经授粉和交叉授粉花的转录组比较Erigeron Breviscapus.分析候选人自我不相容性相关基因

背景

自我不相容（SI）是一种广泛和重要的交配系统，促进植物中的折叠。Erigeron Breviscapus.是一种自交不亲和的菊科植物。然而，SI反应的遗传特征E. Breviscapus.在很大程度上仍未知。来理解可能的机制E. Breviscapus.为了响应SI，我们对头状突起进行了比较转录组分析E. Breviscapus.自交和异花授粉后，为分析拟南芥的si相关候选基因提供了有价值的信息大肠breviscapus。

方法

使用高通量的下一代测序（Illumina）方法，不同基因的转诊表谱分析E. Breviscapus.获得了，通过定量实时PCR（QRT-PCR）验证了一些结果。

结果

组装后，获得了63,485个基因模型（平均基因大小882bp; N50 = 1485 bp），其中38,540个未成根（总基因模型的60.70％）通过与四个公共数据库的比较来注释（NR，瑞士 - Prot，Kegg和COG）：38,338人（占总基因模型的60.38％）显示了NR数据库中的序列高同源性。在三个cDNA文库中鉴定出差异表达的基因（非，自我和交叉授粉的CapitulumE. Breviscapus.），大约230个基因可能与SI响应有关。几种这些基因在自我授粉的高等程度中升级，但在交叉授粉的高地下调，例如SRLK(SRK-like)及其下游信号因子，MLPK．QRT-PCR确认了表达模式EBSRLK1和EBSRLK3.基因与SI不相关E. Breviscapus.．

结论

这项工作代表了自我授粉和交叉授粉花中基因表达的第一个大规模分析E. Breviscapus.．大量可能参与SI反应的显著基因表现出差异表达，其中包括在细胞间通讯、信号转导和授粉过程中发挥关键作用的基因．因此，我们假设那些显示差异表达和编码SI响应的关键调节剂的那些基因，例如MLPK，研究进展，凸轮，EXO70A1，地图，SF21和点头，可能会影响SI响应大肠breviscapus。我们的研究一起携带，提供了与SI相关基因的池E. Breviscapus.并提供了一种阐明Si在奥斯特科埃的机制的宝贵资源．

自我不相容性（SI）是最普遍的和重要的交配系统，促进折叠的同时防止近亲繁殖。许多开花植物有SI系统[1，可分为配子体SI (GSI)和孢子体SI (SSI)两种类型。花粉的不亲和性表型在GSI中是由其自身的单倍体基因型决定的，而在SSI中则是由亲本植物的二倍体基因型决定的[2］．芸苔属被认为是SSI的热点，其使用雌蕊表达的受体激酶来识别自我/非自动花粉[3.]并由多个等位基因控制年代基因座[4，5］．年代等位基因在物种内具有高度的氨基酸序列差异[6- - - - - -9］．年代-Locus受体激酶（SRK.）被鉴定为女性决定蛋白[10］．年代- 富含半胱氨酸的（可控硅)蛋白被鉴定为十字花科的雄性决定因素[11，12］．SCR到SRK的结合诱导SRK的自磷酸化，这触发了导致SI响应的信号级联。ARM重复包含1（研究进展） 和米-基因座蛋白激酶(MLPK）是正面介导信号转导的两个信号分子。研究进展表现在病耻感中并与之相互作用SRK.通过它的细胞质域[13，14］．MLPK在隐性突变体中识别出来芸苔属植物拉伯var。黄色莎莎。基因的突变导致Sib·拉伯黄色sarson [15］．与SI信令路径相关的其他组件包括Thioredoxin-H 1（thl1.） 和Thioredoxin-H 2（thl2.)．而且，加利福尼亚州^2＋也参与了Si的信号转导。在柑橘柑橘，几种可能调节CA的新型基因^2＋自花粉识别过程中发现了内稳态[16］．

