基础被子植物油脂合成:转录组分析gydF4y2BaPersea美国gydF4y2Ba中果皮gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物在种子以外的组织中合成和储存大量三酰甘油(TAG)的机制尚不清楚。了解非种子组织中碳分配和油积累的控制因素对多年生生物能源作物产生富油生物量至关重要。gydF4y2BaPersea美国gydF4y2Ba(鳄梨)，一种具有独特特征的基部被子植物，是大多数开花植物的祖先，每干重约70%的TAG储存在中果皮，一种非种子组织。通过对牛油果中果皮组织中丙酮酸生成到TAG积累的选择途径进行转录组分析，并与油棕榈(oil palm)和双子叶植物(油菜和蓖麻)的中果皮组织进行比较，以确定植物中TAG的组织和物种特异性调控和生物合成。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

对牛油果中果皮脂质代谢途径的RNA-Seq分析显示，牛油果中果皮脂质代谢途径与其他富油物种相似。然而，只有一些主要的脂肪酸合成途径基因同源性与单子叶植物和双子叶植物相似。在果实发育过程中，富含油酸的TAG的积累与硬脂酰- acp去饱和酶和内质网(ER)相关酰基辅酶a合成酶的转录水平较高相关。ER中参与TAG生物合成末端步骤的酶的基因表达水平进一步表明，酰基辅酶a依赖性和非依赖性机制都可能在TAG组装中发挥作用，这取决于果实的发育阶段。此外，除了脂肪酸生物合成调节因子wr1的同源基因表达外，wr1的高转录水平可用于gydF4y2BaWRI2-likegydF4y2Ba而且gydF4y2BaWRI3-likegydF4y2Ba提示额外转录因子在非籽油积累中的作用。脂肪酸合成所必需的质体丙酮酸可能是由参与糖酵解及其中间体运输的基因上调所驱动的。通过对不同植物和组织贮藏油生物合成的比较转录组分析表明，这一被子植物的一些独特而保守的特征可能是其丰富的TAG含量的原因。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的工作代表了一个基础被子植物物种的全面转录组资源，并为了解它们在中果皮组织中的脂质代谢提供了线索。通过对油梨中果皮与单子叶和双子叶植物种子组织和非种子组织的转录组比较，发现油梨中果皮的脂质基因同源性在进化过程中高度保守。在该被子植物富含油脂的中果皮组织中特异性表达的同源蛋白，如writ2、er相关的酰基辅酶a合成酶和脂滴相关蛋白。本研究为进一步研究提高非种子组织含油量奠定了基础，对利用代谢工程提高不同物种非种子组织含油量具有重要意义。gydF4y2Ba

基生被子植物是最早也是最古老的开花植物科，起源于一亿多年前，只有几百种，而单子叶和真子叶被子植物有数十万种[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．鳄梨(gydF4y2BaPersea美国gydF4y2Ba)属于这个家庭gydF4y2Ba樟科gydF4y2Ba，是最大的基底被子植物科之一，有50多个属[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，已被广泛用于研究裸子植物被子植物花发育的早期进化模式[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．牛油果也是一个有利的系统，可以用来研究水果组织(而不是种子)中淀粉或脂类等贮藏物质合成机制的进化。有趣的是，与大多数被子植物果实不同，鳄梨果实生长的特点是细胞分裂不受限制，这种分裂贯穿整个果实发育时期[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．在发育过程中，肉质可食用部分以干重累积60% ~ 70%的油和10%的碳水化合物。油以三酰甘油(TAG)的形式储存，主要成分为油酸[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．约60%的总碳水化合物是七碳糖衍生物，如d -甘露寡糖及其糖醇perseitol [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．牛油果的高营养价值和单不饱和油对健康的促进作用，使其目前在世界范围内的产值达到38亿美元[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

与油棕榈和橄榄一样，牛油果的中果皮(一种非种子组织)积累了大量的TAG，是少数几个这样的例子之一。一般来说，在植物组织中，TAG的生物合成主要涉及质体中脂肪酸的合成，并将其转移到内质网(ER)，然后在酰基辅酶a依赖性的甘油-3-磷酸主链上进行顺序的酯化[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba或-独立的方式[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．虽然人们普遍认为TAG在植物中的生物合成是一个高度保守的过程，但其分子和生化细节大多局限于油籽[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．最近，人们更加关注那些在组织中储存油脂的植物，而不是种子，这揭示了重要的差异[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．例如，在牛油果和油棕榈中果皮中，脂滴相关蛋白(LDAP)可能在脂质稳定中发挥作用[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．通常，储存蛋白质，如油酸gydF4y2Ba，gydF4y2Ba在被子植物种子和花粉中，冰韭苷和固醇脂苷在稳定和调节油体大小方面发挥着重要作用[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．然而，包括非籽油丰富组织的比较转录组分析在内的多项研究一致指出，编码这些整体脂体蛋白的基因转录水平缺失或降低[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

油棕和橄榄的转录组研究也表明，非种子中TAG生物合成的转录控制与种子组织中的关键差异[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在种子组织中，许多胚胎发生和种子成熟的主要调控因子，如LEC基因gydF4y2BaLEC1gydF4y2Ba，gydF4y2BaLEC1gydF4y2Ba式(gydF4y2BaL1LgydF4y2Ba)，gydF4y2BaLEC2gydF4y2Ba和FUSCA3 (gydF4y2BaFUS3gydF4y2Ba)和ABA -insensitive3 (gydF4y2BaABI3gydF4y2Ba)直接或间接地通过下游转录因子wrinkle (gydF4y2BaWRI1gydF4y2Ba；［gydF4y2Ba24gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba])。wr1蛋白是aptala2 (AP2)-乙烯响应元件结合蛋白的成员，通过与启动子序列结合调节糖酵解晚期基因和脂肪酸生物合成基因[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．此外，与wr1一起，wr3和wr4也在花和其他非种子组织的脂肪酸生物合成途径中发挥作用[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．有趣的是，在油棕中果皮发育过程中，wr1同源基因的高转录水平与油棕中果皮的油脂积累有关，而wr3和wr4则没有[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．成功的互补gydF4y2BaAtwri1gydF4y2Ba与gydF4y2BaEgWRI1gydF4y2Ba进一步表明，wr1不仅在双子叶和单子叶之间保守，而且在种子和非种子组织中调节脂肪酸的生物合成[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

