枣的代谢组学(凤凰dactylifera)揭示了一个高度动态的成熟过程，说明了果实成分的主要变化

背景

枣是一种营养价值可观的热带水果。以前对枣代谢组的全球代谢表征的尝试受到样本量小和地理采样有限的限制。在这项研究中，为了确定果实代谢组的主要决定因素，研究人员利用代谢组学技术测量了两个独立的成熟枣群，这些枣群在原产地、品种和果实加工条件上表现出极大的多样性。

结果

多变量分析显示，第一主成分(PC1)与枣的生产国显著相关。来自不同发育阶段的未成熟枣的一个较小的数据集的可用性有助于建立枣成熟过程的模型，这有助于揭示PC1中强烈的成熟特征。分析显示，在PC1一端具有早熟剖面的果实中，干型枣的富集，而在PC1另一端具有晚熟剖面的软型枣的过度代表。干枣是北非地区的典型，而软枣在海湾地区更受欢迎，这在一定程度上解释了PC1与地理之间的联系。通过对表达代谢物与PC1相关水平的负荷值的分析，揭示了沿PC1的一系列代谢物种类的富集模式。根据已知的枣成熟阶段，观察到三个不同的代谢阶段:早期阶段富含调节激素、胺和多胺、能量产生、单宁、蔗糖和抗氧化活性;第二阶段持续进行苯丙素次级代谢、基因表达和磷脂代谢;晚期阶段有明显的糖脱水活性和降解反应，导致挥发性合成增加。

结论

这些数据表明，枣成熟作为枣代谢组变化的主要驱动因素的重要性，负责其多样化的营养和经济价值。枣子成熟过程的生化特征与其他水果一致，但自然干燥可防止枣子成熟后的退行性衰老。基于成熟的枣呈现不同程度的成熟的发现，我们对枣代谢组的调查基本上揭示了成熟过程中交换代谢状态的快照，从而深入表征了潜在的生物学。

枣椰树上的枣子(凤凰dactylifera)构成了阿拉伯世界的标志性经济资产。枣椰树种植在维持该地区的生态系统方面发挥着重要作用，在世界上许多其他地区，特别是东南亚、南欧、拉丁美洲和美国也有种植。不像棕榈树可以忍受各种气候，果实的质量取决于气候和农业条件。1]。枣子的成分因品种而异[2]由于收获前和收获后的条件而在同一品种内[3.]。特别是成熟和成熟的过程，造成了枣成分的主要变化[4]。枣子的发育分为四个阶段，它们的阿拉伯名称为Kimri, Khalal，Rutab和Tamr［1，5]。在Kimri阶段，枣子的质地坚硬，呈绿色，尺寸和水分迅速增加，酸性物质和涩味单宁含量也在增加。4]。红枣的蛋白质和游离氨基酸含量在青期最高，在整个成熟过程中不断下降[6，7]。由叶绿素降解引起的颜色从绿色变为黄色(某些品种为粉红色)，标志着进入Khalal阶段，这与其他水果(包括番茄和草莓)的破坏阶段相对应[8]。Khalal阶段的另一个特点是水分的持续流失和非还原性糖(主要是蔗糖)含量的突然上升[9]。果实的软化从这一阶段开始，并在鲁塔卜后期达到最佳水平。后者的特点是香气增加[10]和水果褐变[4]。红枣作为新鲜水果出售，容易腐烂。只有在水分进一步流失到25%以下，并在Tamr阶段同时积累还原糖后，水果才会变得干燥和可储存[11]。干燥过程会导致某些代谢物(如花青素)的水平降低[11]和维生素C [1]同时提倡其他的，包括减少糖分[1]、不饱和脂肪酸[12]及美拉德物质[13]。