甲状腺系院Si的遗传学研究开始于诸如Crepis麻，光argentium和cosmos bipinnatus在1950年代。在菊科中，估计超过60%的物种使用SSI进行遗传测定。首先对菊科植物的SSI系统进行了研究，发现SSI系统是由紫杉醇控制的年代基因座[17，18］．但是，精确的数量SRK.花粉特异性所需的基因和果实中SSI的雄性和女性决定因素仍然未知。狗舌草squalidus（牛津Ragwort）已被用作模型植物，以研究菊科的Si的分子机制。在树栖科中的耻辱表面的早期研究表明，钙科群物种具有干燥型柱头。后来，艾尔曼等人。进行了五种不同植物中花粉 - 耻辱相互作用的比较研究，并显示了钙科群物种的柱头产生少量的表面分泌，并不完全干燥[19］．这一发现随后被Hiscock等人证实S. Squalidus.和其他芽孢杆菌物种，导致钙科污染的重新分类为“半干”[20.］．由此得出结论，SSI在萨尼奥物种通过与芸苔的不同分子机制操作[21］．然而,S. Squalidus.数据集与干燥柱头物种共享更多数量的同源基因，而不是湿耻辱性物种[22］．的数量年代等位基因的S. Squalidus.与使用SSI的其他物种相比，与其他物种相比23.- - - - - -25.］．通过不同的转录物进一步分析了这种推断S. Squalidus.并且SSH成功​​地用于从三种不同的S-Genotypes中脱离富含雌蕊的转录物S. Squalidus.．115种不同候选人的雌蕊特异性基因S. Squalidus.被确定(26.］．几个新的基因，如膜相关蛋白质（地图），sunflower-21（SF21） 和Nodulin / MTN3基因（点头），可能与SI联系在一起S.squalidus。的萨尼奥雌蕊特定地图被发现在柱头的乳头细胞和传递组织中表达[22，27.］．在s . squalidus的核苷酸序列地图展示相对较高年代-Genotypic多态性，其在细胞外区域升高[22，27.］．的SF21基因家族也被隔离S. Squalidus.．这些基因副本存在差异，表达模式[26.］．点头只表达于乳头状细胞S. Squalidus.柱头，在那里它似乎被发育调节，达到最大的表达，当柱头叶反射暴露乳头细胞[22，27.］．

Erigeron Breviscapus.（vant。）手。-mazz，一个重要的中国传统药用植物[28.，29.]，是一种自我不相容的菊科。它已被用于治疗脑血管和心血管问题[30.］．最近，积累研究E. Breviscapus.一直集中于化学成分[31.，32.]药理活动[32.- - - - - -34.]，以及种质资源[35.- - - - - -39.］．但是，关于SI反应的遗传机制很少E. Breviscapus..RNA测序是一种强大的工具，可以研究许多高昂的分子生物学，它已成功用于柠檬中的SI和莱姆萨山［40，41.］．为了揭示与SI反应相关的关键基因，我们比较了小头的基因表达谱E. Breviscapus.在非、自花和异花授粉过程中，利用转录组测序和德诺维集会。在分析之后，发现了较大数量的显示差异表达的潜在的Si候选基因，包括在细胞 - 细胞通信，信号转导和授粉过程中起作用的基因，如MLPK，研究进展，凸轮，EXO70A1，地图，SF21和点头。因此，我们的研究提供了一个与si相关的基因库E. Breviscapus.为菊科植物SI响应的分子机制研究提供了有价值的资源．

