卸载的。木质化的肠鞘不能阻止韧皮部浆质向茎储存薄壁细胞壁的浆质扩散，表明蔗糖可能遵循浆质途径。这些结果表明，蔗糖在高粱茎中的运动路径与密切相关的牧草甘蔗茎中的糖积累路径不同。此外，气孔密度、水分利用效率和碳同化方面的差异也可能导致Wray的成熟叶源强度高于Macia。最后，根据RNA表达水平，SbSUTs不太可能导致Wray和Macia茎之间的糖积累差异，但是SbSUT2和SbSUT4可能对雷的叶源强度增加有一定作用。

方法

植物材料和生长条件

甜高粱种子(高粱二色的L. Moench)品种Wray和谷物高粱品种Macia由内布拉斯加大学林肯分校的Ismail Dweikat博士提供。植物于2013年和2014年夏季在美国密苏里州哥伦比亚市密苏里大学南方农场研究中心(北纬38°54′，西经92°16′)种植。种子被随机分为三个试验区(按地点和时间划分)，每个试验区为每个高粱品种设置一个地块。每个地块由四行相邻的6.6米长组成。外两行作为缓冲，而所有测量参数均取自中间两行植物。每行总共种了100颗种子。在三叶期，将幼苗手工稀疏至每行20株，株距约为0.3 m。

生长、生物量和产量测量

在不同的DAP下，测量了许多与生物量相关的参数，包括主茎高(从土壤表面到穗底测量)和单株叶数和分蘖数[110]。此外，利用LI-3000叶面积仪(LI-COR Inc.， Lincoln, NE)测量总叶面积(LA)、植株顶部第2片叶的长度和宽度(tLL和tLW)、中高叶(mLL, mLW)和植株基部叶(bLL, bLW)。在生理成熟时收集主茎(以种子基部脐上黑色层的存在来定义)，分离节间(IN)并称重以确定鲜重(FW)。IN段在60℃下烘干°C处理5 d，得到干重。测量主茎直径并计算位于主茎基部、中部和顶部的三个in中间的茎周长。

收获后测定了粮食产量的各组成部分。数完主茎的穗数后，采收主穗，晾干，称重，确定总重。然后仔细地脱粒主穗，以确定每粒种子的总重和数量。

白利糖度的内容

糖度测量表明果汁中溶质的含量，是在收获后直接测定的。除去主茎上的穗和叶后，每个节间被分离并立即加工。每个部分的果汁通过台式动力磨机SC-3型甘蔗榨汁机(juernet, Mulligan Associates Inc.， Jupiter, FL, USA)进行提取。当茎段很小时，用大蒜压榨机手工提取汁液，并通过双层粗棉布过滤。随后，使用量筒测量果汁体积，并使用Atago 3810数码手持袖珍折射仪(PAL-1, Atago USA Inc.， Bellevue, WA, USA)用1ml果汁测定Brix百分比。记录了植物在开花和生理成熟时的白锐度测量。此外，还利用一组单独的植物，利用未剪断的主茎，剥去叶片，不带穗，测定成熟时的总果汁体积和白度百分比。

气体交换和叶绿素荧光测量

使用便携式红外气体交换系统(LI-6400XT, LI-COR Inc.， Lincoln, NE, USA)在不同DAP下对完全展开的源叶片进行气体交换测量[111，112]。净光合作用网， μmol m−2年代−1)和气孔导度(g年代， mol m−2年代−1)，在光子通量密度为2000 μmol m时测量速率−2年代−1(通过运行初始光响应曲线确定;额外的文件6:图S4)和环境CO2浓度为400 μmol mol−1。在上午9点至下午12点之间，在43、77、82和91 DAP下对每个高粱品种的15株植株进行了测量。瞬时水利用效率(iWUE)由下式确定:

$ $ \ mathrm {iWUE} \ \离开(\ upmu \ mathrm{摩尔}\ {\ mathrm{摩尔}}^{1}\右)= {\ mathrm{一}}_ {\ mathrm{净}}\离开(\ upmu \ mathrm{摩尔}\ {\ mathrm{摩尔}}^ {1}{\ mathrm{年代}}^{1}\右)/ \ mathrm {T} \ \离开(\ mathrm{摩尔}\ {\ mathrm{摩尔}}^ {1}{\ mathrm{年代}}^{1}\右)$ $
(1)