三种主要类型的枣被称为软的、半干的和干的。软枣在成熟过程结束时水分含量高达30%。它们对病原体非常敏感，经常不能在树上晒干。在Rutab阶段，晒干软枣是很常见的;然而，在这个阶段，某些品种的水果的美味可能导致提前收获，然后人工成熟[4]。重要的是，软枣在人工干燥后仍能保持柔软的质地。以Deglet Noor为最著名的半干枣品种更紧实，水分更少，容易自然干燥。1]。干型品种口感更紧实，是所有品种中最干的，水分含量低于20%，而且会变色[1]。干燥和半干燥品种有时在收获后再水化以达到质量标准[4]。在生化水平上，半干和干品种的特点是蔗糖与还原糖的比例较高，而软品种则主要含有还原糖[14]。软枣、半干枣和干枣之间的差异超越了成分、表型和采收后处理，还涉及气候要求。干枣需要炎热干燥的环境才能达到最佳生长和成熟，而软枣可以忍受一定的湿度，需要较少的热量单位[15，16]。对具有代表性的突尼斯软型和干型品种的遗传分析表明，群体间存在显著的遗传分离，类型和遗传标记之间存在显著的关联[17，18]。重要的是，生产软枣品种的枣树与生产干枣品种的枣树表现出不同的树表型[18，19]。

代谢组学技术为弥合基因型和表型之间的差距提供了一种很有前途的方法[20.]，并已成功用于研究果实和种子生物学的各个方面[13，21，22]。以前对枣的代谢组学测量受到少量枣品种和有限的地理采样的限制[10，12，13]。El Arem及其同事用HPLC和GC-MC技术测量了8种枣，它们都是突尼斯南部的当地品种，具有三个不同的发展阶段[10，12]。测定的挥发性和非挥发性代谢物在不同发育阶段和品种间差异显著。最近，Farag等人使用糖和黄酮醇将21个埃及枣品种分类为不同的簇，使用联合UPLC/GC-MS方法[13]。在这项研究中，对两大成熟枣果进行了全面的UPLC-MS和GC-MS代谢组学测量，这些枣果在产地、品种和收获后处理方面存在很大差异。目的是评估可能导致日期代谢组变化的因素;特别是发育效应，这是根据一个单独的未成熟枣数据集建模的。我们预测，我们的研究结果适用于更大的枣种群给定的样本量和水果条件的异质性。

枣果实的采集与表型特征

成熟的水果

在本研究中，109个独特的枣品种(凤凰dactylifera)，分别在两个不同的场合收集:第一次收集于2012年，第二次收集于2013年。这个词各种在这里用来描述一个不同的表型类型的枣，如果从不同的国家收集相同的品种，每个国家为每个收集的样本分配不同的样本ID。从不同国家收集的14个日期样品的水果照片见图。1。对于每个日期样本，选择少量水果进行预处理。对每个水果进行称重，并记录每个日期样本的平均重量。将两个果实切成两半，以获得果皮和种子的纵向和横切面视图。一张国际ColorChecker色彩重现表(ColorChecker Classic, X-Rite，美国)和一把20厘米的尺子放在人造光下白色背景上的水果上，用佳能Power Shot S100美国相机装在预先设置的三脚架上拍摄照片。可以在附加文件中找到示例照片1:图S1使用Matlab库从给定照片上显示的所有水果中提取RGB颜色值，并分别对每个颜色范围的结果进行平均。从所有处理过的照片的颜色图表读数被用来校准照片的颜色测量。进一步的表型表征包括根据文献分类为软型、半干型和干型，以及每个枣样品一个代表性果实的水分含量测量。对随机抽取的三分之一的枣子样品进行水分测量，并根据在105°C的烤箱中孵育116小时后水果重量损失的百分比进行测量。本研究中所有品种的完整清单及其生产国、采集点和类型信息可在附加文件中找到2。表中列出了每次采集样本的汇总统计数据，包括品种数量、样本数量和每个生产国取样的频率1一。总体而言，第一次样本收集的枣主要来自海湾地区，在相当干燥的条件下从商店和节日中获得，而第二次样本收集的枣主要来自北非，主要是从棕榈树中获得的新鲜枣。对于第二次收集的日期，实地工作许可是从被访问绿洲的所有者口头获得的。两种样品收集之间的销售日期与新鲜日期的性质意味着不同的收获后条件。所有收集到的棕褐色的枣子，在进一步加工前，先在室外晾干两周。一般来说，如果低水分阻止了枣子外观的进一步变化，枣子就被认为是成熟的。值得注意的是，干燥类的枣自然成熟，但由于内在较高的水分水平，软类枣往往人为成熟(详情请参阅背景)。

