葡萄细胞分裂素代谢及信号基因转录的变化(葡萄L.)莓果与异戊烯ladenine的成熟相关的增加有关

背景

细胞分裂素在坐果和早期果实生长中起着重要作用，但其在果实发育后期的作用尚不清楚。最近的报告显示，成熟猕猴桃果肉中的细胞分裂素浓度大大增加(猕猴桃deliciosa(答:Chev。)梁昌峰和A.R. Ferguson)和葡萄(葡萄L.)的研究表明，这些激素与成熟相关过程的控制有关。

结果

在几个葡萄品种的成熟果实中也观察到类似的异戊烯腺苷(iP)积累模式，草莓(草莓属ananassa杜赫)和番茄(茄属植物lycopersicumMill.)，表明这种细胞分裂素具有共同的、与成熟相关的作用。不同葡萄品种和不同果实品种间最大iP浓度的显著差异可能反映了该激素在成熟过程中不同程度的相关性或功能适应性。五种拟南芥的葡萄同源种(拟南芥L.)参与细胞分裂素代谢和信号传导的基因家族被鉴定并分析了它们在发育葡萄浆果和一系列其他葡萄组织中的表达。每个基因家族的成员在浆果发育和不同的葡萄器官中具有不同的表达谱，这表明整个植物中细胞分裂素活性的复杂调控。一组生物合成、激活、感知和信号传递基因的版本后特异性表达，以及在成熟阶段缺乏降解相关基因的表达，表明浆果iP浓度的局部控制导致成熟葡萄中观察到iP的积累。

结论

对参与细胞分裂素产生、降解和响应的葡萄基因的转录分析，为葡萄和其他水果中与成熟相关的iP积累提供了可能的解释。五个基因家族中不同成员的版本前和版本后特异性表达表明，在果实发育的特定阶段，细胞分裂素浓度的调控和对不同细胞分裂素物种的响应是高度复杂和微调的。同样的复杂性和专门化也反映在其他葡萄器官中细胞分裂素相关基因的不同表达谱上。

天然存在的细胞分裂素是腺嘌呤衍生物，其在植物生长发育中的多种功能使其被认为是具有重要生物学和农业意义的分子。植物中最丰富的四种细胞分裂素，反式玉米素(tZ),N⁶——(Δ²-isopentenyl)腺嘌呤(iP),独联体玉米素(cZ)和二氢玉米素在类异戊二烯侧链的立体异构体位置、羟基化和饱和上存在差异[1]，但对这些侧链差异的生理相关性知之甚少[2］．除了它们在调节细胞分裂和分化方面的良好作用外[3.]，细胞分裂素参与一系列植物生存所必需的过程，如叶片衰老[4，5]，控制茎根平衡[6，7]、营养信号[8，9]、应力耐受性[10]和结瘤[11，12］．细胞分裂素的数量和组成是通过生物合成、运输、不同形式的相互转换、偶联的短暂失活和侧链断裂的不可逆失活来调节的[13］．对这种平衡的有针对性的干扰，导致水稻花序和花分生组织活性的增加和种子产量的提高(栽培稻l .) [14]和拟南芥(拟南芥l .) [15]，最近为细胞分裂素在生殖发育和作物生产力中的重要性提供了证据。为了支持这一观点，大量物种的未成熟种子和果实中已报道了高细胞分裂素活性或浓度，包括豌豆(Pisum一l .) [16]，白羽扇豆(Lupinus白色l .) [17，圣诞玫瑰(Helleborus尼日尔l .) [18]，西红柿(茄属植物lycopersicum机。)19]，草莓(草莓属ananassa杜赫)(20.]、猕猴桃(猕猴桃deliciosa(答:Chev。)梁志峰及费格逊)[21]，覆盆子[22]和葡萄(葡萄l .) [23- - - - - -25］．一般来说，细胞分裂素的活性/浓度在受精后不久达到峰值，与细胞分裂率高的时期相吻合，这与这些激素与坐果和早期果实生长有关[26，27］．6-苄基氨基嘌呤、N-(2-氯-4-吡啶基)-N ' -苯脲(CPPU)和噻地脲(TDZ)等合成细胞分裂素已广泛应用于葡萄[28]、猕猴桃[29]，蓝莓(Vaccinium ashei里德)[30.]，苹果(马吕斯有明显Borkh。)31]和梨(Pyrus普通的l .) [32来改善坐果和/或增大果实大小。相比之下，细胞分裂素在果实发育后期的作用却鲜有文献记载和理解，部分原因是通常报告的细胞分裂素活性/浓度在初始生长阶段后下降[33］．上述细胞分裂素对果实成熟进程的影响因果实种类和使用细胞分裂素的不同而不一致。例如，经过cppu处理的葡萄显示出糖和花青素的延迟积累，并且比对照的浆果更加坚硬[34]在蓝莓中也发现了类似的cppu诱导的成熟延迟[30.］．然而，在猕猴桃中观察到相反的效果，CPPU处理导致糖积累增加，酸度降低，果肉硬度降低[35］．TDZ对猕猴桃的催熟作用与CPPU相同[35]，而经tdz处理的柿子的成熟(Diospyros柿子L.)果实延迟，这可以通过糖积累和叶绿素降解的延迟来证明[36］．相比之下，6-苄基氨基嘌呤处理对柿子的成熟进程没有影响[36］．因此，虽然应用研究没有给出内源细胞分裂素在成熟过程中可能发挥作用的任何明确迹象，但在缺乏细胞分裂素的拟南芥突变体中，角果的不同步成熟和活籽产量的减少表明这些激素参与了果实成熟[6］．此外，最近两项有关猕猴桃的研究[37]和葡萄浆果[38已经报道了成熟水果果肉中活性细胞分裂素的浓度急剧增加。就猕猴桃而言，这一增长的主要原因是tZ，而iP是成熟葡萄中积累的主要细胞分裂素种类。

