20种有分类关系的产苄基异喹啉生物碱植物的代谢组分析

背景

最近，在阐明苯并异喹啉生物碱(BIA)代谢方面的进展主要集中在少数模式植物物种上。目前对罂粟等植物中BIA代谢的理解依赖于基因组学和代谢组学的结合，以促进基因的发现。BIA代谢积累了可待因和吗啡等重要的药理制剂。代谢组学研究为特化代谢基础的主要生化网络提供了重要的见解，并作为代谢工程、基因发现和调控机制阐明的关键资源。除了模型植物之外，很少有广泛的代谢组学报告可用于已知的大量植物物种，这些植物物种产生估计2500种结构多样化的BIAs，其中许多表现出有前途的药用特性。

结果

我们采用了一种多平台方法，结合四种不同的分析方法来检测20种非模型的、bia积累的植物物种。根据报道的BIA含量、分类分布和在现代/传统医学中的重要性，选择了毛茛科4科植物。一维¹基于H nmr的谱分析定量了91种代谢物，揭示了糖、氨基酸和有机酸含量的显著物种和组织特异性差异。根和根状茎中的单糖和双糖普遍低于茎，各种代谢产物将愈伤组织与完整的植物器官区分开来。直接流动灌注串联质谱提供了110种脂类衍生物的广泛调查，包括磷脂酰胆碱和酰基肉碱，高效液相色谱结合紫外检测定量了15种酚类化合物，包括黄酮类、苯甲酸衍生物和羟基肉桂酸。超高效液相色谱结合高分辨率傅里叶变换质谱生成了所有物种的大量质量列表，用于挖掘推定对应于BIAs的代谢物。观察到不同的生物碱分布，包括普遍存在的和潜在的稀有化合物。

结论

广泛的代谢物分析结合多种分析平台，可以更全面地了解所选植物物种的整体代谢情况。这项研究首次将代谢组学方法应用于这些物种中的大多数，尽管它们在现代和传统医学中都很重要。这些代谢组学资源与基因组学数据相结合，成为研究非模式植物物种BIA生物合成的关键资源。

代谢组学，一般定义为在特定条件下对给定系统中所有代谢物的测量[45]，是一种重要的功能基因组学工具，广泛应用于基因型鉴别、病理表型和天然产物发现等领域。与动物相比，植物是代谢组学研究的一个特殊问题，因为植物含有大量(约20万种化合物)和种类繁多的代谢物[42］．植物积累了大量的特殊代谢物，其中许多具有强大的药理活性。突出的例子包括苯基异喹啉生物碱(BIA)类化合物，它大量出现在毛茛目，特别是在罂粟科，毛茛科，小檗科和Menispermaceae科(补充文件)1)．虽然BIAs有一个共同的生物合成起源，从酪氨酸开始，分支的生物合成途径-许多在生化和遗传水平上仍未解决-导致形成不同的分子结构(附加文件)2)．对许多积累bia的植物，特别是在现代或传统医学和文化实践中具有重要意义的植物的生物碱含量进行了有针对性的研究[17，51］．越来越复杂的分析平台的出现支持了基于高分辨率质谱(MS)的BIA分析黄连碱黄花［29，30.]、罂粟(果实；［49])和紫堇属之植物物种(27］．液相色谱(LC -NMR)和LC- ms -NMR等联合技术已应用于生物碱的分析Eschscholzia californica［14),南天竹属有［26细胞培养。

只有有限数量的报告试图定义支撑生物碱生物合成的生化网络。包括初级代谢和次级代谢的大范围代谢组学在很大程度上局限于模式植物物种，包括罂粟，一个长期用于研究BIA代谢的模型系统。¹利用H NMR对罂粟植物中的34种根代谢物和21种乳胶代谢物进行了鉴定和定量[18］．同样，使用NMR在罂粟细胞培养物中监测了42种不同的代谢物，揭示了真菌激发子诱导后初级和次级代谢的广泛重编程[69］．基于nmr的代谢组学报道Chelidonium majus，尽管化合物鉴定能力有限[43］．化合物鉴定同样限制了使用FT-ICR-MS分析的罂粟细胞培养物的更详细的轮廓，尽管确认了992种不同的分析物的存在[70］．自这些报告以来所取得的技术进步提高了化合物鉴定的能力。动物代谢组的分析现在拥有数百种代谢物的常规识别和定量(例如，人类尿液，>400代谢物;［6])，并在植物代谢组学研究中有所反映[54］．目前的关键策略包括综合使用多种提取程序和分析平台，以提高代谢覆盖率和减少偏倚。例如，用水、醇和有机溶剂分别提取可产生不同的代谢物谱[62］．水萃取物的质子核磁共振在确定和定量的化合物的数量和结构多样性方面仍然是一个领域标准，现在有各种生化数据库和二级分析工具[5，61］．基于ms的方法通过提供更强的光谱分辨率和低丰度化合物分析的灵敏度来补充核磁共振[50]而大量的开源和商业软件包则有助于下游分析[53］．有关样品分馏(即色谱类型)、离子生成和质谱分析仪类型的选择[例如，三重四极杆、飞行时间(TOF)、Orbitrap、离子回旋共振(ICR)]会影响最终数据集的性质。核磁共振和基于ms的平台都非常适合化学计量学方法，如主成分分析(PCA)和层次聚类，这些方法通常需要从复杂的数据集中得出生物学相关的结论[63］．