未成熟的水果

在第二次采集样本时，在收集棕榈树成熟果实的同时，收集仍在成熟阶段的未成熟果实，偶尔收集成熟前阶段的晚绿色Kimri果实。共收集了37个未成熟的枣子，对应10个枣子样品。对10个样品中的每一个，根据颜色变化和皮肤皱纹的视觉评估，对未成熟水果的成熟程度进行排名。每个水果都被赋予了一个基于样本编号和一个反映样本中水果等级的字母的ID。表中列出了所有未成熟的水果id和相应的样品id2。来自两个日期样品的未成熟水果的照片如图所示。1 b。

代谢物的测量日期样品

日期、预处理和测量方案

在第一次采集的样品测量一年后，分别测量了第二次采集的枣果实的代谢含量。MetaSysX GmbH公司对第一批数据进行了预处理。由MetaSysX GmbH和Metabolon Inc.， USA。第二次采集的数据由美国Metabolon公司单独进行预处理和测量。MetaSysX和Metabolon的样品处理和代谢组学测量方案在附加文件中有详细描述3.。

简单地说，用MetaSysX将50毫克的枣果皮和果肉在液氮中快速冷冻，并按标准化程序提取[23]。干燥的代谢物提取物用a测定水域ACQUITY反相超高效液相色谱(RP-UPLC热费希尔Exactive质谱仪由电喷雾电离源(ESI)和Orbitrap质谱仪组成。采用C8和C18色谱柱分别进行亲脂和亲水测定。全扫描MS模式记录色谱图(质量范围[100-1500])[23]。使用REFINER MS®7.5 (Genedata，瑞士)软件分析和处理UPLC-FT-MS运行的色谱图。使用内部软件工具进一步过滤和分析数据(参见附加文件)3.)。样品也使用安捷伦科技GC耦合到leo Pegasus HT质谱仪由EI电离源和TOF质谱仪组成。立柱:30米DB35;启动温度:85°C 2分钟;梯度:15°C每分钟高达360°C。从Leco Pegasus软件导出的NetCDF文件被导入到R”。Bioconductor包TargetSearch用于将保留时间转换为保留指数(RI)，对色谱图进行对齐，提取峰并通过将光谱和RI与GMD进行比较来注释它们[24，25]。从两个平台获得的数据根据样品重量和测量日归一化，以尽量减少在许多天的测量过程中的过程误差。

用Metabolon公司的代谢物(Metabolon Inc.)制备枣样品，并按标准溶剂萃取法提取。26]。UPLC/MS/MS分析基于Waters ACUITY超高效液相色谱(Waters Corporation, USA)和ThermoFischer Scientific Orbitrap Elite高分辨率精确质谱仪(Thermo Fischer Scientific Inc.， USA)，配备加热电喷雾电离(HESI)源和Orbitrap质谱仪。在酸性和碱性LC相容溶剂中重构了LC正、LC负模式的干燥样品提取物。使用单独的专用柱对每个样品进行两次独立的注射。质谱分析在质谱和数据依赖质谱之间交替进行²使用动态排除进行扫描。采用气相色谱/质谱法，将样品在真空干燥下干燥一整天，然后用双甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)在干燥的氮气下衍生化。GS/MS分析基于ThermoFinnigan™TRACE™DSQ™(ThermoFinnigan, USA)快速扫描单四极杆质量分光光度计，使用电子冲击电离源。气相色谱柱为5%苯基，温度变化范围为40至300°C，时间跨度为16分钟。使用内部信息系统提取两个平台的原始数据文件(参见附加文件)3.)。由Metabolon Inc.维护的参考图书馆[27]，由包含保留时间、保留指数、质荷比(m/z)的化学标准品和包括MS/MS光谱数据在内的色谱数据组成，用于鉴定实验样品中的代谢物，详细信息见[28]。在本研究中，样本在两到三天的时间内进行分析，因此执行数据归一化步骤以纠正仪器日间调谐差异的变化。