本研究的目的是进一步研究葡萄中与成熟相关的iP浓度增加，重点关注局部细胞分裂素生物合成、激活、感知、信号传递和降解的作用。相关基因在葡萄果实发育过程中的表达谱表明，不同的细胞分裂素相关基因控制着不同发育阶段果实中细胞分裂素种类积累的数量、组成和对细胞分裂素的反应。此外，有证据表明，iP在成熟阶段的积累在一系列葡萄品种中是普遍的，在番茄和草莓中也会发生。

植物材料

为了分析细胞分裂素相关基因表达和细胞分裂素水平的发育变化，葡萄l .简历。根据Böttcher等人的描述，每隔一周从一个商业葡萄园收集设拉子浆果。[39]在2010/2011赛季。用于各种葡萄器官基因表达研究的所有组织均取自南澳大利亚阿德莱德实验葡萄园或温室中生长的设拉子植株[39］．除设拉子浆果系列外，还从以下样品中测量了细胞分裂素:葡萄l .简历。赤霞珠和cv。雷司令，生长在一个商业葡萄园(怀克里，南澳大利亚;−34.100°，139.842°)，如Kalua和Boss所述，每两周采样一次[40，41］．在研磨和细胞分裂素提取之前，从冷冻浆果中取出种子。2）葡萄l .简历。黑比诺浆果，生长在一个商业葡萄园(威伦加，南澳大利亚;−35.263°，138.553°)和1)中的样品，但保留种子。3)糖含量相近(19.4 ~ 20.8°Brix)的13种葡萄品种(11葡萄,一个葡萄属杂交和一个种间杂交)生长在一个实验葡萄园(Waite Coombe葡萄园，阿德莱德，南澳大利亚;−34.263°，138.553°)在2013/2014赛季。使用PAL-1数字折光仪(Atago, Tokyo, Japan)从两棵葡萄树上的六串浆果(每个重复10个浆果，3个重复)中采样，检测总可溶性固形物，然后在上述指定的糖含量范围内立即脱色并在液氮中冷冻浆果。4)西红柿(茄属植物lycopersicum轧机。var. Moneymaker)从温室(CSIRO农业，阿德莱德，南澳大利亚)的种子中种植，并在Böttcher等人详细说明的五个标准成熟阶段收获。[42］．5)草莓(草莓属ananassa杜赫。简历。Ablion)在四个不同的成熟阶段(小绿、大绿、变熟、红熟)，在一个商业草莓农场(南澳大利亚的汉多夫;−35.038°，138.816°)。每个生物复制阶段至少使用5个草莓。对于第二组样品，瘦果在液氮中冷冻前用镊子去除。

总可溶性固形物(TSS)水平测定

根据Davies等人的描述，对发育系列浆果的TSS(糖度)进行测量。43］．

系统发育分析

通过BLASTP搜索非冗余NCBI蛋白数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)使用各自的拟南芥序列(见附加文件1)，数据来源于拟南芥信息资源(TAIR;https://www.arabidopsis.org/)，作为查询。利用MEGA6.06中相应的核苷酸序列进行系统发育分析[44拟南芥和葡萄各基因家族的核苷酸序列采用MUSCLE比对[45]，剔除所有包含缺口和缺失数据的位置。采用基于JTT矩阵模型的最大似然法推断其进化史[46］．100个重复生成了一个自举共识树[47]并且在小于70%的复制中复制的分区对应的分支崩溃。通过对JTT模型估计的两两距离矩阵应用Neighbor-Join和BioNJ算法，自动获得启发式搜索的初始树，然后选择具有较高log值的拓扑。采用标准遗传密码表对编码数据进行翻译。葡萄基因的命名遵循Grimplet等人发表的指导方针。[48］．