我们设计了一种多平台方法，结合了四种不同的分析方法，以获得在非模型中运行的生化网络的更完整的视图，bia积累植物(图2)。1)．这项研究首次将代谢组学方法应用于这些物种中的大多数，尽管它们在现代和传统医学中很重要[17］．在此报告的大量数据收集作为(i)控制生物碱代谢的生化机制研究的关键资源，(ii)新基因的发现，和(iii)未来代谢工程的努力。代谢物和转录物资源的开发极大地促进了罂粟等模型系统中新基因的发现，使几种主要BIA途径的阐明接近完全。结合我们的转录组分析[19]，这项工作的目标是为显示独特和未开发的BIA剖面的植物建立等效资源。

生物碱结构多样性和富集的物种和组织选择

选择20种植物进行代谢组学分析，主要基于已报道的生物碱积累剖面，如相关文献所述。其他因素包括分类分布、组织可用性以及在传统医学或文化实践中的使用(表明可能存在药理活性BIAs)。

研究重点集中在毛茛科(Ranunculaceae)属4个科之一:罂粟科(Papaveraceae)(8种)、毛茛科(Ranunculaceae)(4种)、小檗科(Berberidaceae)(4种)和Menispermaceae科(4种)(表2)1)．尽管BIAs在不同被子植物类群中都有报道，但它们最常出现在这四个科[17］．许多不同的BIA结构亚型出现在毛茛科，包括12个显示在附加文件2．为了最大限度地提高生物碱类型的多样性，我们选择了据报道富含各种不同BIAs的植物。例如,紫堇属之植物而且罂粟花已知物种积累了大量不同的BIAs，包括morphinan、原小檗碱、苯并苯胺、aporphine、pavine和邻苯酞异喹啉生物碱[24，25］．Menispermum canadense除了双苄基异喹啉类生物碱外，还可产生极为罕见的异丙胺生物碱，这些生物碱更典型地存在于弯叶虫科成员中[10］．小檗科和毛茛科也有多样性;Thalictrum例如，物种可产生氧苯-异喹啉生物碱、多异喹啉衍生物和差异取代的阿啡分子[2，46，56］．根据表明BIAs积累位点的文献来源，选择根、茎或根状茎进行代谢组学分析。这是一个关键的考虑因素，因为BIA含量在不同的器官中差异很大。比如血精Sanguinaria黄花在根和气生器官(叶、花)中的浓度分别比在根状茎中的浓度低10倍和1000倍[8］．在选择物种和器官类型时，植物特定的环境(例如在医学上的用途，保护状况)是次要考虑因素。例如,黄连碱黄花是加拿大某些原住民的重要传统医药，由于现代过度采伐的做法，现在被视为濒危物种[3.］．这些情况，加上独特的富酞异喹啉BIA剖面[29的选择h .黄花目标植物。在三个物种中，愈伤组织培养被用来代替分化的器官(表1)．作为完整植物的替代品，细胞培养已经作为生物合成模型和生物碱生产系统使用了三十多年[67］．本研究中包括愈伤组织，允许对完整植物和细胞培养物的代谢组进行一般比较。

