利用转录物和代谢物的联合分析，提出了两个区域差异萜烯积累的关键基因

背景

萜烯因其极低的感知阈值和宜人的花香而引起酿酒师的极大兴趣。即使是同一品种，在不同的葡萄生长环境下，萜烯的分布也会有很大的不同。近年来，对葡萄果实中萜类合成所需的一系列基因进行了生物化学鉴定。然而，控制不同地区葡萄果实中萜烯积累差异的基因尚未被确定。

方法

采用气相色谱-质谱(GC-MS)技术对游离萜和糖苷结合萜进行了鉴定和定量。通过RNA测序获得基因的转录表达谱，并通过定量实时PCR (QPCR)对部分结果进行验证。利用Cytoscape软件v 2.8.2 (www.cytoscape.org)。

结果

“白麝香小粒”浆果采自甘肃高台(GT)和河北昌黎(CL)两个气候截然不同的葡萄酒产区，在连续两年的四个发育阶段。GC-MS分析表明，游离萜和糖苷结合的萜烯主要是在变异后积累的，而来自CL的成熟葡萄果实的游离萜烯和糖苷结合的萜烯含量明显高于来自GT的果实。转录组分析显示，参与萜烯生物合成的一些关键基因在CL区显著上调。特别是在MEP通路中，表达VviHDR(1-羟基-2-甲基-2-丁烯基4-二磷酸还原酶)与萜烯积累平行，可促进异戊烯基二磷酸(IPP)进入萜烯合成途径。糖苷结合的单萜烯在两个区域随着成熟而不同地积累，这与单萜烯葡萄糖基转移酶基因的表达是同步的(VviUGT85A2L4（VviGT14))。其他基因也被发现与不同地区葡萄中萜烯和单萜苷积累的差异有关。通过基因共表达网络分析预测调控萜烯合成的转录因子。此外，与脱落酸(ABA)和乙烯信号响应相关的基因在GT葡萄中表达水平比CL葡萄高。

结论

葡萄果实中游离萜和糖苷结合萜在GT区和CL区产生的差异至少与两者的表达有关VviHDR和VviUGT85A2L4（VviGT14)。结合转录因子和成熟相关基因的表达模式，我们推断GT地区较少的降雨和较强的日照可以启动早熟相关基因的表达，加速浆果成熟，最终限制萜烯挥发物的产生。

葡萄浆果中的萜挥发物是葡萄酒花香/果味的主要来源，也是芳香葡萄酒的品种风味的主要来源[1，2]。葡萄中的萜烯以游离和糖苷结合的形式存在。一般来说，糖苷结合形式比自由形式存在得更多[3.，4]。自由形式的萜烯直接导致香气，而非挥发性和无味的结合型萜烯是葡萄酒香气的潜在贡献者，因为它们可以在酿酒过程中通过酸性和酶水解转化为自由挥发的化合物[5，6]。麝香型葡萄品种挥发物的分布已被广泛研究[7- - - - - -10]，这表明大多数萜烯化合物随着葡萄成熟而积累[11]。典型的麝香猫般的香气主要归因于大量的C10萜类(单萜类)。浆果中萜烯挥发物的浓度受多种因素影响，如葡萄品种、成熟度、年份和葡萄园管理技术等[12- - - - - -17]。同一品种，生长在不同的气候和地区，可以有不同的芳香轮廓[18，19]，这导致所生产的葡萄酒的芳香品质有很大差异[18，20.]。然而，对葡萄中萜烯化合物的区域差异关注有限;气候或地域因素如何及通过何种机制影响相关基因的表达和萜烯的产生尚未阐明。

萜烯的生物合成途径及其涉及的基因是众所周知的。萜烯源自两种常见的可相互转化的五碳前体:二磷酸异戊烯基(IPP)及其异构体二磷酸二甲基烯基(DMAPP) [21]。在植物中，这些C5前体通过两个独立的途径合成:质体2-甲基- d -赤藓糖醇-4-磷酸磷酸(MEP)和细胞质甲羟戊酸(MVA)途径[22，23]。MEP途径为单萜和二萜的合成提供底物，而MVA途径为倍半萜的合成提供代谢前体(C15) [24，25]。最近，一项同位素标记实验表明，在一些植物中，MVA和MEP途径之间存在代谢物的交叉流动[26]。IPP和短二磷酸戊烯基可能连接上游类异戊二烯代谢的MVA和MEP途径[27]。在类异戊二烯代谢物中，单萜烯是马斯喀特和芳香的非马斯喀特品种酿造的白葡萄酒香气的最大贡献者[28，29]。在这里，我们主要关注的是葡萄中单萜烯的产生。

1-脱氧-d -木lulose 5-phosphate synthase (DXS)是MEP途径的入口酶，催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸缩合成1-脱氧-d -木lulose 5-phosphate (DXP)。DXP通过6个酶促反应进一步转化为焦磷酸香叶基(GPP, C10)。MEP途径中至少存在三种限速酶，包括DXS、DXP还原异构酶(DXR)和1-羟基-2-甲基-2-丁烯基4-二磷酸(HMBPP)还原酶(HDR) [30.- - - - - -32]。DXS是几种植物中关键的限速酶[31]。过度表达dx导致类异戊二烯终产物明显增加拟南芥(33]。此外，积累VviDXS转录本与葡萄中单萜烯的浓度呈正相关[34，35]。数量性状位点(QTL)分析显示VviDXS与葡萄浆果的麝香猫味道强烈相关[36]。的表达式VviHDR与葡萄果实变熟期单萜酚的积累有关[11]。

萜类合成酶(terpene synthases, tps)是一个庞大的基因家族，作为萜烯生物合成途径的最终酶，它分别负责从底物DMAPP、GPP、FPP或GGPP中产生半萜烯(C5)、单萜烯(C10)、倍半萜烯(C15)或二萜烯(C20) [37]。初级单萜骨架可以通过其他类型的酶的作用进一步修饰，如细胞色素P450羟化酶、脱氢酶(醇和醛氧化还原酶)、还原酶、糖基转移酶和甲基转移酶[38]。分析诉酿酒用葡萄12倍覆盖基因组序列预测69个推定功能VviTPS年代(39]。到目前为止，有43个完整版本VviTPSs已被生物化学表征，其反应产物涵盖了葡萄果实中大部分单萜和倍半萜挥发物[39- - - - - -41]。在芳香型‘gew rztraminer’葡萄中，上游萜烯生物合成途径基因转录物的增加与单萜醇糖苷积累的开始相关[11]。在其他两个芳香葡萄品种(莫斯卡托比安科和阿莱蒂科芳香)中，表达量最高VviTPS基因属于TPS-一个和TPS-b亚家族也很好地对应了游离萜烯浓度的峰值。在TPS-g亚家族中，只有VviPNLinNer1编码芳樟醇合成酶的基因在成熟浆果中表达量最高，而香叶醇合成酶基因在青浆果和成熟初期表达量最高[42]。关于将游离萜烯转化为它们的结合形式，三单萜醇β-D-glucosyltransferases -VviGT7,VviGT14和Vvigt15最近被生物化学表征[43，44]。VviGT7被证明在葡萄成熟过程中主要将香叶基和神经基转化为它们的结合形式[43),而VviGT14可以葡萄糖化香叶醇，(R, S)-香茅醇和橙花醇的效率相似VviGT15更喜欢香叶醇而不是醇[44]。Vvi另一种尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT) GT16也能以较低的效率将单萜酚和一些短链醇和芳香醇葡萄糖化[44]。ugt负责葡萄浆果中糖基共轭萜烯的产生。虽然已经在葡萄果实发育过程中功能鉴定了萜烯生物合成途径的一些重要基因，并研究了它们的表达模式，但目前还不完全清楚哪些基因在葡萄果实中游离萜烯和糖苷结合萜烯的积累中起主导作用，哪些基因在转录或翻译水平上容易受到气候因素的影响。这些问题的答案将有助于解释不同地区葡萄果实中萜烯谱的差异，并为理解萜烯生物合成的调控奠定基础。