RNA提取，cDNA合成和qRT-PCR

RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR如前所述[49]根据Böttcher等人的描述进行了修改。[39］．所使用的基因特异性引物和相应的接入号ACT2(内参基因)已发表[50］．本研究中使用的所有细胞分裂素相关基因引物对都在附加文件中列出了相应的扩增子大小2．基因表达数据使用MeV软件(版本4.9;http://www.tigr.org/software/tm4/mev.html)，并以分层聚类的热图形式呈现。

核碱基细胞分裂素的提取与定量研究

用于iP的量化和tZ, 100 mg果实组织在1 mL 70% (v/v)乙醇，0.2 mM二乙基二硫代氨基甲酸中提取，加入5 pmol d6-iP和d5-tZ (OlChemIm Ltd.， Olomouc，捷克共和国)作为内部标准，在4°C的旋转混合器上搅拌2小时。组织在4℃离心成球后，去除上清液，4℃保存，同时在1 mL 70% (v/v)乙醇，0.2 mM二乙基二硫代氨基甲酸中，在4℃下提取1 h。离心后将上清液与初始提取物结合，去除有机溶剂在真空内将水相调整到pH 7.5 (NaOH)，并应用于100 mg C18 SPE柱(Waters, Wexford, Ireland)。用pH为7.5 (2 mL)的水冲洗柱，然后用80% (v/v) MeOH, 2% (v/v)乙酸(2.5 mL)洗脱。干燥后的残渣再悬浮于50 μL 90 % (v/v) 15 mM甲酸中，用氨水和10% (v/v)甲醇调节至pH 4.0，用Agilent LC-MS系统(1200系列高效液相色谱- 6410三四质谱联用)分析。样例(10μL)第一次被分离在卢娜C18柱(75×4.6毫米,5μm (Phenomenex托兰斯,CA))举行30°C使用以下条件:溶剂0-20 min,线性梯度从10% (v / v)甲醇,90%甲酸15毫米,调整与氨pH值4.0至95% (v / v)甲醇,5% (v / v) 15毫米甲酸,调整与氨pH值4.0,5分钟,线性梯度从95% (v / v)到10% (v / v)甲醇在1分钟,6分钟,0.4毫升分钟⁻¹．将流出液引入ESI离子源(雾化器压力35psi)，脱溶气体温度为300°C，流量为8 L min⁻¹，毛细管电压设为4kv。采用正离子模式下的多重反应监测进行检测。碎片的优化是用iP完成的，tZ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)以及使用Agilent MassHunter Optimizer软件(版本B03.01)的标签标准。以下主要跃迁被用于定量:d6-iP 210 > 137, iP 204 > 136, d5-tZ 225 > 137，tZ 220 > 136。此外，每种化合物都包含一个限定离子跃迁:d6-iP 210 > 148, iP 204 > 148, d5-tZ 225 > 119，tZ 220 > 119。监测d5-可提高分析的灵敏度tZ和tZ的保留窗口(0-15分钟)与d6-iP和iP(15-22分钟)不同。iP和的浓度t使用校准曲线对提取物中的Z与其内部标准进行定量:使用50 μM原液制备8个标准溶液(1 nM - 500 nM)，每个标准溶液50 μL与5 pmol d6-iP和d5-混合tZ(一式三份)。样品干燥在真空内再悬浮于50 μL 90 % (v/v) 15 mM甲酸中，用氨水、10% (v/v)甲醇调节pH 4.0，使内标准浓度各为100 nM。对每个样品抽取10 μl进行如上所述的LC-ESI-MS/MS分析，并使用Agilent定量软件(版本B04.00)绘制每种未标记化合物的已知浓度与分析物峰面积与相应内部标准峰面积的比值，从而生成校准曲线。该方法的检出限(信噪比>3)为0.2 fmol μL⁻¹为tZ和0.08 fmol μL⁻¹iP的定量限(信噪比>10)为0.67 fmol μL⁻¹为tZ和0.25 fmol μL⁻¹iP。

统计数据分析

TSS含量和细胞分裂素浓度经方差分析(ANOVA)和Duncan事后检验有显著差异。对从设拉子浆果发育样本中收集的基因表达数据进行方差分析，然后采用Fisher 's Least Significant Difference (LSD)事后检验，以检验是否存在显著差异。使用IBM SPSS Statistics ver对各种数据集进行统计检验。20 (IBM澳大利亚，悉尼，新南威尔士州，澳大利亚)。