测量实验设计

第一次收集的日期包含62个日期样本，MetaSysX测量分三次进行，共产生186个测量的代谢谱(表2)1- b)。对于Metabolon, 34个样本被重复测量，而28个样本被单独测量，总共测量了96个代谢谱(表1)1- b,无花果。1 c)。在本文的其余部分，我们将后者称为“DS1-bolon”，而前代谢组学数据集将称为“DS1-sysX”。第二次样本采集的数据仅由Metabolon测量，因此衍生的代谢组学数据将简称为“DS2”。DS1-bolon和DS2代谢组学数据可在附加文件中找到4&附加文件5分别。实验设计包括对51个成熟日期样本中的每个样本进行单次测量(表2)1- b,无花果。1 c)，同样地，37个未成熟的水果每个都测量一次。为了考虑批量测量效应，第一次采集的10个水果与第二次采集的88个水果一起再次测量，得到98个测量的代谢谱(表2)1- b)。我们分别使用术语“ds2 -未成熟”和“ds2 -成熟”来区分来自37个未成熟日期样本和61个成熟日期样本(包括第一次收集的10个样本)的代谢组学数据。1 c)。DS1-sysX、DS1-bolon和DS2的样品特性总结如表所示1- b。由于本文广泛使用了Metabolon测量数据集，因此在图中进一步说明了这些数据集。1 c。

代谢组学数据的统计分析

数据预处理和平台比较

对代谢组学数据进行对数变换和缩放，使每个测量的代谢剖面的测量值中位数等于整个数据集的总体中位数。对DS1-sysX、DS1-bolon和DS2分别进行规范化。默认情况下，生物重复(当可用时)不合并，并且每个重复的测量被视为单独的代谢谱。然而，由于分析很少，需要对每个日期样本进行一次测量，并对重复进行平均。在适用的情况下，将清楚地指出这一点。平台的比较是基于样本中平均代谢物缺失水平和生物重复的中位相对标准偏差(RSD)。RSD表示为重复的代谢物标准偏差除以平均值。通过对第一次收集的样品(或DS1-bolon)进行Metabolon测量，可以通过对混合样品的均匀混合物进行重复测量获得技术重复数据(参见附加文件)3.)。计算这些技术重复的中位数RSD，用Metabolon评估数据质量。

成熟日期和质量控制的无监督PCA分析

使用多变量统计分析软件包SIMCA v13.0.3分别对DS1-bolon、DS1-sysX和DS2-mature进行主成分分析，以表征各自数据集方差占显著比例的集体代谢变化。Simca默认代谢物缺失阈值为50% [29]。提取的主成分的显著性是通过内置的交叉验证从SIMCA得到的，其中对于每个连续的成分，部分数据交替地保留在模型之外，然后预测[29]。基于PC1/PC2二维空间，位于Hotelling 95%置信椭圆区间之外的DS2-mature数据样本78-BZGZ-MA和105-ZGHL-EG被视为异常值，排除在数据集的进一步分析之外[29]。

枣成熟过程的SIMCA OPLS-DA和O2PLS-DA模型

枣成熟的代谢特征通过对第二次枣样本收集的发育阶段数据集(ds2 -未成熟数据集)的分析建模如下:首先，对测量的代谢组学数据进行PCA分析，以确认之前通过对果实成熟程度的视觉评估设定的单个果实的样本内排名(参见上一节)。PCA分析揭示了具有可比成熟剖面的水果集群跨样本(更多细节在结果部分)。这些聚类用于定义开发阶段类，作为OPLS-DA分类器的训练集[29，30.]。将分类器应用于DS2中其余的样本，可以计算出指示样本成熟代谢状态的类别预测分数。对于DS1-bolon，由于批量测量之间可能存在差异，在ds2 -未成熟数据上训练的OPLS-DA模型不适合。此外，与第二个日期集合不同的是，第一个集合中没有包含开发阶段数据集。相反，我们开发了一种基于第一次样本采集的10种水果的策略，这些水果沿着第二次样本采集的样本再次测量。由于所讨论的样品包含在两个批次测量中，因此它们将被称为第一批和第二批样品对于本文的其余部分。我们从第一次样本收集中预测日期成熟状态的策略如下:首先，我们使用先前在ds2未成熟样本上训练的OPLS-DA模型来预测第一批和第二批样品基于与训练集相同批次测量的DS2数据。该类信息用于基于第1批和第2批代谢组学测量数据对相同样品(第1批和第2批样品)训练O2PLS-DA分类器。O2PLS-DA程序[29，30.]能够根据对训练集的多次测量(这里来自不同的批量阅读)，一致地识别出训练集中不同类别的代谢物。O2PLS-DA模型的综合性质意味着它可以用于计算第一次和第二次样本收集日期的类别预测分数。第一次样本收集的分数用于指示这些日期样本的成熟状态，而第二次样本收集的分数用于通过与原始OPLS-DA模型对相同样本的类别预测分数进行比较来优化和验证O2PLS-DA模型(更多细节见附加文件)1:图S2)。O2PLS-DA模型仅在代谢测量数据上定义。

成熟枣的pc与枣(软/干)类型、生产国、成熟状态和颜色的关联分析

采用统计分析R软件3.1.1版中的lm函数运行回归模型。PC ~ date_variable，其中date_variable由四个变量中的一个组成:date_type，一个分类变量，有两个级别:软的和干的，半干的类型被分配到干类2);date_country，将抽样国家从西向东排序的有序变量;date_ripening_state分别对应OPLS-DA和O2PLS-DA模型对第一次和第二次采集样本计算的类别预测分数，date_color是基于红/绿/蓝(RGB)颜色测量平均值的连续变量。R包地图，生成图3所示的地理地图。2描绘国家生产的日期。

成熟期pc下载空间代谢物种类分布分析

为了进一步表征PC1，我们在底层负荷值空间上人工检测了PC1代谢产物的分布，这些代谢产物被划分为氨基酸代谢、糖代谢、能量代谢、脂质代谢、嘌呤和嘧啶代谢、次级代谢和维生素代谢等广泛的代谢类别。后者是指通过PCA分析赋予代谢物的一组负荷值，其中每个负荷值表示相应代谢物丰度剖面与PC评分之间的相关性。在广泛的代谢类中，确定了具有相同功能或结构特征并具有可比负荷值的代谢物组。它们的共同特征主要包括共通途径、共同的催化活性或统一的结构主题。这些代谢物组被映射到原始大类中的亚类如下:

氨基酸代谢

细化为子类氨基酸这包括蛋白质生成氨基酸和非蛋白质生成氨基酸亚类一级胺由氨基酸直接脱羧而来，3)亚类二肽从成对的氨基酸偶联物，4)亚类谷胱甘肽循环和谷胱甘肽代谢具有氧化和还原形式的谷胱甘肽，在谷胱甘肽合成和降解途径中类似谷胱甘肽和γ -谷氨酰氨基酸中间体的代谢物，5)亚类n -乙酰化氨基酸6)子类多胺和多胺降解。

糖代谢

细化为以下子类:1)子类非还原糖以蔗糖和蔗糖类糖为特征的亚纲还原糖和衍生醇、内酯和酸3)子类三羧酸循环封装二羧酸和三羧酸中间体，4)亚类糖酵解捕获磷酸化糖以及关键产物丙酮酸酯和衍生物乳酸，5)亚类糖脱水包括果糖和葡萄糖脱水的产物。

脂质代谢

其中可识别出以下子类:1)子类溶血磷脂2)子类lysophospholipid退化除了溶血磷脂的n -酰基乙醇胺衍生物外，还具有自由的头基和剩余的溶血磷脂酸或可选择磷酸化的头基和剩余的单酰基甘油[31］，3)亚类不饱和脂肪酸和氧脂类sphingoid基地。

嘌呤和嘧啶代谢

被分成两个子类，每个子类都有不同的加载值范围:1)子类核酸和tRNA核苷封装简单形式的核碱基和DNA/mRNA核苷，以及携带更复杂的tRNA特异性修饰的核苷。核苷修饰的产物已知发生在成熟的真核rRNA中[32]显示了不同范围的加载值，并在子类下捕获核糖体rna核苷。

次生代谢

在负载空间中观察到3个代谢物簇，包括:1)亚类丹宁酸2)子类一般苯丙烷途径具有一系列查尔酮衍生物类黄酮，不包括单宁，以及前体羟基肉桂酸酯和其他衍生物，3)亚类聚甲氧基肉桂酸酯、羟基苯甲酸酯和挥发物(VOCs)包括二甲氧基肉桂酸酯和三甲氧基肉桂酸酯、羟基苯甲酸酯和肉桂酸甲酯的潜在衍生物[33]和源自前体和产物分子的挥发物。