虽然我们对不同植物和组织类型的脂类生物合成的了解已经取得了重大进展，但在碳分配如何调控以及油脂含量和组成方面仍然存在空白[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．其他可能在控制酶方面发挥作用的转录因子，如在TAG积累的后续步骤中所需的酰基转移酶，也仍然难以捉摸。在本研究中，我们询问了哪些与脂质生物合成相关的基因在基底被子植物中果皮组织中主要表达，以及它们的表达模式与单子叶植物和双子叶植物组织相比有何不同。为了解决这些问题，并进一步研究脂质生物合成基因在植物间的进化关系，我们对牛油果中果皮发育过程中的RNA进行了定量分析。因为独特的位置gydF4y2Bap .美国gydF4y2Ba它在植物进化中占有重要地位，是探索脂质合成调控机制保存的优良系统。gydF4y2Ba

基生被子植物，对其gydF4y2Bap .美国gydF4y2Ba属，起源于单子叶植物和双子叶植物分离之前，具有双子叶植物和单子叶植物共同的特征。此前曾报道过一种双子叶植物橄榄中果皮中脂肪酸生物合成的转录组分析[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba和油棕榈，单叶棕榈[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba];关于分化程度更高的基底被子植物的类似研究尚未见报道。本研究以牛油果中果皮为材料，研究了一个被子植物系早期富油组织的脂类生物合成。牛油果5个阶段的中果皮组织(I-V)，鲜重为~ 125 ~ 200g(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，使用下一代测序方法生成时间转录组数据(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。为了将脂质生物合成基因的表达模式与时间油脂积累联系起来，我们还对中果皮的脂肪酸含量和组成进行了分析。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba而且gydF4y2BacgydF4y2Ba)．鳄梨RNA-Seq数据集的详细信息汇总在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1和NCBI生物项目PRJNA253536。基于BlastP与脂质生物合成途径蛋白的比对，以每百万分之10个reads (RPKM)为代表的contigs的预测功能注释是基于gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba并在附加文件中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2，以及contig序列(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:数据S1)。必须指出的是，尽管转录水平可能并不总是反映蛋白质丰度或酶活性，但类似的转录组数据已经成功地用于识别生化途径中的关键步骤[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．与本研究最相关的基因功能预测及其在中果体发育过程中的表达水平列在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3。gydF4y2Ba

牛油果中果皮脂肪积累与果实生长的关系gydF4y2Ba

鳄梨的果实是一种单籽浆果，它的发育和生长可以持续9个多月。一般来说，开花后50天左右采收的早期果实重量约为10克，88天采收时，果实重量增加10倍，230天采收时，果实重量增加20倍以上[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．第1期“哈斯”果实采收期为100dafb左右，果实重约125 g，第5期成熟果实平均重达230 g。果实的中果皮约占果实总重的三分之二，并随着发育而继续增加(图3)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．果重的增加与中果皮组织中脂质含量的积累高度相关gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.978;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S1)。第V期果实含油量约为第I期果实的12%，是第I期果实含油量的3倍。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．在I期果实中已经积累了大约1 / 4的中果皮总含油量，这表明脂质合成在发育的较早阶段就开始了。根据脂质含量和果实重量，估计10 - 2月收获的果实代表果实发育的中成熟期(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．有趣的是，与成熟的油籽不同，成熟的“哈斯”牛油果在收获后仍能保持高达18%的油分积累，直到成熟。gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．与中果皮相比，牛油果种子的含油量要低得多，在整个发育过程中变化不大(图3)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

脂肪酸组成是组织特异性的，并随着中果皮的发育而变化。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．主要脂肪酸中，中果皮中油酸含量最多(18:1)，种子中亚油酸含量最多(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．中果皮组成在16:0、16:1和18:0时，发育中后期变化较小;18:1的比例稳步上升，18:2的比例同时下降。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．在发育过程中，种子的成分几乎没有变化，与中果皮不同的是，种子中亚麻酸的比例更高，16:1的比例更低。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．总之，数据表明，中果皮油积累速率及其组成的变化与果实发育和生物量的增加直接相关(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S1)。果实的发育和生长，包括贮藏代谢物的积累，是一个高度协调的过程，受多种激素相互作用的调控。事实上，一些研究表明，外源ABA处理通过诱导不同脂质生物合成基因的表达，促进了TAG的积累gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba［gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba和castor [gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．然而，在牛油果中，果实发育和脂质积累的协调机制是通过激素介导的，尚不清楚。gydF4y2Ba

对牛油果中果皮部分脂质代谢途径的转录本分析显示，牛油果中果皮脂质代谢途径与其他富油物种相似gydF4y2Ba

蔗糖转化为TAG的过程包括蔗糖的降解、质体中丙酮酸的生成、糖酵解、戊糖磷酸途径和质体转运体、质体中脂肪酸的合成以及ER中TAG的组装(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这六种代谢途径需要超过200个基因的表达(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。在牛油果中果皮中，大约45%的转录本与糖酵解相关的基因相对应，34%与塑料脂肪酸生物合成相关的基因相对应。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．我们进行的分析旨在发现鳄梨脂质生物合成和调控中的保守功能，而不考虑RNA数据集中的紧密亲对偶链或等位转录本的分离。因此，对编码相同蛋白家族或蛋白复合体基因的多个转录本进行汇总，并表示为RPKM/protein(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。更详细的全基因组组合分析将有助于进一步的基因家族成员解析。总的来说，基于保守蛋白注释，在中果皮的五个发育阶段，参与糖酵解或丙酮酸生成以及随后脂肪酸合成的基因的平均RPKM/蛋白也很丰富(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3;无花果。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

值得注意的是，质体中与酰基合成相关的转录本的高比例和高RPKM/蛋白，与磷脂合成和TAG组装基因转录本水平的模式形成对比(图1)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．事实上，在分析的6种代谢途径中，它们的相对丰度仍然是最低的，而且转录水平在中果皮发育阶段没有变化gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3;无花果。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．在双子叶和单子叶的富含油脂的种子和非种子组织中，也观察到与质体脂肪酸合成相关的基因表达水平增强的模式和大部分参与TAG组装后期步骤的基因转录相对较小的变化[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．这些数据表明，在不同的富油组织和不同的物种中，与油脂积累相关的常见酶化学计量学和时间调节是保守的。gydF4y2Ba

