玉米籽粒叶酸代谢相关基因的全基因组鉴定及转录分析gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

玉米是全球主要主食作物，含有各种浓度的维生素。叶酸是必需的水溶性B-维生素，其在生物体中的一种碳（C1）供体和受体中起重要作用。为了了解玉米叶酸新陈代谢的理解，我们进行了密集的gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba利用公开的数据库分析筛选与叶酸代谢有关的基因，然后检查两个玉米自交系籽粒中叶酸衍生物的转录本表达模式和图谱。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

共鉴定了与16种叶酸代谢相关酶对应的36个候选基因。玉米基因组包含叶酸和C1代谢所需的所有酶，在所有被调查的物种中具有高度保守的功能域。系统发育分析表明，玉米中的这些酶在整个进化过程中都是保守的，并且与高粱和小米中的酶具有高度的相似性。对2个玉米自交系的LC-MS分析表明，5-甲基四氢叶酸是叶酸衍生物在幼粒中的主要形式，而5-甲酰基四氢叶酸在成熟粒中的主要形式。大部分与叶酸和C1代谢相关的基因在这两种玉米株系之间表现出相似的转录表达模式，授粉后第6天(DAP)的转录丰度最高，而授粉后第12天(DAP)和第18天(DAP)转录丰度较低。与DAP 30种子相比，成熟干种子中5-甲基四氢叶酸含量减少，5-甲酰四氢叶酸含量增加。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

玉米和其他植物物种之间涉及叶酸和C1代谢的酶。叶酸和C1代谢在转录水平的年轻开发玉米种子中活跃。gydF4y2Ba

叶酸是必需的水溶性b族维生素，包括四氢叶酸(THF)及其衍生物。叶酸作为单碳(C1)供体和受体在所有物种中都扮演着重要的角色。叶酸分子由一个蝶啶环、一个对氨基苯甲酸(p-ABA)环和一个或多个l -谷氨酸的尾部组成。C1取代基连着NgydF4y2Ba^5gydF4y2Ba蕨类植物和/或n的位置gydF4y2Ba^10gydF4y2BaP-ABA的位置形成具有不同性质和功能的所有类型的叶酸衍生物[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba叶酸的生物合成仅限于植物和微生物，而不是动物。合成四氢叶酸所需的反应在植物中与在细菌和真菌中基本相同[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．在胞质中，GTP环水解酶I (EC:3.5.4.16, GTPCHI)催化GTP转化为二氢蝶呤的第一步，二氢蝶呤醛缩酶(EC:4.1.2.25, DHNA)裂解DHN的侧链形成6-羟甲基二氢蝶呤。在质体中，4-氨基脱氧chorismate (ADC)由ADC合酶(EC:2.6.1.85, ADCS)生成，并由ADC裂解酶(EC:4.1.3.38, ADCL)酯化形成p-ABA。在线粒体中，Pterins和p-ABA随后被浓缩、谷氨酰胺化并还原成THF单氨酸。在线粒体中，二氢叶酸被羟甲基二氢pterin焦磷酸激酶(EC:2.7.6.3, HPPK)和植物双功能酶二氢pteroate合成酶(EC:2.5.1.15, DHPS)转化，然后通过二氢叶酸合成酶(EC:6.3.2.17, DHFS)作用于第一个谷氨酸。随后，二氢叶酸被二氢叶酸还原酶还原为THF (EC:1.5.1.3, DHFR)。四氢呋喃单酯可分别运输到胞质和质体中，并在不同的细胞室中通过folylpolyglutamate合成酶(EC:6.3.2.17, fgs)的作用而发生聚谷氨酰胺化。在C1代谢过程中，聚谷氨酰THF被用作甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)羟甲基转移酶从丝氨酸生物合成5,10-亚甲基THF的辅助因子(EC:2.1.2.1, SHMT)，而丝氨酸作为C1的替代供体。四氢呋喃被甘氨酸脱羧酶(EC:1.4.4.2, GDC)回收，甘氨酸脱羧酶参与了甘氨酸和四氢呋喃形成5,10-亚甲基-四氢呋喃的过程，甘氨酸脱羧酶复合物由四种不同的蛋白质组成;即P-(GDCP)、H-(GDCH)、T-(GDCT)和l -蛋白[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．然后，5,10-亚甲基-四氢呋喃可被5,10-亚甲基-四氢呋喃脱氢酶/5,10-亚甲基-四氢呋喃环水解酶可逆氧化为10-甲酰四氢呋喃(EC:1.5.1.5 3.5.4.9, DHC)。化合物10-甲酰四氢呋喃脱甲酰酶(EC 3.5.1.10, 10-FDF)能水解10-甲酰四氢呋喃，释放THF和甲酸，而10-甲酰四氢叶酸合成酶(EC:6.3.4.3, FTHS)能消耗THF和甲酸，重新生成10-甲酰四氢呋喃。此外，亚甲基四氢叶酸还原酶(EC:1.5.1.20, MTHFR)可将5,10-亚甲基thf还原为5-甲基thf (5- m - thf)， 5-甲基thf可作为甲基供体从同型半胱氨酸合成蛋氨酸(EC:2.1.1.14, MS)。此外，5-甲酰四氢呋喃环寡酶(EC:6.3.3.2, 5- fcl)和5-甲酰四氢呋喃环寡酶样蛋白(5- fcll)可催化5-甲酰四氢呋喃(5- f -THF)转化为5,10-甲基四氢叶酸;而SHMT1促进5-F-THF的形成[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．总的来说，有16种酶参与了叶酸和C1在植物中的代谢(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

由于缺乏功能性DHNA，HPPK / DHP，ADC，ADCL和DHFS，人类不能合成叶酸gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba因此，需要在诸如小麦粉等食物中的叶肉强化[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．此外，已知过度表达叶酸生物合成和代谢酶，源自植物或非植物生物体是一种有效的替代方案，可增强粮食作物，包括番茄，稻米和玉米（玉米）中的叶酸含量[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．玉米是全球主要粮食作物。到目前为止，关于玉米叶酸代谢基因的研究还很少[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．例如，从玉米中克隆了第一个DHFR-TS基因，ZmDHFR-TS的RNA转录本显示在发育中的玉米粒和分生组织中积累到高水平[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．另一个涉及叶酸代谢的基因在gydF4y2Ba布朗中脉2gydF4y2Ba（gydF4y2BaBM 2.gydF4y2Ba)突变体，其中一个功能性的MTHFR基因显示转录水平降低。结果，突变体呈现出与木质素浓度降低和木质素组成改变相关的红褐色[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．然而，目前还没有关于玉米中叶酸代谢基因的系统特征的报道，也不知道叶酸在玉米籽粒形成过程中如何流动。因此，在全基因组水平上鉴定叶酸相关基因及玉米籽粒形成过程中叶酸代谢特征，可为了解玉米中叶酸代谢及叶酸强化玉米品种的分子育种奠定基础。gydF4y2Ba

在这项研究中，一个集中gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba使用所有公开可用的数据库对参与叶酸代谢的基因进行分析。我们发现玉米基因组含有叶酸和C1代谢所需的所有酶，其特征在于高度保守的结构域，类似于其他物种。为了进一步推进我们对玉米叶酸新陈代谢的理解，选择两种具有显着差异的成熟种子总叶酸差异的代表性玉米近交系，以研究叶绿体相关基因的表达和叶酸衍生物的分析。gydF4y2Ba

玉米推定叶酸代谢基因的鉴定与系统发育分析gydF4y2Ba

为了了解叶酸在玉米中的代谢，我们首先在全基因组范围内研究了拟南芥和玉米之间所有叶酸相关基因的保存，因为与其他植物相比，拟南芥中叶酸代谢途径已经被很好地描述了。叶酸代谢包括叶酸合成和C1循环。利用拟南芥同源物，通过BLAST鉴定了玉米中与叶酸合成有关的酶。因此，鉴定出8种酶gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.分别为HPPK / DHPS和ADC的一个正序，分别为GTPCHI，DHNA，DHFS和FPG，三种用于ADCL，4个用于DHFR。在每组玉米直肠（如GTPCHI，DHNA，DHF）和DHFR中，蛋白质相似度均高于90％。两种FPGS orthologs之间的蛋白质相似性为77.8％。在Adcl Orthologs之间观察到相当低的蛋白质相似性（AdCl1和AdCl2之间的45.3％）。这些结果表明，叶酸合成中涉及的大多数末端均在玉米中得到保守。gydF4y2Ba

还鉴定了含有C1代谢的八种酶，其分别被鉴定为SHMT，GDC复合物（GDCH，GDCP和GDCT），DHC，MTHFR，MS，10-FDF，FTH和5-FC1。因为shmt1是拟南芥的主要功能性Shmt酶[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，玉米SHMT1，拟南芥SHMT1最接近的对等物，被用于本研究。结果表明，玉米GDC蛋白复合物由1个GDCP、1个GDCT和4个GDCHs组成，与玉米GDCH的序列相似性最低，为71.2%。10-FDF和FTHS各有一个正交谱;MTHFR和5-FCL各有两个直系基因，每对直系基因之间的序列相似性分别为94.5%和51.2%。DHC和MS各有3个同源性，同源性最低的分别为61.0% (FOLD2和FOLD3之间)和96.3% (MS1和MS2之间)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这些结果表明，玉米蛋白质水平C1代谢中涉及的大多数正端表现在玉米中高度保守。gydF4y2Ba

为了探讨玉米中鉴定的叶酸组合相关蛋白质是否含有酶活性的保守结构域，来自植物的所有同源物（gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba高粱、水稻、小米和拟南芥)、哺乳动物(gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba人，大鼠和小鼠）和微生物（gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba酵母和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba)，使用简单模块化架构研究工具进行分析[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba(聪明的)。正如预期的那样，参与叶酸代谢和C1循环的酶在玉米和其他物种之间很大程度上是保守的。代表蛋白来自玉米，拟南芥和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba显示在表格中gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．三种物种叶酸合成中所涉及的酶的详细比较导致了以下有趣的结果。首先，相同的PFAM结构域具有不同的长度。例如，FPGS和DHFS含有MUR_LIGASE_M结构域，其负责分别将谷氨酸附着到甲磺酰胺或单氟酰胺。然而，FPG中的Mur_Ligase_M域是36-氨基酸短于玉米和拟南芥中的DHF中的36-氨基酸（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba其次，GTPCHI在植物中演化了两种GTP_CYCLOHOI域的重复，而只有一个gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba（桌子gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.第三，三种酶，包括ADC，HPPK / DHP和DHFR / TS，已经进化为植物中的双官能酶。例如，玉米和拟南芥ADC都包含两个Gatases，一个Anth_synt_I_N和一个Chorismate_Binding域，其在功能上对应于anth_synt_i_n和含Chorismate_binding的paba和含Gatase的pabbgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba生产ADC。在HPPK/DHPS和DHFR/TS中也观察到类似的现象gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.参与C1反应的两种酶在不同物种中含有不同数量的PFAM结构域。例如，玉米GCST中有三个GCV_T结构域，而拟南芥和玉米中有两个gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．五个域名gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在拟南芥和玉米中发现S-methyl_trans、Pterin_bind、B12-binding、B12-binding_2和Met_synt_B12为Meth_synt_1和Meth_synt_2的两个结构域gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

从高粱、水稻、小米、拟南芥、人、大鼠、小鼠、酵母和水稻中提取叶酸相关蛋白的系统发育树gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba使用邻近加入方法构建。玉米和高粱或小米之间的大多数思克信誉价值高于70％，暗示玉米酶与高粱和小米之间的酶之间的密切关系。这些观察结果与玉米，高粱和小米共享共同的C4源[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.在动物中不存在一些同源物，包括ADC，ADCL，DHNA，HPPK / DHP和DHFS（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，其余来自植物和动物的同源物被分为两个同胞类群(fig .;gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.有一种特殊类型的树，其植物分支被分为多个类，每个类包含大部分的植物物种，如DHC、ADCL、5-FCL和GDCH(表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.其余树木的特征是，所有植物同源物都被归类为单个疏水物，其中玉米矫形器均以作为单一基因存在，例如ADC，HPPK / DHPS，GDCT，GDCP，SHMT1，HPPK / DHPS，10-FDF和FTH，或作为多种基因，如DHNA，DHFS，GTPCHI，DHNA，DHFS，DHFR，MS，FPG和MTHFR（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba；表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这些结果表明，叶酸和玉米植物相关蛋白质在玉米中保存，并且在进化过程中，这些蛋白质的功能的分化复杂化。gydF4y2Ba

玉米在参与叶酸和C1代谢的基因数量中不同于拟南芥。例如，在玉米中鉴定在玉米中的DHFR，GTPCHI，DHFS和GDCH的更多直域，以及DHNA，10-FDF，FPG，DHC，HPPK / DHPS和GDCP的较少。这些酶，四种，包括ATDHFS，ATFPGS1，ATFPGS2和ATFPGS3，用作拟南芥中的连接酶[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.AtDHFS突变导致胚胎致死率[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，而FPGS1或FPGS2功能障碍导致在黑暗或光照下对低氮的反应异常[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．虽然DHFS和fpg具有相同的结构域，但它们在拟南芥中具有不同的功能。在玉米中，相应的同源基因中也发现了Mur_ligase_M结构域，包括两个DHFSs和两个fpgs，进一步对这些同源基因的生化和遗传研究将阐明它们的生物学功能。gydF4y2Ba

DHNAs在拟南芥和玉米之间有不同的表达模式[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．在拟南芥中鉴定出3个DHNA同源基因，其中gydF4y2BaAtFolB2gydF4y2Ba在根，茎，金属，幼叶和成熟的叶子中高度表达，而且gydF4y2BaAtFolB3gydF4y2Ba是发现不了的gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．然而，只有两个dha同源基因被鉴定(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.的成绩单gydF4y2BaFOLB1玉米gydF4y2Ba和gydF4y2Bafolb2玉米gydF4y2Ba在根，芽，发展叶子和流苏，种子[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．这些观察意味着玉米orthologs可能比拟南芥的角色发挥不同。gydF4y2Ba

玉米内核中的叶酸分析gydF4y2Ba

玉米粒是人体叶酸的主要来源[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．研究叶酸在玉米籽粒形成和成熟种子中的生物合成对了解叶酸在玉米中的代谢通量具有重要意义。为此，选择了两个具有代表性的玉米自交系，干种子中总叶酸含量差异显著。Ji63来源于中国，属于NSS亚群体，系谱为(127-32 × Tie84) × (Wei24 × Wei20);GEMS31来自美国，属于TST亚群，系谱为2282-01_XL380_S11_F2S4_9226-Blk26/00 [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．采用液相色谱-串联质谱法(LC/MS)测定了2个自交系不同产地的干种子中的5-F-THF和5-M-THF含量。不考虑年份间的显著差异，GEMS31的总叶酸含量远远高于Ji63, 2010年的最小差异为12.9倍(见表)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.此外，观察到，5-F-THF连续四年在JI63和Gems31中占Gems31中的70.3％以上的70.3％。这些结果表明，5-F-THF在GEMS31和JI63中是叶酸衍生物的主要储存形式，无论干燥种子中的总叶酸水平如何。gydF4y2Ba

调查期间叶酸衍生品是如何积累形成内核,内核在R1(吐丝期)DAP 6, R2 DAP 12(猛烈的阶段),R3(灌浆期)DAP 18日R4 DAP 24 (milk-dough后期阶段),和R5(影响早期阶段)DAP 30 2013年收集质分析。从DAP 6到DAP18, 5-M-THF在两种品系幼粒中积累量均高于干粒。GEMS31和Ji63在发育早期的总叶酸含量相近，两者的比值约为1 (DAP 6为0.91,DAP 12为1.07)。在发育后期，即DAP 18和DAP 30, GEMS31的总叶酸含量显著高于Ji63(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.这些结果与干燥种子中观察到的结果完全不同，表明在种子成熟过程中持续的活性叶酸代谢。gydF4y2Ba

5-M-THF占超过总数的60%的叶酸GEMS31 (DAP 12衣冠楚楚的6 61.1%,67.2%,69.9%,DAP 18)和90.2%以上Ji63 (DAP 12衣冠楚楚的6 90.2%,98.3%,97.1%,DAP 18)在内核形成的早期阶段(表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.5-F-THF在DAP - 18前无显著变化，GEMS31的5-F-THF维持在~0.80 nmol/g FW, Ji63的5-F-THF维持在~ 0.10 nmol/g FW。DAP 18后，两品系5-M-THF均降低至相同水平，5-M-THF的比例也因5-F-THF的增加而降低(图18)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba；表格gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.值得注意的是，从DAP 30开启，在GEMS31中观察到比JI63在GEMS31中更高的5-F-THF（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.这两条自交系的分析证明了5-M-THF至少在DAP 18之前的主要叶酸衍生物，暗示在种子开发的早期阶段的更具活性C1反应，而不是晚期阶段，因为5-M-THF是这样的事实C1循环的供体。gydF4y2Ba

不同代谢物在种子发育过程中表现出不同的积累模式，贮藏代谢物一般从发育早期开始积累[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．在玉米中，超过80%的总淀粉储存在胚乳中，80%的总油储存在胚中，蛋白质同时存在于胚和胚乳中[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．石油合成速率在DAP 15 ~ DAP 25之间达到高峰，在DAP 30上达到积累高峰;类胡萝卜素的行为类似[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．淀粉积累发生从DAP 10，DAP 15上的峰值，此后保持稳定[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．同样，氨基酸在早期积累，氨基酸生物合成相关基因的稳态转录产物在DAP 10的籽粒和DAP 15的胚胎中达到峰值[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．也有报道称，一些代谢物在核形成过程中减少。例如，玉米中的黄酮类化合物在DAP 14到DAP 40期间减少[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．与上述代谢产物不同，叶酸衍生物在玉米籽粒中的积累模式不同。5-M-THF在DAP 12达到峰值后持续下降，而5-F-THF在干性种子的早期保持在低水平不变，但逐渐上升到高水平(图12)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.这些结果表明，不同的叶酸衍生物在玉米种子发育过程中可能有不同的功能。gydF4y2Ba

叶酸相关基因在玉米籽粒中的转录表达gydF4y2Ba

为了解叶酸和C1代谢相关基因的转录表达情况，利用qRT-PCR技术对Ji63和GEMS31种子发育过程中的相关基因进行了研究。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.使用的样本与用于叶酸分析的样本相同。叶酸生物合成相关基因的转录本在两个品系的DAP 6上最为丰富(见图)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba），观察到与C1新陈代谢相关基因的类似模式（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，尽管有一个例外gydF4y2BaADCL2.gydF4y2Ba在Ji63(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.最活跃的DNA合成发生在种子发育的早期阶段(DAP 1至DAP 6)，这一阶段需要叶酸依赖的嘌呤和嘧啶的合成[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．因此，在DAP 6上检测到的叶酸相关基因转录水平最高，支持了之前的报道，表明叶酸和C1代谢在幼嫩种子中活跃。gydF4y2Ba

然而，必须采取预防措施将基因转录水平与叶酸水平联系起来。首先，叶酸图谱显示5-M-THF在DAP 12上有一个峰值，但编码MS(消耗5-M-THF合成蛋氨酸)和MTHFR(催化5-M-THF形成)的基因转录本在DAP 6上达到峰值，在DAP 12和DAP18上急剧下降(图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.其次，Gems31和Ji 63之间的叶酸相关基因的转录物与叶酸相关基因没有显着差异，尽管干燥种子中的总叶酸明显不同。上述观察结果表明了玉米种子的现有复杂的叶酸代谢调节机制。与基因组 - 范围的协会研究组合的叶酸相关酶酶活性的调查将使我们阐明叶酸代谢相关蛋白在玉米核中叶酸衍生物积累中的作用。gydF4y2Ba

综上所述，这些发现表明叶酸和C1代谢在玉米和其他物种之间是保守的，特别是高粱和小米。代谢谱分析表明，5-M-THF是早期发育种子中主要的叶酸衍生物，而5-F-THF是成熟种子中主要的储存形式。这两种叶酸衍生物在内核开发过程中发挥着不同的作用。参与叶酸和C1代谢的基因在籽粒发育的早期阶段积极表达。本研究为进一步深入研究玉米中叶酸代谢奠定了基础。gydF4y2Ba

植物材料及叶酸含量测定gydF4y2Ba

JI63和Gems31近亲植物在2013年夏天在北京顺义生长。实验领域是植物土壤，PH 6.8，有机物0.7％，磷13.8mg / L和钾48mg / kg。在田间制备期间，施加440kg /英亩的尿素（46-0- 0）。种植后施用除草剂。植物的手工用5米长的行，分别为25厘米的行和植物间隔。在授粉（DAP）后6,12,18,24和30天内收获核样品，并分别从三个耳的耳轴移除。将来自三个耳朵的三种生物复制混合，随着一种重复被收获并立即在液氮中冷冻。在每次重复中重复叶酸脱落和测量四次。在这些重复中获得了类似的结果，并在本报告中描述并讨论了一种复制的结果。此外，这两条自交系在2009年在海南成长，于2010年在云南，2012年，在2012年，在中国海南。gydF4y2Ba

5-M-THF和5-F-THF标准购自Schircks Laboratories。从现场采集的样品用于鉴定叶酸谱。样品制备和代谢物测定的方法已在前面介绍过[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．连续四年进行一次每次自交系的干燥种子叶酸含量。在DAP 6,12,18,24和DAP 30上的种子中的叶子以四种生物重复测量，每个样品由50mg植物材料组成。gydF4y2Ba

玉米和其他物种叶酸代谢基因的鉴定gydF4y2Ba

随着植物中的叶酸代谢酶作为查询的报告[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]爆炸软件用于搜索玉米基因组数据库，包括玉米遗传学和基因组学数据库[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，拟南芥信息资源[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]国家生物技术信息中心[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]，植物区系[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]，以及Swiss-Prot蛋白数据库[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]（瑞士人）。表格中列出了用于对准和系统发育树结构的蛋白质及其登记号gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

序列比对、系统发育分析和区域检测gydF4y2Ba

使用ClustalW工具对玉米和其他物种中叶酸代谢酶的238个氨基酸序列进行了比对[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．通过使用MEGA版本5的邻居连接算法，多次对齐导致了一棵无根距离树。使用bootstrap分析(1000次重复)检验了树的可靠性。使用“简单模块化建筑研究工具”鉴定这些保存完好的主题[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

实时定量qRT- PCRgydF4y2Ba

使用标准的TrizoL RNA分离方案（Invitrogen）提取来自玉米粒子的总RNA，DAP 12和DAP 18提取[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba),分别。为了消除任何残留的基因组DNA，用RNase-free DNase I (New England Biolabs)处理总RNA [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，并使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas)合成第一链互补DNA (cDNA) [gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba］．本文中使用的引物列于表中gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．Primer Premier 5.0 [gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]，根据相关基因CDS序列设计引物。gydF4y2Ba

使用SYBR premix Ex Taq (TaKaRa)在7500 real-time PCR体系中进行qRT-PCR [gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］．CDNA由三个样品制成，并在全份数中进行所有反应。PCR条件如下：95℃，30s，40个循环为95℃，5s，60℃，34 s。这gydF4y2Ba施gydF4y2Ba（GRMZM2G126010）用作参考基因以归一化靶基因表达，其使用相对量化方法计算（2gydF4y2Ba^{——ΔΔCTgydF4y2Ba}）.gydF4y2Ba

可获得的支持数据gydF4y2Ba

系统发育数据已保存在TreeBase [gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]，登录地址为:gydF4y2Bahttp://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S17972gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

ADC:gydF4y2Ba

4-aminodeoxychorismategydF4y2Ba

ADCL：gydF4y2Ba

ADC裂合酶gydF4y2Ba

adc:gydF4y2Ba

ADC合酶gydF4y2Ba

ARATH:gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba

C1：gydF4y2Ba

一个碳gydF4y2Ba

衣冠楚楚的:gydF4y2Ba

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二氢氟乙酯还原酶gydF4y2Ba

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感谢华中农业大学闫建兵教授提供的玉米种子，感谢齐鲁师范大学卢小多教授指导种植。基金资助:国家重点基础研究发展计划(批准号:no. 201710229723);2013年cb127003 C.Z.)。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 中华人民共和国北京，中国农业科学院生物技术研究所gydF4y2Ba

   连通，陈茂然，梁秋菊，刘芳，洪岩孟，徐博思，陈金凤，张春义，江凌gydF4y2Ba

2. 中华人民共和国武汉，华中农业大学gydF4y2Ba

   郭护住gydF4y2Ba

3. 中华人民共和国北京，北京药理学和毒理学研究所gydF4y2Ba

   京才李gydF4y2Ba

4. 中华人民共和国作物基因资源与遗传改良国家重点实验室，北京gydF4y2Ba

   梁秋菊，张春义，蒋玲gydF4y2Ba

5. 中华人民共和国绵阳西南科技大学gydF4y2Ba

   金丰陈gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba灵江gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

TL和WG进行了分子遗传学研究，参与了序列比对并起草了手稿。MC、QL、FL参与样本采集。JL通过LC/MS预制成叶酸图谱。HM、BX、JC进行统计分析。CZ和LJ设计了实验，分析了实验数据并起草了实验手稿。所有的作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。gydF4y2Ba

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