维生素代谢，激素代谢和能量代谢

这些都是不需要进一步细化的小类。

最后是一般类别降解活性和氨基酸挥发性(VOC)是为了捕获嘌呤、维生素和氨基酸降解的代谢物，从而合成短链挥发物[8]。对于文章的其余部分，所有上述提到的代谢物亚类以及未精制的类别维生素代谢，激素代谢，能量代谢和降解活性和氨基酸VOC将统称为“代谢物类”。值得注意的是，分析仅限于代谢测量数据。

枣果代谢组学数据集和平台比较

在这项研究中，成熟的枣子在两个不同的场合从14个不同的国家收集，包括:摩洛哥、阿尔及利亚、突尼斯、利比亚、埃及、苏丹、约旦、沙特阿拉伯、伊拉克、卡塔尔、阿拉伯联合酋长国、伊朗、巴基斯坦和美国。与第二次采集的枣子数据不同，第一次采集的枣子数据由MetaSysX和Metabolon同时测量，这分别产生了两个代谢组学数据集DS1-sysX和DS1-bolon。总体而言，MetaSysX在生物重复中显示出相对较高的中位RSD(参考RSD计算的详细方法):0.35，而Metabolon的中位RSD为0.261- b)。基于计算平均欧氏距离的并行分析av“在给定样品的所有代谢物测量值之间”年代和数据集中其他样本的对应数据显示，在年代并且其生物副本在两个数据集中通常具有最低的值(附加文件)1:图S3)。这表明，尽管MetaSysX测量值比Metabolon测量值稍微嘈杂，但两个平台在日期样本之间的差异仍然高于同一样本中单个水果之间的内在差异。Metabolon对合并的第一批样品进行技术重复测量的中位RSD低至0.12(表2)1- b)。为了进一步提高数据的可重复性，值得注意的是，DS1-sysX的特点是在各个样本中代谢物缺失的水平更高，特别是在脂质平台上(表1)1- b)。另一方面，与DS1-bolon相比，DS1-sysX具有更高的检测信号数量(3143个，而不是282个)，见表1-B)因为MetaSysX执行了非目标峰提取。此外，复杂的脂质只能通过MetaSysX测量得到。

比较来自第一次和第二次样本收集(DS1-bolon和DS2)的代谢物测量数据显示，后者检测到的代谢物数量高于前一次数据集(表2)1- b)。这可能主要是由于第一个样本集最初由MetaSysX处理，而第二个样本集仅由Metabolon处理，并与更新的库进行匹配(参见附加文件)3.)。此外，在第二组中包含成熟前阶段的枣可能导致检测到新的代谢物。在这两个数据集中都检测到一系列次生代谢物，特别是一般苯丙烷途径的成员，包括类黄酮物种单宁、黄酮、黄烷醇、黄烷酮、糖基化黄酮和糖基化黄酮醇，以及羟基肉桂酸盐、甲氧基肉桂酸盐、木脂素、单脂醇和二苯乙烯(表1)3.);然而，绝大多数检测到的代谢物都是初级代谢物。它们包括氨基酸、脂类、糖、维生素、醇类、酸类、胺类、嘌呤类和嘧啶类，将在讨论部分详细介绍。DS1-bolon独有的代谢物有53种，而DS2只检测到173种代谢物;在两个数据集中测量了229种代谢物，使得Metabolon在两个数据集中检测到的独特代谢物总数等于455。

成熟枣代谢组学数据的PCA分析揭示了与该地区地理相关的第一主成分

为了研究收集到的成熟枣成分的内在变化，使用SIMCA对测量到的代谢组学数据进行PCA分析(有关QC预处理的详细信息，读者请参阅方法部分)。在DS1-bolon中，发现前四个成分是显著的，它们共同占数据集中总变异的41.1% (PC1单独占17.7%，其次是PC2 9.7%， PC3 7.8%和PC4 5.7%)。为了验证这些结果，分别对来自相同日期样本的DS1-sysX代谢组学数据进行了主成分分析。DS1-bolon和DS1-sysX的PC1评分高度相关(Pearson R = 0.90, pvalue < 2.2e-16)。2)，确认来自PC1的影响与平台无关。将DS1-bolon的PC1分数与date_country变量(在方法部分中定义)进行回归，结果显示显著的pvalue = 4.80e-08，调整后的r²为0.34。date_country变量与DS1-bolon的PC2、3、4之间无显著相关性。