牛油果脂肪酸生物合成途径中只有部分主要同源物与单子叶植物和双子叶植物相似gydF4y2Ba

质体中丙酮酸转化为脂肪酸至少涉及14种酶和/或蛋白质复合物(图1)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．这些蛋白质中有几个是由一个以上的基因编码的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3;［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．通过比较鳄梨、油棕榈、油菜籽和蓖麻富含油脂的组织中基因家族成员同源基因的转录水平，虽然在不同的物种和组织中有一些相似性，但也发现鳄梨有一些例外(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．例如，在丙酮酸脱氢酶复合物(PDHC)的三个酶组分中，而异二聚体蛋白(E1αgydF4y2Ba_2gydF4y2BaβgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)由单基因编码，E1组分的E1β亚基，E2(二氢脂酰胺乙酰转移酶，LTA)和E3(二氢脂酰胺脱氢酶，LPD)组分显然由两个基因编码[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．而转录本为同源的所有基因编码gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在富油组织中检测到PDHC成分gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba油棕榈和蓖麻，在牛油果中只检测到这些成分的一个同源物(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在鳄梨中一个同源基因的表达也被注意到，在被子植物中通常由一个以上的基因编码的其他酶(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．以异聚体乙酰辅酶a羧化酶(ACCase)的生物素羧基载体蛋白(BCCP)为例，在牛油果中果体转录组中只有BCCP1的同源物(AT5G16390)。BCCP1和2个同源异构体在油棕、油菜籽和蓖麻中均可检测到，但在油棕中果皮中以BCCP1为主，而在蓖麻和油菜籽中以BCCP2为主。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．同样，在牛油果的转录组中也有一个羟基酰基[酰基载体蛋白(ACP)]脱水酶(HAD)和酰基ACP硫酯酶a (FATA)的同源基因，而这两个同源基因至少在油棕榈中果皮和油棕榈中果皮的转录组中可以检测到gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba蓖麻籽(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．此外，在鳄梨中表达PDHC-E1β、HAD和FATA的同源物与主要在单子叶和双子叶中表达的同源物不同(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba；［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在一个基础被子植物物种中，PDHC-E1β， LPD, BCCP和HAD基因的第二个同源基因也在基因组水平上被观察到[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．这些数据表明，与基生被子植物相比，单子叶植物或双子叶植物的种子和非种子组织中可能进化出了不同或额外的同源物参与脂肪酸合成。gydF4y2Ba

超过60%编码脂肪酸生物合成途径蛋白的转录本定位于硬脂酰-ACP去饱和酶(SAD/DES)和ACP。此外，它们的转录水平随着中果皮的成熟而增加。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba而且gydF4y2BacgydF4y2Ba)，与油气成藏规律相吻合(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．在拟南芥中，SAD/DES和ACP分别由7个和5个成员基因家族编码，是质体脂肪酸合成中所有蛋白的最大基因家族[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．在富含油脂的组织中大量表达的SAD同源物在不同物种的所有种子组织和非种子组织中都是相同的。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．相比之下，表达ACP(在脂肪酸合成过程中携带酰基中间体的辅助因子)的主要同源物在不同物种中有所不同(图3)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在牛油果中果皮中，ACP转录本的表达量约占脂肪酸合成基因总表达量的24%(图;gydF4y2Ba3gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba)．在5个ACP基因的同源基因中，与ACP4相关的转录本(AT4G25050)在鳄梨中最为丰富;其他亚型要么几乎检测不到，要么没有表现出来(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．有趣的是，虽然ACP4同源转录本在油棕中也很丰富[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，它在油菜和旱金莲胚胎以及蓖麻胚或胚乳中表达最少或检测不到，其中ACP1、ACP3和ACP2分别以ACP1、ACP3和ACP2为主[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．先前的研究表明，ACP的多种异构体在植物进化早期就已经进化出来，它们的表达主要依赖于组织类型[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]和差异调节，如ACP4的光敏诱导[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．ACP4同源物在基生被子植物和单子果中果皮富含油脂的中果皮中的丰度表明，ACP4亚型可能在早期进化，以响应光异养非种子组织中作为TAG的脂肪酸生物合成需求。gydF4y2Ba

牛油果硬脂酰- acp去饱和酶基因的表达模式反映了牛油果的脂质组成gydF4y2Ba

在牛油果中果皮发育过程中，同源蛋白的转录水平为gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba悲伤(AT2G43710;FAB2)是本研究中脂质生物合成酶中表达量最多的酶，约占所有塑料脂肪酸合成基因表达量的44%(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba而且gydF4y2BacgydF4y2Ba)．尽管基于SAD极低的催化周转率(0.5 sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}；［gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]，值得注意的是，在牛油果中，其水平相对于β-酮酰基acp合成酶ⅲ(KAS III;AT1G62640;无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S2)。同样的,gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba蓖麻胚和胚乳中含有30 ~ 90%的油酸及其衍生物，其转录水平比KASIII(附加文件)高出50倍以上gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S2)，与它们的油成分有关[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．SAD的异构体负责将第一个双键引入硬脂酰- acp，生成油酰- acp (18:1)gydF4y2Ba^Δ9gydF4y2Ba机场核心计划)。相比之下，油棕中果皮中单不饱和脂肪酸含量< 40%，SAD转录水平仅比KASIII高16倍gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S2)。在几乎不含油脂的枣椰树中果皮中，去饱和酶同源转录本仅比KASIII高3倍gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S2)。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，gydF4y2Bafab2gydF4y2Ba突变体的18:1水平降低，其他去饱和酶亚型不能恢复，除了DES1 [gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．在牛油果中果皮中，FAB2同源基因的转录水平不仅丰富，而且随着成熟程度的增加而增加(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S2)，与增加18:1的内容相关(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)，这与它作为牛油果油成分的关键决定因素相一致。gydF4y2Ba

