丛枝细胞初级代谢产物的共生依赖性积累gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

丛枝菌根共生的特点是在根系中存在不同的共生结构和共生阶段。因此，需要在细胞水平上分析分子变化的工具来揭示丛枝菌根(AM)共生的发展和功能。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

本文对AM真菌与寄主植物之间营养物质传递的部位&含丛枝细胞的代谢产物池进行了分析。激光捕获显微切割（LCM）结合气相色谱-质谱（GC-EI/TOF-MS）可以分析这些细胞内的初级代谢物水平，这些代谢物可能来自植物或真菌。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

高水平的氨基酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸和谷氨酰胺，观察到在丛枝细胞。蔗糖含量升高和己糖水平的稳定状态表明真菌伴侣直接同化单糖。gydF4y2Ba

丛枝菌根共生（Am Symbiosis）是一种广泛的互动协会。AM共生涉及在共生界面的互利营养交换，特别是磷酸盐和植物的氮气易位。另一方面，碳主要以碳水化合物的形式提供给生物营养的AM真菌。在共生相互作用期间，两种合作伙伴都经历了显着的形态和生理修饰，涉及代谢物简介的改变[gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba–gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba］．众所周知，突变真菌菌丝从土壤中占用不同形式的氮，并将其转移到宿主工厂[gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba–gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba]. 此外，菌根植物的根系碳水化合物库也发生了显著的变化[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

AM共生的特点是在宿主细胞内形成高度分枝结构，即丛枝。丛枝是在菌根的内根皮层形成的。这些胞内结构是由丛枝周围膜(PAM)中的一些转运体促进的营养相互转移的主要部位[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．ArbUscules的开发是异步过程。根系和连续重新定位的所有发育阶段的分布使整根器官水平的特定重编程过程的分析复杂化。gydF4y2Ba

因此，需要应用单细胞分离方法，即激光显微切割，来分析特殊小分子（如代谢物）的细胞特异性积累[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．单细胞分析允许检测潜在的关键化合物，这些化合物已经改变浓度或只在植物-真菌相互作用的特定发育阶段被检测到。激光显微解剖已经成功地用于研究植物中RNA、蛋白质和代谢物水平的细胞特异性变化[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba–gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

气相色谱-质谱联用技术是目前应用最广泛的代谢产物检测技术之一。该方法便于代谢物的鉴定和稳健定量[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba–gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba]. 然而，这种分析技术通常应用于整个植物或器官。因此，这种代谢物剖面具有较低的空间分辨率。然而，了解代谢物在特定组织或特定植物细胞中的分布对于理解这些分子的生物活性作用是必不可少的。gydF4y2Ba

最近，通过GC-MS，HPLC和LC-MS的组合施用来进行不同定子阶段的枪械菌根菌根菌根的综合性新代谢分析[gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba]. 基于这一信息，激光显微切割和显微代谢组学分析相结合有望以足够的空间分辨率提高对共生相互作用过程中细胞代谢过程的认识。在本报告中，我们讨论了植物宿主细胞和真菌有机体对共生相互作用的适应，特别关注初级代谢产物的差异积累。gydF4y2Ba

菌根不同细胞类型的代谢产物谱gydF4y2Ba

在一个完全发育的AM共生系统中，根系中存在着不同的共生结构。AM真菌在内部皮层根细胞中形成胞内结构，称为丛枝，丛枝是真菌向寄主植物传递养分的场所。这些皮质细胞经历了深刻的转录重编程[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]导致形态和生理变化，包括一种新的膜类型的发展，丛枝周围膜(PAM)。最近的方法使用激光捕获显微解剖包含细胞的丛枝菌揭示了关于转录组的见解[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba和蛋白质组变化[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba在这些细胞中。菌根代谢组的变化gydF4y2BaM截形gydF4y2Ba根以前曾在整个根水平上被描述过[gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]. 然而，目前还没有关于定植细胞特定代谢物组成的数据集。gydF4y2Ba

本文将LCM技术与气相色谱-高灵敏飞行时间质谱联用（GC-EI/TOF-MS）技术相结合，研究了菌根丛枝细胞的代谢变化gydF4y2BaM截形gydF4y2Ba的根源。gydF4y2Ba