葡萄品种在果实发育过程中表现出相似的细胞分裂素积累模式，但在完全成熟时iP浓度有所不同

最近发现在成熟的设拉子浆果中iP浓度大幅增加，这为细胞分裂素可能参与葡萄成熟过程提供了第一个证据[38］．为了评估与成熟相关的iP积累是否在葡萄中是一种常见的现象，从开花后2周(wpf)到15-17 wpf后的商业收获，对来自三个不同葡萄品种的浆果进行了iP含量分析(图2)。1)。另外一种活跃的细胞分裂素存在于葡萄浆果中，tZ (38]，也被纳入分析。tZ浓度通常较低(低于1 pmol g⁻¹鲜重(FW))，且仅在赤霞珠的一个时间点显著升高(图。1， 4 wpf)，雷司令(图;1 b， 2 wpf)和黑比诺(图。1 c， 6 wpf)。增加最多的是t在黑比诺浆果中记录了Z浓度(约20倍)，与赤霞珠和雷司令浆果不同，黑比诺浆果在提取细胞分裂素之前没有去籽。在所有三个测试品种的浆果中，iP浓度在改版后4周(这里定义为TSS水平显著增加之前的最后一个采样时间点)显著增加，并在此后继续增加(图2)。1)。然而，收获时的绝对iP浓度差异很大，赤霞珠最高(73.9 pmol g)⁻¹其次是黑比诺(31.5 pmol g)⁻¹FW)和雷司令(14.6 pmol g⁻¹弗兰克-威廉姆斯)。

为了更详细地分析不同品种浆果iP浓度的差异，在相同葡萄园中种植的13个不同葡萄品种的葡萄在相似的TSS含量(19.4-20.8°Brix)下取样，并进行iP定量(表2)1)。测量到的iP浓度差异高达14倍，范围为4.46 pmol g⁻¹FW在维欧尼浓度为62.90 pmol g⁻¹设拉子的FW和iP丰度与浆果肤色无关。而赤霞珠浆果中的iP浓度(表1)与来自不同年份和不同葡萄园的相同TSS范围的浆果相当(图2)。1)，雷司令(Riesling)、黑比诺(Pinot Noir)的浆果中含量较低(表2)1和无花果。1 b, c)和设拉子(表1和无花果。2)。

多基因家族编码葡萄基因，在细胞分裂素的生物合成、激活、感知、信号传递和分解代谢中发挥作用

为了研究葡萄浆果iP浓度的版本后增加是否是局部细胞分裂素生物合成、激活和/或分解代谢变化的结果，葡萄基因属于异戊烯基转移酶(IPTs)、LONELY GUY (LOG)细胞分裂素核苷5 ' -单磷酸磷酸核糖水解酶和细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CKXs)家族，通过与各自拟南芥基因的序列相似性进行了鉴定(表2)2，其他文件1而且3.a - c)。细胞分裂素组氨酸激酶(CHK)受体和a型和-B型反应调节因子(RRs)也包括在分析中，因为功能性感知和信号转导系统是检测和响应变化的iP浓度的先决条件(表2)2及附加文件1，3.D和4)。

腺苷酸IPTs催化细胞分裂素生物合成主要途径的初始步骤N⁶腺苷5 ' -磷酸丙烯酰化形成ip -核苷5 ' -磷酸[51，52］．类异戊二烯侧链随后可被细胞色素P450酶CYP735A1/CYP735A2羟基化产生tZ-ribotides [53］．然而，单个葡萄CYP735A同源基因[NCBI: XM_002280169, CRIBI: VIT_214s0006g02970]在浆果中没有表达(数据未显示)，因此细胞分裂素物种转换在本研究中不被认为是相关机制。trna - ipt催化异戊烯基到tRNAs中的腺嘌呤碱基的添加，这可能导致释放cZ和水解后iP [54］．葡萄基因组被发现编码8个IPTs(表2)，其中6个与拟南芥腺苷酸IPTs和两个拟南芥tRNA-IPTs的同源体(VviIPT2, VviIPT9)聚在一起(附加文件)3.A).腺苷酸ipt作用产生的无活性细胞分裂素核苷可通过LOG磷酸核糖水解酶转化为活性碱基[55］．十个小道消息日志基因进行了鉴定(表2)，并与拟南芥中该家族的9个基因进行了比较3.B).细胞分裂素的失活通过ckx催化的类异戊二烯侧链的氧化裂解发生[56，57］．在8个葡萄藤ckx(表2)，其中4个是拟南芥CKXs的近亲3.C).所有5个葡萄CHK序列均鉴定出一对一的同源物(表2和附加文件3.D)，其中三个(VviCHK2-VviCHK4)代表善意的细胞分裂素受体[58］．细胞分裂素信号通路His-Asp磷酸化中继的下游靶点是rr，它们被分为细胞分裂素信号的阴性(a型)或阳性(b型)调控因子[59- - - - - -61］．与拟南芥相比，a型(11)rr多于b型(8)rr(表2)2和附加文件4)是在葡萄基因组中发现的。

细胞分裂素相关基因亚群的表达与果实发育过程中iP的积累相一致

为了揭示版本后iP的积累和参与控制细胞分裂素浓度的基因的转录丰度之间的因果关系，在发育中的设拉子浆果中对细胞分裂素碱基进行了量化(图2)。2)和相同的浆果组织用于分析48个细胞分裂素相关基因的表达(表2和无花果。2 b)。对于在两个以上时间点表达的基因(29)，在附加文件中提供拷贝数和统计数据分析5．VviCHK1，VviCHK5而且VviCKI由于其在细胞分裂素感知和信号转导方面的作用尚不明确，未被纳入本研究[62，63］．本研究分析的40%的基因被描述为剪接变异(表2)2, (64])。用于基因特异性扩增的引物对允许>覆盖90%的所有已知变异，因此预计将为每个基因提供可靠的表达模式。

设拉子果实发育过程中细胞分裂素浓度的变化(图。2)与赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、雷司令(Riesling)和黑比诺(Pinot Noir)的情况相似。1)。这些结果证实并扩展了之前使用不同提取和定量方法获得的设拉子样本子集的数据[38］．tZ浓度在整个发育过程中保持较低且不变，而iP浓度从11 wpf开始显著增加，最高达到98.7 pmol g⁻¹FW在15 wpf(图。2)。

总共有38个细胞分裂素相关基因被发现在浆果组织中的一个或多个时间点表达，层次聚类显示了6组基因表达谱(图2)。2 b)。簇1包含4个基因日志,一个嗯和两个RRS，在1到4个WPF之间表达最高，在其余的发育过程中转录水平中等到低。九个基因，由两个组成IPT年代,一日志,一个嗯和五个RRs，构成聚类2，在1-4 wpf和11-16 wpf之间出现峰值，且在版本后峰值时转录丰度最高。集群3由IPT12而且RR11a的转录峰在5 - 8 WPF之间，而在RR11a，也是16 wpf。群集4中的表达式(1CKX,两个RRS)主要局限于4 WPF时间点。簇5是最大的簇，由15个基因组成，代表了所分析的所有5个细胞分裂素相关基因家族，主要表达在非常年轻的浆果(1-4 wpf)中。第6簇包含两个基因，都是日志S，表达在9 ~ 16 wpf之间。在星系团之外，LOG13而且CKX6a转录本仅在一个时间点检测到(分别为2 WPF和10 WPF)，而RR37在幼果中低表达(1 ~ 2 wpf)，在14 ~ 16 wpf高表达。

细胞分裂素相关基因在不同的葡萄组织中有不同的表达谱

为了更全面地了解葡萄细胞分裂素代谢和信号传导成分的表达和推断活性，我们还分析了上述48个细胞分裂素相关基因在一系列其他葡萄组织中的转录积累(图2)。3.)。所有试图放大CKX10而且RR36用于生成qRT-PCR标准的任何被测葡萄cdna片段均失败(数据未显示)，因此这两个基因不能纳入表达分析。其余46个基因的转录本，包括8个没有在浆果中表达的基因(图2)。2 b)，在至少一种被测组织类型中被检测到，基因表达谱聚类为7组(图。3.)。集群1，由RR34而且LOG12主要表达在节5 (L5)和节9 (L9)叶片和种子5 wpf (S5;RR34)．簇2也由两个基因组成，RR35而且CKX6b，在花和根中表达。集群3包括5个基因，1个日志和四个RRs，转录本在所有组织中均有检测，在花、L9、S5、S9或根中表达量最高。最大的一组基因(21)集中在簇4中，主要表达在卷须和根中。CKX5而且CXK6a在S5中也有高表达。聚类5包含8个基因，代表了所有5个细胞分裂素相关基因家族，在L9或根的表达量最高。的共同特征RR26，CKX11而且LOG13簇6中为s14特异性表达，而簇7中为s14特异性表达CHK3而且RR31转录本主要存在于花和种子中。有三个基因表现出独特的表达谱:LOG5b主要在节间表达，LOG5a除种子外，在所有组织中均有表达RR40转录本仅在根中检测到。所有表达基因的拷贝数在附加文件中提供6而且7．

番茄和草莓也出现了与成熟相关的iP浓度增加

涉及在果实发育过程中测量细胞分裂素的研究很少，这可能是为什么除了葡萄以外，没有任何水果物种在果实成熟阶段积累iP的原因之一[38］．为了研究与成熟相关的iP增加是葡萄浆果独有的还是水果中的普遍现象，研究人员在番茄和草莓果实的几个发育阶段测量了核碱基细胞分裂素(图2)。4)。在番茄,tZ浓度普遍低于定量限，iP浓度低于1 pmol g⁻¹各测试阶段的FW(图;4)。而在红色硬果中，iP浓度显著升高。在草莓,tZ只能在预熟果实的花托中检测到。4 b)。在小绿果中的浓度t在细胞分裂素提取前去除瘦果，Z显著降低。与番茄类似，草莓花托中的iP浓度很低，但在果实成熟时显著增加，在完全成熟的红熟草莓中甚至更高(图2)。4 b)。在发育的最后阶段，含瘦果花托的iP含量显著高于不含瘦果花托。

大多数已发表的关于水果中细胞分裂素的研究，包括葡萄[23- - - - - -25]，草莓[20.]，西红柿[19]，苹果[65]，西瓜(Citrullus lanatus(研究)。Mansf。)66]、日本梨(Pyrus serotinal .) [67]和柿子[68]，已经利用生物测定法，基于细胞增殖或色素积累的变化，来确定活性细胞分裂素的浓度。在所有水果品种中，细胞分裂素的活性在经过细胞分裂阶段的年轻果实中较高，而在成熟果实中活性较低或无法检测到。这似乎与四种葡萄品种中报告的与成熟相关的iP浓度增加相矛盾。1而且2)、番茄和草莓(图。4)，但必须考虑到以上提到的生物分析是主要使用的tZ，而不是iP，作为参考细胞分裂素。可检测的tZ浓度被发现仅限于成熟前的草莓(图。4)，在变种前的葡萄中，种子似乎是主要的tZ源为高证明t含籽黑比诺浆果组织在6 wpf时的Z浓度(图。1 c)。积累tZ在葡萄种子早期发育过程中也有报道[69，70］．虽然这两个,tZ和iP被归为细胞分裂素，仅在侧链的羟基化上有所不同，它们在植物内的定位和运输、信号输出和生物学效应方面需要被视为不同的独立分子。在拟南芥中，最近的实验中突变体受损反式-羟基化步骤，将iP转化为tZ揭示了茎尖分生组织细胞增殖的调节是一种特有的功能tZ (71］．为了进一步支持功能规范，Takei等人。[9]报道了z型细胞分裂素在玉米上的应用(玉米L.)叶片诱导ZmRR1，而没有变化ZmRR1在ip型细胞分裂素的响应中观察到表达。此外，CHK受体[72- - - - - -75和CKX降解途径的成员[57，76]的受访者对iP和tZ.不同的角色tZ和iP在植物长距离信号通路中的作用一直是人们讨论的焦点，因为人们发现木质部液中主要含有Z和iPtZ以其核苷和核苷的形式[9，77，78]，而iP核苷和核苷似乎是通过韧皮部运输的[78，79］．因此，从上面列出的证据来看，由于所选择的生物测定中缺乏这种细胞分裂素的活性，水果iP浓度的变化之前没有被检测到是可行的。然而，从少数几个在肉质水果、葡萄的发育过程中对iP进行量化的例子来看([38];与番茄(本研究)、草莓(本研究)和猕猴桃相比，在成熟阶段积累的iP多100倍[21，37]在从粉红色到红色覆盆子的转变过程中，没有检测到iP浓度的增加[22］．番茄、草莓和猕猴桃的iP浓度与已发表的拟南芥幼苗的iP浓度范围相似[80，81]、玉米根、叶及粒[82]、小番茄子房[83]，水稻花序分生组织[14]及各种大豆(大豆(l)mer .)纸巾[84]，而在葡萄浆果中检测到的iP数量是前所未有的。这表明了葡萄中iP积累的特定相关性，并可能与扩张驱动的变种后生长和这些浆果中的高糖积累率有关[85］．一项利用8个独立拟南芥微阵列实验数据的研究揭示了细胞分裂素诱导12种扩张素和18种其他细胞壁相关基因[86]，证实了先前报道的细胞分裂素诱导的细胞壁特性变化，如延长性增加[87]，或厚度减少[88］．因此，浆果细胞的版本后扩张可能至少部分受观察到的iP浓度变化的控制。细胞壁转化酶基因的诱导和大量细胞分裂素调控基因参与海藻糖-6-磷酸代谢[86]进一步表明iP在维持成熟浆果的下沉强度方面可能起着作用。细胞分裂素被认为是营养器官中碳水化合物和氨基酸库强度的正调节因子，可将源组织中的碳水化合物和氨基酸吸引到细胞分裂素浓度高的部位[89- - - - - -92］．研究土荆芥石L.细胞悬浮培养[93]和烟草叶片衰老(烟草l .) [4，94]的研究表明，库强度可能是由细胞分裂素诱导的细胞壁转化酶和己糖转运蛋白介导的，它们在功能上与异体韧皮部卸载途径有关，因此与源器官和库器官之间蔗糖梯度的维持有关[95］．在葡萄中，韧皮部从共质体卸载到外质体卸载的转变，与成熟阶段的开始以及转化酶和己糖转运蛋白表达的增加相一致，已被描述[96，97］．为了支持iP在变型后浆果作为强库器官的维持中可能发挥的作用，在赤霞珠中报道了一个细胞壁转化酶基因，其表达谱类似于变型后iP积累的模式。98，99］．

本研究中观察到的不同葡萄品种之间最大iP浓度差异较大的因果关系(图2)。1而且2、表1)是未知的，需要进一步的研究，但遗传和环境因素可能是原因。细胞分裂素在许多植物物种中对花青素积累的良好刺激作用[One hundred.- - - - - -102]表明红色品种中iP的变型后积累与花青素之间可能存在联系。然而，从红皮和白皮品种中获得的iP数据表明，虽然iP浓度最高的三个品种都是红皮，但不能明确区分红皮和白皮品种。例如，红宝石浆果的iP浓度，除了皮肤也产生花青素在果肉，不能与白色品种的低iP浓度，如雷司令或维欧尼(表1)。

在设拉子葡萄发芽时的出血液中检测到许多细胞分裂素碱基、核苷和核苷，包括低水平的ip型细胞分裂素[103]，不排除本研究报告的版本后iP积累(图2。1而且2)是iP从韧皮部导入的结果。然而，番茄细胞分裂素相关基因的空间表达模式[83]和猕猴桃[37表明细胞分裂素在果实中发生局部生物合成和降解，并在果实发育过程中发挥重要作用。这在葡萄中也得到了证实，其中调节细胞分裂素生物合成的基因(IPTS)，激活(日志S)、退化(CKXS)，感知(嗯S)及信号(RRs)在果实发育的各个阶段均有表达(图;2 b，附加文件5)。八个小道消息的抄本IPT年代(表2)。其中五个(IPT10-14)只适用于版本前阶段，而其他三个(IPT2，IPT9，IPT15)在版本前和版本后表达，包括iP积累期间(图2)。2)。具体的表达IPT某些发育阶段的基因似乎受到高度调控IPT12，在5到8 wpf之间达到峰值，已被描述为版本后浆果中两个sirna的靶点，导致转录后沉默[104］．两种tRNA-IPTs的表达增加(IPT2，IPT9)可能反映了trna -水解在浆果发育后期对细胞分裂素库的更大贡献，这可能会产生cZ和iP [54］．然而，就像之前的研究一样[38),c设拉子浆果中的Z浓度在整个浆果发育过程中一直低于检测限(数据未显示)。从…的表情判断IPT在其他葡萄器官中的基因(图;3.和附加文件6)，并与拟南芥的报告一致[105]，西红柿[83]和大豆[84]，局部细胞分裂素生物合成似乎发生在整个植物中，特别是在根、卷须和成熟叶片中。由核苷前体产生活性细胞分裂素碱基的log依赖通路最近已被确定为水稻细胞分裂素激活的主要机制[55]和拟南芥[106］．它在浆果发育的早期(1-3 wpf)和晚期(9-16 wpf)也表现出活跃LOG12而且LOG17在变种前和变种后的果实中均有表达，另外4个日志S在版本前期表达，S的表达LOG5a而且LOG14是后版本特异性的(图;2 b)的转录累积LOG5a与iP增长模式密切匹配(图;2)。所有十日志基因(表2)在至少一种被测的葡萄组织中以不同的模式表达，在相同的器官中有显著的转录物积累IPT(图。3.和附加文件6)。

CKX酶对细胞分裂素的不可逆降解是调控局部细胞分裂素浓度的重要部分[107而在葡萄浆果中似乎仅限于早期发育阶段(1-4 wpf，图;2)。的逐渐减少CKX5转录本此前在两项研究葡萄浆果发育过程中转录变化的微阵列研究中被报道过[99，108］．在改型后葡萄中细胞分裂素降解的缺乏可能导致iP浓度的大幅增加，特别是因为iP比其他细胞分裂素更容易受到ckx催化降解的影响[57，76］．