ER-而不是质体相关的酰基辅酶a合成酶在牛油果中果皮中表达最高gydF4y2Ba

长链酰基辅酶a合成酶(LACS)参与游离脂肪酸的硫酯化反应，这是大多数脂质代谢酶利用脂肪酸所必需的。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba已确定有9种LACS亚型参与脂肪酸和甘油脂代谢[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．在牛油果中果皮中，LACS4同源转录本最丰富，其次是LACS8、LACS1和LACS9(图4)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．这些数据与在含油丰富的种子中所观察到的结果相反[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba和非种子组织[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，其中LACS9转录本表达最丰富(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．Plastid LACS9确实被认为是LACS的主要亚型，参与了酰基辅酶a的生产，用于膜甘油脂和储存TAG的合成gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba53gydF4y2Ba尽管在发育中的种子中也发现了大量的LACS8、LACS4、LACS2和LACS1转录本gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．突变的研究gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba发现TAG积累在功能丧失中不受影响gydF4y2Balacs8gydF4y2Ba而且gydF4y2Balacs9gydF4y2Ba双突变体的脂肪酸含量分别降低了11%和12%gydF4y2Balacs1gydF4y2Ba而且gydF4y2Balacs9gydF4y2Ba双,gydF4y2Balacs1gydF4y2Ba，gydF4y2Balacs9gydF4y2Ba,gydF4y2Balacs8gydF4y2Ba这表明LACS1和LACS9可能具有重叠作用[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．然而，在葵花籽中，脂肪酸合成过程中LACS9和LACS8同源异构体的表达水平很高，因此LACS8被认为是一种与LACS9功能相似的候选基因[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．最近，研究表明LACS4和LACS9在将脂肪酸从ER导入质体方面具有重叠功能[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在牛油果中果皮中，超过80%的LACS同源转录本由er相关亚型(LACS1、LACS4和LACS8)代表，只有16%由塑性LACS9同源转录本贡献(图4)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，目前还不清楚哪一种LACS可能促进酰基活化，以及它可能发生在哪里。最近，一种质体定位蛋白FAX1 (At3g57280)被证明可以介导叶绿体游离脂肪酸的输出[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]及其同源基因在牛油果中果皮组织中表达(42 RPKM;额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。因此，有可能牛油果FAX1同源物有助于游离脂肪酸的输出，然后酰基激活可能发生在ER:包膜接触位点或半融合[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]，这与溶素-PC酰基转移酶(LPCAT;AT1G12640) [gydF4y2Ba59gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．在这方面，在牛油果中果皮中发现了一个LPCAT的同源物，平均为30 RPKM/阶段gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。LACS还负责ER中磷脂酶a2介导的酰基编辑产生的酰基的再酯化。在牛油果中果皮中检测到3种PLA2同源异构体(AT4G29070、AT3G18860、AT2G19690)的转录本，平均为127个RPKM/阶段(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。gydF4y2Ba

在其他LACS亚型中，gydF4y2Ba在gydF4y2BaLACS2和gydF4y2Ba在gydF4y2BaLACS3被证明与表面脂质合成和gydF4y2Ba在gydF4y2BaLACS5具有花组织特异性[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．虽然在鳄梨中果皮中检测不到LACS3，但LACS2和LACS5同源蛋白均表达较差，因此不太可能在TAG生物合成中发挥作用(图3)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．过氧化物酶体LACS6和LACS7同源几乎检测不到转录本(<1 RPKM/阶段)[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba表明脂肪酸在鳄梨中果皮发育过程中很少发生β-氧化(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。gydF4y2Ba

ER中大多数TAG生物合成基因在不同的富油组织中表现出相似的表达模式gydF4y2Ba

在牛油果中果皮中，TAG生物合成基因的同源(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)的平均表达量为75 RPKM/蛋白，这比每个蛋白的脂肪酸合成基因表达量少了7倍(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．与脂肪酸合成基因相比，TAG合成基因在其他含油丰富的种子组织和非种子组织中也有类似的低表达[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在牛油果中果皮中，与甘油-3-磷酸(G3P)序列酰化相关的所有基因的同源性，gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba产生TAG的Kennedy通路，即甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT9)、溶血磷脂酰基转移酶(LPAAT)、磷酸酯酸磷酸酶(PP/PAH)和二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)在中果皮发育过程中表达(图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。GPAT9同源基因的表达水平在中果体发育过程中保持相似，但在ER中主要的LPAAT亚型LPAAT2的表达水平下降了两倍gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3;无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在编码PP/PAH的各种同源基因中，PAH1和PAH2转录本丰富，它们在中果皮发育过程中水平保持中等相似(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。gydF4y2Ba

根据二酰甘油(DAG)在TAG合成的末端步骤中酰化的酰基来源，这些反应被称为酰基辅酶a依赖或非依赖(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．依赖于酰基辅酶a的TAG合成的关键步骤是由DGAT催化。在两种主要的DGAT形式中，DGAT1在牛油果中果皮中表达量最高，从I期到V期增加了2倍以上(图1)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．DGAT2的转录本也可检测到，但其丰度比DGAT1少8倍gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。在油籽中，虽然参与TAG合成的基因表达量相对较低，但DGAT的表达量例外。在油菜和蓖麻中，相对于GPAT9, DGAT亚型的表达分别高7倍和9倍，并且DGAT转录水平的增加与它们的油脂积累相一致(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4;［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．相比之下，虽然DGAT1和DGAT2在油棕中果皮中都有丰富的表达，积累了约80 - 90%的TAG，但转录水平平均仅比GPAT9高2倍(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4;［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．类似地，在牛油果中，DGAT转录水平与GPAT9(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。gydF4y2Ba