为此目的，我们使用了一个修改的方案，最初开发的代谢产物的测量在维管束细胞gydF4y2BaA.拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]（图。gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba)．这些修改是必要的，因为高灵敏度的分析方法需要减少由固定介质中聚合物质引起的背景。纵向切取根碎片定植，显微镜下鉴定非定植的根细胞，并切取。gydF4y2Ba

另一份文件显示了为分析收集的含有丛枝的细胞的显微图像gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba:图S1。gydF4y2Ba

共分离出13638个含丛枝细胞（arb）和12560个皮层细胞（cor），并进行GC-EI/TOF-MS分析。GC-MS测量显示两种细胞类型的代谢物组成存在明显差异（图。gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba). 这表明GC-EI/TOF-MS介导的LMD分离细胞初级代谢物分析是可行的，应用的方法对有限的根材料具有足够的灵敏度。gydF4y2Ba

在两个细胞群中总共检测到56个注释的极性初级代谢物和14个尚未确认的极性初级代谢物(附加文件)gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba：表S1，附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。每个代谢物的离子计数比表明不同代谢物在arb细胞中积累(图。gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba：表S1和附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。之前Schliemann等人检测和定量了81种极性化合物gydF4y2Ba不规则噬根菌gydF4y2Ba［gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

此外，还发现了71种分析物gydF4y2BaLaparregydF4y2Ba与菌根有关[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．与这些研究相比，我们不可能增加可检测到的初级代谢物的总数，但我们的高分辨率方法的应用使特定化合物依赖菌根积累的空间信息成为可能。gydF4y2Ba

LCM是增加给定小区区域或小区类型的时空信息的有力工具[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］．在最近的研究中，该方法成功地利用GC-MS对植物组织的代谢组进行了研究[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]. 有关植物代谢组学样品处理的详细综述已在各种综述中报道[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]. 但到目前为止，高分辨率的方法来确定代谢物变化的细胞，这是直接相关的共生界面缺失。因此，微代谢组学的应用有助于阐明丛枝菌根共生过程中发生的细胞类型特异性变化。gydF4y2Ba

虽然复杂的化学杂质仍可作为背景检测分析的细胞群(附加文件gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba：图S3a），源自极性代谢物的离子的测定显示出这些化合物的积累的澄清差异。作为一个例子，与在减去非样品控制的杂质后，与非殖民化细胞相比，蔗糖和α，αα，αα，α特拉醛糖可以被检测为在殖民化细胞中累积化合物（附加文件gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba：图S3A）。gydF4y2Ba

GC-EI/TOF-MS色谱图描述了在含有丛枝的细胞和非定殖根的皮层细胞中检测到的化合物的绝对总离子计数（TIC）gydF4y2BaMedicagogydF4y2Ba是否显示在附加文件中gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba:图S3b。arb和cor细胞中离子的计数与非样本对照(由组织包埋材料组成)进行比较。gydF4y2Ba

细胞水平的营养转移gydF4y2Ba

含仲叶细胞中的大多数分析物与氮代谢有关gydF4y2Ba

所有分析的氨基酸都显示了对定植的累积反应（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。天门冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的上调幅度最大。gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba)．这些发现与最近的数据一致，显示整个根在定殖后Glu、Asp和Asn的过度积累gydF4y2Bar . irregularisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba］．此外，我们还可以鉴定出在arb细胞中积累到较低水平的氨基酸。甘氨酸，高丝氨酸，缬氨酸，亮氨酸，丝氨酸，脯氨酸和苏氨酸(图。gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba)．综上所述，在已鉴定的56种根皮层细胞初级代谢物中，有14种化合物可归为氨基酸，并且它们在定殖的根细胞中均表达上调gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。gydF4y2Ba