中国大部分葡萄酒产区属于大陆性季风气候，夏季湿热，冬季干冷。而在西北地区，夏季干旱，年降雨量只有80-150毫米，日照强烈，昼夜温差大。相对而言，中国东部年降雨量约为700毫米，集中在夏秋两季。中国西部和东部地区明显不同的生长环境导致成熟葡萄果实的品质以及葡萄酒的风味和感官特征存在差异[19，20.，45]。最近，一项对西北(甘肃高台)和东部(河北昌黎)赤霞珠葡萄挥发物谱的调查显示，C6挥发物、2-甲氧基-3-异丁基吡嗪和达马酮浓度的变化强烈依赖于浆果发育期间的天气条件。19]。该品种在两个地区的转录组比较也得到了广泛的研究[46]。尽管葡萄和葡萄酒风味特征的地区差异一直吸引着中国研究人员的兴趣，但萜烯化合物却没有得到足够的重视，这可能是因为以前的研究使用的是赤霞珠和梅洛等非芳香品种，其中萜烯的种类较少，浓度较低。

本研究的重点是白麝香葡萄小粒(葡萄L.)浆果，一种麝香型葡萄品种，生长在两个气候截然不同的地区:中国西北部甘肃省的高台(GT)和中国东部河北省的昌黎(CL)。酿酒师最初注意到，在两个地区酿造的这种葡萄酒呈现出不同的香气表现。然而，葡萄果实中萜类物质的分布及相关的生物合成代谢尚未得到广泛的研究。在这项工作中，测量了萜烯挥发物的浓度(包括游离形式和糖苷结合形式)和全转录基因表达谱，以确定主导或调节葡萄果实中萜烯积累的基因和潜在转录因子(tf)，并进一步解释不同地区之间观察到的萜烯挥发物积累的差异。本研究结果将促进我们对萜烯复杂而重要的生物合成和调控的认识，并为当地葡萄园提高葡萄芳香品质提供一些建议。

两个地区葡萄中游离萜和糖苷结合萜的比较

总可溶性固形物(°Brix)和可滴定酸连续两年在两个地区的葡萄果实发育中呈现相似的变化模式。然而，与来自CL地区的浆果相比，GT地区接近收获的浆果(e - l38)含有明显更高的可溶性固形物含量和可滴定酸(图2)。1)。随着成熟，总萜烯浓度分别增加了约3倍(CL)和1.5 ~ 2倍(GT)。2)。除2010年的e - l35和e - l36外，CL和GT葡萄游离萜烯和糖苷结合萜烯的总浓度差异有统计学意义。特别是，糖苷结合形式的浓度差异远大于自由形式。从分层热图聚类中可以清楚地观察到自由挥发物在两年时间序列中的三个演化趋势(图3)。3)。在第一种趋势中，香叶醇、橙花醇、芳樟醇、月桂烯、独联体-玫瑰氧化物的浓度通常随着浆果成熟而增加(附加文件)1:表S1A)。此外，大多数在成熟葡萄果实中具有第一进化趋势的化合物在CL区比GT区生长的葡萄中浓度更高。具有第二种进化趋势的化合物，如萜烯醇和独联体/反式-呋喃芳樟醇氧化物，在豌豆大小期(e - l31)或变型期(e - l35)达到最高水平，随后在变型后葡萄中降低其水平。在收获时，这组挥发性化合物在来自CL和GT地区的葡萄之间没有显着差异。其余化合物被归类为第三种进化趋势，包括三烯醇、香茅和吡喃芳樟醇氧化物。不同地区、不同年份的累积趋势不同。在第三组中，羟三烯醇(脱氢形式的芳樟醇)在浆果成熟过程中呈下降趋势，这与芳樟醇的发育积累相反。在检测到的游离萜中，芳樟醇和香叶醇的含量最高，其次是橙花醇、龙涎香、香茅醇和香叶醇独联体——升至氧化物。除香茅醇外，其他5种萜烯在CL区成熟葡萄中的浓度均高于GT区(图2)。3 b)。我们必须注意到，即使在同一地区，两个年份之间的复合进化趋势也存在很大差异。由于这种差异，我们分析的是年度数据，而不是两年数据的平均值。研究结果表明，游离挥发物的积累很容易被年份所改变。

由于大多数化合物从变熟阶段积累到成熟/收获阶段，糖苷结合萜烯在成熟浆果中具有很高的浓度(图2)。4)。这种发展模式与之前报道的相同[4，47- - - - - -49]。与GT区相比，两个年份CL区葡萄中大多数结合挥发物的浓度都显著升高。例如，cl生产的葡萄中糖苷结合的香叶醇和橙醇比gt生产的葡萄高2 ~ 3倍(图2)。4 b)。糖苷结合的香叶醇、橙醇和芳樟醇是白麝香葡萄小粒浆果中含量最多的三种萜。在本研究中，由于三种化合物在不同区域间积累的差异，导致萜烯总浓度存在较大差异，如图所示。2。一些其他化合物，如吡喃芳樟醇氧化物的糖苷结合形式(独联体/反式)、薄荷醇和橙花醇在浆果发育过程中表现出不同的趋势。然而，这些化合物在葡萄浆果中含量都很低。自由形式与糖苷结合形式的比例根据化合物本身的不同而显著变化(附加文件)1(见表S1A和表B)。我们注意到游离萜中芳樟醇的浓度高于香叶醇和橙花醇的浓度，相反，芳樟醇苷的含量低于香叶醇和橙花苷，说明游离型芳樟醇转化为结合型的量较少。橙皮苷是白麝香葡萄果实中最丰富的单萜苷结合物。GT区葡萄中游离香茅醇的含量高于CL区，而香茅苷的含量则相反。值得注意的是，一些糖苷结合萜烯的浓度在2010年和2011年之间存在显著差异。例如，玫瑰氧化物(独联体/反式)、呋喃芳樟醇氧化物(独联体/反式)、香茅醛、香茅醛和三烯醇可以很容易地被氧化或脱氢修饰，而辛烯、月桂烯、萜烯和柠檬烯是由TPS-b亚家族酶产生的。因此，陈年葡萄酒香气的差异可能与这些挥发性化合物的产生有关。