通过PC的通量可能在牛油果中果皮TAG积累中起到额外的作用gydF4y2Ba

植物中存在多种途径在ER中组装TAG，而破译通过替代方案的相对通量尤其具有挑战性[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．除了gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba生成的DAGgydF4y2Ba通过gydF4y2Ba在Kennedy途径中，用于合成TAG的DAG前体也可以通过两种酶的可逆作用从PC中获得，PC:DAG胆碱磷酸转移酶(PDCT/ROD1;［gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]和/或胞苷-5 ' -二磷酸胆碱:DAG胆碱磷酸转移酶(CPT;［gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．在牛油果中果皮中，同源蛋白的表达水平为gydF4y2Ba在gydF4y2BaCPT平均比PDCT高6倍(图1)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。此外，在牛油果和油棕榈中，但与油籽相反，磷脂二酰基甘油酰基转移酶(PDAT1;AT5G13640)的转录水平与DGAT相当(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。此外，在DGAT水平占主导地位的油菜籽和蓖麻种子组织中，PDAT1转录本相对于GPAT9表达水平较低(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。之前，Stobart和Stymne得出结论，tag主要是合成的gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba因为牛油果的微粒体缺乏酰基交换和DAG与PC的相互转化[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．虽然DAG:PC交换和PDAT可能不会对鳄梨产油中果皮的主要通量造成影响，特别是在采后成熟阶段[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]， CPT和PDAT的转录水平相对于其他富油组织(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)表明，PC作为鳄梨TAG合成的中间体的可能性，尤其是在果实发育早期，需要进一步研究。gydF4y2Ba

通常，通过“酰基交换/编辑”过程，酰基进入PC是快速的，这允许进一步的修改，如去饱和。在牛油果中果皮中，大约18%的脂质在I ~ III阶段是多不饱和的，而在IV和V阶段多不饱和的只有不到10%。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．与脂质组成相一致的是，相对于IV和V阶段，I - III阶段LPCAT和PDAT的转录水平较高(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S3)表明酰基编辑可能在中果体发育的早期阶段起作用。与此相一致的是，油酸去饱和酶同源物(FAD2)的转录水平在发展的早期阶段也比阶段IV和V高出2倍以上gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。然而，FAD2转录水平平均只比GPAT9高1.5倍(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)，反映了牛油果中果皮的整体含油性质。相比之下，油菜籽、蓖麻和油棕中的FAD2转录本水平分别比GPAT9高46、49和144倍gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。综上所述，这些结果表明，在牛油果中果皮和其他非种子组织中，通过PC的通量可能在获得大量TAG积累方面发挥了额外的作用。gydF4y2Ba

不同于种子组织的蛋白质可能包裹着牛油果中果皮中的脂滴gydF4y2Ba

脂滴蛋白，如油黏蛋白、钙粘蛋白和固醇黏蛋白，在种子和一些非种子组织(如花药和花粉)的储存脂质区隔中发挥着广泛的作用[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．最近，蛋白质组学、脂质组学和转录组学对牛油果中果皮中两个新的脂滴相关蛋白(LDAP1和LDAP2, At3g05500的同源物)的研究做出了贡献[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．在中果皮5个发育阶段，LDAP1和LDAP2的转录水平总和平均超过250 RPKMgydF4y2Ba1gydF4y2BaS2:表;［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．这些蛋白与小的橡胶颗粒蛋白具有同源性，并被预测可以结合和稳定牛油果中果皮组织中富含脂质的颗粒。牛油果等富油组织的脂滴比油籽大得多;油棕中果皮组织均质化时脂滴融合[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．此前的转录组研究表明，油棕和橄榄富含油脂的中果皮组织几乎不表达油酸苷、钙红蛋白和固醇油酸苷，被认为不太可能在果实发育过程中对TAG的稳定发挥重要作用[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．类似地，在牛油果中果皮中，虽然油酸蛋白(At3G18570)、钙红蛋白(At1G70670;At2G33380)和固醇脂苷(At5G50700)的转录水平非常低(<10 RPKM;额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S3)，支持了这样一个结论，即这些种子相关蛋白不太可能参与稳定非种子组织中的脂质。gydF4y2Ba

WRI的多个同源蛋白在牛油果中果皮中高表达gydF4y2Ba

油棕中果皮的转录组研究表明gydF4y2BaWRI1gydF4y2Ba，除了在种子中高表达外，还与非种子组织中的油脂积累高度相关[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．有趣的是，在牛油果中果皮中，除了gydF4y2BaWRI1gydF4y2Ba其亚型wr2和wr3的转录本也高表达。此外，如在油棕中果皮中，上游调节子的同源gydF4y2BaWRI1gydF4y2Ba在种子组织中，如LEC1, LEC2和FUS3在牛油果中果皮中要么不表达，要么几乎检测不到(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。然而，ABI3同源转录本(At3g24650)平均有43个RPKM(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。这些数据强化了非种子组织中wr1的调控可能与种子组织中不同的结论。gydF4y2Ba

最近的研究在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba显示,gydF4y2BaWRI3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaWRI4gydF4y2Ba每一种能补偿低脂肪酸水平的gydF4y2Bawri1-4gydF4y2Ba突变体;它们在功能上是非冗余的，在花组织中角质生物合成需要它们[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．有趣的是，在牛油果中果皮中，整体的表达模式gydF4y2BaWRIgydF4y2Ba同源基因与已知的wr1调控的基因类似gydF4y2Ba机场核心计划gydF4y2Ba，gydF4y2BaBCCPgydF4y2Ba，gydF4y2BaKASIIgydF4y2Ba,gydF4y2BaPDHCgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba；［gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]和石油聚集模式(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．尽管互补和转录激活子研究排除了wr2在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba脂肪酸生物合成[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba在一种被子植物的中果皮组织中，其同源物在油脂积累过程中的高表达表明它可能在非种子组织中起作用。通过对来自双子叶植物、单子叶植物和基部被子植物的WRI同源物的系统发育树的研究，发现WRI在陆地植物进化早期可能存在基因复制事件，因为wr2蛋白形成了一个单系群，并与所有其他WRI同源物分离。其他的WRI同源基因组成了两个不同的组，它们都属于一个WRI基因分支gydF4y2Bap .金属盘gydF4y2Ba与高等植物的wr1、wr3和wr4基因分离(图2)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．构建的不同物种WRI基因树表明gydF4y2BaPaWRI2-likegydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtWRI2gydF4y2Ba比WRI的其他基因都要古老，而且彼此之间也有很大的差异。高表达水平的gydF4y2BaWRI2-likegydF4y2Ba在牛油果中果皮中，之前没有报道过在任何其他富含油脂的组织中，以及wr1和wr3，但没有报道过wr4，这表明可能通过分化gydF4y2Ba在gydF4y2Bawr2可能已经脱离了石油生物合成的功能gydF4y2BaPaWRI2-likegydF4y2Ba保留了它的功能。虽然gydF4y2BaAtWRI2gydF4y2Ba不补gydF4y2Bawri1gydF4y2Ba突变体，互补研究与gydF4y2BaPaWRI2-likegydF4y2Ba正在进行中。根据基因表达数据，预测gydF4y2BaWRI2gydF4y2Ba鳄梨的同源性可能在这一基底被子植物的TAG积累中发挥额外的作用。gydF4y2Ba

