单子叶和双子叶MLO白粉病易感因子在功能上是保守的，尽管进化了类特异性分子特征

背景

植物霉菌遗址O（MLO）蛋白家族的具体成员作为粉状霉菌（PM）的敏感因素，威胁着许多栽培物种的全球蔓延的真菌疾病。以前的研究表明，单子叶床和分子不数MLO易感性蛋白质是系统源性发散的。

方法

遵循一种生物信息化方法，以研究高血管植物MLO易感蛋白的演变类型。对功能分析进行转基因互补试验。

结果

我们的结果表明，单子叶和双子叶MLO易感蛋白进化出了类特异性的保护模式。它们中的许多似乎是负选择的结果，因此可能提供一种适应价值。我们还测试了单子叶和双子叶MLO蛋白之间的不同分子特征是否为PM真菌导致发病所特定需要。为此，我们转化了一个内源性受损的番茄突变体SlMLO1基因，因此抗番茄PM种粉孢子neolycopersici,不同的枣疯病单子叶大麦和双子叶豌豆的易感基因。在这两种情况下，我们都观察到PM症状的恢复。最后，通过组织学观察，我们证明了单子叶和双子叶的易感等位基因枣疯病基因倾向于在植物表皮细胞中渗透未适应的PM真菌物种。

结论

通过这一研究，我们了解了植物的进化和功能枣疯病与PM真菌相互作用的基因。在育种研究方面，我们发现涉及系统发育较远的植物物种的转基因互补分析可以用于新物种的表征枣疯病易感基因。此外，我们还概述了预测在PM易感性中起主要作用的MLO蛋白分子特征。这些都是未来逆向遗传学方法的理想目标，用于在栽培物种中选择功能丧失抗性突变体。

植物阿霉轨迹（枣疯病)含有7个跨膜结构域和一个钙调素结合位点的蛋白质的基因家族代码，拓扑上类似于后生动物和真菌g蛋白偶联受体(GPCRs) [1］．在完成植物基因组测序项目之后，已经确定了许多从12到19种变化的同源物枣疯病二倍体物种的基因家族，即拟南芥、水稻、葡萄、黄瓜、桃子、林地草莓和高粱[1- - - - - -6］．

的特殊同源物枣疯病基因家族充当真菌的敏感因素，导致粉末状霉菌（PM）疾病，全世界蔓延和造成农业环境严重损失。通过功能突变或沉默失活的这些基因，确实导致抵抗（称为-基于抗性)在几种植物中[7］．第一个枣疯病PM发病所需的基因是大麦HvMLO［8，9］．从那时起,枣疯病在水稻(OsMLO3)， 小麦 （TaMLO_A1和TaMLO_B1），拟南芥(ATMLO2.，ATMLO6.和ATMLO12.）， 番茄 （SlMLO1）， 胡椒 （Camlo2.），烟草（ntmlo1.），豌豆（PsMLO1）， 莲花 （LjMLO1)和桶形苜蓿(MtMLO1) ［10- - - - - -17］．

防御机制枣疯病基于耐药性阻止真菌在表皮细胞中的渗透，并与细胞壁贴位(称为乳头)的形成有关[11］．类似的预渗透防御措施也发生在非寄主抗性中，在PM真菌物种和超出寄主范围的植物物种之间的相互作用之后。与参与的假设相一致枣疯病非宿主阻力的基因，功能丧失HvMLO在大麦和小麦PM真菌之间的相互作用中Blumeria Graminis.f . sp。Tritici.与表皮细胞死亡的渗透率降低和降低的表皮细胞死亡率有关，后者是渗透后的防御机制[18，19］．

对MLO蛋白功能相关区域的特性进行了一些研究。多重比对表明，在整个MLO家族中存在高度保守的残基，因此预测这些残基将提供一种常见的蛋白质结构支架[12，20.］．此外，已经报道了在大麦HVMLO推定的原位中特异性保守的残基和基序的发生[9］．最后，通过与部分或完全PM抗性的自然发生和诱导突变的关联推断出MLO易感蛋白的功能重要残留物[11，12，21- - - - - -25］．

在我们之前的研究中，我们发现双子叶植物具有亲缘关系枣疯病同一植物家族的基因由于其作为PM易感基因的功能而被保守[6，16］．值得注意的是，在明显分离的系统发育型切口中，单子叶和二萝氏蛋白蛋白参与PM易感组（例如[2，9])。在这里，我们证明了被子植物PM易感基因的进化导致了类特异性分子性状的固定。其中许多似乎是负面选择的结果。通过转基因互补试验，我们证明，尽管有不同的保护模式，单子叶和双子叶枣疯病在与PM真菌的相互作用中，易感基因在功能特征方面基本上是保守的。讨论了我们的发现对植物育种研究的影响。

被子植物MLO同源物的类特异性分子特征需要PM敏感性

以往的研究表明，双子叶和单子叶MLO蛋白在两个不同的系统发育分支(例如[2，9])。这一点通过一项基于upgma的系统发育分析得到了证实，该分析涉及到所有12个直到最近在功能上与PM易感性相关的MLO同源物(图)。1）.旨在检测负责这种系统发育发散的分子特征，将相同的MLO同源物用作蛋白质多对准的数据集（图。2）.值得注意的是，这导致了41个在单子叶中没有残基而在双子叶中没有残基而在单子叶中没有残基的对齐位置和84个在双子叶中没有残基而在单子叶中没有残基的对齐位置的识别。根据其侧链基团的化学特征(疏水、极性碱性、极性酸性和极性不带电)，在44个排列位置上，类特异性残基被另一类具有不同性质的残基取代。

进化分析支持的类特定分子特征的适应性相关性

为了对导致上述类别的分子特征的进化事件进行推断，我们执行了基于密码子的单似然祖先计数（SLAC）分析，对每个非同义词和同义网站的同义替换的非合成级别的差异（DN-DS）。进行测试以预测每个密码子的演变：中性/ dn = ds或负（净化）/ dn 枣疯病易感基因，仅为四株单子叶枣疯病到目前为止，同源物与PM发病机制有关，只有使用一个不太小的序列数据集，dN-dS分析才能提供重要的结果。我们发现130个密码子在显著负选择下，编码氨基酸分散在MLO蛋白域。在130个密码子中，有27个被翻译成类特异性残基，因此预测它们将提供一个自适应值(附加文件1）.

单子叶和二焦体MLO易感基因的功能保护

我们测试了PM真菌物种是否具体需要在感染一个或另一类高血管培养物中的PM真菌物种中的不同分子特征。为此目的，我们开发了两种用于单码子的转基因表达的构建体（大麦HvMLO)和双子叶植物(豌豆)PsMLO1）枣疯病番茄SLMLO1线中的基因，其具有内源基因丧失功能突变的纯合SlMLO1因此对番茄PM真菌具有抗性粉孢子neolycopersici．我们推出的是，仅在功能保存的情况下，PM症状的互补和恢复SlMLO1和任何两个测试的转基因。总共，十九岁::PsMLO1和20 35s ::HvMLO获得转化体。在这两种情况下，获得18个个体，显示可变转基因表达水平。对于每个构造，三个₁显示高转基因表达的植物（35s ::PsMLO1-4、−6和−7和35S::HvMLO-9、−10和−15)自花授粉产生T₂家庭（附加文件2）.来自每个T的十个人₂家庭测试是否存在转基因并接受挑战o . neolycopersici．三个T₂家庭overexpressingPsMLO1（35s ::PsMLO1_(+))表现出PM症状，平均疾病指数评分从2.87到2.92不等。三个T₂家庭overexpressingHvMLO（35s ::HvMLO_（+））显示平均d ..得分从1.8到2.4。相比之下，所有非转基因35s ::PsMLO1_(−)和35 s::HvMLO_(−)T₂与Slmlo1植物相似，几乎没有真菌生长。3.和额外的文件3.）.对于三种35S转基因植物::HvMLOT₂家庭，普通D.I之间发现了正相关性。和相应的转基因表达水平₁植物(图。3.和额外的文件2和3.）.总之，这些结果表明，单子叶和双子叶枣疯病关于PM发病机制所需的分子特征，功能挽救易感基因。

非宿主相互作用中单子叶和二象MLO易感基因的功能守恒

我们接下来研究了单子叶床和DiCot Mlo同源物之间的功能保护是否在非宿主植物PM相互作用中持有真实。为此，我们使用了PM物种b .茎f.sp。hordei（BGH.)接种携带野生型的Slmlo1突变系(Moneymaker (MM))植株SlMLO1，以及两辆35S::HvMLOT₂家庭（35s ::HvMLO-9和-10，之前在图3中描述，附加文件2和3.）.BGH.是对大麦的适应性PM和对番茄的非适应性PM。在Slmlo1细胞系中，75.4%的感染单位与乳头形成有关，24.6%与细胞死亡反应有关(图1)。4）.与SLMLO1线相比，转基因35S ::HvMLO-9 T.₂植物显示出较低水平的乳头形成（31.3％）和更高水平的细胞死亡反应（68.7％）。在mm，乳头形成和细胞死亡发生在类似于35s ::HvMLO-9植物（分别为14.6％和85.4％）。连同，这种证据表明这两者都表明了HvMLO和SlMLO1易受非宿主病原体侵入的。

的功能表征枣疯病参与PM易感性的同源物对植物微生物相互作用以及植物育种的基本研究具有很大的兴趣，因为可以方便地使用函数丧失基因型来引入培养物种中的耐用和广谱抗性[7］．先前的调查结果表明枣疯病在某一植物物种中，基于抗性的表达可能会由于外源基因的表达而丧失枣疯病来自同一植物科近缘种的易感基因。事实上，在大麦中已经观察到恢复的易感性HvMLO小麦转化的突变体TaMLO_B1和大米OsMLO3,还有豌豆PsMLO1突变体表达莲花LjMLO1或桶三叶草MtMLO1［12，13］．最近，番茄上显示了类似的证据SlMLO1用胡椒转化的突变体Camlo2.或烟草ntmlo1.［16，17］．在这里，我们研究了互补是否也可以通过转移发生枣疯病来自更进化的植物物种的基因。我们在西红柿中发现了这个枣疯病突变背景，转基因表达枣疯病豌豆（恒定相关的DiCot物种）和大麦（单子叶种类）的易感性基因足以重新建立PM易感性（图。3.和额外的文件3.）.这一发现表明，尽管存在系统发育距离和特殊分子性状的进化(图。1和2)，单子叶和双子叶MLO蛋白在与PM病原体相互作用的特征方面基本保守。为了支持这一结论，我们证明了单子叶基因HvMLO还有双子叶基因SlMLO1两者都能增强非适应病原体的渗透b .茎f.sp。hordei和西红柿相比枣疯病- 压力器（图。4）.此外，在查阅科学文献后，我们发现只有1 / 30枣疯病到目前为止，与PM抗性相关的蛋白质替换涉及到一个类特异性残基(图中定位350位的单子叶特异丙氨酸残基)。2） （桌子1) ［22］．在双子叶植物中，同样的残基被甘氨酸(与丙氨酸具有类似的非极性化学性质，见表)所取代1），表明，在这种情况下，类别特定的保护与蛋白质结构或功能的重要变化无关。

我们不能排除类特异性性状可能对与PM真菌的相互作用有很小的影响。的确，通过比较三个独立的T₂每个构造的家庭，我们发现过度表达PsMLO1导致更高的D.I.索引得分比其中一个HvMLO(无花果。3.和额外的文件3.）.显然，与其他几种单码子和Dicot转基因的互补测试有助于回答这个问题。

通过对dN-dS差异的分析，我们为负选择作用于几个类特定残差提供了证据，这些残差因此可能发挥了主要的适应作用(附加文件1）.然而，如前所述，转基因互补试验表明，这些类特异性残基对植物和PM病原体之间的相互作用结果并不重要。可能，在本研究中发现的一些类特异性残基可能与PM真菌的相互作用无关。MLO易感蛋白在其他生理过程中的作用可以解释为什么尽管它们在发病机制中是必需的，但却没有被进化所排除。在这方面，值得一提的是拟南芥和大麦对PM的抗性枣疯病突变体与叶片衰老的诱导有关，这是一种多效表型[11］．

我们表明,枣疯病PM发病所需的同源物可以补充a枣疯病无论供体和受体物种之间的系统发育距离如何(图。3.）.为了测试候选人的功能，这将是一个很好的优势枣疯病易感基因，目前正在被几个研究人员在栽培物种中鉴定[4，5］．此外，我们还概述了处于负选择的MLO蛋白区域，因此有望与功能相关。这些区域是选择抗PM疾病的功能缺失突变体的理想目标。在这方面，育种家可能会使用多种工具，如传统的TILLING靶向诱变方法(靶向诱导基因组局部病变)或基于锌指核酸酶(ZFNs)的先进基因组编辑技术，定期聚集成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN) [26- - - - - -28］．

这项工作为被子植物的进化和功能提供了新的认识枣疯病易感基因。我们表明，与本研究中进行的类似的互补试验适用于未来针对不同栽培物种的新PM敏感性因子的表征活动。此外，我们还提出了一系列功能缺失选择的基因靶点毫升耐药突变体。

生物信息分析

以下MLO蛋白在实验中被证明是PM易感性所必需的，我们使用CLC序列查看器软件(http://www.clcbio.com/products/clc-sequence-viewer/):拟南芥AtMLO2 [GenBank: NP172598]， AtMLO6 [GeneBank: NP176350]， AtMLO12 [GeneBank: NP565902]，番茄SlMLO1 [GeneBank: NP001234814]，豌豆PsMLO1 [GeneBank: ACO07297]，辣椒CaMLO2 [GeneBank: AFH68055]，荷花LjMLO1 [GeneBank: AAX77015]，木本苜蓿MtMLO1 [GeneBank: ADV40949]，大麦HvMLO [GeneBank: P93766]，水稻OsMLO3 [GeneBank:AAK94907]，小麦TaMLO_B1 [GeneBank: AAK94904]和TaMLO_A1b [GeneBank: AAK94905]。对齐给geneous v8软件(http://www.geneious.com, (29]），突出氨基酸具有不同极性，以及在线Web服务phylogyy.fr（http://www.phylogeny.fr/)构建一个无根径向系统发生树。

为了预测类特异性分子特征的进化类型(负性或中性)，以上所有的双子叶枣疯病以易感基因为数据集，基于非同义和同义位点(dN/dS)的非同义-同义替换差异，进行密码子进化分析。这是通过使用单一可能性祖先计数(SLAC)方法执行的，该方法由Datamonkey web服务器(www.datamonkey.org）.默认值为0.1被视为在显着的负面选择下呼叫密码子的阈值。

全长PsMLO1和HvMLO的分离和克隆

利用RNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen)从豌豆(品种Sprinter)和大麦(品种Maythorpe)中分离出总rna，并利用SuperScript III第一链合成试剂盒(Invitrogen)和oligo(dT)合成相应的cdna。_20.底漆。特异性引物对，命名为PsMLO1-Fw/PsMLO1-Rev和HvMLO-Fw/HvMLO-Rev(附加文件4表S2)PsMLO1和HvMLO全长编码序列，分别。PCR反应采用高保真Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)，退火温度为55℃。将扩增子连接到gateway兼容载体pENTR D-TOPO (Invitrogen)上，克隆到大肠杆菌根据制造商的说明，一拍摄®TOP10细胞（Invitrogen）。在通过菌落PCR选择阳性菌落后，使用上面提到的两个基因特异性引物对，提取重组质粒并测序它们的插入物。选择每个构建体的单个菌落，其中插入物导致与那些相同的序列HvMLO和PsMLO1存放在NCBI数据库中。

转基因SLMLO1突变体番茄植物表达PSMLO1和HVMLO的生成和功能表征

遵循制造商说明（Invitrogen），克隆HvMLO和PsMLO1将35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子和标记基因插入到含有35S花椰菜花叶病毒启动子和标记基因的双质粒载体pK7WG2中nptII进行卡那霉素耐药选择。然后将质粒转移到大肠杆菌如前所述，通过菌落PCR和测序筛选阳性菌落。最后提取重组载体并转移到AGL1-上梵G株农通过电穿孔。

番茄的转变ol-2突变系，携带PM易感基因的功能缺失突变SlMLO1，根据[6] 和 [16］．评价表达水平PsMLO1和HvMLO在T₁利用qPsMLO1-Fw/qPsMLO1-Rev和qHvMLO-Fw/qHvMLO-Rev引物对植株进行实时定量pcr(附加文件)4）.底漆对设计在伸长因子1α.基因（QEF-FW / QEF-REV）用于相对量化（附加文件4）.

主机和非主机交互作用的功能特征

对于上述两个转基因，每一个都有三个T₁表达量最高的个体允许自花授粉，共产生6个T₂家庭。通过PCR测定每个家庭的个体，用于通过PCR，分别使用在NPTII标记基因和35s启动子上设计（附加文件）的引物对NPTII_FW / NPTI_REV和35S-FW / 35S-REV和35S-FW / 35S-REV进行过表达构建体的存在/不存在过表达构建体。4）.十个耐抵抗损失损失的SLMLO1工厂SlMLO1每个家庭的等位基因和十个人都挑战了番茄PM真菌的孤立o . neolycopersici荷兰瓦赫宁根大学植物育种系进行了研究。接种是按照[30.]，对4周龄植株喷施悬浮孢子，悬浮液为4 × 10的最终浓度。悬浮孢子悬浮液从重病植株的新鲜产孢叶片中提取⁴孢子/ ml。接种植物在20±2℃的温室室中生长，具有70±15％的相对湿度。根据第三和第四叶上的疾病迹象的存在，在接种后15天进行疾病评估，根据第三和第四叶的存在，根据0到3的规模，[10］．

对于非宿主交互的功能表征，来自三个35秒之一的种子::HvMLOT₂以前测试的家庭在半效梅拉希奇和斯科吞并（MS）琼脂上进行表面灭菌和播种，补充有50mg / ml卡那霉素，用于选择转基因植物。将种子在4℃下放置2天，然后转移到生长室10天。将五种转基因幼苗移植在盆中并转移到温室隔间。PM易感品种满族，五个SLMLO1植物和五个金钱制作植物的三种大麦植物被用作对照。孤立的b .茎霍德(BGH.)，用于接种。这是通过揉搓被严重感染的满洲树叶来完成的BGH.在第三片番茄叶子上。72h后，接种植株在20°C、光照16 h /d、70% RH的气候室中保存4cm²从接种叶(第三叶)上剪下叶片。每个基因型分别从3株植物中提取3个样本。

每片叶用1:3 (v/v)醋酸/乙醇溶液漂白，48 h后用0.005%台班蓝染色，见31］．通过显示表皮细胞死亡的感染单元的频率估算了真菌渗透率。对于每种基因型，考虑到至少100个感染单位，考虑了三种生物学重复。

我们承认Henk Schouten博士，Anne-Marie Wolters博士和Ruents Niks博士在编制稿件期间为批判性阅读和有价值的建议。我们还承认Romero Cynara为她的帮助接种Blumeria Graminis.f.sp。hordei．MA、CL、LR和SP的工作得到了意大利大学和研究部GenHort PON R&C项目的支持。

从属关系

1. 瓦赫宁根UR植物育种，瓦赫宁根大学和研究中心，Droevendaalsesteeg 1, 6708, PB，瓦赫宁根，荷兰

   Michela Appiano, Miguel Santillán Martínez, Richard G F Visser & Bai Yuling

2. 意大利国家研究委员会的生物科学与生物资源研究所，通过Amendola 165 / A，70126，意大利

   多梅尼科Catalano

3. 福贾大学农业、食品和环境科学系，那不勒斯路2571100，意大利福贾

   Concetta Lotti.

4. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京市中关村南大街12号，100081

   郑郑

5. 巴里大学土壤、植物和食品科学系，遗传和植物育种部，Via Amendola 165/A, 70126，意大利巴里

   Luigi Ricciardi＆Stefano Pavan

相应的作者

对应到玉玲白或Stefano Pavan.．

相互竞争的利益

两位作者宣称没有竞争利益。

作者的贡献

MA开发了转基因植物，进行了病害试验，并参与了实验设计、结果解释和手稿起草。MISM进行了组织学分析。ZZ为转基因互补试验制备过表达结构。DC、CL、RGFV、LR和YB参与了实验设计和手稿的关键修改。SP进行进化分析，并参与实验设计、结果解释和手稿起草。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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