其中T为蒸腾速率。

利用LI-6400XT红外气体分析仪附带的叶片荧光仪测定了光系统II在适应黑暗的叶片上的最大光化学效率(Fv/Fm)。叶绿素荧光测量在完全展开的源叶片上，使用56 DAP的暗适应剪辑适应黑暗至少30分钟。使用美能达SPAD-502米(Spectrum Technologies, Plainfield, IL)估算43、77、82和91 DAP下的叶绿素含量[113]。

气孔数

在植物花期叶片正面和背面采集表皮叶印记[j]。114，115]。将一滴“强力胶”涂在目标叶子区域后，将一张干净的玻璃载玻片轻轻地压在上面，并牢牢地按住它，直到粘合剂干燥。玻璃载玻片被小心地从叶子表面抬起，这导致表皮印痕直接放置在玻璃载玻片上。每个基因型5株，在成熟的、完全展开的源叶中心处的两个表皮表面采集了3个区域。使用20倍放大的尼康Eclipse 80i复合荧光显微镜在亮场照明下拍摄图像，并使用开源ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)，以计算每个视场的气孔数目。

染料输运试验

饲养实验采用5,6-羧基荧光素二乙酸酯(CFDA, 50 μg/ml, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，如前所述[36，116]。秋冬两季在高压钠灯照明(1600 μmol / m)的温室内种植−2证券交易委员会−1)，在30/24°C的昼夜温度下提供16小时的光周期。在花前或花中节间完全伸长的植株用于实验。将穗下第三或第四个成熟源叶的切尖浸入30ml CFDA溶液中1小时。5小时后，将被喂食叶片下方多个节间处完全伸长的茎组织的横切面放置在水中，并使用配备100 w汞灯的尼康Eclipse 80i荧光显微镜，分别使用紫外线(360- 370 nm激发滤光片和420 nm长通发射滤光片)或蓝光(465- 495 nm激发滤光片和515- 555 nm带通发射滤光片)进行检查。117]。

为了研究红花素O染料的运动，将开花后的高粱植株从茎基部切开，将切开的末端浸入0.07%的红花素O水溶液中2小时[118]。将横切的茎切片置于水中，在显微镜下分别使用亮场、紫外线和绿色照明(530- 560 nm激发滤光片和590- 650 nm带通发射滤光片)进行检查。

所有图像均使用尼康DXM1200F相机和尼康NIS Elements F软件(3.0版)拍摄。对于每种类型的照明，一个图形中的所有照片都是使用相同的显微镜和相机设置拍摄的，包括相同的增益设置。

总RNA的分离和逆转录

为了进行基因表达研究，在花期从田间种植的植物中收集成熟的源叶和茎样本，立即在液氮中冷冻，保存在干冰上，并在- 80°C保存直至处理。叶组织采自叶片中部，不采中肋，茎组织采自主茎中高处节间中部。每个品种使用5个生物重复。

叶片组织在液氮中研磨成细粉，使用预冷臼和杵。为了研磨茎组织，干冰首先在低温组织研磨机中研磨。所得到的干冰粉被丢弃，冷冻的茎碎片被立即放入冷冻研磨机进行加工。将粉末状组织收集到15毫升的冷冻管中，放置在干冰上，直到所有样本都被处理。

用1ml TRIzol®试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)和200 μl氯仿，从100 mg冷冻的地面组织中提取总RNA到1.5 ml冷冻的Eppendorf管中。取175 μl上清液分离RNA。RNA用RNase-free DNase (Qiagen, Valencia, CA, USA)处理，然后用RNeasy MinElute Cleanup试剂盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)分离。将RNA溶解于无rnase的水中，用分光光度法和凝胶电泳法评价其质量。