¹H NMR分析突出了糖、氨基酸和有机酸含量的物种和组织特异性变化

通过NMR对代谢物进行测量预计有利于糖、氨基酸和有机酸，因为这些构成了植物中发现的最丰富的水溶性初级代谢物[62］．大多数苄基异喹啉生物碱在纯水中难溶，用酒精或水-酒精混合物提取更有效[18，40］．为了重点研究主要代谢物，使用水进行植物核磁共振提取，而在UPLC-FTMS之前，甲醇提取富集了生物碱含量。由于Chenomx NMR Suite 7.0能够有针对性地鉴定和定量复杂样品中的>300代谢物，因此使用它进行NMR谱分析(http://www.chenomx.com)．苯基异喹啉类生物碱的标准光谱尚未在Chenomx文库中表示;这一现实，除了在纯水中的溶解度差之外，还排除了生物碱的结构分析。尽管如此，共有91种代谢物被识别出来并使用一维(1D)进行量化。¹H NMR和Chenomx NMR套件支持。额外的文件3.列出每种植物4个重复中检测到的化合物及其丰度。代谢物数量构成了使用MetaboAnalyst v. 2.0进行主成分分析(PCA)的基础[65］．PCA是一种无监督的方法，用于将大型数据集总结为更容易解释的主成分(PC)分数。主成分分析的目标是使用最少数量的pc来解释尽可能多的数据方差[11，23］．通常，2或3维评分图足以对代谢组学数据进行有意义的解释。伴随载荷图用于解释得分图的模式。特别是，负荷图可以揭示对样本间方差贡献最大的代谢物(在本文中称为“负荷”)。数字2a和b分别说明基于nmr的代谢物量的PCA评分和负荷图。核磁共振检测到的最丰富的代谢物是糖、糖酸和醇，以及各种氨基酸，包括谷氨酰胺、天冬酰胺和精氨酸(附加文件)3.)．然而，代谢物的数量在物种之间变化很大，形成了总体差异的基础。例如，与果糖、葡萄糖和蔗糖相对应的负荷是PC1变异的重要贡献者(图1)。2 b)，以区分富含糖的Chelidonium majus(CMA),Argemone墨西哥(AME),Glaucium flavum(GFL)从糖消耗chelanthifolia延胡索(CCH)组织(图2)．图中显示了这些代谢产物和其他代谢产物对方差的影响。3.．虽然CMA根的糖已耗尽，但许多其他代谢物，如葡萄糖酸盐和阿拉伯糖醇，只存在于这些组织中。多元醇，如阿拉伯糖醇，主要与真菌王国有关[33]在根外生菌根中相对于游离真菌可升高[35］．CCH根系中糖的消耗和阿拉伯糖醇的富集反映了共生真菌的存在。CCH根相关转录组学数据的评价[19]揭示了与未培养的根际分离物和其他未鉴定的真菌、细菌和原生生物的DNA高度同源的非植物序列的存在。虽然很明显，在RNA提取时，各种微生物与CCH根有关，但BLAST结果不足以确定任何植物-微生物相互作用的性质，如果存在这种关系的话。

愈伤组织培养与大多数其他植物组织不同，特别是沿着PC2(图2)。2)．部分原因是某些氨基酸(如谷氨酰胺、精氨酸)、甘油酯和甘露醇的丰度较低。2 b,无花果。3.，附加文件3.)．类似的结果也被发现罂粟花bracteatum(PBR)茎组织，以聚类的PBR突出Cocculus trilobus(CTR),Cissampelos mucronata()和金果榄等(TCO)数据(图;2)．除了一些例外，根和根茎中的单糖和双糖普遍低于茎，这可能反映了这些组织中木质化次生木质部的存在。

DFI-MS/MS显示主要膜脂和酰基肉碱普遍存在

为了检测极性较低的代谢物，包括长链酰基肉碱、甘油磷脂和鞘脂，采用有机溶剂提取，制备直接流动注射(DFI)-MS/MS分析。采用直接流动注射(DFI)串联质谱(MS/MS)检测和定量肉碱、磷脂和鞘脂的试剂盒为基础，有针对性的定量方法。总共检测到110种代谢物，并在20种积累bia的植物物种中进行了量化。检测到的化合物属于三类脂类之一，由O——或者N-链接头组:酰基肉碱，甘油脂和鞘脂。化合物身份和丰度在附加文件中列出4．磷脂酰胆碱(PC)分子表现出部分去饱和，O-连接的双酰基(aa)链长度可变，共有34或36个碳(两个酰基链的总和)是迄今为止最丰富的代谢物。在动植物体内，PC脂质是血浆、线粒体膜和内质网的主要成分[57］．具有一个或多个双键的C34或C36双酰基(aa)脂质(例如PC aa C34:1, PC aa C34:2等)的丰度比具有较短链长的等效PC脂质高1000倍。这些结果反映了PC的含量拟南芥［39]，这并不奇怪，因为长度为16或18个碳的脂肪酸通常构成了在进一步衍生化之前在叶绿体间质中合成的大部分脂肪酸。二酰基PC脂质比混合链(即烷基酯或' ae ')和单链(即' lyso ')脂质更丰富。例如，PC aa C34:2的平均水平是PC ae C34:2的37倍。特异于类囊体膜的磷脂酰甘油(PG)脂类和主要存在于叶绿体包膜和类囊体膜的糖脂类没有使用AbsoluteIDQ p150试剂盒进行测量。尽管使用该试剂盒可获得大型化合物库，但应用领域通常以动物为重点，某些植物特异性代谢物尚未被代表(http://www.biocrates.com/products/research-products/absoluteidq-p150-kit)．除了5种鞘脂外，还测量了28种酰基肉碱代谢物。与动物相比，植物酰基肉碱的含量较低，除了已知参与脂肪酸代谢外，对其生物学作用知之甚少[7，44］．PCA表明PC水平是PC1方差的重要贡献者，它区分了根小檗属植物thunbergii(蓝芽),Xanthorhiza simplicissima(XSI)和chelanthifolia延胡索(CCH)从组织中表现出较高水平的几种PC类(附加文件5)．此外，PCs和酰基肉碱对PC2方差的共同贡献似乎是有区别的Eschscholzia californica(ECA)来自其他物种。关于植物酰基肉碱的生物学作用的进一步研究将有助于解释这些观察结果。