氨基酸作为氮供体，与应力和防御机制有关，用作合成其他化合物的池。另外，它们可以促进氮气运输。govindarajulu等。［gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba]表明，在AM共生过程中也向植物输送了大量的氮。氮被真菌的根外菌丝从土壤中吸收，并以精氨酸的形式转移到植物中。根系总氮的很大一部分来源于这种共生转移[gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba]. 铵在植物细胞内被释放，可以被氨基酸同化gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba谷氨酰胺合成酶 - 谷氨酸合成酶途径（GS-Gogat）。在我们的转录组学研究中[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba[胆量胆囊]我们观察到编码谷氨酰胺合成酶的基因的高表达水平（MTR.36015.1.S1_AT）。在编码硝酸盐还原酶的另一只手基因上（MTR.10604.1.S1_AT，MTR.42446.1.S1_AT）被调节，其表明硝酸盐代谢降低。在先前的研究中，鉴定了两种推定的铵转运蛋白，其中（MEDTR7G075790.2）仅在菌根菌根细胞的非殖民化细胞中诱导，而另一个（MEDTR7G140920.1）仅在ARB细胞中强烈诱导[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．我们的结果指出了一种改进的NHgydF4y2Ba_4.gydF4y2Ba^+gydF4y2BaAM共生过程中植物细胞的有效性，直接导入氨基酸合成。含丛枝细胞中天门冬酰胺、天门冬氨酸和谷氨酸含量的增加与较高的氮素利用率明显相关。精氨酸水平升高并不表明自由基内菌丝体的快速周转。gydF4y2Ba

线粒体三羧酸循环（TCA）的中间产物如富马酸和琥珀酸的积累可以被检测到，而TCA循环的另一种化合物苹果酸的水平保持不变（图。gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。一些氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸的合成利用TCA循环中间体。此外，通过TCA循环激活助熔剂在其他方面已经示出了gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba自由基外菌丝体的C标记实验[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]在自由基内菌丝体中[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

定植皮层细胞的碳分配gydF4y2Ba

在植物寄主和真菌伴侣之间营养转移相关的代谢物中，细胞特异性代谢物分布的差异最为显著。正如预期的那样，高水平的海藻糖（可能是真菌引起的）正在arb细胞中积累（图。gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba)如前所述[gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba]. 海藻糖是真菌、细菌和昆虫中常见的碳水化合物。在高等植物中也发现了编码海藻糖生物合成途径酶的基因，但这种双糖的含量很低[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

最近研究表明，海藻糖可以作为蔗糖类似物干扰碳水化合物的分配。具体来说，海藻糖可以通过两种假设机制影响碳水化合物介导的基因表达：作为蔗糖的类似物，或在分裂后通过释放葡萄糖，从而在代谢微调和植物发育中发挥作用[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba］．在转录组学研究中，我们已经可以观察到蔗糖调节基因的高表达，比如蔗糖合酶，特别是在arb细胞中[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]. 这些数据与蛋白质组学分析一致，我们发现了一个积累的蔗糖合酶[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．在我们之前的研究中，没有检测到与海藻糖合成直接相关的基因。然而，海藻糖在arb细胞中的特异性积累可能通过其作为信号分子的作用影响定殖细胞在菌根结构发育过程中的代谢。gydF4y2Ba

我们观察到arb细胞中蔗糖水平显著升高。蔗糖是植物碳水化合物运输的主要形式。在一些研究中，在菌根根中观察到特定糖水平的增加[gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]. 糖类或代表结构成分，或作为前体分子，在真菌和植物有机体中合成广泛的其他代谢物。真菌自由基内的菌丝体可以吸收葡萄糖，在一定程度上还可以吸收果糖，但不能吸收蔗糖[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．gydF4y2BaM截形gydF4y2Ba影响蔗糖代谢的突变体在丛枝发育和维持中受到损害[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]. 蔗糖被蔗糖合成酶和/或界面质外体中的转化酶分解，相应的己糖被真菌吸收。此外，在菌根根皮层细胞中动员的蔗糖可以作为合成arb细胞中丛周膜（PAM）所需的碳库[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

相比之下，我们发现arb细胞中的己糖(葡萄糖和果糖)水平与cor细胞相比只有轻微的变化。这可能表明真菌对这些己糖的快速吸收和代谢。最近报道了己糖快速转化为真菌贮藏化合物海藻糖和糖原[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

殖民化皮质细胞中的麦芽糖的减少量（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：图S2）可能表明麦芽糖酶快速分解为葡萄糖。gydF4y2Ba

之前的研究结果表明，在菌根化过程中，根系碳状态发生了变化。菌根的定殖gydF4y2BaLotus对虾gydF4y2Ba根系使淀粉浓度降低[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]. 淀粉降解可能发生在来源器官或组织中，在那里麦芽糖形成并进一步分解为蔗糖。蔗糖被运输到根皮层细胞，直接用于真菌的碳供应。之后它被分解成葡萄糖，因为这是碳水化合物的形式，优先被真菌吸收，如图所示gydF4y2Ba^14gydF4y2BaC标记实验[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．这就解释了葡萄糖水平仅略有上升的原因。gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba)，因为葡萄糖被真菌迅速吸收和代谢。gydF4y2Ba