用1 μg的总RNA用iScript合成互补DNA (cDNA)TM逆转录混合(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)，根据制造商的协议。寻找合适的内参基因进行规范化SbSUT对微管蛋白(Sb02g037260)、泛素(Sb02g021080)和肌动蛋白(Sb01g010030)这几个广泛应用的内源内参基因的表达稳定性进行了检测，但它们在叶和茎组织间的表达不稳定。因此，采用外源基因荧光素酶作为内参基因[119，120]。在cDNA合成之前，将50 pg荧光素酶RNA (Promega, Madison, WI, USA)加入RNA中，作为定量实时逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)实验的参比基因。

qRT-PCR扩增及数据分析

本研究中使用的引物在附加文件中列出8表S4。引物被设计为只特异性扩增SbSUT感兴趣的基因，并为每个基因产生100 - 150bp大小的产物SbSUT基因。首先将引物序列与高粱基因组(高粱二色的V2.1可在www.phytozome.net)，以确保目标序列具有独特的同源性，并从Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA)订购。PCR条件在温度梯度上进行优化，以确定最佳退火温度，并确保扩增单个PCR产物。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分析，以确认它是预期大小的单个产物。PCR产物使用RapidTip纯化试剂盒(diffity Genomics, West Henrietta, NY, USA)纯化，并测序以确认PCR引物对目标基因特异性。所有SbSUT基因特异性引物设计方法如上所述SbSUT5底漆。该引物集先前由Milne等人发表。[85]，并按上述程序进行验证。

qRT-PCR实验采用5个生物重复，每个重复4个技术重复，非模板对照用无核酸酶水代替cDNA。在每个反应中，10 ng cDNA与5 μl的ScoFast™EvaGreen®Supermix with Low ROX (Bio-Rad, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)混合，并加入0.4 μM的正向和反向引物，最终体积为10 μl。一个CFX384连接TM采用Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)进行分析。扩增程序如下°摄氏30秒，然后是40个95度循环°C为5 s, 57°温度30s，最终温升0.5°C从65到5秒°C至95°C。

采用Pfaffl法对qRT-PCR数据进行分析[121]。首先，用下式确定参比基因和靶基因的PCR效率:

$ $ \ mathrm {E} = 1{0} ^{左\ [1 / \ mathrm {m} \右]}$ $
（2）

式中，E为PCR效率，m为对已知序列稀释的cDNA进行qRT-PCR分析得到的标准曲线斜率。然后，根据E和样本相对于对照表达量的Cq偏差与内参基因的比较，计算目标基因的相对表达比，如下式所示:

$ $ \ mathrm {R} ={\离开({\ mathrm {E}} _ {\ mathrm{目标}}\右)}^{\三角洲\ mathrm C {} \ mathrm {q}} {{} _ {\ mathrm{目标}}}^{\离开(\ mathrm{控制}- \ mathrm{样本}\右)}/{\离开({\ mathrm {E}} _ {\ mathrm {ref}。}\右)}^{\三角洲\ mathrm C {} \ mathrm {q}} {{} _ {\ mathrm {ref}。}}^{\离开(\ mathrm{控制}- \ mathrm{样本}\右)}$ $
（3）

其中R是相对表达比，E目标为目的基因的PCR效率(SbSUTx), Eref。为内参基因(荧光素酶)的PCR效率，ΔCq目标为对照减去目标基因样本的Cq偏差，ΔCqref。为对照减去参比基因样本的Cq偏差。Cq值大于31表明基因表达水平低于可精确测量的水平[90- - - - - -92]。用5个生物重复的折叠变化值的平均值来绘制基因的表达水平SbSUT对两个品种在两个组织中的基因进行分析，并绘制各自的表达水平SbSUT在Wray中使用Macia中相应的基因。

统计分析

统计分析采用SAS (version 9.3, Cary, NC, USA;SAS Institute, Inc.， 1998)。采用混合模型方差分析(PROC mixed, SAS)确定Wray和Macia之间是否存在显著差异，分别以品种和植物作为固定效应和随机效应。所有结果均以均数±标准误差(SE)报告;品种间差异显著(p≤0.05)。

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致谢

我们感谢两位匿名审稿人的评论，Felix Fritschi使用LI-3000, Pat Brown和Gene Stevens在收获和测量高粱茎汁体积和白利度值方面提供建议，Matt Boyer和Kristen Leach帮助处理高粱样品进行白利度测量，以及John Boyer和Priya Voothuluru在染料运输研究方面提供建议。本研究由美国能源部科学办公室，生物与环境研究办公室(BER)资助，批准号:DE-SC0006810，由美国国家科学基金会植物基因组研究计划(批准号:IOS-1025976)到DMB。