酚类物质含量反映了环境因素的影响

以植物酚类化合物为目标的高效液相色谱-紫外法用于鉴定和定量15种代谢物，包括黄酮类化合物、苯甲酸衍生物和羟基肉桂酸(附加文件)6)．除了两种苯甲酸衍生物(即丁香酸和没食子酸)，本研究中检测的所有酚类化合物都来自苯丙烷途径。苯丙类化合物占陆地生物圈总碳的近20% [66]在植物中发现了超过7000种不同的苯丙类化合物[60]，它们的功能包括色素、细胞壁成分、气味化合物和信号分子。尽管这些化合物含量丰富，在植物中无处不在，但酚类化合物的出现和数量在不同物种之间差异很大，在单一物种内部也取决于环境、发育或遗传因素。例如，在不同的种子中，各种黄酮类化合物的数量存在显著差异拟南芥结果表明，即使遗传背景的微小变化也会影响多酚的含量[47］．在本研究中观察到酚含量在定量和定性上的差异，并且在培养组织和完整植物之间有明显的区别。PCA沿着PC1从其他物种的根和茎中定义了CMU、TCO和CTR的愈伤组织，这占数据中观察到的方差的40%(附加文件)7A).愈伤组织培养缺乏或缺乏一些酚类化合物，包括木犀草素和山萘酚，这些化合物在根和茎组织中相对丰富(补充文件)8)，并对PC1沿线的方差做出了贡献(附加文件7B).木犀草素和山萘酚是具有光保护功能的类黄酮，已知它们会在太阳辐照度和紫外线胁迫下积累[1，20.］．此外，类黄酮在根皮层组织中富集，可能提供了对抗生物和非生物应激的保护[38］．在黑暗的无菌条件下生长的愈伤组织，由于没有光或其他环境压力的诱导，这些化合物的含量可能较低。

几种化合物的丰度在不同物种之间差异很大。例如，槲皮素水平为>35 mg g⁻¹干重Stylophorum diphyllum茎，但几乎检测不到(<1毫克g⁻¹)。尽管酚积累剖面受到遗传因素的影响，但这些在室外和温室中种植的植物的代谢物含量可能直接受到环境因素的影响。香豆素在茎组织中含量普遍较低，但在几种植物的根中含量较高chelanthifolia延胡索(CCH)(附加文件8)．与其他品种相比，CCH根中也含有丰富的肉桂酸和丁香酸。已知真菌感染可引起根分泌肉桂酸和丁香酸[28］．有可能CCH根，以及本研究中检查的其他根，在分析之前暴露于微生物挑战。

UPLC-FTMS分析区分愈伤组织与富含bia的植物组织

非靶向UPLC-FTMS分析有望生成与各种代谢物(包括生物碱)相对应的广泛质量列表。在正离子模式下进行的分析平均检测到412种化合物，列出了多达1200种不同的质量(例如，对Eschscholzia californica)，每个人分配自己的色谱保留时间(R_t)(附加文件9)．相比之下，在负离子模式下进行的分析平均每个物种产生799个化合物，最大质量为1767大肠californica(附加文件10)．尽管基于ms的方法检测到的大量代谢物对于生物标志物发现和病理诊断等非靶向应用非常重要，但化合物鉴定仍然是一个挑战[22］．尽管如此，基于质谱的方法对生物碱的分析很重要，因为生物碱通常以低丰度存在。为了深入了解20个选定植物物种的BIA含量，我们挖掘了正离子模式数据集(附加文件)9)，并确定了与已知生物碱的经验公式相对应的确切质量。这些质量和相关信息(预测的原子组成，R_t和假定的BIA分配)被编译在一个单独的文件(附加文件11)表示浓缩的生物碱特定列表。由于结构异构在BIAs中很常见，许多化合物具有相同的经验公式，因此具有相同的质量。在这种模棱两可的情况下，质量不是分配给单个BIA，而是分配给具有相同经验公式的生物碱群(即“质量群”)。用于挖掘正模式数据集的已知BIAs(按质量组组织)列表可在附加文件中找到12．

标准没有作为UPLC-FTMS分析的一部分，不允许绝对量化。然而，离子计数的比较提供了相对BIA丰度的快照。离子计数形成主成分分析的基础，如图所示。4(分数图)和4B(装载图)。尽管结构不同的BIAs之间的电离效率的可变性可能在一定程度上影响了观测到的丰度，在进行直接比较时应谨慎，但仍然可以从多元分析中得出一般结论。这些结果如图所示为热图。5而且6，可以比较不同物种的相对生物碱丰度。PC1占数据集方差的45%以上，它能清楚地将愈伤组织(CMU、TCO、CTR)与根、根茎和茎样本区分开(图2)。4)．目视检查显示，在愈伤组织中，特别是在CMU中，相对缺乏与偏压相对应的肿块。5而且6)．只有一个质量(米/z336.12303)在R洗脱_t在CMU中检测到= 7.3 min，而在分化组织中，平均每个物种有32种假定的生物碱。尽管生物碱的生物合成机制(如信使rna、酶)仍然经常存在，但生物碱在整个植物中丰富而在培养细胞中缺乏的情况经常发生[68］．例如，罂粟细胞培养缺乏吗啡生物碱，尽管这些化合物在整个植物中过量。然而，从罂粟细胞培养中获得的资源导致了几种参与吗啡生物合成的酶的发现[17］．