几种与香味有关的挥发物的浓度超过了成熟葡萄的感官阈值，如芳樟醇、香叶醇、月桂烯和香叶醇独联体——升至氧化物。这一结果表明，这些挥发物在很大程度上有助于葡萄浆果的芳香属性1:表S1C)。此外，一些苷类，如橙花醇、芳樟醇和香叶醇，也达到了各自的阈值，可能有助于葡萄酒的芳香特征(附加文件)1:表S1C)。在商品成熟期(E-L38)， CL和GT地区的葡萄中可能有香气贡献的化合物水平不同，从而产生不同的芳香感觉。

葡萄中萜烯合成相关基因的表达谱

我们首先研究了萜烯前体的生物合成途径。基于RNA-seq数据，我们量化了MVA和MEP途径所需基因的转录丰度，以及编码异戊二烯基二磷酸合成酶、香叶基二磷酸合成酶(GPPS)、法尼基二磷酸合成酶(FPPS)和香叶基香叶基二磷酸合成酶(GGPPS)的基因。如图所示。52010 - 2011年，这些基因在葡萄中的发育表达模式相似。

MEP途径为单萜和下游类胡萝卜素的合成提供前体(IPP和DMAPP)。MEP途径由七种叶绿体定位酶组成[26，50]，其中6个转录本在我们的实验中分别在4个发育阶段表达。大部分基因在发育早期高度表达(E-L31)，并在随后的过程中保持一定的表达水平(图2)。5 b)。这两个VviDXS和VviDXR在葡萄成熟过程中呈下降趋势。DXSs是葡萄单萜合成的主要调控因子之一[j]。35]，其中VviDXS (XM_002277883.2)是葡萄中最重要的同工酶。在这项研究中，VviDXS在CL和gt生产的葡萄中，转录本积累没有统计学上的显著差异。此外，的表达VviDXSL4(XM_002266889.2)在E-L35期与CL区相比，GT区葡萄中表达量显著上调，且与单萜烯的产生并不平行。因此,VviDXS不应该是造成CL和GT区域单萜烯产生差异的关键基因。相比之下,VviHDR(XM_002284623.2, MEP通路的最后一个酶)可能是一个显性参与基因。如图所示。5度的表达VviHDR随着葡萄发育的进行，单萜烯含量增加，其中cl型葡萄的增量远大于gt型葡萄，这与在两个产区和两个年份观察到的单萜烯积累高度平行。的表达式VviGPPS(XM_002268193.2)的丰度随浆果成熟略有增加，但两区域间的丰度差异无统计学意义。

IPP和DMAPP也通过细胞质MVA途径产生。该途径由六种酶组成，在四个发育阶段的每一个阶段都观察到所有转录本。除了编码乙酰辅酶a乙酰转移酶的两个转录本(AACT, XM_002265654.2和XM_003635348.1)外，其余四个转录本随浆果成熟呈下降趋势。例如，在浆果发育过程中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)和FPP合成酶的三种转录物中，有两种转录物的编码量普遍下降。HMGR是MVA途径中的一种限速酶[51，52]。然而，在这项研究中，这三个VviHMGRs在E-L35(附加文件)上，GT区域的果实中表达量高于CL区域1(表S2)，而在这一阶段的浆果中只鉴定出少数倍半萜化合物，表明VviHMGRs与细胞质中倍半萜的产生不完全相关。

VviTPSs是一个大的基因家族，负责将GPPS转化为各种萜烯。目前有67个VviTPS从我们的RNA-seq数据中鉴定出等基因。根据序列的同源性对其进行了功能表征支持在NCBI nr数据库中，这些基因被分为TPS-a、TPS-b和TPS-g亚家族。聚类分析用于鉴定具有相似表达模式的基因。倍半萜烯是通过法尼酯焦磷酸(FPP)的TPS-a亚家族成员产生的，FPP是通过细胞质中的MVA途径形成的。我们鉴定了20个编码推测的TPS-a酶的转录本，其中一些被NCBI注释为类似价合酶、类似芽胞烯合酶或(E) -beta-caryophyllene合成酶。然而，在我们的分析中，20个TPS-a转录本中有10个仅在葡萄的一个或两个发育阶段被检测到，因此没有被分配到热图集群中。其他10个转录本在所有四个发育阶段均表现出可检测的水平(表1)1)。在这10个转录本中，4个主要在幼龄浆果中表达(HM807374.1 (NM_001281275.1)、XM_002263544.2、NM_001281284.1和JF808010.1)，而其他6个基因在成熟浆果中特异性表达(XM_002283034.1、HM807380.1、NM_001281095.1、NM_001281043.1、NM_001281134.1和NM_001281286.1)。6)。编码germacrene D合成酶的基因(NM_001281134.1/ HM807377.1)在葡萄成熟过程中表达呈上升趋势。(+)-价合酶(NM_001281286.1, AY561843.1/FJ696653.1，VviValCS)是倍半萜生物合成的关键酶，对芳香白葡萄和非芳香葡萄品种的芳香挥发物的产生都有重要贡献[j]。40，53]。虽然VviValCS在本研究的成熟浆果中有高表达水平，相应的浆果中没有检测到倍半萜。相比之下，只有少数倍半萜，如α-茂烯，α-钙蜡烯和雪松醇，在绿色浆果中被定性鉴定(它们无法量化，数据未显示)。根据转录物丰度与代谢物浓度的不一致，推测Vvi在该葡萄品种中，ValCS与倍半萜的产生无关。生化意义高VviValCS成熟浆果的转录水平也将是我们未来研究中正在进行的调查问题。

单萜烯是由TPS-b和TPS-g亚家族的成员产生的1)。在25个推测的TPS-b基因中(表2)1)，目前的NCBI RefSeq mRNA数据库(更新日期:2014-12-10)中缺少7个基因，并在以下分析中被排除。在剩下的18个基因中，有8个基因在本研究中仅在一两个阶段被检测到，而其他10个基因在整个葡萄发育过程中都表现出可检测的表达水平(表1)1)。其中8个转录本(XM_002275070.2、XM_002267417.1、XM_003634850.1、HM807382.1、HM807383.1、NM_001281170.1、NM_001281238.1和NM_001281080.1)在葡萄发育过程中呈下降趋势;E)- β -辛烯合成酶(NM_001281016.1 in NCBI/ HM807386 in Martin等，[39])主要在成熟葡萄中表达。在e - l38期，与CL区相比，GT区浆果中该基因的表达上调(图2)。6 b)，这是不符合ocimene积累。目前的结果也与另一份报告[42]。因此，(E)- β -辛烯合成酶(NM_001281016.1)可能在很大程度上影响了两个研究区域辛烯的生产。另一个转录编码(E)- β -辛烯合成酶(NM_001281259.1 in NCBI, HM807385 in Martin等。[39])在两个年份来自两个地区的葡萄中表现出不同的表达模式。该基因在GT葡萄中的表达在两个年份均呈上升趋势。在CL葡萄中，从e - l31到e - l36的表达量呈上升趋势，随后在2010年份的e - l38处表达量下降，而转录本仅在2011年份的e - l31处检测到(图1)。6 b)。因此，我们推测该基因的表达与成熟浆果中新烯的产生没有密切的关系。基于发育表达模式，两种α-松油醇合成酶VviTer1 (AY572986.1)和VviTer2 (AY572987.1)也被认为与单萜烯积累无关，因为它们的表达水平较低，仅在几个阶段被检测到。相反，两个标记为α -松油醇合成酶(XM_002267417.2)和月桂烯合成酶(XM_003634850.1)的转录本表现出较高的丰度(XM_002267417.2, RPKM > 900;XM_003634850.1, RPKM > 5800)。因此，我们推断这两种月桂烯合酶参与了该葡萄品种单萜烯的高积累。