定植细胞对磷的吸收gydF4y2Ba

植物对磷的吸收在寄主-真菌相互作用中起着重要作用。真菌吸收和转移介导的磷有效性增加是寄主植物的主要益处[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]. 磷酸盐含量（图。gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：图S2）在arb细胞中高度升高，证实磷酸盐通过菌根途径转移[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]. 植物磷酸转运蛋白在arb细胞中表达[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba–gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]介导磷酸从丛枝周围空间进入植物细胞的吸收。这说明含丛枝的细胞是AM真菌与寄主植物之间磷酸转移的场所。磷酸转运体的转录物丰度显著增加gydF4y2BaMTPT4.gydF4y2Ba磷酸反应性泛素结合酶gydF4y2BaPHO2gydF4y2Ba在丛枝和相邻的非定殖细胞中检测到，但在非菌根根的对照细胞中仅检测到非常低的水平[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]. 这些例子说明了定植细胞和邻近细胞中磷酸水平的提高如何影响磷酸反应基因的转录。gydF4y2Ba

代谢物模式表明应激耐受力增加，防御反应减少gydF4y2Ba

在本研究中，将大量的多胺甲醛，二乙醇胺和较低的延伸亚胺肽检测到根皮层中菌根结构的发育响应（图。gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。腐胺在含有菌根细胞的丛枝中发现，但在非定殖的根细胞中没有gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。在我们的样品中未检测到与多胺生物合成有关的其他成分。gydF4y2Ba

一般来说，多胺参与细胞分裂和分化，并在菌根共生中发挥有益的作用[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba–gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

另一类主要在定植的皮层细胞中检测到的初级代谢产物是糖醇山梨醇和松果醇。多元醇是一种含有多个羟基的醇类化合物，它们的丰度常常指向应激反应。例如，松果醇在盐驯化过程中积累，但据报道松果醇也会增加植物的菌根gydF4y2BaLotus对虾gydF4y2Ba［gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．同样，山梨醇被发现在酵母中提供对盐胁迫的保护[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]是真菌细胞壁的一部分。此外，山梨醇是光合作用的直接产物，是植物碳素骨架和能量在库器官和源器官之间的转运体[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

加法，加乳糖酸在含仲核的细胞中积聚，其可以作为抗坏血酸生物合成的前体。在该细胞类型中还减少了几种其他有机酸，即Gallic酸和葡萄糖酸（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：图S2）。没食子酸是一种可溶性酚类化合物，广泛存在于多种植物中，具有抗真菌活性。Lattanzio等人描述了菌根真菌对酚类化合物的敏感性[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．在丛枝细胞中检测到这种有机酸的减少，表明一种抑制植物防御来适应真菌。由于同样的原因，葡萄糖苷酸在菌根定殖细胞中减少gydF4y2BaM截形gydF4y2Ba树根也有抗真菌的作用[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]. 葡萄糖酸可由根系定殖的植物促生根际细菌（PGPR）产生，是在磷酸盐限制条件下从根际分泌的可溶解磷酸盐的根系分泌物的一种成分[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．因此，菌根植物磷酸盐状态的改善也导致了这种有机酸的减少。gydF4y2Ba

在ARB细胞中测定了当前研究的减少的壬二酸水平，二羧酸（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。这种防御化合物通过启动植物的系统免疫来增强对致病菌的抵抗力[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．虽然没有观察到抗真菌活性gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba壬二酸[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]根皮层细胞可能减少壬二酸的数量以适应菌根真菌。gydF4y2Ba

冷冻切片和LCM相结合用于细胞分离，然后以GC-EI/TOF-MS作为分析工具，使我们能够确定由于细胞定植引起的初级代谢物分布的变化gydF4y2BaM截形gydF4y2BaAM真菌的根gydF4y2Bar . irregularisgydF4y2Ba．这些代谢的变化强烈地暗示了一种共生依赖的适应，定植皮层根细胞来适应真菌的伙伴。gydF4y2Ba

此外，这里开发了分析的协议gydF4y2BaM截形gydF4y2Ba根是一个可靠的和有价值的工具，为进一步的研究，例如，亲脂性和次生代谢产物的定殖菌根细胞从苜蓿根。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