BIAs的假定鉴定揭示了基因发现的线索

在不同物种中最常发生的质量包括米/z342.16988 (R_t= 5.6分钟)，314.17507 (R_t= 4.3分钟)和336.12303 (R_t= 7.3分钟)。这些团块中的最后一团可能与小檗碱相对应，小檗碱是一种普遍存在于毛茛科植物中的生物碱[12］．由于在UPLC-FTMS分析中没有标准，我们使用23个可用的生物碱标准对相同的组织进行了额外的三重四极杆LC-MS/MS研究，这允许明确识别几个未知因素。通过碰撞诱导解离(CID)分析，确定了小檗碱在几种植物中的存在。LC-MS/MS结果总结为有代表性的带注释的色谱图(附加文件13)和CID峰值列表(附加文件14)．虽然许多偏见分享公式C_20.H₂₄没有₄（米/z(附加文件12)，在5.6 min时频繁出现该组分的代谢物(14/20种)，可能是木兰苷(图。6)．与小檗碱一样，木兰碱是一种常见的BIA，在毛茛科的所有科中都有发现，并且零星地出现在不相关的目中[21，32，37，40］．主成分分析表明，负荷推定对应小檗碱和木兰碱(图。4 b)有助于区分富含生物碱和缺乏生物碱的植物组织。

chelanthifolia延胡索(CCH)富含在其他物种中很少或没有发现的几种生物碱，这一结果可能有助于沿着PC2从其他植物中明确分离CCH(图2)。4)．此外，在其他植物中丰富的某些团块(如。米/z342.16998 R_t= 5.6分钟)无CCH。CCH特有的团块包括那些可能对应于邻苯二甲酸异喹啉生物碱的团块。例如,米/z370.12851 (R_t= 5.9和6.3分钟)可能代表corledine, corlumidine或severtzine，所有的经验公式C_20.H_20.没有₆到目前为止只在紫堇属之植物物种(4］．其他符合此分子式的化合物包括邻苯二代异喹啉香芹碱和香蔻宾(R)，主要局限于Fumarioideae部落(表1) [16，36，64］．（年代)-邻苯二酰异喹啉肼的潜在前体(米/z384.14416) (36]是已知发生在黄连碱黄花．在HCA根茎中发现了与这些生物碱相对应的团块。6)．不像模式植物罂粟的酞异喹啉类生物碱(如诺卡平)，水仙碱、科莱丁、科鲁米定、塞瓦辛和伊吉宁都缺乏4 ' -羟基或4 ' -甲氧基(附加文件)15)．该基团的存在是罂粟中noscapine生物合成的绝对必要条件，作为关键的CYP82酶(1-羟基-N-甲基加拿大碱13-羟基化酶)在此位置不接受缺乏羟基功能的底物[9］．CCH和HCA中存在非羟基化邻苯二酰异喹啉生物碱，可能表明CYP82变体具有不同的底物接受谱或替代生物合成。在HCA和CCH转录组中分别发现了11个和8个CYP82同源体[19］．检测这些酶是否参与非羟基化邻苯酞异喹啉生物碱的生物合成，有助于阐明HCA和CCH中的通路。

有趣的是，FTMS结果显示，PBR可以产生邻苯二酰异喹啉生物碱，尽管数量很少。一个单独的团块，假定代表noscapine (米/z414.15473)在PBR茎中发现。6)．这些结果对基因发现的过程很重要，特别是当与转录组数据一起考虑时。例如，在PBR茎中表达的几个未鉴定的基因与那些已确定参与罂粟中noscapine生物合成的基因具有显著的同源性[19］．在PBR中鉴定出与诺scapine相对应的质量增加了假设的重量，即这些PBR基因是功能同源的，在苯硫代异喹啉生物合成中起作用。此外，CCH等物种中独特物质块的出现使“假设驱动挖掘”成为可能，即怀疑目标生物碱的出现使合理的候选基因选择和分析设计成为可能。例如，在CCH中存在大量可能对应于苯硫代异喹啉生物碱(如甘薯碱)的物质，可以作为检测CCH中未鉴定的诺卡平合成酶(NOS)样基因的基础，使用苯硫代异喹啉底物，如双核碱，一种怀疑的甘薯碱氧化产物[16］．罂粟中的类似反应包括nos催化的那可汀半缩醛氧化成诺卡平[9］．在CCH转录组中鉴定出6个与罂粟NOS大量同源的CCH基因[19］．本质上，这个代谢物列表(图。5而且6)可以作为选择新基因测试假设活性的指南。