测序和从头组装E. Breviscapus.转录组

使用illumina测序技术来制备MRNA样品的三个游泳池（自授粉，交叉授粉和非授粉）Capitulum用于构建用于高通量测序的文库。Illumina Hiseq 2000的下一代测序产生了68.68米的原始读数，包括来自三个文库的13.87GB，Q30百分比（测序误差率为0.1％）以上82％。从原始读取中删除了仅具有3'-Adapter片段的读取，导致53.44米的清洁读数，其中Q30以上94％以上（表1)．过滤后的reads由Trinity重新组装(kmer长度= 25)。组装结果表明，该基因的转录组E. Breviscapus.由63,485个unigenes组成。这些基因的平均长度为882 bp, N50值为1485 bp。ungenes的大小分布如图所示。1．通过Getorf预测每个序列的编码区域，其从我们组装的转录组预测63,254个开放阅读框（ORF），28,272（44.7％）ORF超过300bp。这些ORF的平均长度为554bp，N50值为1167 bp。unigenes的尺寸分布如图2所示。1．本研究中生产的高质量读数已存放在NCBI SRA数据库中（登录号：SRA245957）。

功能辅助和分类

对装配后的单基因进行注释是基于对特定数据库的序列相似性搜索。将所有的unigenes与Nr数据库、Swiss-Prot蛋白数据库、KEGG数据库和COG数据库中的序列进行比较，使用BLASTX，截断e值为10⁻⁵．共有38,540人（所有Unigenes的60.70％）返回了显着的爆炸结果（附加档案1:表S1)。其中38338个unigenes与Nr数据库中的序列具有较高的相似性，占总unigenes的60.38%。在COG数据库、KEGG数据库和Swiss-Prot数据库中，与序列具有显著相似性的unigenes分别为12279(19.34%)、8483(13.36%)和25994 (40.94%)2)．

对28571个注释的unigenes进行GO分类，将其分为功能类别:细胞成分、分子功能和生物过程。在各种细胞成分中(忽略未知和其他细胞成分类别)，细胞、细胞部分和细胞器是最具代表性的。其他重要的细胞成分，如细胞器部分、膜、大分子复合物、胞外区域、细胞连接和膜包腔等也通过GO注释进行了鉴定。同样，在各种分子功能中，结合活性和催化活性最为突出;代谢过程和细胞过程在生物过程分类中最具代表性(图)。2)．

COG是一种基于66个基因组的蛋白质序列的系统发育关系的数据库，包括细菌，植物和动物。至少三个谱系的单个蛋白质或副病毒在每个COG中分类为代表古老的保守领域。在这内E. Breviscapus.unigenes数据集中，12279个(e值≤1.0E-5)被分为25个功能性COG簇(图3)。3.)．五大类别为：1）仅限通用功能预测;2）复制，重组和修复;3）转录;4）信号转导机制;5）翻译后修饰，蛋白质周转和伴侣。

三个图书馆的基因表达差异

使用RPKM方法计算基因表达水平，这对读取计数进行了测序深度和基因长度的影响。基于所施加的标准[FDR≤0.01和日志₂（折叠变化）≥1]，2072个基因被鉴定为样品T1（非授粉花）和T2（自授粉花）之间的显着差异表达基因（DEG），其中1426个被上调基因，646次下调这E. Breviscapus.转录组。共鉴定到2099个基因在T1和T3(异花授粉)之间存在显著差异，145个基因在T2和T3之间存在显著差异。对这些DEGs进行了GO和KEGG分析。

在样品T1和T2之间，1371只与50个亚类相关联，这些亚类别被分为三大类：生物过程，细胞组分和分子官能。在GO分类的三个主要类别中的每一个中，“代谢过程”，“细胞部分”和“催化活动”术语是显性的（图。4)．为了进一步调查这些DEG的生化途径，我们将所有参数映射到Kegg数据库中的术语。在2072只溃疡中，220个基因具有KO ID，可以分为78个途径。其中，显着富集了两种途径（矫正P值≤0.05）：参与植物 - 病原体相互作用和淀粉的基因和最显着富集的淀粉和源代谢（图。5A)．T1和T3样本中，1452个基因表达上调，647个基因表达下调;其中1354个DEGs与52个亚类相关，230个被定位到81个通路(图)。5B.)．在样品T2和T3之间，将上调92个基因的表达水平，下调53个基因;这些DEG中的73与35个子类相关联，14个被映射到12个途径（图。5C)．

三种文库中Si响应相关基因转录谱的比较

以前的研究表明，涉及Si响应的许多基因是差异表达的，例如用于细胞 - 细胞通信的基因和信号转导。揭示参与SI反应的基因E. Breviscapus.，详细分析了Si相关基因的相对表达水平，结果表明，其大多数未成年人在三种文库中表现出显着变化。根据自我和交叉授粉之间的表达谱的相似性聚集与Si相关的那些基因。Pheatmap软件参与Si的230个诱发基因的基因表达的热图如图1所示。6．使用DESEQ包获得的方差稳定数据用于通过PheatMap软件生成热图。转录数据的RNA-SEQ分析显示一些基因（SRLK，MLPK.和卡普）在自授粉的高地表达，但在交叉授粉中表达不当。相比之下，Thl.和凸轮自花授粉后表达下调，异花授粉后表达上调。然而，EXO70A1.在三个cDNA文库中显示出没有差异。将进一步检查这些基因以研究其生物学功能。在附加文件中列出了SI响应中涉及的部分未成年人的RPKM值2S2:表。

SI响应中候选基因的鉴定及表达分析

一个假定的SRK样基因，EBSRLK 1（CL21813Contig1）被克隆。通过使用整个预测的蛋白质序列进行对准来进行系统发育分析E. Breviscapus.由Mega软件和其他物种。邻近的系统发育树证明了CL21813Contig1（EBSRLK1)与SRK.从S. Squalidus.L.，但距离很远SRK.(GenBank登录号:CAG28412、CAG28414和CAG28413)7)．钙离子能够传输在细胞上发挥主要动作的不同信号。钙调蛋白（凸轮)，作为多功能钙受体，与植物的各种生理和发育过程有关。RNAseq结果显示CL21813contig1 (EBSRLK1)和T3_Unigene_BMK.9975（EBSRLK3.）在自授粉后上调。自授粉后24和10小时观察到最高表达水平EBSRLK1和EBSRLK3.， 分别。然而，它们的表达水平在交叉授粉的Capitulum中较低而不是在自授粉的高质量中。最高的表达水平EBSRLK1和EBSRLK3.分别在授粉后24和48小时观察到交叉授粉的高原。cl4907contig1（EBCAM.)自花授粉后下调，异花授粉后上调。这三个基因的表达水平在自花授粉和异花授粉之间存在显著差异(重复测量方差分析:EBSRLK1时间效果，F_1,16. = 96.822,P< 0.001。时间*治疗，F_7日16= 100.492,P< 0.001;治疗,F_7日16 = 34.321,P< 0.001;EBSRLK3.时间效果，F_1,16. = 16.929,P = 0.001. time * treatment,F_7日16 = 212.676,P< 0.001;治疗,F_7日16= 112.076,P< 0.001;EBCAM.时间效果，F_1,16. = 14.695,P = 0.001. time * treatment,F_7日16 = 18.906,P< 0.001;治疗,F_7日16 = 20.065,P< 0.001)。自交和异花授粉后6、10、24和48 h, 3个基因的表达量均有显著差异(EBSRLK1独立的T-测试：t ≥ 5.650,P≤0.005;EbSRLK3 t≥9.740，P≤0.001;EBCAM T.≥6.208，P≤0.003）。确认RNASEQ的结果，三个候选SI相关基因（两个ebsrlks.和一个凸轮选择用于进一步的表达分析。使用基因特异性引物对，通过使用QRT-PCR在自我或交叉授粉之后在不同时间点处分析候选基因的表达水平（图。8)．这三个基因在qRT-PCR分析中的表达模式与RNAseq分析的趋势相似(图2)。8)．

为了确定与SI有关的基因，我们对E. Breviscapus.来自下一代RNA-seq数据的转录组和从头组装reads。我们在3个文库(样本T1为非授粉花、样本T2为自授粉花和样本T3为异授粉花)中鉴定了63,485个ungenes。缺少E. Breviscapus.基因组信息，转录组数据的可用性将提供有价值的资源来调查SI反应的机制。

参与SI反应的基因E. Breviscapus.

的年代-Locus编码两种蛋白质：SRK和SCR。SRK.编码A.年代受体激酶(42.，43.］．E. Breviscapus.表现出与其他菊科物种相同的SSI系统。年代等位基因在物种内具有高度的氨基酸序列差异E. Breviscapus.也不例外:雌蕊SRLK来自转录组的基因显示出序列差异。系统发育分析srk从不同的物种中显示出一些特征srk（例如T1_UNIGENE_BMK.9975和CL21413Contig1）E. Breviscapus.与其他人不一致SRK.基因(没有显示)。转录数据的RNA-seq分析显示了相同的表达模式(图。6B.)．以前的研究S. Squalidus.已经证明了芸苔属植物年代基因,SRK.，并不仅仅表现在耻辱感上，或与之相联系年代-locus [21］．在三个样本中，差异表达，推定EbSRLK基因被确定。一个假定的EBSRLK1克隆CL21813contig1基因。定量PCR分析表明EBSRLK1在自我授粉的大纲中高度表达，在交叉授粉中表达不当（图。8)．然而，它们的表达模式表明它们不太可能直接参与SI，并且可能类似于SRK样基因S. Squalidus.．需要进一步的研究来解剖这些功能SRK样基因E. Breviscapus.．

与女性因素形成对比srk，男性年代-dereminant SCR充当配体[44.］．HV地区年代- SRKS的DOMAIN充当SCR绑定站点，涉及两阶段识别过程[45.］．在三个图书馆E. Breviscapus.，仅向SCR，CL18556Contig1和CL4799Contig1注释两个unigenes（图。6B.)．SCRs的功能分析E. Breviscapus.在花粉-雌蕊相互作用过程中，将在未来的研究中进行。

Si反应的信号通路

的E. Breviscapus.数据集显示了许多在耻辱和花粉颗粒之间识别中发挥着主要作用的基因。在鉴定的基因中，我们专注于那些编码的基因地图，SF21，Nodulin3.，研究进展，MLPK，EXO70A1.，凸轮和thl1./thl2.．

研究进展和MLPK的候选下游效应SRK.．所以，研究进展的SI响应可能是一个正效应芸苔．反义抑制研究进展导致SI响应的部分分解[46.］．在这项研究中的三个样本中，只有一个研究进展发现转录本(图。6B.)．没有其他ACR1.基因表明组件是不完全的和/或表达的ACR1.基因太低，无法获得足够的解读来组装。MLPK能与激酶结构域相互作用吗SRK.［47.］．MPLK.被认为在srk介导的信号传导中起作用。在本研究中，我们发现MLPK基因在自花传粉样品中表达上调，而在异花传粉样品中表达下调(图。6B.)．

作为一个相互作用的因素研究进展，EXO70A1.已被隔离在B. Napus.［48.］．过度表达EXO70A1.自我不相容B. Napus.部分分解Si，而抑制则EXO70A1.(通过RNAi或T-DNA插入)自相容B. Napus.和A. Thaliana.抑制花粉粘附，水合和萌发[48.］．六个unigenes编码EXO70A1.虽然在三个cDNA文库中没有观察到它们的表达差异(图。6B.)．需要进一步的研究来阐明EXO70A1.基因E. Breviscapus.．

thl1.和thl2.从酵母双杂交筛选中鉴定为srk结合伴侣[49.]并作为SRK信号传导中的负调节器[50.，51.］．对十字花科植物的研究表明，THL在SI反应中起关键作用。在三个cDNA文库中E. Breviscapus.，一个惊人的发现是鉴定了88个推测的THL蛋白(图。6A)．功能分析是必要的，以阐明光线的作用thl1./thl2.在信号转导过程中E. Breviscapus.．