Medicago truncatulagydF4y2Ba盖尔顿。简历。在高浓度HgydF4y2Ba_2.gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4.gydF4y2Ba8分钟，用水冲洗8-10次，表面用6%次氯酸钠消毒10分钟。种子分布在皮氏培养皿中的湿滤纸上。在4℃下过夜进行分层。种子在25℃黑暗中再培养4天。将幼苗种植在含有粘土、硅砂、蛭石和接种物的盆中gydF4y2Ba不规则噬根菌gydF4y2Ba(30 % gydF4y2Ba五/五gydF4y2Ba)作为基质。接种物通过预培养获得gydF4y2Ba虾夷葱gydF4y2Ba具有gydF4y2Ba血管球intraradicesgydF4y2Ba．该植物在受控环境条件下在温室下在24℃下在温室中生长21天，具有16-H光/ 8-H-暗循环。用0.5×Hoagland溶液施肥植物[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]含20μM磷酸盐，每周两次。gydF4y2Ba

激光捕获微肥（LCM）的协议 - 用于代谢物分析的皮质细胞系列gydF4y2Ba

解剖菌根（1厘米长）菌根（21 dpi）和非菌根gydF4y2BaMedicago truncatulagydF4y2Ba植物在液体n中冷冻gydF4y2Ba_2.gydF4y2Ba并彻底干燥12小时冻干（Alpha 2-4，基督，德国基督，德国），以抑制酶活性和溶质损失的代谢物变化。为了避免通过嵌入材料的过度污染（组织冻结介质，电子显微镜科学，USA，USA），冻干根部布置在冷冻嵌入材料块的顶部上，并通过用手指短接触嵌入块的短触摸。通过在-22°C（Leica CM 1950 Cryostat，Leica Microsystem，Wetzlar，Germany）中使用低温恒温静验（30μm厚）切割纵向部分（30μm厚）。未涂层玻璃幻灯片（超级霜，VWR，DAMSSTADT，德国）用乙醇（Merck，Darmstadt，Germany）洗涤，并用组装根部烘干后。p.a.l.m.激光MicroBeam系统（德国伯尼亚特，德国）用于皮质根细胞的微生物。使用P.A.L.M.Robosoftware 2003（Microsaster Technologies，Bernried，Germany）：自动LPC焦点，速度为95，速度为100（系统特定单位），选择以下参数。在手动监测下进行切割和分离，在40倍放大率下用低热紫外线（337nm氮气）激光器进行。gydF4y2Ba

所有耗材（尖端和反应管）用乙醇清洗两次并干燥。将分离的标本直接弹射到一个盖有0.5毫升反应管的盖子中，并用胶粘帽（Carl-Zeiss Microimaging，德国哥廷根）。收集了1300638个含丛枝菌根细胞和12560个非定殖根皮层细胞进行代谢物分析。使用P.A.L.M.Robosoftware 1.2（Microlaser Technologies，Bernried，Germany）通过LCM软件包估计每个解剖样本的细胞体积，并求和以计算总细胞体积。gydF4y2Ba

代谢物提取和分析gydF4y2Ba

激光捕获显微切割冻干细胞获得的细胞类型特异性群体的极性初级代谢产物gydF4y2BaMedicago truncatulagydF4y2Ba采用气相色谱-电子轰击电离/飞行时间质谱（GC-EI/TOF-MS）对根进行分析。由于提取后所需的高浓度因子，以及由于样品与包埋材料和带粘帽的取样管接触，预计会受到各自实验室化学品的污染。为了区分污染物和收集的单细胞群的内源性代谢物，用空LCM管进行了非样品对照实验。试管中填充300μl乙醇或300μl乙醇和1 mm的混合物gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba嵌入材料并与常规样品平行处理。通过激光捕获微粉分离的细胞通过剧烈摇动在管底部，在300μl乙醇中剧烈摇动并以20.000g离心2分钟。将样品通过真空离心（浓缩器5301，EPPendorf，汉堡，德国）干燥，而不除去切屑的残留固体材料，并在二氧化硅球存在下储存在-80℃下长达3个月。将干燥的沉淀溶于3μl新鲜制备的甲氧胺盐酸甲氧肟甲氧胺盐酸盐中，在纯吡啶中溶于40mg / ml，并在30℃下温育90分钟，然后用9μl组成的混合物衍生化。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-甲基-gydF4y2BaNgydF4y2Ba- （三甲基甲硅烷基） - 三氟乙酰胺（MSTFA）和时间标准（CgydF4y2Ba_10gydF4y2BaCgydF4y2Ba_12gydF4y2BaCgydF4y2Ba_15gydF4y2BaCgydF4y2Ba_18gydF4y2BaCgydF4y2Ba_19gydF4y2BaCgydF4y2Ba_22.gydF4y2BaCgydF4y2Ba_28.gydF4y2BaCgydF4y2Ba_32.gydF4y2Ba和CgydF4y2Ba_36.gydF4y2Ba正构烷烃混合物）在37℃下保持30分钟[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．在整个过程中都要小心避免潮湿。添加到样品中的烷烃被用来计算保留时间指数(RIs) [gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