21个转录本被归为TPS-g亚家族(表2)1)。其中6个已从当前RefSeq mRNA数据库(2014-12-10更新)中删除。这个亚家族的tps只产生无环萜烯醇。10TPS-gMartin等人对基因进行了生物化学表征。[42]。这些功能已知的TPS-g5个基因(HQ326231.1、HM807392.1、HM807393.1、HM807394.1和XM_003635234.2)随着浆果成熟的进行转录产物产量呈下降趋势(图2)。6)，这与该品种中游离单萜醇的积累不一致。这一结果也验证了之前的发现，大多数的表达支持与葡萄果实中萜烯挥发物的产生并不完全相关[54，55]。在翻译水平上可能存在调控，如蛋白质量、酶活性或翻译后修饰。值得注意的是，在已被证明负责芳樟醇合成的七个基因中在体外(39),只VviPNLinNer1(HM807391.1)的表达随浆果发育呈上升趋势(图2)。6 b)，这与芳樟醇的积累是平行的(图2)。4 b)。在Moscato Bianco葡萄(马斯喀特品种)中，VviPNLinNer1也表现出类似的发育表达模式[42]。的表达趋势VviPNLinNer12011年gt生产的浆果有很大不同。关于两个地区之间的比较，的表达VviPNLinNer1与CL葡萄相比，GT葡萄在E-L38阶段的表达上调了约2.5倍(附加文件)1(表S2)，而GT成熟葡萄中芳樟醇的浓度明显较低(图2)。4 b)。显然，这两个地区的葡萄中芳樟醇积累的差异并不仅仅取决于该基因的表达。VviCSLinNer(HM807393.1)在E-L31期高表达，随后迅速下降(图2)。6 b)。在e - l31期，该基因在CL葡萄中的转录丰度比GT葡萄高近4倍(附加文件)1:表S2)当CL葡萄具有较高浓度的结合芳樟醇(附加文件1:表S1B)。这意味着的表达式VviCSLinNer可能与地区有关。Zhu等人也观察到VviCSLinNer在Gewurztraminer葡萄发育早期高度表达[56]。相比之下，Martin等人观察到VviCSLinNer在葡萄品种中有一个表达高峰[11]。在我们的研究中，有三个基因编码香叶醇合成酶:VviCSGer(HQ326231.1),VviGwGer(HM807398.1),VviPNGer(HM807399.1)也在绿色期唯一表达(E-L31和E-L35)，表明这些基因的表达具有发育特异性。

此外，目前NCBI标记为神经醇合成酶的5个基因(XM_003635120.1、XM_003635129.1、XM_003635234.1、XM_003635365.1和XM_003635343.1)和2个转录本(XM_003635129.1和XM_003635343.1)的表达量随着葡萄果实的发育而增加，其中一个转录本(XM_003635129.1)在GT区浆果中的表达量高于CL区。另一个转录本(XM_003635234.1)在CL区浆果中的水平高于GT区，这表明两个区域的神经樟醇积累应该在很大程度上依赖于该基因的表达。

与单萜醇糖基转移酶相对应的基因

Monoterpenolβ- d -葡萄糖基转移酶(GTs)负责将游离萜烯转化为其糖苷结合形式。对于酿酒葡萄来说，这种酶尤其重要，因为葡萄中自由形式的单萜烯一旦生产出来就很容易散发到大气中，而糖苷结合的单萜烯(葡萄中挥发物的一种储存形式)的水平实际上反映了葡萄和葡萄酒的潜在芳香品质。gt是一个尚未被清楚了解的大基因家族。最近,monoterpenolβ- d -葡萄糖基转移酶(GTs)已从不同葡萄品种中分离出来并进行了生化鉴定;它们对香叶醇、橙醇和香茅醇表现出很高的活性，并有助于在葡萄成熟过程中产生它们的糖苷[43，44]。在这项研究中，VviUGT88A1L3（VviGT7在Bönisch等，[43])对于同一地区生产的葡萄，在两个年份中表现出相似的表达趋势，也是如此VviUGT85A2L4（VviGT14在Bönisch等，[44)(图7)。至于CL地区的葡萄，VviUGT88A1L3（VviGT7其中，XM_002276510.2)在豌豆期(E-L31)表达量高，远高于GT葡萄，从E-L31到e - l35(2010年份)或e - l36(2011年份)表达量急剧下降，随后在E-L38期表达量增加。这种表达模式与在其他马斯喀特葡萄中观察到的一致[43]。该基因的累积表达量与香叶苷和奈叶苷浓度呈正相关(附加文件)1表S3)。此外，的表达VviUGT88A1L3在e - l31阶段，CL区相对于GT区高度上调。VviUGT88A1L3在葡萄成熟过程中，这种表达可能与香叶苷和奈叶苷的积累有关。VviUGT85A2L4（VviGT14在E-L 31 ~ E-L 36期，XM_002285734.2)的表达普遍增加，在E-L 38期表达减少，而在GT区，随着葡萄果实的发育，XM_002285734.2)的表达逐渐增加。该基因的表达在含cl的葡萄中比含gt的葡萄显著上调。根据在两个地区和两个年份的葡萄中获得的数据，表达VviUGT85A2L4与白麝香葡萄果实中香叶苷、奈叶苷和芳樟苷含量呈极显著正相关(r分别为0.93、0.94、0.86);p< 0.05;额外的文件1表S3)。从显著的差异VviUGT85A2L4两个地区的浆果之间的转录丰度，可以推断VviUGT85A2L4可能是环境诱导的，并且糖苷结合的香叶基和神经基在区域之间的差异积累在很大程度上取决于该基因的表达。的表达式VviUGT88A1L4（VviGT15除了2011年份GT葡萄在e - l35期的表达量高于e - l31期外，其在发育果实中的表达量逐渐降低。此外，该基因在区域之间的转录丰度没有显着差异。因此，人们认为VviUGT88A1L4与两个区域的糖苷结合萜烯的差异积累无关。至于VviUGT85A2L5（VviGT16(XM_002263122.1)，本研究未检测到其转录本。Bönisch和他的同事也发现VviUGT85A2L5很少参与这些化合物的糖基化葡萄葡萄(44]。

确定额外的候选人Vvi在葡萄果实中参与糖苷结合萜烯合成的UGTs，我们采用K均值聚类分析对147个基因的表达谱进行了聚类VviUGTs与我们的RNA-seq数据中的udp -糖基转移酶(UGTs)相对应(附加文件2:图S1)。总共32个VviUGTs在集群1、2和3中，与糖苷结合萜烯的产生平行，表达呈上升趋势(附加文件2:图S1A，所选基因的详细信息在附加文件中提供1(表S4A)。根据这147个品种的氨基酸序列，建立了系统发育树Vviugt。这些基因被分成几个组(附加文件2:图S1B，所选基因的详细信息见附加文件1:表S4B)。24个序列与已知的萜烯gt (VviGT7/ VviGT14/ VviGT15/ VviGT16)高度相似。将K均值分析结果与序列相似性分析结果相结合;我们推测这四个转录本应该是假定的单萜醇糖基转移酶。根据Grimplet等人推荐的葡萄基因命名系统[57]，它们被命名为VviUGT88A1L1(XM_002276679.2),VviUGT86年a1l (XM_002276822.1),VviUGT85A1L1(XM_002285742.2)和VviUGT85A1L3(XM_002268601.2)。随着葡萄的成熟，这四个基因的表达都在增加。的成绩单积累VviUGT85A1L1和VviUGT88A1L1与白麝香葡萄果实中香叶基、橙叶基和亚芳酰糖苷的产量呈正相关(附加文件1表S3)。此外,VviUGT85A1L1在E-L36期CL区相对于GT区表达上调，这与香叶基、橙叶基和芳樟基苷在浆果中的积累一致。因此，表达式VviUGT85A1L1可能与这些结合化合物在两个区域的不同积累有关。进一步的生化表征是必要的，以更好地了解这些假定的糖基转移酶的机制。

综上所述，基于转录物积累与最终代谢物产生之间的关联，我们确定了一些基因可能主导了CL和GT区域自由形态和/或糖苷结合单萜烯的差异积累，例如VviHDR(XM_002284623.2), VviCSLinNer(HM807393.1)，神经醇合成酶基因(XM_003635234.1);VviGT14(XM_002285734.2)和VviUGT85A1L1(XM_002285742.2)。不考虑年份的影响，这些基因在不同地区之间的表达都有显著差异。此外，还鉴定了其他区域差异表达基因(deg)，包括VviDXS5(XM_002266889.2),三个VviHMGR8 .基因(XM_002265602.1, XM_002283147.2和XM_002275791.2)VviTPSs。然而，它们转录本的积累与最终萜烯代谢物的产生没有强烈的正相关关系。

转录因子共表达网络分析(TFs)和差异表达基因(DEGs)

为了确定调节这些deg的潜在转录因子(TFs)，我们对各种基因表达水平之间的相关性进行了网络分析TFs和deg。基于葡萄基因组的注释，我们首先从数据库中选择了725个不同类别的转录因子(tf)。对每一对变量(结构基因vs.基因)计算Pearson相关系数。TFs)在不同的发展阶段。度和TFs将相关系数较高(绝对值> 0.8)的数据用一条线连接，构成相关网络模块。DEGs与的共表达TFs另见图。8。

近年来，一些MYC、WRKY、AP2、AP2/ERF和MYB家族的tf被报道参与了其他植物萜类合成基因的转录调控，如Catharanthus roseus也叫，拟南芥和茄属植物lycopersicum毛状体(58- - - - - -62]。这些已鉴定的tf大多控制倍半萜合成酶基因的启动子。在本研究中，这些TF家族的一些成员也与deg正或负共表达，包括不仅参与MEP和MVA途径的基因，还参与游离和糖苷结合单萜合成的基因。例如AP2/ERF/B3 (XM_002276456.1)与VviDXSL4(XM_002266889.2),VviHMGRs(XM_002265602.1和XM_002275791.2)和VviPNaPin(HM807384.1)转录产物积累系数分别为0.84、0.90、0.80、0.87(附加文件1表S5);HMGR是倍半萜类生物合成途径中的一种酶。5)。在青蒿AP2/ERF家族的两个转录因子(ERF1和ERF2)上调amphaa -4,11-二烯合成酶(倍半萜合成酶)基因的表达[60]。此外，我们观察到乙烯响应的TF (XM_002267364.1，VviCRF4)， 6个AP2/ erf, 45个erf, 4个myc, 20个WRKYs和9个myb与几个高度共表达VviTPSs,如VviCSLinNer(HM807393.1)和神经元醇合酶样基因(NM_001280966.1/HM807396.1)(附加文件1(表S5)，提示这些tf可能潜在地激活上述结构基因的启动子。

最近在葡萄中发现的单萜醇糖基转移酶(GTs)的转录调控尚不清楚。这种共表达网络分析显示，许多TFs与转录物积累呈强烈负相关VviUGT85A2L4（VviGT14)另外两个糖基转移酶基因，VviUGT85A1L1(XM_002285742.2)和VviUGT85A1L3(XM_002268601.2)(图。8)。这些潜在的tf包括bHLH, HD-Zip, GATA, NF-YC, NF-YB家族的成员，这些家族对光有反应[63，64]。值得注意的是,VviERF3L (XM_002285337.1),VviGATA5L (XM_002272726.1)Vvigt - 2l (XM_002266159.1，一个三螺旋TF)，与VviUGT85A2L4（VviGT14)。随着葡萄的成熟，三螺旋TF (XM_002266159.1)转录物逐渐积累，并响应糖苷结合单萜的产生。在Kaplan-Levy和他的同事们的工作中，发现三螺旋家族tf对光线、压力和发育有反应[65]。基于我们目前的发现，我们认为三螺旋TF (XM_002266159.1，Vvigt - 2l)可能参与糖苷结合单萜的生物合成调控。此外，一个MYB TF (XM_002265012.1，VviMYBA2)，两个WERK tf (XM_002277846.2和XM_002284930.1)和两个ERF tf (XM_002285337.1和XM_002263269.2)也与VviGT1,相关系数约为0.7。

基于这种共表达分析，预测了一些tf的功能。例如,VviCAMTA4L(XM_002270829.2，钙调素结合TF)与VviDXSL4(XM_002266889.2),VviHMGR1 (XM_002265602.1),VviHMGR2(XM_002275791.2),VviPNaPin(HM807384.1)，但与VviHDR(附加文件1表5)。CAMTAs(钙调素结合转录因子)将环境线索与植物激素依赖性生长反应联系起来。拟南芥camta受生物和非生物胁迫诱导，对热胁迫、冷胁迫、高盐度、干旱、紫外线辐射、机械损伤、植物激素(乙烯和ABA)和信号激发剂(如茉莉酸甲酯(MJ)和水杨酸(SA))的反应不同且迅速(在15分钟内)[66，67]。这项研究还揭示了VviCAMTA4可以在转录水平上响应CL和GT地区的不同气候，调控单萜合成相关基因的表达。此外，热休克转录因子(Hsf)已被证明参与浆果热反应的调节[68]。在本研究中，Hsf家族的5个成员也表现出高共表达VviPNLinNer1和VviCSLinNer2个神经元醇合成酶样基因(NM_001280966.1/HM807396.1;XM_003635234.1)。最近，PIF5，一种基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子，被发现可以调节MEP通路基因的转录，并作为ipp代谢增强剂发挥作用[j]。69]。在目前的预测中，PIF3 (XM_002276162.2)和PIF1 (XM_002263361.2)均与VviCSLinNer(HM807393.1),VviNerL8(XM_003635234.1)和VviPNaPin(HM807384.1)。因此，PIFs(如PIF3和PIF1)也可能参与了葡萄萜烯生物合成下游途径的调控。

