的关键作用PpMYB10.1桃花青素积累及其等位基因类型与肤色表型的关系

背景

果皮呈红色是桃子最重要的特征之一。碧桃)，这主要是由于花青素的积累。三个MYB10的基因,PpMYB10.1，PpMYB10.2,PpMYB10.3在桃果实中被报道为红色和花青素合成的重要调节因子。在本研究中，的贡献PpMYB10.1/2/3.研究了白桃‘望月’和红桃‘赤月’的果皮对花青素积累的影响。然后我们研究了等位基因类型之间的关系PpMYB10.123个日本桃品种的皮肤颜色表型，为今后建立dna标记打下基础。

结果

在‘望月’和‘赤月’的果实发育过程中，花青素积累仅在红‘赤月’果实成熟后期的果皮中观察到，并伴有导致花青素积累的最后一步基因mRNA水平较高UDP-glucose: flavonoid-3-O-glucosyltransferase（UFGT）.这也与PpMYB10.1．不像PpMYB10.1的表达水平PpMYB10.2/3.“望月”和“赤月”在整个果实发育过程中表皮含量都很低。此外,只有PpMYB10.1揭示了‘望月’和‘赤月’叶片和花中总花青素积累的表达水平。引入PpMYB10.1成烟增加了烟草的表达UFGT，产生更高的花青素积累和更深的红色转基因烟草花;然而，过度表达PpMYB10.2/3.与野生型花相比，转基因烟草花的花青素含量和颜色没有变化。双荧光素酶测定表明PpMYB10.1与PpbHLH3的活性显著增加PpUFGT启动子。我们还发现了两者之间的密切关系PpMYB10.1等位基因类型MYB10.1-1/MYB10.1-2，与皮肤颜色的红色强度有关。

结论

我们证明了PpMYB10.1红皮桃中花青素积累的主要调节因子是什么PpUFGT转录。PpMYB10.2/3.可能参与了桃花青素积累以外的其他功能。有两个MYB10.1-2型的桃品种，其果皮颜色呈白色。相比之下，MYB10.1-1或MYB10.1-1/MYB10.1-2两种类型的人分别呈现红色或淡红色。这些发现有助于阐明花青素积累的分子机制，并产生与肤色表型相关的基于基因的标记。

桃子(碧桃)是一种重要的落叶水果，其总产量仅次于葡萄、苹果和梨，居世界第四位。中国是世界上最大的桃果生产国，约占总产量的57%。在日本，桃子排名第六^th在产量上，继2012年的柑橘、苹果、梨、柿子、葡萄之后。果皮颜色是决定桃果商业价值的重要性状之一，其主要决定于桃果红色的花青素或黄色的类胡萝卜素的含量和组成[1，2]。在类胡萝卜素积累方面，黄皮肤型和白皮肤型已被发现，该性状由单一基因控制Y/y连锁群1位点[3.，4]。最近，表征Y/y几个研究小组已经报道了基因座;类胡萝卜素裂解脱氧酶（CCD4)已被确定为黄色色素沉着和功能丧失的调节剂CCD4结果是黄皮肤的人[5- - - - - -9]。相反，红皮桃的红色依赖于花青素的积累，花青素是类黄酮生物合成途径的水溶性色素。红色颜色的强度根据品种和品系的不同而有所不同，这表明红色是遗传控制的。此外，花青素在皮肤中的积累在很大程度上取决于环境因素，如光照和温度条件[10- - - - - -12]。大多数日本品种，包括“赤月”，在环境条件适宜的情况下，呈现红色，而一些日本品种，如“望月”，很少积累花青素;因此，该品种适合罐装加工。在日本，红皮桃的市场价值普遍很高，因此农民有时会使用纸袋处理来提高果皮的颜色，尽管在日本冈山县已经建立了使用红皮品种(称为“Hakuto”)生产白皮桃(http://world.momotaros.com/peach.html）.