使用安捷伦6890 N气相色谱仪（安捷伦科技公司，德国Böblingen）通过GC-EI/TOF-MS分析化学衍生后，立即对样品进行分析，并将其无分离进样到FactorFour VF-5 MS毛细管柱上，30 m长，0.25 mm内径，0.25μm膜厚（瓦里安安捷伦科技公司），连接到飞马座III飞行时间质谱仪（LECO Instrumente GmbH，德国门兴格拉德巴赫），如[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba,gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]. 对每个样品进行两次技术复制。gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

GC-EI/TOF-MS色谱图进行基线校正，并使用Chromotof软件（Leco，St.Joseph，USA）以NetCDF文件格式导出。通过与非样品对照组比较的差异分析以及随后与Golm代谢组数据库参考集合的光谱和保留指数匹配，手动识别初级代谢物(gydF4y2Bahttp://gmd.mpimp-golm.mpg.de/gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba64gydF4y2Ba–gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]国家标准与技术研究所（NIST 08；gydF4y2Bahttp://www.nist.gov/srd/nist1a.cfmgydF4y2Ba). 手动监督代谢物鉴定的指导原则是每个化合物至少有3个特定质量片段，保留指数偏差<1.0%[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

从NETCDF文件中提取观察到的质量特征的峰值高度，根据保留指数对齐，并使用TagFinder软件处理成标准化的数字数据矩阵[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]. 如果需要，使用非样本对照的平均峰高进行峰高背景减影。计算标准化反应，除以汇集的显微解剖样品的总估计细胞体积（使用LCM软件包P.A.L.M.Robosoftware 1.2，Microlaser Technologies，Bernried，Germany），再除以内标物docosane的峰高。非样品对照组不含二十二碳烷。丛枝细胞制剂中代谢物的标准化反应除以皮层细胞中代谢物的标准化反应。gydF4y2Ba

是共生关系:gydF4y2Ba

丛枝菌根共生gydF4y2Ba

仲裁员：gydF4y2Ba

含菌根细胞的丛枝菌gydF4y2Ba

客户关系：gydF4y2Ba

非菌根根皮层细胞gydF4y2Ba

GC-EI / TOF-MS：gydF4y2Ba

气相色谱-质谱、高效液相色谱、高效液相色谱gydF4y2Ba

中国大陆:gydF4y2Ba

激光捕获显微解剖gydF4y2Ba

质:gydF4y2Ba

液相色谱-质谱法gydF4y2Ba

myc +:gydF4y2Ba

菌根的根gydF4y2Ba

myc -:gydF4y2Ba

Non-mycorrhizal根gydF4y2Ba

抽搐:gydF4y2Ba

总离子色谱图gydF4y2Ba

这项工作由德国马克斯·普朗克协会资助。该项目由德国研究基金会(SPP Plant Microbe Interaction)资助。gydF4y2Ba

我们要感谢来自马克斯普朗克分子植物生理学研究所的Ines Fehrle提供的技术援助。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 马克斯·普朗克分子植物生理学研究所，德国波茨坦，Muehlenberg 114476gydF4y2Ba

   尼科尔卡德菲尔德，亚历山大·埃尔班，拿世曼西姆·康卡＆弗兰扎斯卡克莱金斯基gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

通信gydF4y2Ba妮可卡德gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

NG、SB和AE进行生物实验。FK、NG和JK设计并发起了这项研究。所有作者对数据进行了分析。NG、JK、AE、SB、FK撰写并批复。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文在知识共享归属4.0国际许可条款下发布(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何介质中不受限制地使用、分发和复制，前提是您给予原始作者和来源适当的信任，提供到知识共享许可证的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域放弃(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba