马铃薯和番茄第4染色体上的一个抗病位点表现出保守的多部结构，在不同的谱系中表现出不同的进化速度

背景

在植物基因组中，基于NB-LRR的抗性(R)基因倾向于在相对较少的基因组区域以大小不同的簇状出现。r基因序列的分化主要通过累积点突变和基因转化事件来实现。马铃薯和番茄第4染色体有一个同位的r基因位点(称为R2马铃薯的基因座，主要是在中美洲/墨西哥野生土豆种的基础上在抗oomycete病原体引起的巨大抗枯萎病的基础上进行检查Phytophthora Infestans.．迄今为止的证据表明，在这些基因型中的基因座中的基因转换事件表征的快速进化模式的发生。

结果

的物理图谱R2轨迹是为三个开发的茄属植物tuberosum基因型并用于鉴定番茄同步序列。轨迹的功能诠释显示出存在许多抗性基因同源物质（RGHs）属于R2基因家族(R2GHs）组织成共计4个离散的物理集群，其中三个被保守美国tuberosum和番茄。系统发育分析显示出透明的正非/逐渐关系S. Tuberosum R2GHs但不在R2GH克隆了Solanum.野生物种。这项研究证实，与野生物种相比R2GH基因转化并不是分化的主要力量S. Tuberosum R2GHs和直向/谬误推理关系已经通过在这些基因型点突变的缓慢积累维持。

结论

美国tuberosum和茄属植物lycopersicum R2GH小号进化主要是通过复制和删除事件，其次是突变的逐步积累。相反，普遍的基因转换是进化的重要力量，塑造在墨西哥野生薯种轨迹。我们的结论是不同的选择力量型的演变R2在这些谱系中的基因座和与不同进化路径的病原体引导选择的共同演变。

植物已经进化了精致的机制，以防止生物威胁的攻击。对病原体和害虫的细胞内防御通过不相容的相互作用机制局部和系统地促进，其通过抗性（R）基因协调[1］．最大的一类植物R基因编码的蛋白质的模块化的特征在于，结合核苷酸（NB）位点和富亮氨酸重复（LRR）结构域。的NB域调节防御反应的病原体的下游信号[2那3.];而非自我的识别是由位于NB-LRR蛋白C端LRR结构域授予的[3.-5.］．

在植物基因组中，r基因倾向于以紧密相连的基因簇形式出现，在这种基因簇中，复制是通过不合法的重组过程实现的，包括一组密切相关的r基因序列或r基因同源物(RGHs) (6.-8.］．这种r基因串联排列的组织提供了对多种病原体和同一病原体的不同变体的更广泛的潜在反应范围[9.］．

r基因在植物基因组中聚集的趋势促进了序列交换，从而能够快速重新排列，以应对病原体种群的变化。尽管如此，Song等人[9.)表明,RGH年代的rb.马铃薯中的基因座是独立进化的，主要通过点突变而不是序列交换。这种进化有助于维持不同基因型同源物之间的同源关系，而频繁的序列交换和基因转换事件则掩盖了这种关联[10.］．基于这些观察结果，Kuang等人。[10.]假设植物病害R-基因在与对比进化率解释进化模式两类组织。I型R-通过基因序列频繁往来迅速发展，而II型R基因进化缓慢，以自发的方式。两个基因类型可以存在于相同的群集或单独，并且它们可以具有在天然种群和物种[内的不同的频率10.那11.］．

块茎作物马铃薯(茄属植物tuberosum)是世界上第三重要的粮食作物，也是茄科(茄科中包括与之密切相关的模式种番茄)的重要成员。马铃薯易受多种病虫害的影响，这些病虫害会影响植株的各个部位，造成块茎质量和数量的严重下降。马铃薯r基因座基于序列的比较分析数量最近有所增加[12.-16.]，由于近期发表马铃薯基因组序列的一定程度[17.］．茄科基因组中的r基因倾向于分布在家族成员中保守的限制性染色体区域[7.那8.那18.］．然而，同位基因在Solanum.r基因簇由于与不同病原体的相互作用而获得不同的特异性[7.那8.那19.］．马铃薯和番茄4号染色体上有一个同位的复杂r基因区。该地区是马铃薯抗病的热点地区，对不同的病原菌和害虫均表现出定性和定量的抗性[20.］．在番茄的轨迹上没有对功能性的贡献尚未检测到。oomycete.Phytophthora Infestans.马铃薯晚疫病(马铃薯晚疫病的致病因子)被认为是全世界马铃薯的主要生物胁迫，不仅因为它能迅速摧毁未经处理的马铃薯作物，还因为它有潜力在短短几年内反复适应抗药品种[21.］．从4号染色体上的抗性热点中，最近已经从不同的品种中克隆了大量的小种特异性晚疫病r基因Solanum.野生物种:R2(从Solanum Demissum.）,R2样，RPI-EDN1.1(从Solanum Edinense.）,rpi-abpt.[从Solanum.ABPT(源自种间桥梁之间的杂交茄属植物bulbocastanum那茄属植物acaule,年代olanum phureja,美国tuberosum[22.]）]，RPI-BLB3.(从美国bulbocastanum）,Rpi-hjt1.1、Rpi-hjt1.2 Rpi-hjt1.3(从solanum hjertingii.）,Rpi-snk1.1和Rpi-snk1.2(从茄属植物schenckii）[23.那24.］．所有基因编码NB-LRR蛋白约846个氨基酸长。它们属于同一家族，因为它们共享非常高的核苷酸识别水平(从95%到99%)，而且已知它们的产品与四种枯萎效应PiAvr2家族的成员相互作用[25.］．枯萎病和马铃薯包囊线虫的数量抗性位点(QRLs)也已被定位到该区域[20.，抗性表型一般归因于r基因的存在。因为晚疫病r基因R2从S. demissum是第一个被映射到这个轨迹的26.]，对于简洁，这种染色体4个抗性和所有R-基因同源物的热点将在下文中提到R2GH的年代R2地区。

这R2GHs克隆到了R2地区Solanum.野生物种(半蒴苣苔，小蒴苣苔那S. edinense那美国schenckii那S. Hjertingii）以及繁殖的克隆Solanum.ABPT被描述为“序列相似性的拼接物”[23.那24.];这表明它们可以被归类为I型r基因。然而，这张照片是从对来自晚疫病病原体多样性中心的墨西哥野生物种的非常具体的关注中出现的。在马铃薯基因组序列的基础上，我们试图深入了解马铃薯的结构和进化R2南美物种的基因型美国tuberosum和密切相关的物种番茄。该地区的分析是在三个地区进行的美国tuberosum基因型为DM1-3 516R44 (DM)、RH89-039-16 (RH)(分别为最近用于马铃薯基因组草图的双单倍体和二倍体杂合无性系)和杂合二倍体基因型HB171(13) (HB)，并与品种Heinz 1706产生的番茄全基因组序列进行了比较。该区域的特征是多部聚集组织和显示高水平的共线性的基因型分析。与迄今为止从野生物种中分离出来的基因相比，似乎R2GH本研究调查的基因型中的S进化缓慢，通过点突变的积累，暗示两种不同的进化模式特征的成员R2在不同的地区Solanum.物种。

组织和结构R2马铃薯和番茄基因型的基因家族

共9个细菌人工染色体(BAC)克隆，跨越780 KbpR2对马铃薯二倍体无性系RH的一个单倍型(RH- h0)的基因座进行了测序。HB二倍体克隆的序列覆盖率较低，HB- h0单倍型的序列覆盖率为~ 430kbp, HB- h1单倍型的序列覆盖率为~ 122kbp，其中HB- h0单倍型携带数量抗性等位基因S. demissum[27.］．DM的当前假斑构建的约3 MB区域[28.)生成R2在DM基因组中鉴定了区域。该区域包括7'超杯'，其中6个含有R2GHs，单个间质超杯不含有R2GHs。仔细检查目前的假模构建中的DM序列，以及与番茄和其他马铃薯基因型的比较，表明该区域中的三个连续支架（PGSC0003DMB000000690，PGSC0003DMB00000007和PGSC0003DMB000000964）被放置在不正确的方向上。另外两种含有R2GHs的超杯（PGSC0003DMB000000719和PGSC0003DMB000001035）不能放置在该区域中，在重新定向三个倒立支架后具有高置信度。经修订的顺序实际上对应于在当前假调子组件之前对马铃薯基因组的构建中这些支架的组织，其中PGSC0003DMB000000690，PGSC0003DMB00000007和PGSC0003DMB000000964处于相反的方向，并且未经警告，PGSC0003DMB0000719和PGSC0003DMB0000035。出于本研究的目的，我们在我们的观点中采用了这一点，更有可能在R2位于DM的情况下安排。一个11.6 Mbp（SL2.40SC03604）的单个脚手架与R2从番茄品种Heinz 1703（Hz）基因组序列（番茄WGS支架，SC2.40）中鉴定了土豆中的区域，这形成了马铃薯/番茄比较的基础。附加文件1显示了不同马铃薯基因型和番茄中该区域的完整序列覆盖，其中DM区域组件的修订版包括可以在该区域中放置在该区域中的5个超级支架。

该区域在四个基因型的功能注释显示了一个复杂的结构，包括几个明显离散的亚簇R2r基因同源物与相对较大的簇间区域混杂在一起。根据rich等人的研究，每个簇间区域至少有8个开放阅读框架，与疾病抗性没有直接关联。[29.]，允许定义每个含R基因的区域作为独立RGH集群。DM，马铃薯基因型以最大覆盖范围，具有跨越〜1500kbp传播四个分立的集群。RH，其中有在单一单元型780kbp的〜跨度接近完全的序列覆盖，显示出三个集群。围绕侧翼区域的初步审查R2GHRH中的簇表明它们与3个DM簇占据同位，其中第4个DM簇的位置落在RH的覆盖窗口外。尽管两个HB单倍型的序列覆盖不完整，但RH中覆盖的三个簇在该基因型中也被覆盖，而第四个DM簇的区域没有序列覆盖。(附加文件1给出了区域在所有测序基因型中的全面图解)。番茄也表现出三个离散的簇，这些簇似乎占据了覆盖所有马铃薯基因型的三个簇的同位。在DM中识别的第四个聚类区域中，番茄没有一个等价的聚类，尽管在番茄组装的这个区域覆盖良好。

我们比较了这一区域，涵盖了三个明显同位的r基因簇，在三个马铃薯基因型和番茄上具有相同的序列覆盖。在马铃薯DM和RH-H0基因型中，这一区域的面积约为800 Kbp，而番茄当量区域的面积较小，约为550 Kbp。在这两个物种中，该区域包括一个远端r基因簇(a)，一个中心簇(B)和一个近端簇(C)。转录方向和每个簇上r基因同源物的数量通常是很保守的。所有R2GHs簇B和簇C的成员具有相同的取向，而簇A的成员与两个物种的簇的取向相反。在所有基因型中，A群的基因型数量最多R2GHs，其次是集群B，其中集群C的数量最少。虽然集群B和集群C的土豆和番茄的大小相似，但在集群A中，土豆基因型拥有的R2GHs大约是番茄的三倍(附加文件1)．RH、DM和HB(H0)具有高度共线且几乎完全保守的微共线r间基因簇序列(附加文件)2)．马铃薯和番茄在r基因簇间序列上也表现出广泛的共线性。共鉴定出5个马铃薯-番茄微同线区，其中14对同源基因在相近物理距离范围内。两个物种之间的微同位只会被马铃薯序列中转座元件的单侧插入中断(附加文件3.)．

第四簇仅在DM中发现，距离簇A约3700kb，位于簇2的附近R2GHs(请参阅附加文件1)．序列覆盖不会延伸到马铃薯基因型RH和Hb中该区域，并且在这些基因型中可以存在或不存在同步簇。如上所述，尽管序列覆盖率足够的植物邻近植入番茄植物的等同区域中，没有发现其他R2GH。

在DM和HZ的全基因组序列的可用性，允许进一步鉴定R2抗性基因同源物位于R2地区。这些异位r-基因同源物可以被认为是议员R2基因家族，在核苷酸水平上显示> 77%的同一性R2区，尽管它们被转移到不同的基因组位置[30.］．如前所述，PGSC0003DMB000000719和PGSC0003DMB000001035存在于R2区域(介于PGSC0003DMB000000964和PGSC0003DMB000000355之间)，在目前马铃薯第4号染色体伪染色体分子构建中，分别含有4个和2个R2GHs。如前所述，PGSC0003DMB000000690、PGSC0003DMB000000707、PGSC0003DMB000000964等相邻超支架再倒置时，不能再自信地放置在该区域，因此我们在本研究中将其视为未锚定。

另一个超级支架PGSC0003DMB000000029，包含一个R2GH，存在于马铃薯染色体4,15.6 mbp上R2地区。在番茄三进一步异位R2在4号染色体(近20 Mb)上鉴定了同源物R2区域)和染色体7。

序列的分析R2GH年代的R2地区

通过对马铃薯和番茄基因型的序列注释，共发现了127个基因R2在被检测的基因家族中，在A群中有80个，在B群中有33个，在C群中有12个，在附加群中有2个，这在DM中是明显的4.)．以便更好地了解R2GHs在里面R2检查基因型的区域，所有R-基因被手动检查和分类为全长开放阅读框或假置原因。

127年的R2GHs67被分类为部分基因序列，或在5 '或3 '端被截断，或包含内部缺失。部分基因长度为345 bp (RH0A012)至2529 bp (RH0A007)．剩余的58全长同源物的基因与2530的平均长度（±41.7）bp和含有3’ 和5’ 的可变长度的非编码区的内含子较少。这些全长同系物，五含有早熟终止密码子和由核苷酸插入或缺失15个表现出帧偏移。因此，87组的序列被归类为假基因和38成全长开放阅读框的基因。全长ORFR2GH在结构上与Lokossou所描述的相似[24.Chipcreet [23.为40个成员R2基因家族克隆于Solanum.野生品种及栽培品种[23.那24.］．其中包括31个全长ORF r基因同源物(15RGH年代从S. demissum, 9RGH来自S.．edinense， 一RGH从美国bulbocastanum， 一RGH从S. Hjertingii.,四个RGH年代从美国schenckii和一个RGH从种间杂交ABPT， [22.)，不参与赋予抗枯萎病能力的;9个功能基因R2(从S. demissum）,R2样，RPI-EDN1.1(从S. edinense）,rpi-abpt.(从Solanum.ABPT),RPI-BLB3.(从美国bulbocastanum）,Rpi-hjt1.1、Rpi-hjt1.2 Rpi-hjt1.3(从S. Hjertingii.）,Rpi-snk1.1和Rpi-snk1.2(从美国schenckii）[23.那24.］．所有成员R2基因家族图谱R2轨迹涉及进一步分析它们的进化模式，包括长度大于1.5 kbp的假生素。

建立正交关系R2GH年代

非常相似的数字R2GHS出现在簇A，B和C，在整个马铃薯基因型检测（附加文件1和4.；无花果。1)表明，与大多数其他复杂植物r基因座的观察结果相反[17.那29.]，存在高度的位置正交R2GH在RH，DM，HB的轨迹以及某种程度上也在马铃薯和番茄之间。

的多重对齐R2GH使用最近的非茄科r基因同源物进行分析RPP13从拟南芥(accession FJ624096)作为外群，生成邻域连接系统发生树，清晰地显示了邻域间的位置正交性R2GH占据不同单倍型的同步位置（图。2)．尽管缺乏完全连续序列覆盖，R2GH在RH-H0、HB-H0和DM中发现的“核心”组分别有28、6和3个成员，在a、B和C群中。总的来说，在这三个单倍型中，似乎存在一个单一的“正单倍型”，它包含相同数量的共线R2GH在三个星系团(图。1)．尽管他们的分歧最近的起源 - RH是二倍体马铃薯从荷兰育种无性，HB是从主双单倍体（PDH247）之间的交叉派生二倍体克隆S. demissum在其谱系和组Phureja克隆（DB226（70））在Bradshaw等人描述。2006年[27.]并且DM是一倍的单倍体实验克隆[28.这三种基因型都有广泛的贡献美国tuberosumPhureja组(RH 25%， HB 50%， DM 100%)。因此，我们重建的单倍型(RH、DM和HB-H0)很可能主要代表这一谱系。

HB-H1，我们对它的了解有限，它可能反映了一种组合美国tuberosum和S. demissum。其二倍体亲本PDH247与品种Stirling背景相似，在该区域定位了抗枯萎病的大效数量性状位点(QTL)，在HB171中也定位了相同的QTL [27.那31］．鉴于抗枯萎病在此背景下来源于S. demissum然后，人们可能期望从HB-H1的这个区域中从该来源中突出的速度段，尽管该段与“受体”的边界美国tuberosum基因组不明。尽管该单倍型相对较低的序列覆盖率相对较低，但显而易见的是，簇B相对于其他单倍型扩增（图。1)．初步检查表明，A组和B组之间发生了某种形式的序列重排(这将在下面进一步讨论)。

番茄R2GHS与马铃薯同系物的分化程度更大，且更大的分类差距意味着马铃薯和番茄同系物间的亲缘关系不明显。然而，在聚类A的三个成员中，有可能鉴定出马铃薯和番茄之间的同源关系。

R2GH年代从Solanum.野生物种没有表现出任何明显的同源关系美国tuberosum血统R2GHs，在系统发育树上形成了第二个不同的类群(图。2)．这一点的重要性将在稍后详细讨论。

建立之间的谬误关系R2GH年代

为了检查相对正交和逐渐的关系R2GH来自分析的基因型，在三种马铃薯基因型中研究了所有成对同源物之间的核苷酸同一性的百分比。R2GHS的一致性从77%到100%(87.7%±3.2%)不等。推测的同源序列(通过位置同步和系统发育分析鉴定)的同源性最高，为96.6% ~ 100%(平均99.4%，58对同源性为100%)。副对数的一致性范围从69%到97%(平均84.69%)。

比较结果显示，4组高度保守的拟对数具有92%到97%的一致性美国tuberosum单(无花果。1)．个人单倍型中的这些高度一致旁系同源很可能是单基因或基因块的重复最近事件的结果。同样高度保守的旁系没有对在番茄鉴定R2GHS，表明没有像马铃薯那样最近的重复事件。

基于核苷酸的识别，进一步澄清了HB-H1单倍型中簇A和簇B之间的重排(图)。1)．一双R2GHs似乎存在于四个串联排列的平行副本中(图中用黄色和橙色标记。1），从而所述一对特别容易重复。此共生同源对的拷贝参与共线性的破坏单倍型HB-H1和DM / RH / HB orthohaplotype之间观察到。一对附加的高度保守的旁系同源（标记为蓝色图。1在DM / RH / HB ortho-haplotype和Hb-H1中鉴定在簇B中。从集群A插入在此时在HB-H1中中断集群B的CLineARITY。三个随后R2GHs（图7，8和9中的图7.1)与HB-H1无明显的同源关系R2GH在DM/RH/HB正单倍型中，而在这两种单倍型中，对B群的最后成员重新建立了同源性。

两种不同的机制盛行于R2GH年代

如前所述，在图2中的树枝图中可以观察到两个不同的树拓扑。2它们与相关的分类学关系相关联R2GH年代的调查。一个模式基本上对应于R2GH年代从Solanum.野生物种和其他R2GH来自耕种美国tuberosumRH, DM和HB基因型。类似的现象在RGC2莴苣的抗病位点，在抗病基因同源物中显示两种类型的序列多样性[15.］．Kuang等人提出，生菜中的两种不同的树拓扑对应于两种不同类型的同源物，以进化速率区分，即快速进化的I型RGH和发展缓慢的II型RGHs。

在我们的系统发育分析中，RH, DM和HBR2GHS表现出II型基因的特征：等位基关系R2GHS可以很容易地从这个树状拓扑中推导出来:在系统发生树中形成单系分支的直系关系具有高bootstrap值(一般接近100%);连接直系亲属的分支非常短(< 1%核苷酸取代);而连接平行链的分支非常长(>5 %核苷酸替换)。这种行为反映了进化的生与死模型[32］．

树拓扑变化R2GH年代从Solanum.野生物种：分支的长度是中间（在1到6％之间的变化），节点的引导值大部分<90％。因此，该部分的划分器假设I型电阻基因同源树的属性隐藏成员之间的正交关系[10.］．距离分析也表明R2GH在已知的积极参与枯萎病抗性的S倾向于形成一个单系群，也包括5个非功能成员Solanum.野生物种Gh2 gh45 gh-d3 gh-8和AM-5(无花果。2)．这些r基因和同源物是序列的马赛克，产生了分布在所有域的身份延伸(图)。3.)．在抗枯萎病“功能分支”中，LRR结构域是高度一致的(图中黑色阴影的基因转换事件)。3.)，因为已知它们的产品与数量有限的枯萎病效应剂直接或间接地相互作用[25.］．

虽然系统发育分析支持较慢的II型进化模式R2GHS来自DM，RH和HB，该结论是通过上述树的两部分中不同基因型之间的相对进化距离复杂化。DM，RH和HB表现出的强大正常关系R2GH这可能至少部分是由于这些基因型相对于野生物种的分类学分离程度较低。尽管如此，DM/RH/HB同源单倍型中与野生物种分支相对较长的平行对数分支仍然表明，这两个类群表现出不同的进化模式。进化速率的一个更确定的足迹是基因转换事件(类型I进化的主要特征)在多大程度上具有均质并行簇成员，较低的基因转换率导致相对较长的并行分支。因此，我们预计在DM/RH/HB同源单倍型的序列中，这种非互反序列交换(I型进化的特征)将以相对较低的速度发生。以确定序列之间的交换R2GH，目视检查与Genconv程序的输出相结合[33，用来检测所有基因对之间可能的基因转换事件R2GH在RH、DM和HB中仅鉴定出5个单独的序列交换R2假字(附加文件5.），表明RH / DM / HB邻单倍型的成员都没有受到序列的频繁交流，并主要通过进化的点突变在高变部位的积累。

这种对比以前所观察到的内容R2基因家族成员R2基因家族Solanum.野生物种[23.那24.］．所描述的相同分析R2GH对RH、DM和HB的s进行检测R2GH年代从Solanum.我们统计了总共72个基因转换事件的野生物种。5 '和3 '端功能r基因和r基因同源物之间存在序列交换。令人惊讶的是，它们也可以在属于不同的成员之间被识别出来Solanum.野生物种。即使不可能观察到所有同源物的嵌合，序列交换在多样化的成员中发挥了重要的作用，这是毫无疑问的Solanum.野生物种R2基因家庭（附加文件5.)．

因此，系统发育分析和检验的进化力量形成的顺序R2GH它支持存在两种不同的进化模式，作用于不同谱系的r基因同源物。

这R2在马铃薯和番茄基因型中，抗性热点具有异常高度保守的多部分结构

这种分析最显著的特征之一是在R2在研究中检验了马铃薯和番茄基因型的基因座，其中的成员R2基因家族按>50 Kbp的间隔被组织成几个离散的簇，编码两个物种在结构和功能上无关的基因。在一个不间断的比较窗口中，土豆和番茄的基因型分别延伸约800 kb和500 kb，三个簇显示出清晰的保守性。DM有一个相邻的簇(RH和HB没有序列覆盖)，这在番茄中显然不存在。

这R2区域以前在马铃薯和番茄中进行了研究，作为利用捕获和重测序方法对两个物种的R基因补体进行大规模重新注释的一部分[34那35在这些研究中，DM被描述为在该区域有两个集群，而在后者中，西红柿也被描述为有两个集群。这与我们所展示的图片略有不同(土豆有4个集群，番茄有3个集群)，主要有两个原因。在第一个例子中，我们对分离集群所需的独立非r -基因orf的数量的定义略有不同(8个而不是14个)。这导致了在我们的研究中a和B的分离，在之前的研究中，土豆和番茄都被描述为一个单一的聚类。我们采用较少的中间基因来定义聚类，主要是为了突出a和B聚类之间非R基因编码基因的共同块的力量，以阐明种之间和马铃薯基因型内部的聚类共同关系。此外，在之前的任何一项研究中，聚类C都没有描述土豆，尽管Andolfo等人描述的第二个较小的聚类是番茄。[34[确实与群集c相对应。然而，在该研究中描述的第二个较小的群集实际上是本研究中描述的DM特定群集。在本研究中，对同同簇进行更精细的尺度描绘，并包含所有跨两个物种的同同簇对，将使该研究的组织更加清晰R2两个物种中的地区。

比较的R2通过对马铃薯和番茄区域的研究，我们可以对该位点的进化史做出一些广泛的结论。类群A、B和C的位置守恒(其侧翼区域和相似的相对大小)表明这些类群的存在早于番茄-马铃薯的形成。马铃薯A簇的大小显著增大，表明在物种形成后，该簇中发生了多个重复事件。为了检验这一点，类似于Andolfo等人[34，我们在马铃薯的同源单倍型和番茄中寻找潜在的重复事件(尽管我们使用了直接的序列身份比较而不是系统发育推断，并且由于使用了较高的阈值来声明假定的同源性，识别出的重复实例较少)。cluster A中几组高度相同的parogs的鉴定清楚地支持了马铃薯谱系中的多个重复事件，cluster B中至少有一个重复事件也很明显。

DM特定R2GH群集在番茄中缺乏同序群集。考虑到马铃薯复制的历史，这一簇更有可能是在马铃薯物种形成后出现的，但不能排除相反的情况(番茄谱系的损失)。在番茄cv的簇内缺乏高度相同的平行对数。Heinz 1703使用了一个阈值，在这个阈值上它们在马铃薯谱系中可以被识别，这表明在这个番茄品种中没有最近的重复事件，可能表明番茄集群的组织更类似于该位点的“物种形成前”结构。而聚类间序列表现出明显的同源性，只有三个R2GHS显示马铃薯和番茄之间的高级别（可能指示诸如常见病原体的选择性，作用于物种边界），但在这些物种上比较时，剩余的同源物之间没有明确的陈列表。

r基因家族的进化模式美国tuberosum基因型

我们的特点R2在三个地区美国tuberosum基因型与栽培品种群体Phureja在背景中的贡献。我们的数据与以前从抗抗野马铃薯物种的等位基因采矿研究中的可用数据的比较表明，基于系统发育和基因转化分析，通过不同谱系采集两种不同的谱系模式。

系统进化距离分析倾向于将RH、DM和HB同源物与野生物种成员分离，并揭示出各自类群的两种不同的树拓扑结构。连接RH、DM和HB的分支R2GHs是很短还是很长，而分支连接R2GH年代从Solanum.野生物种大多是中等长度。可以清楚定义谬误/直系(DM/RH/HB)或混淆谬误关系(野生物种)的分支的这种区分，此前已被证明表明同一r基因家族的成员在单一位点获得不同的进化速度[19.］．

通过基因转换分析研究了上述差异背后的进化机制，发现DM/RH/HB正单倍型中同源基因之间的非互反序列交换是一个低频率事件，这是II型r基因的一个特征诊断。谬论之间的低同一性掩盖了它们的进化关系，除了四个高度相同的谬论副本，它们被认为是最近重复事件的结果。这种进化模式支持一种从复制开始的出生和死亡过程，随后是多样化、新功能化或原始基因的沉默，以产生新的不同的谬误[36］．另一方面，Solanum.野生物种同源物是嵌合序列，表现出广泛的非互易序列交换的足迹，其特征在于I型R-基因的典型典型的快速进化速率。

I型和类型之间的表观差异II R2GH这一研究回避了这些不同进化模式的来源问题。这两组物种的分类学分离与它们的起源中心有关Solanum.调查的野生物种都起源于墨西哥，而美国tuberosum基因型有南美的起源[37］．这似乎是一个合理的假设，不同的地理分布导致了不同的进化压力，最明显的差异是，墨西哥物种是在最具毁灭性的马铃薯病原体的多样性的地理中心进化的，p . 5．适应和进化新的R-基因特异性在晚期枯萎病原体的多样性中心的必要性显然是从根本上形成了进化动态R2而由于缺乏这种压力，南美衍生物种的多样化步伐更为缓慢。成员之间的保守进化R2来自块茎的基因家族，占用土豆和果实番茄与快速选择普遍存在Solanum.野生种，其多样化无疑发生在番茄/马铃薯物种形成之后。

值得指出的是，上述基于我们的数据提出的假设存在一些局限性。如上所述，我们检测的基因型的多样性相对狭窄，可能很大程度上反映了这一点美国tuberosum．因此，尽管我们可以肯定地说R2GH来自南美洲特定背景的物种经历了较慢的II型进化模式，我们不愿将其扩展到其他地理来源相似的物种。此外，野生物种的生存方式R2GH通过等位基因挖掘过程被隔离，可能引入了在结构上类似于通过基于地图的克隆最初鉴定的功能构件的基因的偏差，并且我们还缺乏由BAC和WGS测序提供的野生物种的上下文信息这美国tuberosum基因型。因此，虽然我们可以合理地假设，更快的I型进化模式正在野生物种中发生，但我们不能排除II型进化同时发生在R2这些基因型的位点。事实上，在相同的r基因家族中，I型和II型进化的发生已经被观察到[19.］．

比较来自R2番茄和栽培和野生土豆中的基因座使我们能够描述这些谱系中轨迹的发散进化路径（图。4.)．这美国tuberosum在本研究中所研究的基因型在R2从番茄中预测物质的轨迹。R2GH从DM、RH、HB和番茄中进化而来的s主要是通过一个出生和死亡的过程，点突变的重复、积累和转位事件导致了目前的组织R2地区。另一方面，基因转换在形成r基因同源物的进化过程中起着重要作用Solanum.野生物种。尽管r基因位点可以编码多种疾病抗性特异性，但在其多样性的中心，单一的侵袭性病原体可能在任何这样的位点上作为形成进化过程的主要驱动力。在缺乏这种强大的选择压力的情况下，相同的r基因位点可能在不同的谱系中遵循非常不同的路径。

本研究中使用的序列

来自DM1-3 516R44基因型的土豆序列（PGSC_DM_V3_2.1.10_pseudomolecule_agp（1））从马铃薯基因组测序联盟公共数据释放（solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml.)．RHPOTKEY文库的BAC末端序列(BES)从Genbank的GSS部门下载。Hein等[38提供了含有拷贝的Hb Bac克隆的BAC结束序列R2GH年代,番茄的简历。将亨氏1703 (HZ)全基因组序列(Tomato WGS scaffold, SC2.40)下载至Solanum.基因组网络（https://solgenomics.net)．

马铃薯BAC序列生成如下。r基因序列GHA, Rpi-abpt那Gh10, gh11, gh12, gh13, gh14, gh15, gh16, gh2, gh3, gh45, gh5, gh7, gh8, gh9, ghd3, r2, am2那AM5 AM3, ednGH3那ednGH4那ednGH5那ednGH6那ednGH7那ednGH8那R2样，RPI-EDN1.1那hjtGH1那RPI-HJT1.1.那RPI-HJT1.2那RPI-HJT1.3那Rpi-snk1.1那Rpi-snk1.2那snkGH2那snkGH5那snkGH6那snkGH7那RPI-BLB3.和SBA.[8.那9.]从Genbank下载(文集FJ536324-FJ536346;GU563963 - GU563979)。

马铃薯BAC序列的鉴定与测序R2地区。

来自GB BAC文库(建立在RH89-039-16基因型上，35700个克隆，平均插入大小102 Kbp)的BAC克隆GB003E01的鉴定和测序在Moloney等人中进行了描述。[39］．RHPOTKEY BAC文库的BAC克隆RH049C05、RH089H21、RH082P19、RH103C24、RH131E21、RH005L24、RH175J12和RH107O01(由RH89-039-16基因型生成，78,000个克隆，结果表明，在番茄基因组区与番茄基因组区同位序列上进行了比对，结果表明，在番茄基因组区与番茄基因组区同位序列上进行了比对，结果表明，在番茄基因组区与番茄基因组区同位序列上进行了比对，平均插入长度为120 KbpR2轨迹。从HB171(13) BAC文库(280,000个克隆，平均插入大小100 Kbp)中鉴定了HB BAC克隆HB036I05、hb0400o06、HB016P11和HB001G02，与Hein等人获得的HB BES一致。[38]，对抗RH BAC克隆的序列。类似地，RH BAC克隆的序列计算机辅助鉴定DM superscaffolds。

BAC测序和装配

本研究对RH和HB中的12个BACs进行了测序。使用德国GATC公司在ABI 3730 xl上使用Sanger测序方法对BAC克隆进行了至少6倍的测序。BAC序列使用Staden Package (MRC Rosalind Franklin Centre for Genomics Research, Cambridge, UK)中的汇编程序Gap4进行组装，达到HTGS II期的最低标准。所有序列事先进行修剪，去除测序载体、克隆载体和大肠杆菌污染物序列。通过将CONTIG与重叠的BAC序列或番茄正交性BAC序列对准，通过将自动组件I与HTGS相I / III从HTGS相I / III带来。通过从重叠的BAC克隆或PCR利用序列来填充CONTIG之间的间隙。KM502302（RH103C24），KM502303（HB016P11），KM502304（HB011I06），KM502305（HB015I19 / HB036I05），KM502306（HB026A19），KM502308（RH131E21），KM502309（HB040O06），KM502310（：BAC的分别以下列登录号提交到GenBankRH082P19），KM502311（RH005L24），KM502312（HB001G02），KM502313（RH175J12），KM502314（RH107O01）。如上所述，还从HTGS期I提前到研究，另外三种BAC作为AC233622，AC233613（RH049C05）和AC236731（GB0036731（GB003E01），其研究。

r基因序列的命名法

来自RH，DM和HB和番茄品种Heinz的R-Genes序列被命名为区分基因型，R-基因群患者患者和阶段。前2个字母表示基因型（RH，DM，HB，Hz），然后表示指定阶段的数量（0或1）。字母A，B或C，反映了隶属关系。最后三个数字区分单个R-基因序列。

序列比对，系统发育和多样化选择分析

使用ClustalW 2.0.12进行DNA比对[40保持默认设置。对齐是使用Jalview手动重新定义的[41，然后使用木村的两个参数模型来创建连接邻居的树。使用PAUP*4.0计算bootstrap值。(Sinauer Associates，桑德兰，马萨诸塞州)。系统发育树使用Figtree v.1.3.1程序进行显示。

被检测到的任一视觉上或使用统计程序，用于检测基因转化GENECONV版本1.18 [序列交流33］．GeneConv使用默认设置运行。如果全球化的话，认为重组存在于交换的船只中P.值< 0.05。每个事件都被视觉确认，当一个基因与多个同源物在同一位置交换序列时，只考虑最长的转换链。当两个序列之间的分离事件仅被一个不匹配隔开时，就被连接成一个更长的转换域。

BAC:

细菌人工染色体

Kbp:

千碱基配对

LRR：

亮氨酸重复

注:

核苷酸绑定

子:

开放阅读框

QRL:

定量阻力轨迹

QTL：

数量性状位点

R-Gene：

抗病基因

RGH:

耐药基因相同器官

R2GH:

R2耐药基因相同器官

UTR:

翻译区

WGS:

全基因组测序

这项研究由Teagasc Walsh奖学金计划、农业、食品和渔业部门的研究刺激基金、欧盟以及Teagasc/JHI核心基金资助。

从属关系

1. 作物，环境和土地利用计划，Teagasc，橡树公园，Carlow，爱尔兰

   Marialaura Destefanis, Istvan Nagy, Brian Rigney, Denis Griffin和Dan Milbourne

2. 细胞与分子科学，詹姆斯赫顿研究所，邓迪，DD2 5DA，英国

   格伦·J·布莱恩，凯伦·麦克莱恩和英戈·海因

3. 农药，植物健康和种子测试实验室，农业，食品和海洋部，Backweston Campus, Celbridge, Co. Kildare，爱尔兰

   Marialaura Destefanis

4. 奥尔胡斯大学分子生物学和遗传学系，Forsøgsvej 14200, Slagelse，丹麦

   什特伊

相应的作者

对应于丹米尔堡．

利益争夺

两位作者宣称没有相互竞争的利益。

作者的贡献

MD进行了分子遗传与进化研究，共同性分析;基因注释;参与构建物理图谱及BAC测序;并起草了手稿。IN进行BAC克隆组装，提供生物信息学支持，参与物理图谱的构建和BAC测序。BR通过同源性分析和基因注释对当前的伪分子组装进行了修改R2地区。GJB、IH和KM对HB BAC文库进行了筛选，并提供了HB BAC末端序列(GJB也参与了手稿的撰写)。DG与DM共同构思并协调了研究，DM是研究的负责人，参与了共同分析、物理图谱的构建、BAC测序和书写。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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