代谢组学的一个重要目标是获取尽可能多的代谢物信息，这需要使用多个分析平台。本研究采用的多面方法结合了五种不同的技术，以获得更广泛和更准确的20种不同的bia积累植物物种的初级和次级代谢的快照。在不同来源组织(如愈伤组织与分化器官，茎与根/根茎)之间观察到初级代谢产物的差异，这可能与生物碱含量的变化有关。紫外线和根际真菌等因素是影响植物整体生物化学的无数因素之一。环境因素对初级和次级代谢都有影响，有力的证据表明植物的反应是高度协调的[17，70］．生物碱作为防御代谢物的生产可能是由生化事件支撑的，只能通过大范围的代谢物分析来可视化。这些复杂机制的阐明依赖于持续和迭代的代谢组学研究，而这些研究又依赖于不断改进的分析技术。

植物材料及组织制备

所选组织取自黄连碱黄花，Sanguinaria黄花，黑种草，十大功劳aquifolium，Menispermum canadense，Stylophorum diphyllum,Xanthoriza simplicissima在植物园(Jardin Botanique de Montréal)种植的户外植物(Montréal, Québec;http://espacepourlavie.ca)．Jeffersonia diphylla而且小檗属植物thunbergii植物购买自Plant Delights Nursery(北卡罗来纳州罗利;www.plantdelights.com)和Sunnyside温室(阿尔伯塔省卡尔加里;www.sunnysidehomeandgarden.com),分别。Chelidonium majus，罂粟花bracteatum，Argemone墨西哥，花菱草californica，南天竹属有，Glaucium flavum，Thalictrum flavum而且chelanthifolia延胡索在标准的露天温室条件下，从盆栽土壤中发芽的种子生长而来。种子取自B和T World Seeds (http://b-and-t-world-seeds.com的例外t . flavum而且p . bracteatum，由Staudensamen (www.jelitto.com)及玫瑰花园人生(www.lavieenrosegardens.com),分别。愈伤组织培养Cissampelos mucronata，Cocculus trilobus,金果榄等购买自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany;http://www.dsmz.de)，并按上文所述进行维护[13］．组织在液氮中快速冷冻，并保存在−80°C。除了目标HPLC-MS/MS外，所有分析都对每个物种进行了4个生物重复，在这种情况下只进行了一次重复。每个生物复制的组织都被冻干，研磨成细粉，并使用水(NMR, HPLC-UV分析)、有机溶剂(LC/DI-MS/MS)或甲醇(UPLC-FTMS)进行分离提取。

核磁共振光谱学

冻育组织粉用水提取三次，脱水。在600 μL磷酸钠缓冲液(50 mM, pH 7)中重构该干燥的水溶性组分₂添加O和30 μL标准缓冲溶液[3.73 mM DSS(2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸二钠)，0.47%叠氮化钠(w/v)]。样品涡旋1分钟，超声30分钟，并转移到标准的Shigemi微细胞核磁共振管。所有¹H-NMR光谱是在500 MHz Inova (Varian公司，Palo Alto, California)光谱仪上获得的，该光谱仪配备了5毫米HCN z -梯度脉冲场梯度(PFG)冷探针。数据是在25°C下使用noasy -预饱和脉冲序列的第一瞬态收集的，因为它具有很高的定量精度。使用8秒的采集时间和1秒的循环延迟收集了256个瞬态光谱。

核磁共振化合物鉴定与定量

所有的fid(自由感应衰减)都被零填充到64 k数据点，并受到0.5 Hz的线展宽。由DSS甲基产生的单线态被用作化学位移参考的内部标准(设置为0 ppm)和定量目的。所有¹使用Chenomx NMR Suite Professional软件包v. 6.0 (Chenomx Inc.， Edmonton, Alberta)处理和分析H-NMR谱。该软件允许定性和定量分析核磁共振光谱，通过手动拟合来自内部参考光谱数据库的光谱特征到完整的核磁共振光谱[59］．使用标准Chenomx 500 MHz代谢物库对每个代谢物进行光谱拟合。对于大多数样品，90%的可见峰被指定为化合物，90%以上的光谱区域可以使用Chenomx光谱分析软件进行常规拟合。大多数可见的山峰都用复合名称进行了注释。先前的研究表明，这种拟合程序可提供90%或更高的绝对浓度准确度[59］．每个谱都由至少两名NMR波谱师处理和分析，以尽量减少化合物的错误识别和错误定量。必要时，采用样品尖刺法来确认指定化合物的特性。在样品中加入20 ~ 200 μM的候选化合物，观察核磁共振信号强度是否如预期变化。