为了进一步了解哪些TFs可能有助于萜烯的区域差异积累，我们鉴定了差异表达的TFsTFs在两个地区处于同一发育阶段的葡萄中。结果表明，葡萄在四个发育阶段有不同的候选tf(附加文件)1表6)。在e - l31和e - l38阶段，除了编码同源盒亮氨酸拉链蛋白hox3样(XM_002280613.2)的基因外，其他候选基因TFs所有这些基因在GT区葡萄中的表达水平都显著低于在CL区葡萄中的表达水平，并且与DEGs共表达呈阳性(附加文件)1表6)。相反，在E-L 34和El-35级，大多数候选TFs与GT葡萄相比，在cl产葡萄中转录上调。值得注意的是，HD-zip (XM_002271656.2，一种同源结构域相关亮氨酸拉链蛋白)与两者呈负相关VviHDR和VviUGT85A2L4（VviGT14)水平，但在e - l35期，GT区葡萄相对于CL区葡萄的转录本积累显著上调。HD-Zip蛋白被认为是激活对改变环境条件的发育反应的重要候选者[70，71]。因此，HD-zip (XM_002271656.2)有可能控制的表达式VviHDR和VviUGT85A2L4（VviGT14)深刻影响GT和CL区域萜烯的差异生产。

我们的基因共表达网络分析为预测潜在的转录因子提供了可能。然而，还需要进一步的实验来验证这些推测的TFs是否能激活葡萄中萜烯生物合成途径中结构基因的启动子。从其他植物中转录调控的充分研究案例，如Catharanthus roseus也叫和拟南芥，已经清楚地表明，转录调控通常涉及一个tf网络。目前的网络分析为葡萄果实萜类生物合成调控提供了一些研究思路。

成熟激素相关基因及其共表达网络

脱落酸(ABA)和乙烯都被证明对葡萄生长环境有反应，并触发葡萄果实成熟[j]。72- - - - - -74]。中国葡萄种植者注意到，中国西部GT产区的葡萄果实在变熟和成熟阶段的持续时间普遍较东部CL产区的短，如表所示2。在此，我们关注的基因参与生物合成和信号反应的ABA/乙烯。根据本研究的RNA-seq数据，我们在GT和CL区域对应的某个物候阶段鉴定出差异表达基因(DEGs)(附加文件)1表S7)。这些基因大部分在GT区葡萄果实的e - l31和e - l35期转录上调，表明GT区葡萄成熟开始早于CL区。例如，一些与ABA生物合成/反应相关的基因在两个区域之间存在差异表达。植物烯合成酶(XM_002271539.2;VviPSY)和辣椒素/capsorubin合成酶(XM_002273826.1)是ABA生物合成的两个关键酶。这两个基因和两个aba应答转录本(XM_003631566.1, XM_002280159.1)的表达在版本开始时在GT区显著上调(E-L 35)(附加文件)1表S7)。同样，在e - l35期，与CL区相比，GT区浆果中乙烯生物合成/信号响应所需的许多基因的表达量也显著高于CL区。先前的一份报告显示，乙烯主要是在“赤霞珠”浆果中产生的。[74]。最近的另一项研究也发现乙烯参与了触发浆果成熟的过程，在马斯喀特汉堡浆果中乙烯峰值先于ABA峰值[75]。在中国西部GT地区，葡萄果实的品种和成熟期较短(见表2)2)可以通过在GT和CL区域观察到的ABA和乙烯相关转录组的差异来解释。此外，ABA也是一种应激刺激信号，这种激素在浆果中迅速积累，以应对缺水和低温[18，76]。与CL区相比，GT区雨量少，日照强，昼夜温差大(表1)2)，可以促进ABA、乙烯相关基因等成熟相关基因的表达，从而加快浆果成熟进程。

为了探究葡萄成熟速度对萜烯积累的影响，我们构建了共表达网络，可视化了三类基因之间的相关性。第一类包括VviHDR和VviUGT85A2L4（VviGT14)。基于基因转录丰度与萜烯浓度高度正相关，提出VviHDR和VviUGT85A2L4（VviGT14)可能主导葡萄中萜烯的区域差异积累。第二组由TF基因组成，与两者均有较高的相关系数(≥0.8|)VviHDR和VviUGT85A2L4（VviGT14)。第三个由ABA/乙烯相关基因组成(图2)。8 b)。7个TFs与两者呈显著负相关VviHDR和VviUGT85A2L4（VviGT14)。这些TF编码为XM_002275675.2 (ICE1-like TF)， XM_002263123.2 (TF HBP-1b(c1))， XM_002270325.2 (GATA TF)， XM_002271656.2 (Zip家族TF)， XM_002283521.2 (IIE亚单元2)，XM_002284806.2 (NF-YB8 TF)和XM_002284815.2 (NF-YC9 TF)。XM_002275675.2 (ice1样TF)和XM_00227165.2 (Zip家族TF)基因与ABA/乙烯相关基因在转录物积累方面呈正相关。因此，葡萄成熟加速可能会导致萜烯生物合成途径中关键基因的下调，最终导致代谢物产量减少。下面的相关性也支持了这一建议。编码XM_002285337.1 (ERF003)、XM_002266159.1(三螺旋转录因子GT-2)和XM_002272726.1 (GATA转录因子5)的三个tf与之正相关VviHDR和VviUGT85A2L4（VviGT14)，相关系数大于0.78。XM_002285337.1的转录本(ERF003)与4个ABA生物合成/应答相关转录本和1个乙烯应答相关转录本(XM_002281384.2)的积累呈负相关。此外，XM_002266159.1(三螺旋转录因子GT-2)与乙烯应答转录因子1B (XM_002264487.1)呈负相关。

研究人员此前曾报道游离单萜烯和糖苷结合单萜烯的积累与葡萄成熟度密切相关[2，8，15，77]。此外，萜烯的浓度受生长条件和气候的影响很大[17，78，79]。本研究观察到，2010年和2011年期间，萜类化合物的浓度有所变化，但两年间GT区浆果中游离萜和糖苷结合萜的浓度均低于CL区。因此，我们推断，GT地区葡萄生长季节的特定气候条件(如极端干旱)通过刺激一系列成熟相关的线索，如成熟相关基因的转录激活，加速了葡萄果实的成熟过程，而后者将调控因子和萜烯生物合成相关基因级联，最终限制了萜烯挥发物的产生。

实时定量PCR

为了验证从RNA-seq中获得的表达谱，我们对与萜烯生物合成相关的9个重要基因进行了qRT-PCR，包括VviUGT85A2L4（VviGT14)，VviUGT88A1L3（VviGT7)，VviGPPS，VviFPPS，VviPNLNGL1，VviCSLin /尼珥，VviPLG1，VviNCED1和VviNCED2。三个内参基因(VviUbiquitin，VviActin和VviGADPH)。基于RPKM值的这些基因的表达水平与qRT-PCR (R)测定的表达水平有很好的相关性²> 0.7, Pearson相关)(附加文件2:图S2)。这一结果证明了RNA-seq分析的可靠性。

本研究表明，在“小粒白麝香”葡萄的发育过程中，游离萜和糖苷结合萜的含量都有所增加。从RNA-seq数据中鉴定出转录积累模式与萜烯挥发物产生一致的基因，如VviHDR和VviUGT85A2L4（VviGT14)。CL区果实中萜烯的含量，尤其是其糖苷结合形式的萜烯含量显著高于GT区。两个地区和两年间果实中苷结合单萜积累的差异与基因的表达密切相关VviUGT85A2L4（VviGT14)，它编码一种单萜醇糖基转移酶。假设的TFs调节VviUGT85A2L4（VviGT14)，通过共表达网络分析鉴定Vvi发现GT-2 L (XM_002266159.1，一个三螺旋TF)与表达高度相关VviGT14。在变异起始阶段(E-L35)， GT区浆果中ABA和乙烯的生物合成和信号转导所需的许多基因在转录水平上相对于CL区上调。基于基因共表达网络分析，构建了区域气候、成熟相关激素的产生、浆果成熟加速以及萜类生物合成相关基因和潜在转录因子表达的级联过程，解释了两地区浆果萜类差异积累的机制。虽然需要更多的证据来验证本文预测的级联联系，但本研究通过转录物和代谢物的联合分析，提出了两个区域差异萜烯积累的一些关键基因。本研究为进一步研究麝香型葡萄品种萜类生物合成调控提供了一个切入点。这些基因和转录因子可能被证明是葡萄芳香改良和/或生物技术工业兴趣的有用靶标。

取样位置

“白麝香葡萄小粒”(葡萄白葡萄(L. Muscat blanc)是一种白葡萄品种，成熟的浆果以其独特的麝香葡萄香气而闻名。本研究以甘肃省GT区(北纬39°14′，东经99°84′)和河北省CL区(北纬39°72′，东经119°15′)的葡萄园为研究对象。这两个地区的主要地理和气候资料载于附加文件1表S8。总体而言，与GT区相比，CL区在葡萄生长季的月平均有效积温和总有效积温相对较高。而GT区日照时数明显偏多，降水偏少。

葡萄材料

在这两个地区中的任何一个，都选择了一个大约200公顷的葡萄园进行这项研究。所研究的葡萄园的葡萄分别于2001年(GT)和2006年(CL)从切茎种植。这些葡萄藤都采用垂直茎位(VSP)，排列成南北方向的行，间隔2.0 m，每行两株植株之间的距离约为1.0 m。葡萄园的管理是按照当地酿酒葡萄种植的做法。在试验期间，在研究的葡萄园进行了类似的病虫害管理和施肥。树冠操作都是根据藤蔓生长情况手动进行的。每棵葡萄藤都有一个主葡萄藤，有10-12个果枝。所有的田间工作都得到了葡萄园经理的许可。每个葡萄园分为两个生物群落进行葡萄取样。在这两个葡萄园中，2010年和2011年在相同的葡萄藤上进行了采样。 Grape berries were collected at four time points: (1) pea-size berries (E-L stage 31), (2) berries beginning to color and enlarge (E-L stage 35), (3) berries with intermediate Brix values (E-L stage 36), and (4) ripe/harvest stage (E-L stage 38), respectively, with two repeats. The E-L stages were determined as described by Coombe [80]。为了获得代表葡萄园种群的样本，在每个阶段，从每个地块至少200棵葡萄藤中随机抽取大约1000个浆果。任何身体受伤、异常或感染的浆果都被排除在外。采样时间为上午10:00-11:00。将样品装入Ziplack袋中，放入泡沫冰盒中，在2小时内运至实验站，在液氮中快速冷冻，并保持在- 80℃。然后将这些样品以冷冻状态运回实验室，并在每个年份结束时收集所有样本，总计32个样本，包括两个地区在两年内四个发育阶段的两个生物重复。

理化分析

对于每个样品，大约50克事先去籽的浆果在液氮中均质。匀浆用于分析总可溶性固形物(TSS)、可滴定酸度(TA)和pH值。TSS用自动温度补偿数字折射仪(Pocket refrtometer Pal-1, Atago, Japan)测定，结果用°Brix表示。TA和pH值使用电位滴定器PB-10 (Sartorius，德国)测定。用50ml去离子水稀释5ml透明果汁样品，然后测定可滴定酸度。在pH = 8.2的终点滴定中加入0.05 mol/L的NaOH，根据NaOH消耗体积计算TA。TA的含量用苹果酸的当量表示。对每个样品进行重复测量。

游离和糖苷结合的挥发性化合物的提取

50个冷冻的没有种子的葡萄浆果在液氮中粉碎成粉末。4℃浸渍120 min后，6000℃离心×g取5 mL上清液与1 g NaCl和10 μL 4-甲基-2-戊醇(4M2P, 1.0018 g/L为内标)混合，取15 mL样品瓶。根据我们前期的研究，利用顶空SPME对制备样品中的游离挥发物进行提取和浓缩[81，82]。每个样品进行三次独立提取。

结合的芳香族化合物通过Cleanert PEP-SPE树脂(Bonna-agela Technologies, China, 200 mg/6 mL)吸附分离，事先用甲醇和水(各10 mL)调节。5毫升清汁通过Cleanert PEP-SPE柱。水溶性化合物用5ml水洗脱，游离挥发物用10ml二氯甲烷洗脱，芳香前体用20ml甲醇洗脱。流速约为2ml /min。甲醇洗脱液在真空下用旋转蒸发器浓缩至干燥，再溶解于5ml 2mol /L柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 5.0)中。随后，将100 μL AR 2000 (Rapidase, DSM Food Specialties, France)溶液(100 mg/mL，在2 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH 5.0)加入到糖苷提取物中，并进行搅拌。在最佳条件下进行酶解。将含有混合物的试管密封，置于培养箱中，在40°C下放置16 h，以释放游离挥发物。所得的游离挥发物按上述SPME法提取。

气相色谱条件

挥发性分析采用Agilent 7890 N气相色谱仪与5975C质谱联用(Agilent Technologies, Santa Clara, california, USA)，并配以60 m × 0.25 mm id、0.25 μm膜厚的惠普- innowax毛细管柱(J&W Scientific, Folsom, CA, USA)。载气(氦气)流速为1 ml/min，将SPME提取物以无分裂方式注入气相色谱口。操作条件:进样器，250℃;离子源，230℃;接口，280℃。温度程序从50°C(保持1分钟)到220°C(保持3°C /分钟)，并在220°C保持5分钟。在相同的色谱条件下分析C6-C24正烷烃系列(Supelco, Bellefonte, PA, USA)后计算保留指数。根据NIST05标准库的质谱匹配和实验室参考标准品的保留度指标进行鉴定。当没有参考标准品时，根据标准的NIST05文库并与文献中报告的保留指数进行比较，进行初步鉴定(附加文件)1表S9)。