鳄梨果实中用于油生物合成的有效碳可能是非典型的gydF4y2Ba

多项研究表明，果实生长过程中中果皮含油量的增加伴随着还原糖浓度的降低[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．通常，光合产物以蔗糖的形式被运输到中果皮gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba外质体、细胞质和液泡之间的糖转运体，被水解为己糖，作为糖酵解的碳源。然而，可能在质膜和液泡膜中编码糖转运蛋白的转录本在牛油果中果皮中表达较差，在所有发育阶段平均有26个RPKMgydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。鳄梨的果实，特别是在其生长的早期阶段，除了固定COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba核酮糖1,5二磷酸羧化酶(RBC)也能将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)与碳酸氢盐羧化，通过PEP羧化酶(PEPC)产生草酰乙酸，随后生成苹果酸[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba79gydF4y2Ba］．类似于在C4和CAM植物叶片中发现的机制，苹果酶可以回收COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在非绿色中果皮层产生，随后由RBC固定在更多的绿色组织中，同时释放丙酮酸用于脂肪酸合成。与这一观点一致的是，RBC、磷酸核糖激酶和PEPC同源蛋白的转录水平较高，平均分别为183,195和216 RPKM(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。这些转录本的丰度，特别是中果皮组织发育过程中PEPC的同源转录本的丰度，与其在碳同化中的作用相一致。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在中果体发育过程中，水解糖的酶，如细胞质中的蔗糖合酶(SuSy)的转录本高表达，平均超过500 RPKM/蛋白gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3a;额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)，这意味着SuSy可能是丙酮酸合成所必需的己糖生成的主要参与者。然而，在这些转化酶中，液泡转化酶的转录水平也是丰富的(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3a，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。通常，酸性转化酶水解储存在液泡中的蔗糖，产生的己糖可以通过转运蛋白或转运蛋白运输到细胞质中gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba易化扩散(gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．在牛油果中果皮中，液泡中的己糖是否也可能发生糖酵解，目前尚不清楚。淀粉也是质体中糖酵解的主要底物，在鳄梨中果皮中，淀粉合成和降解基因同源转录本在整个中果皮发育过程中都是丰富的gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3c)。坐果初期(6月)，约44%的肉重是由糖贡献的，在果实快速生长期(至10月下旬)糖继续增加，在油脂积累期开始下降[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．成熟时，中果皮中总碳水化合物约占肉重的10%，由约10%的淀粉、20%的蔗糖、10%的己糖和60%的C7糖和糖醇(甘露七糖和perseitol;［gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．Sedoheputlose-7-P由转酮糖酶(TK)产生，经转醛糖酶(TA)进一步转化为甘露庚糖;甘露庚糖是完全来自于易位糖还是也在中果皮中合成，目前尚不清楚。TK和TA同源基因在中果体中的表达量均较高，其中TA的表达量是TK的2倍gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3c)，表明它们也可能在中果皮中合成。因此，果实生长早期较高水平的C7糖可能在调节油生物合成的起始过程中发挥作用。它们在成熟时的存在被认为是收获后果实成熟所必需的呼吸代谢物[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

塑料糖酵解和胞浆糖酵解可以协同产生合成脂肪酸所必需的丙酮酸gydF4y2Ba

蔗糖的降解、糖酵解及其中间体运输到质体对于提供脂肪酸合成所需的碳至关重要。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．牛油果中果皮的转录组分析表明，细胞质和质体中可能存在一个完整的糖酵解途径。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。此外，几种可能编码质体转运蛋白的同源蛋白的高表达水平也表明，胞质糖酵解途径产生的中间体、六糖和三糖碳或PEP和丙酮酸可能被转运到质体(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3b) [gydF4y2Ba83gydF4y2Ba，gydF4y2Ba84gydF4y2Ba］．通过依赖于nadp的塑料苹果酸酶(NADP-ME)对进口苹果酸进行脱羧也是生成丙酮酸的另一种途径，这在蓖麻胚乳中有报道[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba和玉米[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba］．虽然细胞质苹果酸脱氢酶(MDH)同源物表达水平相当丰富(>60 RPKM，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)， NADP-ME的转录本在质体中表现较差(<10 RPKM，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。这些数据表明，在牛油果中果皮质体中，胞浆中苹果酸的合成及其导入质体中进一步脱羧可能不会产生大量的丙酮酸gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。gydF4y2Ba

通过比较质体和胞浆中糖酵解酶同源基因的转录水平，我们发现了一些特征，这些特征支持质体中丙酮酸的生成，而丙酮酸是中果皮发育过程中驱动脂肪酸合成所必需的。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．在细胞质和质体中，糖酵解酶的同源物均高度代表(>600 RPKM/酶;无花果。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，其中果糖二磷酸醛缩酶(FBA)是表达最丰富的基因(图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba)．然而，糖酵解主要受以下酶类的调控:己糖转化为己糖- p，果糖-6- p转化为果糖-1,6- dip, PEP转化为丙酮酸[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．细胞溶胶中udp -葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)、果糖激酶和焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶同源转录水平的丰度(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S4和图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，以及SuSY和invertases的高转录水平(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba图S3a)表明胞质糖酵解活性很高，可能更多地依赖于UGPase产生的果糖作为底物。有趣的是，己糖激酶的同源物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，在质体中催化葡萄糖-6-p转化为果糖-6-p和依赖atp的6-磷酸果糖激酶的转录水平比在胞浆中更高(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S4和图gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)，表明早期糖酵解在质体中也高度活跃，可能主要依赖于葡萄糖作为底物。此外，在整个中果皮发育过程中，葡萄糖转运蛋白(GLT)、葡萄糖-6- p (GPT)和核苷酸(NTT)同源基因表达量丰富(>100 RPKM;额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba图S3)表明糖酵解前体和中间体运输到质体的范围。丙酮酸激酶在质体中的高表达水平(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)还表明，鳄梨富含油脂的组织的晚期糖酵解可能受到可塑性的控制。总的来说，在基底被子植物的质体中生成用于脂肪酸合成的丙酮酸的方法似乎是细胞质和质体中活性糖酵解以及中间体运输到质体的协同结果，类似于在富含油脂的双子叶植物和单子叶植物组织中观察到的结果[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