钙调蛋白是许多信号转导途径和重要的钙带蛋白质中的重要第二个信使。cl4907contig1（EBCAM.）在自授粉后下调并在交叉授粉后上调（图。8)．定量PCR分析表明表达模式EBCAM.基因与RNA-seq分析相同(图。6A和b)．

一些新的Si候选基因，地图，SF21，点头的雌蕊中特异性表达S. Squalidus.．核苷酸序列地图展示相对较高年代基因型多态性(22］．在三个样本中E. Breviscapus.,很少有地图发现了成绩单。删除的原因地图基因可能相似研究进展基因，即组装不完整和/或表达地图基因太低，无法获得足够的读取待组装（图。6B.)．系统发育分析SF21核苷酸序列比对表明该基因家族受到保守，并且可能在开花植物中的生殖过程中发挥重要作用。在E. Breviscapus.转录组数据集，我们发现了SF21在自授粉和交叉授粉样品中上调基因（图。6B.)．点头在拟南芥和水稻花粉发育中起关键作用的基因家族已被研究[52.，53.］．尽管雌蕊特异性大量Nodulin / MTN3.基因已经被研究，但这些基因在雌蕊中的功能尚未被研究。十unigenes编码点头在我们的研究中鉴定，它们也在自授粉和交叉授粉样品中上调（图。6B.)．SF21和点头可能会涉及SI，但是，需要进一步研究。

此外，还有许多其他基因可能参与三种库中的SIE. Breviscapus.，如SNX2, KAPP和Annexin(图。6A和b)．这些候选基因在SI中的作用和机制还需要进一步的研究。

我们对Capitulum进行了第一次大规模调查基因表达E. Breviscapus.，达斯卡西SSI种类，使用高通量RNA-SEQ分析。组装后，获得了63,485个基因模型（平均基因大小882bp; N50 = 1485 bp），其中通过与四个公共数据库进行比较，通过将38,540个未进剂（总基因模型的60.70％）进行注释（NR，瑞士 - Prot，Kegg和齿轮）。38,338 unigenes（60.38％）与NR数据库中的序列显示出高相似性。在三个cDNA文库中鉴定了DEG（非，自我和交叉授粉的CapitulumE. Breviscapus.)．大约230个基因显示出可能与SI相关的差异表达。定量PCR确认了RNA-SEQ检查的选定基因的表达模式。以前没有报告或研究通过RNA-SEQ分析鉴定的大多数基因E. Breviscapus.．虽然函数信息缺失，但我们假设MLPK，研究进展，凸轮，EXO70A1，地图，SF21和点头可能是至关重要的SI响应大肠breviscapus。然而，EBSRLK1和EBSRLK3.基因被发现与SI in不密切相关E. Breviscapus.他们更像是SRK样基因。研究结果将有助于更好地了解菊科植物的SSI系统。这些基因的功能将为SI的机制提供线索E. Breviscapus.SSI体系。

植物材料与RNA分离

野生型的E. Breviscapus.在本研究中使用。花的组织E. Breviscapus.均采自云南鲁西县种植基地试验田。我们已经得到样品供应商的许可2014年4月3日进行自花授粉和异花授粉试验。简而言之，植物准备试验是通过套袋的枝条上有正在发育的花蕾。所有授粉(自交和杂交)至少重复3次，至少采集到10个袋状开花头。受控的自花授粉和异花授粉被执行，如前面在Hiscock [54.]和Brennan等人。［23.，25.］．在交叉处理中，花药用黑色油漆刷除去。异花授粉是通过接触头状花序的柱头进行的，头状花序上的花有完全呈现的花粉。授粉后，头状花序用大头针固定在一个小的，多孔的，组织授粉袋(5cm x5cm)内。另一方面，在强制自交条件下，用干刷子对袋状头状花序柱头进行自交处理(1% NaCl + 10.1% Tween 20)。让柱头干燥一段时间，然后从同一个体的另一个头状花序施用自交花粉，重新套袋自交头状花序。偶有袋状头状花序的搅动可促进自花授粉。非授粉(样本T1)、自授粉(样本T2)和异授粉(样本T3)后24 h分别收获3个样本。