RNA文库构建及测序

从一个1000个浆果的生物复制中随机选择大约50个浆果进行RNA提取。使用植物RNA分离试剂盒(Sigma RT-250, St. Louis, MO, USA)从冷冻无籽葡萄浆果中分离总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性。使用Qubit 2.0荧光RNA测定试剂盒(Invitrogen Inc.)评估RNA的数量和质量。美国)和Agilent 2100生物分析仪RNA 6000纳米试剂盒(Agilent，美国)。基因表达样品准备试剂盒(IlluminaInc;根据制造商的方案，使用San Diego, CA, USA)进行序列标签制备，Zhong等人也对此进行了很好的描述。[83]。根据冷泉港协议，使用10 μg总RNA构建了约200 bp片段的链特异性RNA-seq文库[83]。

本研究共构建了24个RNA-seq文库用于RNA-seq分析，其中4个文库对应两个年份GT和CL区e - l31期葡萄，8个文库对应E-L35期葡萄，4个文库对应e - l36期葡萄，8个文库对应e - l38期葡萄。也就是说，无论是E-L31期还是E-L36期的葡萄，由于获得的优质RNA数量较少，每年每个地区只获得一个RNA-seq文库，而E-L35期和E-L38期的葡萄每年都获得了两个文库。每个文库中具有不同引物的等量dsDNA被合并到两个单独的池中。测序在美国康奈尔大学生命科学核心实验室中心的Illumina HiSeq2000仪器上进行。测序数据存入NCBI Sequence Read Archive (SRA)序列数据库，登录号为SRP061365。

Illumina序列读取图谱

Clean reads被映射到参考序列核苷酸集合(葡萄RefSeq mRNAs，由23,720个带注释的转录本组成)，检索自国家生物技术信息中心(http://ncbi.nlm.nih.gov)，使用CLC基因组工作台(CLC bio, Boston, USA)进行注释。考虑到文献中tps的注释不完整葡萄RefSeq数据库中，tps的mRNA序列从CRIBI (http://genomes.cribi.unipd.it/grape/)，它由106个带注释的转录本组成，这些转录本构成了我们映射的第二个参考数据集。

在转录组作图之前，从每个序列读取的两端裁剪两个核苷酸。长度小于60个核苷酸或大于两个不明确核苷酸的reads在作图或计数中被排除。在本实验中，我们使用默认映射参数运行程序集，允许最多两次不匹配和最多10次读取命中。基因表达水平由RPKM(每外显子千碱基每百万序列读取的读取数)值表示[84]。当读取可以映射到多个参考位置时，根据先前映射到每个参考序列的唯一读取的相对数量，将它们按比例分配给参考转录本。

基因差异表达分析

在葡萄果实发育过程中，基因表达水平被归一化，并在组装和聚类过程中以每kb每百万reads (RPKM)值计算。这些数据已存入NCBI Gene ExpressionOmnibus (GEO)数据库，可通过GEO登录GSE71146访问。使用p值来评估差异转录物丰度的真实性。采用bonferroni校正p值控制多重检验中的错误发现率(FDR)。以FDR≤0.05且绝对值log2-Ratio≥1作为判断两样本间基因表达差异显著性的阈值。未在其中一个样本中识别的基因的默认值(读取数)为1。

cDNA合成及实时荧光定量PCR分析

采用SuperScript第一链合成系统(Promaga, Madison, Wisconsin, USA)，用5微克的总RNA合成第一链cDNA。使用2微升cDNA (100 ng/μL)进行qRT-PCR，使用SYBR Green PCR主液(Takara, Dalian, China)，遵循制造商的协议和ABI Real-time 7300系统(Applied Biosystems)。在两个独立的生物重复上进行qRT-PCR，每个重复包含三个技术重复。使用PerPrimer 2.0版软件设计基因特异性寡核苷酸引物。引物信息可在附加文件中获得1表S10。应用编码GAPDH的三个葡萄内参基因(EC930334)、肌动蛋白(EC969944)和泛素(EC929411)。最终体积为20 μL的PCR溶液由10 μL SYBR®Premix Ex TaqTM和0.5 μL ROX参比染料(50×) (Takara, Dalian, China)、1 μL引物混合物(正向引物和反向引物，10 mM)、4 μL稀释的模板cDNA和4.5 μLddH2O组成。PCR循环条件为:95°C初始变性30 s, 94°C扩增10 s, 60°C扩增31 s, 40次扩增，65°C至95°C进行熔体曲线分析，检测cDNA样品中可能存在的引物二聚体或非特异性扩增。通过琼脂糖凝胶电泳和反应产物测序验证了引物的特异性。目的基因表达量计算采用公式2-∆CT，其中∆CT = CT，目的基因- CT,ref。CT,ref为三个内参基因阈值周期(CTs)的几何平均值。2-∆CT计算后估计平均值和标准导数(SD)。

数据分析工具

采用R软件(2.0版)进行分层聚类分析、热图可视化、K均值聚类和Pearson相关性评价。用Cytoscape软件可视化共表达网络[85]， v2.8.2 (www.cytoscape.org)。单因素方差分析(ANOVA)采用Duncan 's多极差检验在水平上测量挥发性浓度均值之间的差异p< 0.05。数据以平均值±SDs(标准差)表示。采用MEGA5.0(分子进化遗传学分析软件)邻接法构建系统发育树。

支持本文代谢组学结果的数据集包含在本文及其附加文件中。RNA序列数据从Gene Expression Omnibus (GEO)网站下载，登录号为GSE71146http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE71146。

GT:

中国甘肃省高台地区

肤色线:

中国河北省昌黎地区

议员:

2-methyl-D-erythritol-4-phosphate磷酸

MVA:

甲羟戊酸

dx:

1-脱氧- d -木质素糖5-磷酸合酶

HDR:

1-羟基-2-甲基-2-丁烯基4-二磷酸还原酶

TPS:

萜烯合酶

GT:

单萜葡糖基转移酶

TF:

转录因子

度:

差异表达基因

气相:

气相色谱-质谱联用

本研究由高等学校博士点专项科研基金(20120008110021)和国家自然科学基金(31272118，潘庆华)资助。rna测序工作是在美国纽约日内瓦的美国农业部农业研究服务局葡萄遗传学研究单位进行的。

从属关系

1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院葡萄栽培与酿酒研究中心，北京，100083

   温雅琴，高媛，兰一斌，段长青，潘秋红

2. 美国农业部-农业研究服务，葡萄遗传研究单位，日内瓦，纽约，14456，美国

   Gan-Yuan钟

3. 中国农业科学院蜜蜂研究所蜂产品质量监督检测中心，北京100093

   Ya-Qin温

相应的作者

对应到秋鸿锅。

相互竞争的利益

作者们声称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

YQW进行挥发物分析和real-time PCR，分析RNA-seq数据，并撰写论文。YBL和YG对结果进行统计分析和可视化，并为挥发性测定和RNA分离提供帮助。QHP和GYZ进行了RNA-seq分析，并对稿件的编辑和修改提出了建议。CQD在葡萄园样品上设计了实验。所有作者都参与了结果的讨论，审阅了稿件并批准了最终稿件。

作者的信息

不适用。

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