鳄梨是一种基础被子植物，其果实营养价值极高，其非种子组织中富含油酸，是比较不同被子植物富含油脂组织间TAG生物合成功能的理想系统。在这项研究中，研究人员对牛油果中果皮的基因表达进行了研究，重点关注了在非种子组织中负责碳供应及其转化为油的途径和调控因子。我们还讨论了多种富油物种中油脂合成所需基因的整体进化保护。一般来说，从蔗糖降解到TAG组装过程中表达的基因，已知在单子叶植物和双子叶植物的富油组织中上调[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，也在牛油果中果皮中上调(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．此外，与其他富油组织的研究一致，在ER中，脂肪酸生物合成转录本的表达量比编码TAG组装后步骤的转录本的表达量高数倍(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．生成丙酮酸所必需的质体基因和转运体也在中果皮组织中高度表达(图4)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．最值得注意的是，多种WRI异构体同源转录本在牛油果富含油脂的组织中也很丰富。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．这些数据表明，碳的供应和油的合成可能主要发生在质体中。进一步的互补研究对于确定WRI各种亚型在非种子组织中的功能至关重要。对表达于各种富油组织类型和物种的转录因子进行比较分析是确定可能在WRI上游调控中发挥作用的潜在候选转录因子的必要条件。gydF4y2Ba

对牛油果中果皮转录组的定量分析也揭示了一些独特的特征，这表明我们可以进一步利用牛油果进行研究，以解决我们对非种子组织中TAG合成的一些空白，如油脂成分的调控和确定。例如，值得注意的是，在ER中，相对于牛油果中果皮的GPAT9，最丰富的转录本是LACS同源(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S4)提示在内质网和/或内质网和质体交界处有酰基激活的可能。因此，牛油果富含油脂的非种子组织可能提供了一个无价的系统，以确定质体与ER相关的LACS活性的作用和/或质体与ER之间的直接接触[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]存在于基底被子植物中。此外，利用牛油果中果皮可以确定PDAT1的偏好，并探索其与DGAT1在TAG合成中的重叠功能。这种产油物种还适用于研究酰基编辑是否发生在中果皮(去饱和通量很少)，以及它是否涉及磷脂酶2和LACS或由LPCAT介导。由于油酸等储油蛋白缺乏或表达不佳，TAG是否或如何在非种子组织中包装仍是一个谜;而牛油果中果皮中LDAP1和LDAP2的鉴定为研究TAG的稳定性提供了另一种方法。gydF4y2Ba

鳄梨果实在被子植物的发育和生长中是与众不同的，特别是在它积累的储存代谢物的性质方面。在中果皮发育的早期阶段，7-碳糖和淀粉在调节果实成熟和启动脂质合成方面的作用尚不清楚。通过对中果皮和种子组织的碳水化合物、脂质和激素含量的综合分析，以及转录组学的研究，有望对果实发育和碳分配的协调过程提供更深入的了解。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

鳄梨果实(简历。哈斯)在2009年10月至2010年2月期间从一棵树(44-15-11哈斯接穗上D7克隆砧木)收获，并在4°C过夜运到密歇根州州立大学。克隆砧木位于加州大学南海岸研究和推广中心欧文，加利福尼亚州。从五个阶段的果实称重和解剖分离外皮，中果皮和种子(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2BaS1:表;无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．称取离体组织，液氮速冻gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba并储存在−80°C，直到进一步使用。gydF4y2Ba

脂质提取和定量gydF4y2Ba

为测定牛油果果实组织(中果皮和种子)的脂肪酸含量和组成，采用正己烷-异丙醇法提取牛油果总脂[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba］．将提取的脂质称重，在己烷中重悬，通过碱催化甲基化反应转化为脂肪酸甲酯[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba]，并使用气相色谱-火焰电离检测器(Varian 3800)进行分析，以确定脂肪酸组成[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba］．在脂质提取前，以内标添加的三十七核桃苷对脂肪酸进行定量。gydF4y2Ba

提取总RNA，构建cDNA文库并测序gydF4y2Ba

3 g中果皮组织经N液研磨后提取总RNAgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba并在30 mL TRIzol®试剂(Life technologies)中孵育10分钟，再与6 mL CHCl孵育5分钟gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba．在12000度离心之后gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C孵育15 min，水相以1/3体积8 M LiCl孵育过夜。然后，样品在4°C下12000 g离心30分钟，用1000 μL RLT缓冲液重悬RNEasy试剂盒(Qiagen)，按照制造商的程序洗脱RNA。gydF4y2Ba

利用Illumina测序技术获得了用于中果体发育的RNA-seq数据。对RNA-seq进行I期和III期的两个技术重复(a和b)(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。使用安捷伦生物分析仪(Agilent BioAnalyzer, Agilent Technologies)对RNA质量进行检测，所有提交测序的样本RIN评分均为6.4或更高。文库使用Illumina的定向mRNA-seq文库预发布协议(v1.0)创建。然后，按照制造商的协议，在Illumina GAIIx测序仪上进行单次读取75个周期。使用CLC Genomics Workbench软件的Trim Sequences算法根据质量对Reads进行裁剪和过滤(Limit: 0.05, Maximum ambiguities: 2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)可在NCBI短阅读档案(生物项目PRJNA253536 (gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/253536gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

使用Sera-Mag Oligo (dT)磁珠(Thermo Scientific)从总RNA中分离mRNA进行454次测序。使用罗氏cDNA快速文库准备试剂盒(Roche Diagnostics)从汇集的样本中(5个阶段加2次技术重复)生成cDNA文库。在Roche 454 GS FLX测序仪上使用钛化学(Roche Diagnostics)获得序列。gydF4y2Ba