作者信息

作者指出

  1. r·弗兰克·贝克

    现地址:美国密苏里州哥伦比亚罗林斯街1201号邦德生命科学中心120号密苏里大学分子细胞学中心，邮编65211-7310

  2. 卡桑德拉Hoffner

    目前地址:Sigma-Aldrich Biotech, 545 S. Ewing, Saint Louis, MO, 63103, USA

从属关系

  1. 密苏里大学生物科学部，跨学科植物组和密苏里玉米中心，110塔克霍尔，哥伦比亚，密苏里州，65211，美国

    Saadia Bihmidine, R. Frank Baker, Cassandra Hoffner和David M. Braun

作者
  1. Saadia Bihmidine
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  2. r·弗兰克·贝克
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  3. 卡桑德拉Hoffner
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  4. 大卫·m·布劳恩
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相应的作者

对应到大卫·m·布劳恩。

额外的信息

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

SB进行了形态计量学相关测量、茎汁体积和白锐度测定、光合作用相关参数、qRT-PCR分析、统计分析，并撰写了稿件。CH进行了与生长有关的测量、气孔计数和叶面积分析。RFB进行了染料示踪剂研究并起草了手稿。DMB构思了这项研究，参与了它的设计和协调，并帮助起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

附加文件

附加文件1:表S1。

田间种植的马马属和雷属植物在种植后不同天数的形态参数测定(DAP)。数值为N = 5的平均值±标准差。小写字母表示两行间均值差异显著，p≤0.05一个， p≤0.01b，或p≤0.001c。缩写:MS LN，主茎叶数;主茎叶面积;tLL，顶部叶长;mLL，中间叶长;球茎，基部叶长;tLW，顶叶宽度;mLW，中间叶宽;bLW，基叶宽度;TN，分蘖数; SPAD is a relative measure of chlorophyll; ns, not significant. (PDF 70 kb)

附加文件2:图S1。

百分比(一个)及总果汁量(B生理成熟时收获的整个主茎。数值为N = 5的平均值±SE，星号表示两条线在的平均值有显著差异p≤0.05。Macia =黑盒子，Wray =白盒子。(PDF 64kb)

附加文件3:图S2。

顶部Brix百分比(一个)、中等高度(B)和基底(C)节间在播种后的不同日子取样。数值为N = 15的平均值±SE，星号表示两条线在的平均值有显著差异p≤0.05。Macia =黑盒子，Wray =白盒子。(PDF 55kb)

附加文件4:表S2。

每组的平均Cq值±SESbSUT雷属植物和马属植物的叶和茎组织中均存在基因。(PDF 87kb)

附加文件5:图S3。

田间种植的马属和雷属植物叶片正面和背面每视野平均气孔数。每个品种N = 5株，每个叶片表面共采集N = 3个印痕。数值为平均值±SE，星号表示每个表面的两条线之间或每个品种的相对表面之间的平均值有显著差异p≤0.05。Macia =黑盒子，Wray =白盒子。(PDF 51kb)

附加文件6:图S4。

种植后64 d，田间种植的马马属和雷属植物叶片的光响应曲线。净同化(A)绘制在y轴上，光合有效辐射(PAR)绘制在x轴上。数值为N = 5的平均值±标准差。Macia =黑盒子，Wray =白盒子。两个品种间无统计学差异。(PDF 53kb)

附加文件7:表S3。

田间种植的马属和雷属植物适应黑暗叶片的叶绿素荧光(Fv/Fm)测定。在N = 5种植56天后进行测量。两个品种间无统计学差异。(PDF 88kb)

附加文件8:表S4。

用于qRT-PCR分析的PCR引物组列表。(PDF 80kb)

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引用本文

Bihmidine, S.， Baker, r.f.， Hoffner, C.。et al。蔗糖在甜高粱茎中的积累是通过外质韧皮部卸载发生的，不涉及差异蔗糖转运蛋白表达式。BMC Plant Biol15，186(2015)。https://doi.org/10.1186/s12870-015-0572-8

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关键字

  • Apoplasm
  • 碳水化合物分区
  • Carboxyfluorescein
  • 薄壁组织
  • 韧皮部
  • 高粱
  • 阀杆
  • 蔗糖
  • SUT
  • 合胞体

BMC植物生物学

ISSN: 1471 - 2229

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