DFI-MS / MS分析

使用市售试剂盒AbsoluteIDQ 150 (Biocrates Life Sciences AG, Innsbruck, Austria)对冻干组织粉进行靶向定量代谢组学分析。该试剂盒采用直接流动注射(DFI)-MS/MS技术，特别适用于ABI 4000 QTrap (Applied Biosystems/MDS Sciex, Foster City, California)。使用这种方法，多达163种不同的代谢物，包括氨基酸、酰基肉碱、甘油磷脂、鞘脂和糖可以被识别和量化。试剂盒检测依赖于选择性衍生化和提取，得到的分析物使用预定义的多反应监测(MRM)对、中性损失测量和前体离子扫描进行分析。同位素标记的内部标准品包括作为代谢物定量试剂盒板过滤器的一部分。AbsoluteIDQ 150试剂盒包含一个带有过滤器附件的96深孔板，以及用于制备板分析的试剂和溶剂。为了标准化和校准目的，试剂盒中的前8个孔用于以下:1个空白样品，3个零样品，7个标准样品和3个质量控制样品。植物样品根据制造商的说明进行处理和分析。简单地说，用有机溶剂提取冻干的组织，每个有机部分10 μL加载在96孔试剂盒板上部的过滤器中心，用氮气流干燥。随后加入衍生剂5%异硫氰酸苯酯20 μL。 Following an incubation period, filter spots were dried again and subjected to extraction with 300 μL methanol containing 5 mM ammonium acetate. Extracts were obtained by centrifugation into the lower 96-well plate and diluted with kit MS running solvent. MS analysis was performed according to manufacturer instructions on an ABI 4000 QTrap (Applied Biosystems/MDS Sciex, Foster City, California). byDFIBiocrates MetIQ software was used to control assay workflow, from sample registration to automated calculation of metabolite concentrations to data export.

HPLC-UV分析

为了测定多酚含量，将冻干的植物组织提取[31]及高效液相色谱-紫外分析[48]，并作了一些修改。干燥的粉末在8-10毫升水中均质，并在沸水浴中间歇涡旋孵育30分钟。提取液冷却，3000 rpm离心20分钟。重复提取，上清液经0.45 μm尼龙膜(EMD Millipore, Billerica, Massachusetts)收集过滤。将滤液冻干，溶解于高效液相色谱运行缓冲液(溶剂A;50 mM磷酸钠pH值2.5)，在注射前再次通过0.45 μm尼龙过滤器。使用安捷伦1100系列HPLC系统进行分析，该系统由安捷伦G1311A四元泵和安捷伦G1315B二极管阵列检测器(安捷伦科技公司，加州圣克拉拉)组成。使用Synergi RP-polar C18色谱柱(Phenomenex, Torrance, California)进行分离，并对溶剂a和溶剂B(100%甲醇)进行梯度洗脱，如下:0 min, 5% B;15 min, 30% B, 40 min, 40% B;60 min, 50% B;65 min, 55% B; 90 min, 100 % B. Flow rate was 1.0 mL/min and injection volume was 40 μL. Absorbance was monitored at 254, 280, 306 and 340 nm. Phenolic compounds were identified by comparison of retention time (Rt) and UV spectral data with those of known standards and quantification was achieved using routine procedures based on calibration curves.

UPLC-FTMS分析

用甲醇提取两次冻干植物组织，将上清液池化并再次冻干。精确称量残留物(每个样品4-5 mg)，并在涡流混合和超声处理的帮助下，将其溶解在20%甲醇中，浓度为5.0 mg/mL。然后将每个溶液用5%甲醇1:5稀释，并在10,000 g下离心以去除不溶性物质。使用Dionex Ultimate 3000 RSLC超高性能液相色谱(UPLC)系统与Thermo LTQ-Orbitrap Velos质谱仪(MS)耦合，并配有加热电喷雾电离(ESI)源。植物代谢产物在BEH C上进行分离₁₈UPLC柱(2.1 × 100 mm, 1.7 μm, 130 Å)。流动相为0.01%甲酸水溶液(溶剂A)和0.01%甲酸异丙醇溶液(溶剂B)，进行二元梯度洗脱。在16 min内，梯度为2% ~ 100% B;在两次注射之间平衡柱4分钟之前，100% B浸泡2分钟。柱流速为0.3 mL min⁻¹柱温设置为40℃。注射量为10 μL。质谱检测在傅里叶变换(FT)全质扫描模式(即FTMS)范围内米/z100到1000。质量分辨率设置为30,000 FHMW，自动增益控制(AGC)目标为1×10⁶允许的最大注射时间为500毫秒。每个样品在正离子和负离子检测模式下分别进行两次UPLC-FTMS, LC-MS数据文件以质心模式记录。为了确保质量精度，在所有运行过程中，除了标准的外部校准程序外，还应用了实时内部质量校准，使用来自两个无处不在的背景离子的两个参考质量，即米/z391.28429从(M + H)⁺双(2-乙基己基)邻苯二甲酸盐离子的(+)离子模式检测和米/z112.98563从(2 M + Na-2H)⁻(−)离子模式检测中甲酸的离子。通过这种方法，所有测量的质量误差均在±2.5 ppm范围内。典型的ESI参数如下:离子源喷射电压，(+)ESI为3500 V， (-) ESI为3000 V;鞘气流量40任意单位(AU);辅助气流量15au;加热雾化器温度350°C;毛细管温度325℃。每个样品的(+)和(−)离子模式数据集分别使用免费的XCMS套件进行处理[52，55]可在http://xcmsonline.scripps.edu/用于自动峰提取，保留时移校正，峰分组和对齐。每种植物4个样品中检测到的代谢物以单同位素格式保存在单个CSV峰表中米/z值，和保留时间(R_t在min)与相应的峰面积(离子计数)，为检测到的代谢物横跨样品。人工峰脱同位素应用于每个生成的峰表，这些化学和电子噪声也在这一步中被去除。正离子模式质量表用于挖掘离子质量(米/z)对应于基于已建立的经验公式对已知偏差的预测。使用±2.0 ppm的允许误差范围将观测到的离子质量与预测的BIA离子质量进行匹配。

三重四极杆LC-MS/MS分析

LC-MS/MS采用先前描述的方法[13稍加修改。简单地说，用Bieleski溶液(15:1:4甲醇:甲酸:水，v:v)提取组织，并在14 000 g下在4°C下离心10分钟。上清液经22 μm Millex过滤器(EMD Millipore, Billerica, MA)过滤，在溶剂A (10 mM醋酸铵，5%乙腈，pH 5.5)中进行冻干和重组(5 mg/mL)。配制1:10和1:100的稀释液用于LC-MS/MS分析，使用Agilent 1200系列HPLC耦合Agilent 6410B三重四极杆质谱分析仪(Agilent, Santa Clara, California)进行分析。采用Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱，流速为0.5 ml/min，溶剂a和溶剂B(100%乙腈)的梯度为:0 min, 100%溶剂a;10 min, 50%溶剂A;12 min, 1%溶剂A;13分钟，1%溶剂a，通过ESI源将洗脱液引入正离子模式的MS中。优化BIAs的源和界面条件(气体温度350°C，气体流速10 L/min;喷雾器气体压力50 psi，破碎器100 V，毛细管4000 V)。四极杆1和2仅设置为射频，四极杆3从200-700扫描米/z．这些宽扫描用于选择BIAs，其身份可以通过比较1)保留时间和2)碰撞诱导解离(CID)光谱与真实标准的光谱来确认。对于CID光谱，在四极2上施加25 eV，通过扫描在四极3上检测到所产生的片段米/z比前体离子大40到2个单位米/z．

多变量分析

为了比较来自不同植物物种的样品之间的代谢物组成和浓度差异，使用MetaboAnalyst v. 2.0进行主成分分析[65]，是一种基于网络的代谢组学数据处理工具，可接受各种输入数据，如核磁共振或质谱峰值列表和化合物/浓度信息(http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/)．代谢物数量构成了NMR PCA、LC/DFI-MS/MS和HPLC-UV数据的基础。离子质量的相对丰度(即离子数)m / z)与已知BIAs的预测值相对应，构成提取UPLC-FTMS数据的主成分分析基础。数据处理基本上如前所述[15］．简单地说，数据规范化是使用metabolanalyst的内置规范化协议执行的[65]包括按行和按列归一化和自动缩放过程。这些原始变量被总结为更少的变量(分数)，使用它们的加权平均值(负荷)。图形总结分别作为二维分数和负荷图提供。

BIA:

Benzylisoquinoline生物碱

CID:

Collision-induced离解

发展类金融机构:

顺流喷射

EI:

电喷雾电离

英尺分:

傅里叶变换质谱法

UPLC:

超高效液相色谱法

拥有:

离子回旋共振

LC:

液相色谱法

女士:

质谱分析

核磁共振:

核磁共振

主成分分析:

主成分分析

TOF:

飞行时间

我们非常感谢来自jardin botanique de Montréal的Stéphane Bailleul和Renée Gaudette的宝贵帮助和植物收藏。这项工作由加拿大基因组、阿尔伯塔基因组和阿尔伯塔政府资助。PJF担任加拿大植物代谢过程生物技术研究主席。

从属关系

1. 卡尔加里大学生物科学系，卡尔加里AB T2N 1 N4，加拿大

   吉莉安·m·哈格尔，唐纳德·r·丁斯莫尔和彼得·j·法奇尼

2. 阿尔伯塔大学生物科学系，埃德蒙顿AB, T6G 2E9，加拿大

   Rupasri Mandal, Beomsoo Han和David S. Wishart

3. 维多利亚大学-基因组BC蛋白质组学中心，维多利亚大学，维多利亚，BC, V8Z 7X8，加拿大

   韩俊和Christoph H. Borchers

相应的作者

对应到彼得·法奇尼．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

JMH解读数据并撰写手稿;RM, JH, DRD, CHB和DSW负责代谢产物的各个方面的分析。BSH进行统计分析和解释;PJF构思了这项研究，采购了植物材料，准备了数字，并编辑了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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