Illumina测序使用EASY spin microRNA Rapid extraction Kit (Aidlab, Beijing, China)提取总RNA。使用NanoDrop ND1000 (Thermo Scientific)、凝胶电泳和Agilent 2100生物分析仪(Agilent)对总RNA的数量和质量进行了验证。从10个头状突起中平均收集30微克RNA，用于cDNA文库的制备。

RNA-SEQ图书馆构建和排序

cDNA文库的构建使用cDNA样品制备试剂盒(Cat # RS-930-1001, Illumina Inc.， San Diego, CA)，按照制造商的说明。收集每个处理的总RNA并汇集，并用聚t寡核苷酸附着磁珠富集和纯化mRNA。使用RNA片段试剂盒(Ambion, Austin, TX, USA)对mRNA进行剪切，然后使用逆转录酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)和随机六聚体引物作为模板合成第一链cDNA。第二链cDNA合成使用DNA聚合酶I (New England BioLabs, Ipswich, MA)。裂解片段使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen, Dusseldorf, Germany)纯化，并连接到Solexa适配器上。从1.8%的琼脂糖凝胶中提取所需的片段(约150-200 bp)，并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。最后纯化PCR扩增产物，构建测序文库。采用Illumina HiSeq™2000测序平台进行测序。转录组数据采用Illumina软件进行分析。

从头转录组组装

测序后，含有适配器的原始读数，读取在组装之前，载有超过5％的未知序列的未知序列（'n'）和低质量碱基被识别（对应于0.1％测序错误率）。使用Trinity计划进行清洁读取的DE Novo组装[55.］．首先，将具有一定长度重叠的读本组合成contigs。然后，他们被映射回带有配对端读的contigs，以检测来自同一转录本的contigs，以及contigs之间的距离。最后，通过三位一体连通contigs，得到两端都不能扩展的序列。这样的序列被定义为“unigenes”。之后，利用TGICL软件对三个文库中的unigenes进行进一步组装，获得非冗余unigenes，并使用非冗余unigenes进行进一步分析[56.］．利用EMBOSS软件包中的GetORF函数分析unigenes内的潜在编码区域。使用常见的perl脚本分析长度分布。计算不同长度区间的N50长度、平均长度和单基因数。

功能注释和KEGG通路分析

unigenes的功能使用BLASTX注释[57.]搜索e-value阈值10⁻⁵针对蛋白质数据库，包括NCBI非冗余（NR）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.) [58.]，瑞士 - Prot蛋白质数据库（http://www.expasy.ch/sprot.) [59.]、京都基因及基因组百科全书(KEGG)数据库(http://www.genome.jp/kegg.) [60.]，以及直际蛋白质（COG）数据库的簇（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cog.) [61.］．检索序列相似性最高的蛋白进行分析。KEGG生成代谢途径的注释，COG将每个注释的序列匹配到一个保守的区域。

丰富估计和差异表达分析

为了研究不同样本中每个unigene的表达水平，分别对每个样本进行RNA-seq期望最大化分析，获得转录本丰度估计，它使用一个迭代过程，根据从每个转录本中提取的读取的概率，将读取部分分配给每个转录本[62.］．对齐产生每个UNIGENE的数字表达水平，它使用Trinity封装中的Perl脚本标准化，以获得每千克/百万（RPKM）值的读数[63.］．

为了研究跨样品的转录物的表达模式，通常可用于将分析限制为在至少一个成对样本比较中显着差异表达的那些转录物。使用来自生物导体项目的工具进行三个样品的差异表达分析，包括Edger [64.]及DESeq [65.]，鉴定差异表达的转录物。给定一组差异表达的转录物，我们用FDR（假发现率）≤0.01和日志提取了那些转录物₂叠化(日志₂FC）≥1。

基因验证和表达分析

研究不同的基因(EBSRLK1，EBSRLK3.和EBCAM.）表达式E. Breviscapus.收集并检查八个花阶段（授粉后2,4,6,8,10,24,48和72小时）。用基因特异性引物进行QRT-PCR。本研究中使用的所有引物列于表中3.．从自授粉，交叉授粉或非授粉（对照）CAPITULUM中提取总RNAE. Breviscapus.使用TRIzol试剂(Takara，中国北京)。用RNA纯化试剂盒(Takara)进一步纯化RNA。本实验选择GAPDH作为管家基因。每个反应进行3个重复(每个生物重复包含至少10个头状组织)，每个样品实验重复3次(技术重复)。采用标准曲线法测定mRNA的相对表达量，并与内参基因归一化。Real-time PCR在Roche检测系统(Roche, Switzerland)中进行。热循环参数如下:94°C下30 s;然后45个循环，94℃20 s, 55℃20 s, 72℃30 s。在60℃~ 95℃范围内进行熔化曲线分析，观察PCR产物的特异性。数据采用重复测量方差分析，分别以时间(2、4、6、8、10、24、48和72 h)为主体内效应，以不同交配方式(自交和异交)为主体间效应。 Independent t-tests were performed to explore the detailed effects of treatment. All calculations were performed using SPSS Statistics 17.0 (www.spss-china.com)．

本研究中生成的高质量读取的支持数据已存放在NCBI SRA数据库中，一个开放访问存储库（登录号：SRA245957）。

如果:

自我不相容

GSI：

配子蛋白自我不相容性

SSI：

孢子素的自我不相容性

子:

开放阅读框架

rpkm：

读取每千碱基的外显子模型每百万映射读取

FDR：

假发现率

可见：

差异表达基因

爆破：

基本的局部对齐搜索工具

走:

基因本体论

Kegg：

用于解密基因组的KEGG资源

齿轮:

直际蛋白质群体

NR：

ncbi nr数据库

QRT-PCR：

定量实时聚合酶链反应

E. Breviscapus.：

Erigeron Breviscapus.

SRLK：

年代轨迹受体激酶

可控硅:

年代轨迹cysteine-rich

MLPK：

米-Locus蛋白激酶

研究进展：

臂重复带1

凸轮：

钙调蛋白

地图：

膜相关蛋白质

SF21：

Sunflower-21

点头：

Nodulin / MTN3.

thl1.：

硫昔单蛋白样蛋白1

thl2.：

硫昔单蛋白蛋白2

卡普:

激酶缔合蛋白磷酸酶

SNX2:

annexin s2

Swiss-Prot:

高质量的注释和非冗余蛋白质序列数据库

edger：

一种用于数字基因表达数据差异表达分析的Bioconductor包

DESeq:

基于负二项分布的不同基因表达分析

FDR：

假发现率

我们要感谢Holdhe Peegecture的Herba Erigerontis学院/鸿河Qianshan Bioangineed Co.，Ltd提供Erigeron Breviscapus.样本，Zhiwen Gong关于QRT-PCR分析的建议。

资金

这项工作得到了中国国家自然科学基金（No.81160499和81503184号）的支持。

作者指出

隶属关系

1. 云南省云南农业大学良好农业实践研究中心，云南农业大学，昆明，650201，云南，中华民国

   魏张，春华马，广辉张和生王杨

2. 洪河大学生命科学技术学院，蒙益，661100，云南，云南人民共和国

   魏张，湘伟恒林萌

3. 华南农业大学农业部热带农业环境重点实验室，广州，510642

   你好江

相应的作者

对应到Guang-Hui张或杨阳．

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

WZ和XW进行了差异基因表达分析，qRT-PCR并起草了手稿。NHJ、HLM、CHM参与RNA-seq分析。GHZ和SCY发起了该项目，并全程监督工作。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

作者的信息

不适用。

可用性数据和材料

不适用。

魏章、向维对这部著作贡献相当。

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重印和权限