花青素积累的分子机制已经在果树中得到了很好的研究[13- - - - - -15]。近年来，许多参与花青素生物合成途径的结构基因和各种转录因子已被鉴定和表征(图2)。1）.其中，MYB转录因子基因经常被发现是花青素积累的主要决定因素，它与碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和WD40蛋白(称为MBW复合物)一起作用，激活关键的花青素生物合成基因[15- - - - - -17]。在葡萄中，MYB基因通过表达UFGT［18，19]。在苹果中，myb参与了花青素生物合成基因的激活，调控了果实中花青素的积累[20.，21]。梨果皮MYB10转录水平与花青素生物合成基因通路和花青素生物合成呈正相关[22，23]。在桃里，三个MYB10的基因,PpMYB10.1(蔷薇科基因组数据库检索号:ppa026640m);PpMYB10.2(ppa016711m),PpMYB10.3(ppa020385)，定位于连锁群3的基因组区域，其中花药颜色（Ag))性状的定位，已被报道为桃果实花青素生物合成的重要调节因子[24]。PpMYB10.2正向调节的启动子PpUFGT，这是唯一一个在果实发育过程中与桃果皮花青素积累表达模式相似的基因[25]。Rahim等。[26的表达水平PpMYB10.1和PpMYB10.3与花青素含量及花青素生物合成途径中关键结构基因的表达水平相关。我们对红皮品种花青素积累的初步研究表明，红皮品种花青素积累水平较高PpMYB10.1但是相当低的水平PpMYB10.3，说明桃皮中花青素的积累主要受PpMYB10.1．

本研究的目的是评价这三种化合物的分子特性PpMYB10利用日本桃品种进行基因鉴定。我们首先用两个日本桃品种，白皮的‘望月’和红皮的‘赤月’，研究了基因转录水平之间的关系PpMYB10.1/2/3.花青素生物合成基因，以及果实发育过程中果皮中花青素的积累。接下来，我们分析过表达PpMYB10.1/2/3.在烟草和管制方面PpUFGT启动子活性PpMYB10.1．最后，我们根据不同的等位基因类型研究了桃果皮的红色程度PpMYB10.1．

‘望月’和‘赤月’果皮中总花青素含量及花青素合成基因的表达分析

‘望月’的果皮在前四个阶段是绿色的，在成熟阶段(第5阶段)是淡黄色的(图5)。2）.“赤月”果皮在早期阶段也是绿色的，在第4和第5阶段分别是部分或接近红色的。2）.测定果皮中总花青素含量(图2)。2 b）.正如预期的那样，白皮的望月在整个果实发育过程中没有在果皮中显示花青素。赤木果实发育初期也未发现花青素，仅在第4期出现，第5期大量增加。这与在“赤月”皮肤的第4和第5阶段观察到的红色一致。

利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测花青素生物合成相关结构基因的表达谱(图2)。2摄氏度）.一般来说，参与上游途径的基因包括PpCHS，PpCHI，PpF3H,PpDFR结果表明，‘望月’和‘赤月’在果实发育过程中表皮表达模式相似;表达量从第1期开始升高，第2期达到峰值，后3期依次下降。这也是的表达模式PpANS在“望月”的皮肤里，而PpANS在第5阶段，“赤月”的表达量最高。细胞的mRNA水平PpUFGT“望月”皮肤在所有阶段都很低，“赤月”皮肤在三个早期阶段也很低，在第4和第5阶段有所增加。虽然表达水平PpCHS，PpDFR,PpANS在“赤月”果实的第4和第5阶段，皮肤中的花青素含量更高，只有最后一步基因直接导致花青素的积累，PpUFGT在‘望月’和‘赤月’果实发育过程中，其表达模式与果皮中花青素的积累密切相关。这些结果表明PpUFGT是望月果和赤月果果皮中花青素积累的关键基因。因此，我们认为MYB可以作为反式因子的基因PpUFGT．

的表达分析PpMYB10.1/2/3.在望月果和赤月果的果皮中

PpMYB10.1，PpMYB10.2,PpMYB10.3在连锁组3中彼此靠近定位。由于它们之间的核苷酸序列高度相似PpMYB10s(无花果。3)， qRT-PCR引物PpMYB10.1/2/3.是根据它们之间不同的核苷酸序列手工设计的。将Real-time PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO载体上，仔细检测其特异性，并对7个质粒克隆进行测序，以确保每个引物集的产物特异性。的表达水平PpMYB10.1/2/3.在‘望月’果实的5个发育阶段中，果皮中含量较低(图2)。3 b）.在“赤月”皮肤中，表达水平PpMYB10.1/2/3.在果实发育初期也较低;然后，转录水平PpMYB10.1在第4期和第5期显著增加，而PpMYB10.2/3.在整个果实成熟过程中保持低浓度。高mRNA水平PpMYB10.1第4和第5阶段发现的与花青素含量和红色色素沉着有关，这只在赤月果实的这两个成熟阶段观察到。这些结果表明PpMYB10.1单独负责“赤月”皮肤中的花青素积累。为了证实这一假设，我们创造了过量表达这三种基因的转基因烟草PpMYB10基因。

过表达转基因烟草植株的特性分析PpMYB10.1/2/3.

子的PpMYB10.1/2/3.由CaMV 35S启动子驱动的烟草SR1使用根癌土壤杆菌菌株LBA4404。再生植株在含有50mg /L卡那霉素的平板上，用提取的基因组DNA进行PCR检测转基因的存在(附加文件)1:图S1a)。对于每一个过表达构建，选择6个独立的转基因植物系，显示相应的转基因存在，转移到土壤中，在温室条件下生长。如图所示。4，介绍PpMYB10.1结果表明，转基因烟草花的红色较野生型烟草花深。转基因烟草荚膜过表达PpMYB10.1野生型烟草的囊皮呈绿色(附加文件)1:图S1b)。转基因烟草植株用PpMYB10.2/3.与野生型花相比，花的颜色没有差异(图2)。4）.这一颜色观察反映了花青素积累明显较高的只有6种花PpMYB10.1转基因烟草品系(图2)4 b）.目的:探讨转基因对黄酮醇、单宁等特定类黄酮类化合物分支基因的调控及其表达水平PpMYB10.1/2/3.和N.烟草，守护神，ANR,UFGT在转基因烟草花中进行分析(附加文件2:图S2)。结果表明PpMYB10.1/2/3.转录mrna(图2)。5）.此外，过度表达PpMYB10.1只是大幅上调NtUFGT表达，和过度表达PpMYB10.2/3.并没有显著改变转基因烟草花中所有四个检测基因的转录(图2)。5 b、附加文件2:图S2)。的表达水平NtUFGT的表达水平是否与PpMYB10.1在6个独立的转基因品系中进行转基因(图2)。5）.只有放在一起看PpMYB10.1能激活烟草NtUFGT，导致转基因烟草花的花青素积累量增加，颜色变深。的函数是什么PpMYB10.2和PpMYB10.3？为了证实这一点，我们分析了“望月”和“赤月”的叶子和花朵中的表达。

总花青素含量及表达分析PpMYB10.1/2/3.“望月”和“赤月”的叶子和花朵

望月和赤月的叶子都是绿色的，没有花青素积累，花青素含量很低PpUFGT转录(无花果。6 a、b）.PpMYB10.1和PpMYB10.3转录水平也很低，但是PpMYB10.2是在望月和赤月的叶子中发现的。6摄氏度）.“赤月”花显示更高PpUFGT表达水平高于望月花，导致赤月花中总花青素含量更高(图2)。6 a、b）.它与表达相关PpMYB10.1在“望月”和“赤月”的花中。PpMYB10.2转录率高，但与花青素含量无关，仅为微量PpMYB10.3在“望月”和“赤月”花中发现了这种表达。这些结果表明PpMYB10.1负责'望月'和'赤月'花中的花青素积累。PpMYB10.2和PpMYB10。3种在望月和赤月的叶子和花中具有花青素积累以外的功能。

的功能分析PpMYB10.1在异源系统中进行瞬时启动子试验

评估…的监管能力PpMYB10.1的表达PpUFGT， FLUC报告基因在假定的控制下的瞬时表达PpUFGT由PpMYB10.1单独的或组合的PpMYB10.1和PpbHLH3在烟草benthamiana叶子。如图所示。7，活动PpUFGT启动子被显著诱导PpMYB10.1在…面前PpbHLH3。PpMYB10.1和PpbHLH3单独使用不能显著提高启动子活性PpUFGT．

差异的调查PpMYB10.1“望月”和“赤月”中的表达

自PpMYB10.1在红皮肤的“赤月”和白皮肤的“望月”中表达差异，然后我们打算研究南汽包括血（PpBL),SQUAMOSA启动子结合蛋白样转录因子（PpSPL1)基因，已报道为上游转录因子MYB红桃的规管[27]。的表达水平PpBL在“赤月”中的表达高于“望月”，但明显的表达PpBL即使是白皮肤的“望月”也有记录，尽管较少(附加文件3.:图S3)。的表达PpSPL1它被认为是启动子的转录抑制因子PpMYB10.1［27的转录呈负相关PpMYB10.1在‘望月’和‘赤月’的果实发育过程中，果皮中含有大量的蛋白质。这些结果表明PpMYB10.1基因表达及红肤色受PpBL和PpSPL1就像血肉之躯一样[27]。然而，有人注意到PpBL‘望月’果实第5期表皮中表达量增加PpMYB10.1表达水平一直很低，表明基因组结构等其他因素也可能参与调控PpMYB10.1活动。因此，我们进一步研究了PpMYB10.1有红皮品种和白皮品种。与赤月型PpMYB10.1相比，望月型PpMYB10.2在上下行序列和内含子序列中存在许多插入/缺失(InDel)和单核苷酸多态性(snp)(暂定为赤月型MYB10.1-1和望月型MYB10.1-2)(图2)。8）.特别是，MYB10.1-2型编码区在I外显子8-13 nt处缺失1个，在III外显子431、464和617 nt处缺失3个snp，导致MYB10.1-2型编码区与MYB10.1-1型相比缺失2个氨基酸，取代4个氨基酸(附加文件)4:图S4)。基于外显子III的这三个snp，我们研究了PpMYB10.1在“清水-白东”中，初步发现是杂合的PpMYB10.1轨迹(MYB10.1-1 / MYB10.1-2)。结果表明PpMYB10.1从MYB10.1-1获得的60个独立无性系(表2)1)，表示感应的原因PpMYB10.1表达归因于PpMYB10.1基因组结构。基于两者的差异PpMYB10.1对23个日本桃品种进行了分类。13个品种显示红色皮肤颜色(颜色指数= 2)，附加文件5:图5a)，包括赤木在内，拥有两种MYB10.1-1型，而拥有白色肤色(颜色指数= 0，附加文件5:图S5b)包括“望月”有两个MYB10.1-2型(表2、附加文件6:图S6)。在7个被分析品种中，皮肤颜色呈淡红色(颜色指数= 1)，另附文件5:图S5c)， 3个品种有2个MYB10.1-1型，另外4个品种有1个MYB10.1-1型和1个MYB10.2型(表5)2、附加文件6:图S6)。虽然我们不能排除其他的可能性，如表观遗传调控的差异PpMYB10.1在“望月”和“赤月”中表达的差异，这些结果表明肤色表型可以部分解释PpMYB10.1等位基因类型。

PpMYB10.1有助于桃果果皮和花中的花青素积累

据报道，转录因子MYB10组是导致苹果、梨和草莓等蔷薇科果树皮肤呈红色的原因[21，23，28]。对于peach, Ravaglia等人。[25第一次证明了……的重要性PpMYB10(对应于PpMYB10.2)对油桃花青素积累的影响，而Rahim等[26的表达水平PpMYB10.1和PpMYB10.3与果皮、中果皮和果核周围的中果皮花青素含量相关。这些结果与我们的表达分析结果不一致PpMYB10.2/3.转录本在红皮肤样品中非常低，仅表达PpMYB10.1与整个果实发育过程中花青素的积累高度一致(图2)。2 b和3 b）.最近，Zhou等人。[27也表明了这一点PpMYB10.1在血肉桃中表达与花青素水平相关。我们认为花青素的生物合成机制可能与所分析的桃品种和果实组织有关。在本研究中，直接贡献的是PpMYB10.1发现赤木的花青素积累和果皮和花的红色(图2)。2 b，3 b和6）.在‘望月’和‘赤月’的果实发育过程中，PpMYB10.1表达与PpUFGT(无花果。2摄氏度）.烟草叶片瞬时表达分析表明PpMYB10.1/PpbHLH3显著增加了活动PpUFGT启动子(无花果。7）.此外，过度表达PpMYB10.1结果表明，转基因烟草花青素含量较高，颜色较深，且仅呈增加趋势NtUFGT在类黄酮生物合成途径中表达而无其他分支基因(图2)。5 b、附加文件2:图S2)。此外,PpMYB10.1单独有助于花青素的积累和果肉中的红色，就像“赤月”水果的皮肤一样(附加文件)7:图S7)。这些结果证实了PpMYB10.1是花青素生物合成的关键调控因子并成功激活了启动子吗PpUFGT至少在日本的桃品种中，包括“赤月”。

PpMYB10.2/3.有助于花青素积累以外的过程

的表达水平PpMYB10.2/3.在‘望月’和‘赤月’的整个果实发育过程中都很低，与花青素积累和红色着色无关(图2)。3 b）.相当程度的PpMYB10.2在不含花青素的桃叶中检测到表达，且高表达PpMYB10.2与‘望月’和‘赤月’花的花青素含量也不一致(图2)。6）.Rahim等。[26表明PpMYB10.2在叶片衰老和花发育过程中有助于花青素的积累。然而，最近的一项研究表明PpMYB10.4连锁基团6调控桃叶片花青素积累PpMYB10.2不会使叶子变红[29]。在本研究中，我们的研究结果还提出PpMYB10.2/3.不参与桃叶片和花中花青素的积累(图2)。6）.此外，介绍PpMYB10.2/3.没有改变烟草中的类黄酮生物合成基因，也没有改变转基因烟草花中花青素的积累(图2)。4、附加文件2:图S2)。在拟南芥，AtMYB75(NM_104541)和AtMYB90(AF062915)命名花青素色素的生产（AtPAP1),2（AtPAP2)分别被鉴定为花青素生物合成的调节因子。AtPAP1和AtPAP2在Ravaglia等人构建的MYB系统发育树中，它们具有较高的序列同一性。[25]。然而，过度表达不是AtPAP2但AtPAP1刺激转基因植株花青素结构基因表达水平和花青素积累拟南芥植物(30.]。同样的,PpMYB10.1/2/3.在氨基酸水平上具有较高的序列同一性。我们假设R/ b样bHLH结合基序([DE]Lx₂(RK) x_3.Lx₆Lx_3.R)PpMYB10.2/3.显示出一种不同的氨基酸PpMYB10.1(无花果。3) ［31]，由…PpMYB10.2/3.蛋白质可能与不同的bHLHs作用PpMYB10.1在花青素生物合成以外的过程中起作用。

的初步比较MYB10.1白皮桃和红皮桃品种的等位基因

自PpMYB10.1是花青素在皮肤、花和果肉中积累的关键调控基因，我们试图初步了解PpMYB10.1在“望月”和“赤月”中观察到激活。我们首先试图在上游转录因子中寻找原因PpMYB10.1。的表达分析PpSPL1和PpNAC提示这些基因可能是调控的因素之一PpMYB10.1“Mochizuki”和“Akatuski”的表达水平，但其他因素也可能涉及到观察到的差异表达的原因(图2)。3 b）.为了证实这一点，我们鉴定了转录物PpMYB10.1使用“清水-博东”输入。结果清楚地表明，所有的转录PpMYB10.1类型不是来自MYB10.1-2，而是来自MYB10.1-11)，表示激活PpMYB10.1表达取决于PpMYB10.1等位基因类型。然后我们比较了不同的核苷酸序列PpMYB10.1白皮“望月”桃和红皮“赤月”桃之间的orf，造成不同PpMYB10.1从MYB10.1-1和MYB10.1-2型中翻译蛋白(附加文件)4:图S4)。此外，MYB10.1-1和MYB10.1-2在5 ' -上游、3 ' -下游和内含子上记录了包括indel和SNPs在内的多个序列差异(图2)。8）.因此，的基因组序列PpMYB10.1利用23个不同肤色的日本桃品种，将其分为PpMYB10.1、MYB10.1-1和MYB10.1-2两种类型，其中MYB10.1-2两种类型的果皮颜色为白色，而MYB10.1-1和MYB10.1-1/MYB10.1-2两种类型的果皮颜色为红色或淡红色(表1)2）.MYB10.1-1型和MYB10.1-2型之间的哪些序列差异是导致其激活和失活的原因PpMYB10.1长大。周等。[27他调查了这些人的DNA序列差异PpMYB10.1在“大红袍”血肉桃品种的启动子区和第2内含子中分别发现了一个483 bp的插入和一个SNP。这个483-bp的插入似乎与我们研究中发现的494-bp的InDel相当(图2)。8）.然而，这个483-bp的插入并没有被证明与其他中国桃品种的红色果肉有关[27];换句话说，这个插入不是激活/灭活的原因PpMYB10.1．同样，考虑到使用红桃品种‘Lovell’的桃参考MYB10.1基因具有该插入(见https://www.rosaceae.org/species/prunus/prunus_persica)，我们也假设MYB10.1-2中494-bp的插入与功能无关，但我们发现我们的494-bp InDel与23个日本品种的红色指数有关。在这项研究中，23个日本桃子品种彼此之间有着密切的遗传关系，你可以看到“白东”桃的几个运动(表)2)，这或许可以解释原因PpMYB10.1等位基因类型与这些品种的皮肤红色指数相关。因此，我们不确定我们的结果是否适用于其他品种/品系，特别是日本品种以外的品种。相比之下，我们还发现了其他indel和许多snp在5 ' -上游，3 ' -下游，外显子和内含子PpMYB10.1日本桃品种的等位基因。这表明日本桃品种的基因组结构与中国桃品种并不完全相似[27]。目前，我们尚未确定MYB10.1-1和MYB10.1-2型中导致MYB10.1-1型激活的实际关键序列差异。需要进一步的调查来确定DNA序列中直接促成表达的基本因素PpMYB10.1红皮桃。

我们的结论是PpMYB10.1红皮桃花青素积累的主要调控因子是否与红皮桃有密切关系PpMYB10.1等位基因型和肤色表型(至少在23个日本品种中)。这一发现将使进一步研究的DNA序列PpMYB10.1，为水果育种者建立与白桃和红桃相关的DNA标记提供了必要的信息。

植物材料

桃果采自日本筑波NARO果树科学研究所(北纬36°，东经140°)果园里的“望月”和“赤月”树。2013年4月26日采集叶和花。桃皮和果肉在果实发育的5个不同阶段被人工从3到9个果实中分离出来8:图S8)。其他品种见表2在日本冈山县农林渔业技术中心的果园中种植(北纬35°，东经134°)。皮肤样品冷冻在液氮中，保存在-80°C，直到分析。根据桃皮红色色素沉着的程度/强度对23个桃品种进行了分类;我们将颜色指数0、1和2分别定义为白色肤色、淡红色肤色和红色肤色(参见附加文件)5:图5)。

qRT-PCR及表达分析

将桃样品置于液氮砂浆中研磨，用热硼酸盐法从冷冻粉末中提取总RNA [32]。凝胶电泳和分光光度法分别检测提取RNA的质量和浓度。第一链cDNA合成，使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)逆转录1 μg高质量总RNA。将20 μl cDNA稀释20倍作为qRT-PCR模板。靶基因见附加文件9表S1。RT-PCR引物设计使用Primer3网站(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/、附加文件9:表1)。RT-PCR产物通过片段大小、熔化曲线和测序进行确认。用相对定量法分析靶基因的表达水平延伸系数2管家基因(EF2, ppa001368m)作为内参基因。反应混合物(10 μl)中含有稀释后的cDNA样品1 μl，每个引物0.5 μl (10 μl)， GeneAce SYBR qPCR Mix α Low ROX (Nippon Gene, Tokyo, Japan) 5 μl, DEPC水。使用7500 Real Time PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)进行qRT-PCR，并使用7500 System Sequence Detection Software ver对结果进行分析。1.4.每个样品使用3个生物重复和3个技术重复进行实时分析。

质粒载体构建转化

子的PpMYB10.1/2/3.用KOD-Neo DNA聚合酶(Toyobo, Osaka, OSK, Japan) PCR从‘Akatsuki’的第一链cDNA中生成。根据制造商的说明，将具有预期大小条带的纯化PCR片段克隆到pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen)中。的orfPpMYB10.1/2/3.在35S CaMV启动子转录控制下插入pGWB2载体[33用LR克隆酶(Invitrogen)。然后将重组pGWB2质粒转入根癌土壤杆菌LBA4404采用热休克法，在含有卡那霉素、潮霉素和利福平的Luria-Bertani培养基上28℃培养。

的稳定变换n .烟草

切除的叶子n .烟草以4周龄幼苗的SR1为外植体材料，与之共培养农LBA4404窝藏PpMYB10.1/2/3超表达结构。这种转变是按照Dobhal等人先前的描述进行的。[34]。收集3月龄转基因烟草植株的花，立即在液氮中冷冻，然后在- 80°C保存，用于RNA分离和花青素分析。采用十六烷基三甲基溴化铵缓冲液和硅柱萃取法从转基因烟草花中提取总RNA [35]。的表达水平NtFLS(AB289451),NtANR(AM791704),NtLAR(AM827419),NtUFGT(GQ395697)和转基因PpMYB10.1/2/3.使用NtActin(X69885)作为参考。用于转基因烟草基因表达分析的引物在附加文件中列出9表S1。

瞬时双荧光素酶测定

假定的桃的启动子区PpUFGT该基因位于起始密码子上游2000 bp处，利用从“赤月”果实中提取的基因组DNA进行扩增(引物列在附加文件中)9:表1)。的启动子区域PpUFGT克隆到pGWB35 [33]，其中萤火虫荧光素酶(FLUC)基因受到克隆启动子的控制。将从pRL-SV40载体(Promega, Madison, WI, USA)中扩增的renilla luciferase (RLUC)基因作为内标载体克隆到pBGW2载体中。子的PpMYB10.1和PpbHLH3从“Akatsuki”第一链cDNA扩增的(ppa002884m)也被克隆到pGWB2中。所有合成的质粒都转化为农LBA4404。瞬时表达测定采用n benthamiana用我们实验室可用的方法36]。采用双荧光素酶测定试剂(Promega, Madison, WI, USA)检测FLUC和RLUC，并使用ChemiDoc™MP系统(Bio Rad, Hercules, CA, USA)检测其活性。以FLUC与RLUC的比值收集数据。每个处理进行6个独立的生物复制(来自不同植物的6个叶片)和技术复制(2-3次注射同一叶片)。

总花青素的测定

将桃和转基因烟草样品置于10 ml甲醇:盐酸(99:1,v/v)中。提取在4°C的黑暗中过夜。采用紫外-2450分光光度计(UV-2450;日本京都岛津)。相对花青素含量归一化公式如下:归一化后的OD530 = [(OD530- od650) - 0.2 × (OD650-OD620)] [37]。每次测量进行3次独立的生物重复。

分析PpMYB10.1“清水白东”皮肤中转录的等位基因

“清水白东”的皮肤PpMYB10.1基因型初步分析为MYB10.1-1型和MYB10.1-2型，用液氮冷冻，然后用Multi Beads Shocker (Yasui Kikai, Osaka, Japan)粉碎。用十六烷基三甲基溴化铵法从粉末状皮肤中提取总RNA [38]。第一链cDNA合成，使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)逆转录1 μg高质量总RNA。用于鉴别的RT-PCR引物PpMYB10.1等位基因类型在附加文件中显示9表S1。RT-PCR产物亚克隆至Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)，并测序。

的基因组序列分析PpMYB10.123个桃品种

然后，我们用23个日本桃品种确定了基因组序列(表2)2）.使用DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Tokyo, Japan)提取桃皮基因组DNA。我们首先用基因组DNA和引物进行PCR，用P1、P2和P3引物对InDel进行鉴别(引物见附加文件)9:表1)。简单地说，用3个引物的混合物进行PCR，其中MYB10.1-1/MYB10.1-1 (P1/P2)和MYB10.1-2/MYB10.1-2 (P2/P3)分别扩增出609和426 bp的条带，而MYB10.1-1/MYB10.1-2则扩增出两个条带。这里，P1/P2引物结合后，由于扩增子长度较长(超过5800 bp)，无法在MYB10.1-2/MYB10.1-2型中产生条带。然后用多组引物PCR得到5′-上游、3′-下游、外显子和内含子的序列(数据未显示)。PCR产物按上述方法进行亚克隆和测序。

所有支持数据都作为附加文件包含。

答:

花青素合成酶

bHLH:

基本helix-loop-helix

提单:

血

气:

查耳酮异构酶

CHS:

查耳酮合酶

DFR:

dihydroflavonol-4-reductase

F3H:

黄烷酮3-hydroxylase

美国人:

萤火虫荧光素酶

子:

开放式阅读框

qRT_PCR:

定量实时聚合酶链反应

RLUC:

renilla荧光素酶

SPL1:

SQUAMOSA启动子结合蛋白样转录因子

UFGT:

UDP-glucose: flavonoid-3 -O葡糖基转移酶

本研究由科学研究资助基金(编号:25·03516)，来自日本科学促进会(JSPS)。我们感谢今井博士提供的SR1烟草植株。

从属关系

1. NARO果树科学研究所，筑波藤本2-1，茨城县，305-8605

   段凤英，白松龄，八垣英明，森口隆也

2. 日本冈山县农林水产技术中心农业研究所，日本冈山市赤洼县koada - oki 1174, 709-0801

   田村孝之和东原震介

3. 日本冈山县农林水产技术中心生物科学研究所，冈山县木比州吉川7549-1，日本，716-1241

   吴克群Oda

相应的作者

对应到Takaya守口或吴克群Oda．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

TM和KO设计了这项研究。PAT、SB、HY进行实验。TT和SH用于桃果色指数分析。PAT和TM分析数据并撰写论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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