所有三个葡萄细胞分裂素受体基因(表2)在各组织中均有表达(图;3.和附加文件6)和浆果发育阶段分析(图;2 b)，但同时CHK3而且CHK4在变体前的浆果中表现出较高的转录本积累，相关的其特征是在后期，高ip，版本后阶段表达显著增加。据报道，拟南芥VviCHK2的同源物优先结合iP，而其他两个受体则优先结合tZ (74］．的版本后表达增加相关的因此，可能代表一个放大器，用于在成熟阶段编排ip特定的响应。支持这一假设的是一组后版本特异性的表达RRs，包括4个b型RRs (RR11a，RR11b，RR27，RR29)及三个a型RRs (RR31，RR35，RR37)可以将iP信号转化为成熟特异性的转录应答(表2和无花果。2 b)。变体前浆果的特征是表达一组单独的RR基因(两个b型RRs，四a型RRS)，而不是RR在变种前和变种后浆果期鉴定出显著转录本积累的基因(表2和无花果。2 b)。在其他葡萄器官中，根总体上表达最高RR年代,但RR在所有测试的组织中都发现了转录本，其中9个RRS表示无处不在，9RR局限于特定的器官(图;3.和附加文件7)。

本研究为在许多不同的葡萄品种、草莓和番茄中发生与成熟相关的iP浓度增加提供了证据，因此表明这种细胞分裂素在水果成熟过程的调节中具有普遍作用。在改型后的葡萄浆果中发现的异常高浓度的iP表明了这些水果中iP积累的特定相关性，可能与葡萄中储存的同样高浓度的糖有关。细胞分裂素生物合成、激活、感知、信号和分解代谢相关基因表达的发育变化表明，浆果细胞分裂素浓度的调节和对特定细胞分裂素物种的反应可以局部控制，并为版本后iP的积累提供了可能的解释。在浆果和其他葡萄组织中，每个基因家族的不同表达模式表明了细胞分裂素浓度和反应的空间和时间规范，因此是一个高度复杂的系统。

所有支持性数据都包含在附加文件中。

行为:

肌动蛋白

方差分析:

方差分析

分:

细胞分裂素组氨酸激酶

CKX:

细胞分裂素氧化酶/脱氢酶

保护:

N - (2-Chloro-4-pyridinyl) - N苯基脲

应急服务国际公司:

电喷雾电离

F:

花

弗兰克-威廉姆斯:

鲜重

高效液相色谱法:

高效液相色谱法

我:

节间

知识产权:

N⁶——(Δ²-Isopentenyl)腺嘌呤

IPT:

Isopentenyltransferase

李:

叶

质:

液相色谱-质谱法

格林:

大绿(番茄成熟期)

日志:

LONLEY家伙

迷幻药:

最小显著性差异

女士/小姐:

串联质谱法

拿拿淋:

不适用

ND:

没有检测到

存在:

定量实时聚合酶链式反应

接待员:

根

射频:

红坚(番茄成熟阶段)

RR:

响应调节器或红熟(番茄成熟期)

史:

种子

SE:

标准错误

SG:

小绿(番茄成熟期)

SPE:

固相萃取

师:

卷须

TDZ:

的物质

TSS:

总可溶性固形物

轴承:

翻身(番茄成熟阶段)

WPF:

开花后周

cZ:

独联体玉米素

tZ:

反式玉米素

作者要感谢Angela Keulen, Sue Maffei和Emily Nicholson的技术援助。我们也感谢Chalk Hill Wines和Yalumba Wines为本研究提供的水果。这个项目的部分资金是由澳大利亚葡萄种植者和酿酒师通过他们的投资机构澳大利亚葡萄和葡萄酒管理局提供的。csp09 /05及14/01)，并由澳洲联邦政府提供相应资助。CSIRO农业旗舰是葡萄酒创新集群的合作伙伴。

从属关系

1. CSIRO农业旗舰，Waite校区，WIC西大楼，PMB2, Glen Osmond，南澳大利亚，5064

   克里斯汀Böttcher，克里斯塔·a·伯比奇，保罗·k·博斯和克里斯托弗·戴维斯

相应的作者

对应到克里斯汀Bottcher．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者都对来自野外种植和温室种植植物的组织样本的取样和处理做出了贡献。CB参与了研究的设计，进行了系统发育分析、引物设计和细胞分裂素测定，并起草了手稿。CAB进行qRT-PCR分析，并参与细胞分裂素的提取。PKB参与了研究的设计并进行了统计分析。CD构想了这项研究，并参与了其设计和协调。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

开放获取本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。

转载及权限