生物信息学和数据分析gydF4y2Ba

利用Trinity v.2 [gydF4y2Ba91gydF4y2Ba]gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba使用上述Illumina reads加上454和Illumina配对reads的输入组装，这些reads来自于一个独立项目的Hass叶和花mRNA测序，其数据和详细信息由NCBI生物项目PRJNA258225提供。与单独使用中果皮单读Illumina数据相比，这允许更完整的转录参考。这产生了151788个contigs，然后使用CD-HIT-EST和默认参数进行集群(序列标识:90%，单词大小:10)，产生134,329个序列集群(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。使用CLC Genomics Workbench version 5.5.1进行样本表达评估。通过对非注释序列使用RNA-Seq分析算法将RNAseq读数据与组装好的contigs对齐来生成唯一的计数(参数:相似性0.8;长度0.75部分)。gydF4y2Ba

Illumina测序得到的RPKM值与1a期和1b期技术重复高度相关(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.96702;额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S5a)和3a级和3b级(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.97526;额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S5b)。本研究考虑了大约250个可能与脂质代谢相关的同源基因，通过454测序获得它们的转录水平，其中所有样本被汇集在一起，也与Illumina测序获得的所有5个中果皮阶段的平均表达数据高度相关(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.91171;额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S5c)。gydF4y2Ba

系统发育分析gydF4y2Ba

进化的关系gydF4y2BaWRIgydF4y2Ba单子叶植物(玉米)、双子叶植物(拟南芥)、基底被子植物(鳄梨)和苔藓植物(gydF4y2BaPhyscomitrella金属盘gydF4y2Ba)通过构建系统发育树进行分析。从TAIR数据库中鉴定出4个AtWRI基因的蛋白序列，从转录组数据中获得鳄梨同源基因(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。利用MEGA 6.0构建UPGMA树，利用ClustalW比对蛋白序列[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba］．通过1000个重复的bootstrap分析，验证该树的鲁棒性。利用BLASTP (NCBI)技术对atwr1在玉米和苔藓中的同源性进行了鉴定。在玉米中，两个与atwrit3和atwrit4同源的序列几乎完全相同，称为wr3 /4。此外，已知玉米具有wr1基因的物种特异性复制，两者都具有调节脂肪酸合成的功能[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．AP2转录因子来自gydF4y2Ba衣藻reinhardigydF4y2Ba被用作WRI树的外组。gydF4y2Ba

加入数据gydF4y2Ba

AtWRI1 (NP_001030857.1);AtWRI2 (NP_001189729.1);AtWRI3 (NP_563990.1);AtWRI4 (NP_178088.2);ZmWRI1a (NP001137064.1);ZmWRI1b (NP_001131733.1);ZmWRI2 (NP_001145827.1);ZmWRI3/4a (XP_008656570.1);zmwr3 /4b (XP_008651355.1) (ppwr1 -like (BAL04570.1);PpWRI2-like (XP_001765028.1); PpWRI3-like (XP_001770958.1); PpWRI4-like (XP_001764166.1); CrAP2 (XP_001699213.1).

支持数据的可用性gydF4y2Ba

与此发布关联的支持数据作为附加文件包括在内。RNA-seq数据和详细的数据集可以在NCBI短读存档项目上获得。gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/253536gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们感谢加州大学河滨分校的Mary Lu arpaaia提供牛油果，感谢密歇根州立大学研究技术支持设施的工作人员，以及拜耳作物科学的Peter Denholf提供序列分析方面的建议。本研究得到了美国能源部五大湖生物能源研究中心合作协议(DE-FC02-07ER64494)和拜耳作物科学的支持。AK获得了东田纳西州立大学研究与发展委员会的主要和次要资助。RP、GZ和KM的部分资金来自印第安纳大学METACyt计划，部分资金来自礼来捐赠公司。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 东田纳西州立大学生物科学系，美国田纳西州约翰逊市，37614gydF4y2Ba

   Aruna Kilaru, Parker B. Dabbs, Ha-Jung Sung和Md. Mahbubur RahmangydF4y2Ba

2. 东田纳西州立大学生物医学科学系，美国田纳西州约翰逊市，37614gydF4y2Ba

   Aruna Kilaru和Md. Mahbubur RahmangydF4y2Ba

3. 密歇根州立大学五大湖生物能源研究中心，东兰辛，48824，美国gydF4y2Ba

   Aruna Kilaru, Xia Cao, Nicholas Thrower和John B. OhlroggegydF4y2Ba

4. 拜耳作物科学，莫里斯维尔，北卡罗来纳州，27560，美国gydF4y2Ba

   夏曹gydF4y2Ba

5. 印第安纳大学信息学与计算学院，美国布卢明顿47408gydF4y2Ba

   Greg Zynda & Ram PodichetigydF4y2Ba

6. Laboratorio Nacional de Genómica para Biodiversidad-Langebio/Unidad de Genómica Avanzada UGA, Centro de Investigación y Avanzados del IPN, 36500, Irapuato，瓜纳华托，墨西哥gydF4y2Ba

   Enrique Ibarra-Laclette & Luis Herrera-EstrellagydF4y2Ba

7. Red de Estudios Moleculares Avanzados, Instituto de Ecología A.C, 91070，哈拉帕，韦拉克鲁斯，墨西哥gydF4y2Ba

   恩里克Ibarra-LaclettegydF4y2Ba

8. 美国印第安纳大学生物系，布卢明顿47405gydF4y2Ba

   Keithanne MockaitisgydF4y2Ba

9. 美国密歇根州立大学植物生物系，东兰辛，48824gydF4y2Ba

   John b . OhlroggegydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba一边抚摸KilarugydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

两位作者宣称他们之间不存在利益冲突。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

AK、XC和JO设计了这项研究。HJ和AK进行脂质分析。XC、NT、KM、GZ和RP提供生物信息学支持。AK、XC、PD、MR、JO进行脂质通路分析。EI和LE提供了基因组信息。AK、JO、KM和LE撰写了手稿。所有作者阅读并批准最终稿。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许不受限制地在任何媒体上使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供创作共用许可的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域转让豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba