升高的生长温度降低了PEX5过氧化物酶体靶向信号受体的水平，改善了细胞缺陷拟南芥带有受损的PEX4泛素结合酶的突变体

背景

过氧化物酶体具有关键的代谢反应。例如，脂肪酸β-氧化酶是过氧化物酶，在幼苗早期发育过程中是必需的。过氧化物酶(PEX蛋白)是将蛋白质带入过氧化物酶体所必需的。大多数基质蛋白是通过PEX5传递到过氧化物酶体的，PEX5是一种形成瞬态孔的受体，护送蛋白穿过过氧化物酶体膜。货物运输后，过氧化物酶体-栓系泛素结合酶(PEX4)和过氧化物酶体泛素蛋白连接酶单或多聚泛素PEX5分别循环回胞质或降解。拟南芥pex.突变体β-氧化脂肪酸效率低，因此不能发芽或生长较弱。这些缺陷可以通过在生长培养基中提供固定的碳源(如蔗糖)来部分缓解。尽管广泛的特征过氧化物酶体生物发生拟南芥在非挑战条件下种植，环境压力源对过氧化物血清功能的影响pex突变体功能障碍在很大程度上尚未研究。

结果

我们调查了生长温度对一个小组的影响pex结果发现，高温改善了水稻对外源蔗糖的依赖，降低了PEX5水平pex4-1突变体。相反，低温下的生长加剧pex4-1生理缺陷和PEX5水平升高。过表达的PEX5也恶化pex4-1这意味着当循环被破坏时，PEX5会滞留在过氧化物酶体膜上，从而阻碍过氧化物酶体的功能。在高温下的生长并没有减少膜相关的PEX5pex4-1，表明高温并不能恢复突变体中PEX4的酶功能。此外，防止细胞自噬pex4-1在高温下没有恢复PEX5水平。相比之下，MG132处理增加了PEX5的水平，表明蛋白酶体在降解PEX5，特别是在高温下。

结论

我们认为，高温下的生长增加了蛋白酶体对PEX5的降解，从而降低了PEX5的总体水平，改善了PEX5的生长pex4-1生理缺陷。我们的结果支持了PEX5在货物交付后的有效转回分配的假设，不仅可以使PEX5可用于进一步的货物递送，还可以防止过氧化物功能障碍，从过氧化物体膜中挥之不去。

过氧化物酶体容纳重要的代谢反应，包括β氧化。油料植物,如拟南芥， β氧化脂肪酸，在光合作用建立之前为幼苗的早期发育提供能量[1］．因为这种β-氧化是过氧杀菌剂，所以在发芽期间依赖于固定碳的外部来源，例如蔗糖，是过氧化物组血缺陷突变体的标志[2，3.］．

过氧化物酶体可由内质网产生并通过分裂增殖[4］．过氧缺体的形态和数量可以根据细胞类型，发育阶段或环境条件而变化[5，6］．过氧化物酶(PEX蛋白)在过氧化物酶体生物发生和/或基质蛋白进口中的作用[4，7］．完全折叠或低聚化的蛋白质可通过过氧化物酶体输入机制翻译后导入过氧化物酶体基质[8］．PEX5识别并传递带有过氧化物酶体靶向信号1型(PTS1)的蛋白，通常是c端三肽(例如SKL) (9］．受体-货物复合体在泊泊过氧化物酶(PEX13和PEX14)的协助下运输货物;这种进口物在过氧化物酶体膜上形成瞬态孔，将货物运送到过氧化物酶体基质中[10，11］．

在货物递送后，PEX5随着过氧化物组织的泛素 - 缀合酶（PEX4;通过PEX22的束缚），从膜上从膜回收回到胞嘧啶。[12，13]和环指过氧化物酶(PEX2, PEX10, PEX12) [14，15］．在酵母，PEX4和PEX12单体突突突然PEEX5用于回收和进一步的货物递送，而UBC4和PEX2多聚琥珀酸盐PEX5，其针对蛋白酶体降解的PEX5 [16］．泛素化的PEX5被PEX1和PEX6 atp酶复合物识别并从过氧化物酶体膜中去除[17- - - - - -19]和PEX26，它将PEX1-PEX6异六聚体招募到过氧化物酶体[19- - - - - -21］．

虽然Caenorhabditis elegans.和黑腹果蝇主要通过PEX5-PTS1系统将所有基质蛋白导向过氧化物酶体[22- - - - - -24而在各种酵母、植物和哺乳动物中，过氧化物酶体也能导入含有n端PTS2非肽的蛋白(R[L/I/Q]X .₅霍奇金淋巴瘤)。PEX7识别并导入PTS2蛋白[25，26］．PEX5和PEX7在植物中是相互依赖的[25，27，28]，并相互增强哺乳动物体内货物受体之间的相互作用[29］．在植物中，蛋白酶DEG15在传递到过氧化物酶基质后，切割n端PTS2区域[30.，31］．在哺乳动物中，损坏的Pex7可以泛染和通过蛋白酶降解[32]但是未损坏的PEX7被回收的机制仍不清楚。

泛素修饰可以以PEX5为目标进行循环或降解[16］．此外，累积证据表明，平衡PEX5靶向和转回扩展对于正常过氧缺失功能是重要的[14，33］．在这项研究中，我们证明了升高的生长温度降低了PEX5循环缺陷突变体的PEX5水平。在这种下降中，我们暗示蛋白酶体降解而不是自噬。我们假设，降低PEX5的总水平可以减轻细胞膜相关的PEX5的有害影响pex4-1和改善了相关的生理缺陷。

在高温下生长改善过氧化物酶体缺陷pex4-1

过氧化物素脂肪酸β-氧化为发芽提供固定的碳和能量拟南芥幼苗[1］．无效地进行β-氧化的过氧化物酶突变体未能发芽或生长剧烈[2，3.］．通过补充具有固定碳源的生长培养基，例如蔗糖，这些缺陷可以部分地反转，这绕过β-氧化的需要。结果，过氧血清突变体在常温（22℃）（22℃）（附加档案）时生长时，过氧血清突变体具有短的幼粒子或不会产生蔗糖的发芽1一个)。

为了检查温度对突变体具有受损过氧缺血功能的突变体的影响，我们对正常（22℃）的蔗糖依赖性的过氧化物组缺陷突变体进行调查，升高（28℃）生长温度。我们在基质蛋白受体中测试了突变体（pex5-1，pex7-2)[3.，27，受体对接(pex13-4，PEX14-1)[34，35]，以及受体回收(pex4-1，pex2-1，pex10-2，PEX6-1)[13，14，17］．28°C的生长增加了深度生长的下丘脑长度（附加文件1但在野生型或大多数过氧化物酶体缺陷突变体的测试中，蔗糖依赖性没有显著改变(图1)。1额外的文件1有趣的是，我们发现高温改善了暗生长的蔗糖依赖性pex4-1幼苗（图。1)．22°C,pex4-1不添加蔗糖时，下胚轴变短;然而，在28°C时，pex4-1下杆基类似或没有蔗糖（附加文件1A).这种通过高温生长恢复蔗糖独立性的现象是特定于pex4-1；蔗糖依赖pex5-1，pex7-2，PEX14-1，pex2-1和pex10-2在高温下保持不变或非常略微加剧，pex13-4在没有蔗糖的情况下，在两种温度下都不能发芽。1)．因此，我们专注于pex4-1突变体来阐明伴随高温生长的过氧缺体功能的分子变化。

除脂肪酸外，吲哚-3-丁酸(IBA)在过氧化物酶体中β氧化生成吲哚-3-乙酸(IAA)，抑制细胞伸长[3.，36，37］．类似地，合成的毒素前体2,4-二氯苯氧基丁酸（2,4-DB）在过氧血清中β-氧化至2,4-二氯苯乙酸（2,4-D）[2］．因此，野生型下胚轴在IBA或2,4- db上生长后短，而过氧化物酶体突变体通常有较长的下胚轴[38]（附加文件1a，b）。像蔗糖依赖性（图1），我们发现高温部分恢复的IBA处的生长（图。1 c)和2,4- db(图。1 e）反映了pex4-1突变体。为了确定这种恢复的IBA响应性源于改善过氧缺血功能的还是对生长素的响应程度的改善，我们测试了响应pex4-1到IAA和2,4- d，它们不需要过氧化物酶体链缩短就具有生物活性。我们发现pex4-1对两个IAA的反应都很狂野(图。1 d)和2,4- d(图。1 f)在正常和升高的生长温度下。我们的结论是，高温生长改善过氧化物酶体相关的生理pex4-1突变体。

的拟南芥pex4-1突变改变一个保守的脯氨酸残基并损害PEX4功能[13，但该突变对PEX4水平的影响尚未见报道。我们研制了一种抗体拟南芥PEX4(附加文件2)，并检测了在正常或高温下生长的各种突变体的PEX4水平。我们在22°C生长的所有突变体中检测到了PEX4，发现高温生长后PEX4水平普遍降低(图)。1 b)．在里面pex4-1与野生型相比，在22℃下生长的突变体，Pex4-1蛋白水平降低（图。1 b)，提示Pro123Leu突变使pex4-1蛋白不稳定。Pex4-1水平进一步降低pex4-1在28°C下生长(图。1 b)，表明高温没有改善pex4-1通过将PEX4 -1蛋白水平恢复到野生型PEX4的水平，从而产生生理缺陷。

在酵母中，PEX5 PTS1受体通过PEX1-PEX6 atp酶复合物从过氧化物酶膜反转录转位，然后由PEX4泛素接合酶辅助的PEX2-PEX10-PEX12泛素蛋白连接酶复合物介导泛素化[16，39］．在拟南芥，这些受体循环过氧化物酶的突变可导致PEX5的不稳定，如PEX6-1突变体17，或过度的PEX5膜关联，提示低效的反转位，如pex4-1突变体33]和A.PEX12突变体40］．此外,拟南芥pex7.突变体显示降低的PEX5水平，伴有浅生长而不是深种幼苗的PTS1进口缺陷[27］．我们用免疫印迹法检测突变体中PEX5的水平，发现所有深色生长的突变体除了PEX6-1在22°C下生长时积累了可检测到的PEX5水平。然而，在一些突变体中，在高温黑暗环境下生长后，PEX5水平明显降低(图2)。1 b),特别是在pex7-2在受体 - 回收突变体中（pex4-1，pex2-1,pex10-2)．我们利用内含子证实了在较高的生长温度下维持PEX5水平需要PEX4pex4突变体（pex4-2)．虽然pex4-2未表现出明显的生理缺陷(图。2a，b和额外的文件1C），我们发现在这两种类似的高温度引起的PEX5还原pex4-1和pex4-2(无花果。2摄氏度)．

过表达PEX5会加剧过氧化物酶体缺陷pex4-1

因为PEX5从过氧血清膜中效率低下转回pex4-1［33，因为蔗糖依赖和PEX5水平都降低了pex4-1在升高温度下生长后（图。1，b），我们测试了是否使用本构花瓶马赛克病毒（CAMV）过度表达PEX535个年代启动子可能会加剧pex4-1缺陷。在野生型中过度表达PEX5没有赋予深生幼苗的IBA抗性或蔗糖依赖性（图。2，b和额外的文件1c），我们发现过表达Pex5增加了IBA电阻（图。2 b硫代酶PTS2处理缺陷增高(图。2摄氏度) dark-grownpex4-1这再次表明PEX5水平或定位在水稻幼苗中起关键作用pex4-1生理缺陷。高温生长只部分改善了钢的IBA抗性和PTS2加工缺陷PEX4-1 35S：PEX5(无花果。2 b，c）未能拯救蔗糖依赖PEX4-1 35S：PEX5(无花果。2)．相比之下，过表达PEX7 (PTS2基质蛋白受体)并没有恶化pex4-1缺陷，而是似乎拯救了轻度硫醇酶PTS2加工缺陷pex4-1在22°C(图。2摄氏度)．Pex5或Pex7的过表达没有显着改变Pex14或过氧血清抗坏血酸过氧化物酶（APX3）的水平，两种过氧异式膜蛋白（图。2摄氏度)．

为了确定PEX5的水平是否受PEX4过表达的影响，我们比较了PEX5的水平pex4-1用基因组拷贝转化的幼苗pex4g.ydF4y2Ba或者一个pex4g.ydF4y2BaCaMV驱动的cDNA35个年代启动子[13］．如前所示[13，这两种结构完全挽救了暗生油菜对蔗糖的依赖和对IBA的抗性pex4-1幼苗（附加文件2)．此外，尽管累积的PEX4累积了28°C，但这些线的IBA敏感性，蔗糖独立性和PEX5水平也类似于在28°C的增长后变得野生型。35 s: PEX4线（附加文件2)．这些结果表明PEX4在野生型中并不是PEX5降解的极限。

生理和分子缺陷pex4-1在PEX5

因为过表达的PEX5加剧了pex4-1突变体缺陷和因高温生长而改善pex4-1在降低PEX5水平的同时，我们评估了通过突变降低PEX5功能会如何影响pex4-1突变缺陷。二拟南芥pex5.突变体已经被描述:错误pex5-1等位基因(3.]特别扰乱PTS2导入[25),而PEX5-10 T-DNA insertion allele [13]表达截短的PEX5产品的降低水平，并破坏PTS1和PTS2导入[27，41］．我们发现PEX4-1 PEX5-1双突变体依赖于蔗糖更多（图。3）和IBA抗性（图。3 b)，这些缺陷在高温下的生长并没有得到改善(图。3A，3B)．同样,结合pex4-1与PEX5-10结果产生了幼苗PEX5-10，仍然完全依赖于蔗糖(图。3）和IBA抗性（图。3 b)，受损程度比PEX5-10在蔗糖补充时生长（附加文件1D).此外，种子的萌发缺陷PEX5-10［41]加剧了pex4-1；双突变体幼苗萌发效率较低比PEX5-10当在22℃温育时，在28°C温育时，通常在孵育时未能发芽，因此我们无法评估IBA响应或蔗糖依赖性PEX4-1 PEX5-10在升高温度。

免疫印迹显示出高温的生长进一步降低了截短的Pex5-10蛋白的水平，但似乎减少了硫醇酶PTS2加工缺陷PEX5-10(无花果。3 c)．尽管双突变体表现出增强的生理缺陷(图。3 a和b），结合pex4-1与pex5-1或PEX5-10并没有显著改变硫代酶PTS2的加工缺陷(图。3 c)．

低温下的生长加剧了过氧化物酶体缺陷pex4-1

因为高温减轻了pex4-1生理缺陷，我们测试了降低的生长温度是否会加剧这些缺陷。虽然15°C的生长似乎没有增强蔗糖的依赖pex4-1(无花果。4)，我们发现pex4-1在15°C环境下生长的幼苗比在22°C环境下生长的幼苗更能抵抗IBA。4 b额外的文件1e）虽然在15°C增长时，野生型幼苗在生长时显示了稳健的IBA响应性。同样，PTS2处理缺陷pex4-1在降低温度下生长后更加明显（图。4C)．过表达PEX5加剧pex4-1降低温度的缺陷和生长进一步恶化了硫酶PTS2加工缺陷pex4-1(无花果。4C)．不同温度下野生型幼苗PEX5水平变化不显著，但与生长温度呈明显负相关pex4-1突变体，在较低温度下积累更多的PEX5蛋白，在较高温度下积累较少的PEX5蛋白(图2)。4C)．

PEX5更多的是膜相关的pex4-1；高温不会拯救这种缺陷

某些受体循环过氧化物酶缺陷的突变体，包括pex4-1和PEX6-1，显示膜相关PEX5的升高分数[33］．我们推测，高温可能会增加细胞膜的流动性，并允许更有效的PEX5 retrotranslocation在pex4-1突变体，从而解释了观察到的生理救援。为了测试这个想法，我们使用与免疫印迹相结合的细胞分级，以监测在22或28℃的幼苗中的Pex5定位。如预期的那样，Pex14膜过氧化素是野生型和野生型相关的膜pex4-1在生长温度（图。5)．如前所述以较轻的幼苗观察[33[我们发现，在深种野生型幼苗的提取物中，Pex5在22°C的生长后大部分溶于pex4-1具有较高的膜相关PEX5(图。5)．我们进一步发现，高温(28°C)的生长并没有显著改变野生型PEX5的膜关联。此外，高温并不能挽救高膜相关的PEX5缺陷pex4-1；相反，当PEX5颗粒/上清液比例进一步升高pex4-1在高温下生长（图。5)．我们得出的结论是生理抢救观察以下的生长pex4-1在高温下，并没有从过氧化物酶体膜上恢复PEX5反转录易位。

PEX7识别并交付PTS2货物，但对PEX7回收机制的理解并不透彻。与PEX5水平不同，PEX7水平(图5)。2）或膜协会（图5）在升高的温度下增长后没有明显改变。

高温诱导的PEX5还原pex4-1不是由于自噬

因为在高温下生长降低了PEX5的总体水平pex4-1突变体，我们探讨了这一减少的分子基础。我们首先测试了自噬在PEX5降解的参与。在巨自噬，隔离膜选择性地吞没为最终降解特定的或一般细胞组分在液泡[42］．ATG7是必需的泛蛋白 - 样ATG8脂化的该标记的隔离膜[42]，因此是过氧化物酶体自噬(pexophagy)所必需的[43］．我们发现通过交叉来预防自噬pex4-1到ATG7-3null等位基因[44]不增加PEX5的积累pex4-1在生长温度（图。6)，表明高温诱导的PEX5在pex4-1不需要自噬。

Mg132治疗意味着泛素依赖于调节Pex5水平的蛋白质降解

在酵母中，泛素化的PEX5通过PEX1-PEX6 atp酶复合物从膜上反转录转位进行循环，但如果这种反转录转位减慢，泛素化促进PEX5被蛋白酶体降解[16，45］．蛋白酶体在拟南芥PEX5退化尚未直接表现出来，而是通过在发现减小PEX5水平暗示拟南芥pex6-1突变体17］．测试蛋白酶体的参与拟南芥PEX5降解，我们使用的蛋白酶体抑制剂，MG132，以缓慢泛素依赖的蛋白酶体降解[46，47］．我们发现，MG132在正常和高温下处理24小时后，野生型的PEX5水平同样升高(图2)。7)，提示PEX5在正常情况下可以以蛋白酶体依赖的方式降解。PEX5水平pex4-1Mg132处理也增加了正常或升高的温度或升高的生长（图。7），表明蛋白质组有助于PEX5降解pex4-1也有趣的是，在MG132治疗后，PEX5水平的相对增加更大pex4-1在升高的温度下比野生型生长，表明蛋白酶体的降解是增强的pex4-1在升高的温度下生长的突变体。与Pex5水平相比，在该实验中，PEX7的水平在很大程度上不变（图。7)，表明并非所有过氧化物酶对MG132处理都同样敏感。

我们还观察到硫代醇酶前体在pex4-1和PEX6-1mg132处理后的突变体（图。7)．这一结果表明，在MG132处理下，这些突变体的胞质硫代醇酶可以被蛋白酶体降解，或者基质蛋白进口缺陷得到了恶化。

pex4是通过pex22将泛素缀合酶拴在过氧缺菌中[13］．Pex4对于过氧血清基质蛋白质进口是必要的，可能通过其在泛素突出的PEX5基质蛋白受体中的作用，这允许通过PEX1-PEX6 ATP酶复合物从膜中有效地输送PEX5（图。8A)[48］．的拟南芥pex4-1突变体是由Pro123Leu错义突变引起的，并显示出过氧化物酶体缺陷的各种表型，包括蔗糖依赖、IBA抗性、低效的PTS2处理[13PTS1导入缺陷[14]，和升高的膜相关PEX5 [33］．安装证据表明，膜在膜中的Pex5对过氧化物生理有害。例如，过表达PEX5赋予蔗糖依赖性并增强PTS2处理缺陷拟南芥pex10-2，突变体在其中一个环手指过氧化物中有缺陷[14］．此外，略微减少PEX13的水平，这有助于对接在膜上的PEX5 [35，改善生理缺陷pex4-1［33］．在这项工作中，我们发现过表达PEX5加剧了蔗糖依赖、IBA抗性和PTS2加工缺陷pex4-1突变体（图2和4额外的文件1C，E）。这些发现与假假设一致，PEX4泛素缀合酶通常促进来自过氧异甲烷膜的PEX5转回扩张，并且如果在货物递送后没有迅速地从膜中迅速地除去过氧缺氧体生理学。

不同的环境刺激会影响植物细胞中过氧化物酶体的数量和功能。例如，镉和盐处理可诱导过氧化物酶体产生活性氮种[49- - - - - -51］．在挪威云杉中，轻微的温度升高与过氧化物酶体数量增加有关(Picea amiesl .岩溶。)[6和盐胁迫促进过氧化物酶体增殖拟南芥根(52］．然而，在过氧化物酶体功能受损的植物中，环境对过氧化物酶体的相互作用仍有待进一步研究。在这项研究中，我们发现，随着受体循环突变体在高温下的生长，PEX5水平降低(图)。1 b)，表明受体循环机制的活性可能与温度有关。

我们发现升高的温度增长救出了深种蔗糖的依赖性pex4-1幼苗（图。1)，并改进了pex4-1硫解酶PTS2加工缺陷（图2摄氏度和4C)，而在低温下生长则有相反的效果(图。4)．Pex4水平在高温下降低（图。1 b，3.，4C，6)，表明所观察到的表型恢复并非由于突变体中PEX4水平的恢复。重要的是，细胞膜相关PEX5与胞质PEX5的比值升高pex4-1未通过高温生长纠正（图。5)，表明高温并没有恢复pex4-1酶活性或增加膜流动性以促进PEX5的反转录转位。整体PEX5水平降低，同时改善pex4-1在高温下的生理缺陷（图。1，2，3.，4，6，7），进一步支持结论膜相关的Pex5损害过氧缺血功能pex4-1．阻断自噬未防止高温诱导的PEX5减少pex4-1(无花果。6），表明Pex5在高温下的自噬未降低pex4-1．相比之下，用MG132减缓泛素依赖的蛋白酶体降解可以恢复PEX5的水平pex4-1在高温下生长到野生型水平(图。7)．有趣的是，蛋白酶体降解也有助于水稻抵抗热胁迫[53］．我们的数据在一起与高温促进Pex5的泛素依赖性蛋白酶体劣化的模型一致pex4-1，减少膜相关的PEX5，缓解pex4-1生理缺陷(图。8)．

在酵母中，PTS1转运受体PEX5与对接的过氧化物酶PEX14在过氧化物酶体膜上形成瞬时孔，将转运物运送到过氧化物酶体中[11］．PEX4协助环指过氧化物酶泛素化PEX5 [54]，允许PEX5返回到胞质溶胶中，从而去除膜孔。如何PEX5拓扑改变如在胞质溶胶中的可溶性蛋白，并在过氧化物酶体膜的组成蛋白之间它的周期是未知的。此外，目前尚不清楚为什么过度PEX5恶化这项研究在某些过氧化物酶的突变体缺陷（和[14])。我们推测多余的膜相关的PEX5pex4-1（这项研究和[33)可能仍然存在于孔的构象中，改变过氧化物酶体基质pH、氧化还原状态和/或辅助因子的可用性，从而扰乱过氧化物酶体代谢，并导致观察到的生理缺陷pex4-1．

尽管高温诱导的PEX5水平降低与改善有关pex4-1过氧化物酶病缺陷(无花果。1，2，3.，4)，尽管PEX5过表达(图。2)和低温诱导的PEX5水平升高(图。4）与恶化有关pex4-1缺陷，突变降低PEX5功能并没有减少pex4-1缺陷。事实上,PEX4-1 PEX5-1和PEX4-1 PEX5-10与父母相比，双突变体显示出夸张的过氧化物组织的生理缺陷（图。3A，3B)．这种增强提示pex5-1和pex5-10蛋白不能有效导入过氧化物酶体基质蛋白[3.，27，41]，在没有有效地输送时，授予对过氧化物函数的额外损害（IE。， 在一个pex4-1突变体)。我们期望pex5在不损害PEX5功能的情况下降低PEX5蛋白水平的突变可能改善过氧化物酶体缺陷pex4-1研究结果表明，略微降低PEX13对接过氧化物酶的水平，可以降低植株的生理缺陷pex4-1但并未明显损害过氧化物酶体功能[33］．

酵母pex14是pexophagy [55[缺乏PEX4的酵母突变体显示升高的PEX14水平[12]，这与PEX4也可能直接或间接促进pexophagy的可能性相一致。在哺乳动物细胞中，PEX5将结节性硬化复合物带到过氧化物酶体，在过氧化物酶体中，它调节mTORC途径和自噬以抑制肿瘤形成[56］．在PEX5的N末端区域中的WXXX（F / Y）图案在PTS1货物交付期间绑定PEX14 [57- - - - - -59]与WXXL ATG8结合序列类似，靶向蛋白质到自噬机械[60.］．尽管最近在拟南芥［43，61.，62.]，尚未报道单个植物过氧辛在该过程中的作用。我们发现没有证据证明通常诱导普法力pex4-1；过氧化物酶体膜蛋白PEX14和APX3的水平没有降低pex4-1(无花果。2摄氏度)．有趣的是，在升高温度下，Pex4蛋白通常在升高后的生长下较小（图。1 b，3 c，4C，6），阻止自噬调节这种下降并部分恢复的PEX4水平pex4-1(无花果。6)．这些结果表明，自噬可能参与了高温下PEX4的降解。

人类过氧化物酶体生物发生障碍(PBDs)是由过氧化物酶突变引起的遗传疾病，缺乏有效的治疗。PBD患者的发育迟缓和神经病变往往导致早期死亡[63.］．拟南芥过氧化血突变体与来自PBD患者的成纤维细胞分子分子筛选。例如，人类细胞都有突变PEX6［64.] 和拟南芥pex6-1突变体[17]有低pex5水平（例如,无花果。1 b，7)．有趣的是，低温增加了正常人类细胞中PEX5的膜关联[64.[来自携带的PBD患者的细胞中的过氧化血剂进口增加PEX6突变[65.］．低温可能减缓了PEX5的降解，并增加了PEX5的水平PEX6有缺陷的细胞。在这里，我们发现高温下的生长降低了整个PEX5水平拟南芥pex4-1突变体。总之，这些结果强化了这样一种观点，即针对PEX5水平或定位的治疗可能会改善某些PBD患者的过氧化物酶体功能。

我们提出一个模型(图。8）在其中的pex5pex4-1突变体滞留在过氧化物血型膜上，这损害过氧异相体功能。什么时候pex4-1幼苗在高温下生长，通过Mg132可抑制机制减少总Pex5水平，大概是蛋白酶体降解。该降解减少了过氧异象膜上的PEX5积累。我们的研究结果表明，需要在货物交付后从过氧缺体中删除PEX5，而不仅仅是使PEX5可用于进一步进口圆形，而且还可以防止过氧化物功能障碍，从过氧血清膜中挥之不去的PEX5挥之不去。

植物材料和生长条件

拟南芥野生型和突变体在哥伦比亚-0（Col-0）背景中。ATG7-3［44]，pex2-1［14]，pex4-1［13]，pex5-1［3.]，PEX5-10［13]，PEX6-1［17]，pex7-2［27]，pex10-2［14]，pex13-4［35]，PEX14-1［34， col0转化为35 s: PEX5［17， col0转化为35 s: PEX7［25， col0转化为35S：Pex7a.［27),而pex4-1用基因组救援构建体转化（pex4g.)或35：PEX4.构造（PEX4C）［13之前描述过。pex4-2是来自Kim Gonzalez和Wendell Fleming的礼物。

pex4-1与Col-0交叉转换35 s: PEX5［17和转换为的col035 s: PEX7［25］．纯合子的行pex4-1和转基因中的杂交的后代通过使用基于PCR的基因分型（附加文件中选择3.)．pex4-1被越过了ATG7-3，pex5-1,PEX5-10，并采用基于pcr的基因分型从杂交后代中选择相应的双突变体(附加文件)3.和 [3.，13，43])。

表面消毒的种子在植物营养培养基上生长[66.]用0.6％（w / v）琼脂固化，并补充有表明蔗糖和/或IBA的浓度。将IBA储备溶液（100mm）溶于乙醇中。在电镀之前进行黑暗和单日预孵育的一天分层。将板在22℃下置于黄色光，一天，并在22或28℃下在铝箔中缠绕四天，然后测量深生生长的下胚轴长度。对于Mg132处理，如所描述的，在22℃下涂在铝箔中，在22℃下用铝箔包裹在铝箔中，在22或28中在黑暗中转移到0.5％蔗糖补充的液体营养培养基°C。

免疫印迹

从Pex4（C126-N141，CDSGNLLRSGDVRGFN的C-末端附近的肽产生兔抗血清，并通过Bethyl实验室（Montgomery，TX）纯化的亲和力。该抗体在未检测到的野生型幼苗提取物的免疫印迹中识别〜18kDa蛋白pex4-2的第4外显子上游18个碱基对携带一个内含子G-to-A突变pex4g.ydF4y2Ba．

从生长于在黑暗中0.5％蔗糖补充的植物营养培养基苗蛋白提取物进行处理用于进行免疫印迹。冷冻幼苗地面与1.7毫升试管塑料杵和2X样品缓冲液（两卷500毫摩尔Tris pH 8.0中，4％（W / V）十二烷基硫酸锂，1mM EDTA中，20％（W / V）甘油，加入0.44毫考马斯亮蓝G250，0.332毫酚红）。上清液离心后（4℃，13200转，5分钟）转移至新管，和二硫苏糖醇（DTT）加入至50μM的终浓度。样品在95℃下加热5分钟。样品的等体积克鲁兹标记（圣克鲁斯生物技术，SC-2035），和预染色的标记物（New England Biolabs公司，P7708S）加载到的NuPAGE或螺栓10％（W / V）Bis-Tris凝胶（Invitrogen）和电泳在50mM MOPS游离酸，50mM的Tris碱，0.1％（W / v）十二烷基硫酸钠，1mM EDTA中。蛋白以24 V在8％脱脂干奶粉封闭之前转移到Hybond-ECL硝化纤维素膜（Amersham的Hybond ECL，RPN303D）45分钟Tris缓冲盐水与吐温-20（20毫摩尔Tris pH值7.5，150mM毫氯化钠，0.1％（v / v）吐温20）。，PEX5（1：100，[：将膜与在封闭溶液中稀释的兔初级抗体，其提出了针对PEX4（100 1）温育过夜17)， [27)， PEX14 (1:10000, Agrisera AS08 372， [67.)、硫代酶(1:5000，[68.)， [69.，70)，或ATG7 (1:1000， [71.]）随后是辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔抗体（1：5000，Santa Cruz Biotechnology SC-2030）。使用针对HSC70（1：50000-1：100000，resclyGEN-817）与辣根过氧化物酶连接山羊抗小鼠抗体（1：5000，Santa Cruz Biotechnology SC-2031）配对的小鼠一抗抗体用于监测蛋白质负荷，和线粒体ATP合酶（1：2000，ABCAM＃AB14748也与抗小鼠二抗配对）用于验证分馏实验。通过西方亮Ec1底物（Advansta K-12045）和暴露在放射缩影膜（Genesee 30-810c）上被视为抗体。使用imagej分析带强度[72.］．

分馏

相等的权重(750毫克)的5-day-old dark-grown幼苗被剪刀剪1毫升冷分离缓冲(150毫米pH7.6三,100毫米蔗糖,10毫米氯化钾,EDTA 1毫米,1毫米德勤,1毫米phenylmethyl磺酰氟异丙醇(从一个新鲜的股票),16.7μL植物蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σP9599),1毫米n -乙基马来酰亚胺(来自新鲜制作的乙醇原料)]，放在冰上5分钟。切碎的组织和缓冲液转移到1ml Dounce均质器(VWR 62400-595)中，均质20次，并通过Miracloth (Calbiochem)过滤。低速离心(50 x g, 10 min)清除提取物，给予匀浆(H)。高速离心(15300 x g, 20 min)后，去除上清液(S)。丸resuspended,高速旋转(15300 x g, 20分钟)将上层清液洗(W)和最终颗粒(P)。添加了相应的卷4 x加载缓冲区,和相同量的各部分被用于电泳和免疫印迹显示抗体。

APX：

抗坏血酸过氧化物酶

2,4-D：

2,现在也是酸

2,4-dB：

2,4-二氯苯氧基丁酸

CAMV：

花椰菜马赛克病毒

DTT：

dithiothreitol.

IAA：

吲哚-3-乙酸

IBA：

Indole-3-butyric酸

PBD:

过氧物酶体生物起源障碍

PEX:

Peroxin

PTS：

过氧化物瞄准信号

我们感谢Sarah Ratzel交叉pex4-1来35 s: PEX5和35 s: PEX7和PEX4-1 PEX5-1种子，查尔斯达南为pex4-1 atg7-3金·冈萨雷斯和温德尔·弗莱明pex4-2种子和Bethany Zolman在产生Pex4抗体时提供帮助。我们感谢Richard Trelease和Richard Vierstra分别识别APX3和ATG7的抗体。我们非常感谢来自Wendell Fleming，Kim Gonzalez，Roxanna Llinas，Mauro Rinaldi，Andrew Woodward，Zachary Wright和Pierce Young的批判性评论。该研究得到了NIH（R01GM079177）和Robert A. Welch Foundation（C-1309）的支持。YTK部分由台湾教育部留学奖学金得到支持。

隶属关系

1. 德克萨斯州休斯顿休斯顿生物化学和细胞生物学计划

   高云婷&邦妮·巴特尔

相应的作者

对应到邦妮Bartel．

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

BB和YTK设计了实验。YTK执行了实验。BB和YTK写了这篇文章并批准了这篇文章的最终版本。

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