DS2-mature的PCA分析显示，4个显著分量占总变异的44.2%，其中PC1单独占16.7%，PC2、PC3和PC4分别占11.4%、10%和6.06%。与DS1-bolon相似，单独PC1得分与序号date_country变量显著相关(pvalue = 3.14e-05，调整后r方= 0.45)。综上所述，这些结果表明，解释了第一次和第二次样本收集中成熟日期最大系统性差异的PC1与水果的生产国显著相关。通过DS1-bolon和DS2-mature代谢组学数据集可以观察到，在PC1尺度的正范围内北非枣的密度增加，而在负范围内海湾枣的密度增加。2 b&c分别。

成熟日期的PC1捕捉到果实成熟的不同程度

在第二次样品收集(也称为ds2 -未成熟)中包含一个正在进行成熟活动的枣果实子集。1 b&c)旨在确定成熟过程的代谢特征。目的是评估发育效应对DS1-bolon和DS2-mature中观察到的差异的可能贡献，因为尽管相应的日期样本被认为是成熟的，但仍在经历成熟变化的水果可能偶然存在。用于评估这种可能影响的分析概述可在方法部分找到;在这里，我们展示结果。未成熟果实的PCA分析显示，PC1得分与先前基于果实成熟程度的视觉评估定义的果实排名之间具有高度的一致性(参见方法)(图2)。3)。只有当水果具有相似的PC1评分值时，才会观察到偶尔的差异，这表明成熟状态相似。PC1分数的密度分析揭示了三个广泛的样本簇，它们通过成熟程度的增加被表示为1、2和3类(图2)。3)。在2类和3类上训练的OPLS-DA模型显示，一个显著的预测成分解释了87%的类变量变化(R-squared-Y = 0.87, Q-squared = 0.69)。这个分类器本质上是学习代谢物最好的区分类别。将该分类器应用于DS2中除去训练集的所有样本，得到的分类预测分数反映了这些样本中这些分化代谢物的原始水平。由此可见，这些分数表明了这些样品的成熟程度。对这些预测分数的检验揭示了两个主要观察结果:首先，来自1类的ds2 -未成熟样本正确地放置在离2类最近、离3类最远的地方;其次，ds2成熟日期样本被定位在第2类和第3类之间(图2)。3 b)。通过比较ds2成熟样本的OPLS-DA分类预测分数和PC1分类预测分数，得到了显著的Pearson R值(R = 0.80, pvalue = 4.48e-14)(图2)。3 c)。这意味着除了地理效应之外，DS2-mature的PC1也具有成熟特征。PC2、3、4无显著相关性。

在方法部分概述了将成熟效应映射到DS1-bolon上的过程。简单地说，从OPLS-DA分类器对类别预测分数的检验(图2)开始。3 b在两次批量测量中测量的10个样品(或第一批和第二批样品)分布在第2类和第3类(这里的“批”指的是样本收集集)。这些样本用于构建新的分类器的种子类2和3。后者基于O2PLS-DA程序，该程序能够从相同样品的多次测量中剖析共同信号，从而始终区分样品的类别。在这项工作中，训练集样本的多次测量由它们的第1批和第2批代谢组学测量组成。该训练集的类分离以图1中的结果为指导。3 b并通过OPLS-DA分类器调整以最大限度地提高批2样本子集的派生类预测分数与其对应类之间的一致性水平(详见方法和附加文件)1:图S2)。O2PLS-DA模型具有最佳的一致性水平，包括第1批和第2批样品61、30、60、27、10/24、50、22、44，分别属于种子类别2/种子类别3，而遗漏了样本11(附加文件)1:图S2)。发现DS1-bolon的O2PLS-DA分类预测评分与其PC1评分有很强的相关性(Pearson R = 0.8, pvalue < 2.2e-16，图2)。4)。这意味着来自第一次收集的日期的PC1也与该地区地理的成熟效应有关，其方式与来自第二次收集样本的PC1类似。同一数据集的PC2、3和4未发现显著关联。

重要的是，第一组和第二组数据样本的O2PLS-DA类预测分数具有可比性，并且可以沿同一轴进行投影，如图所示。4 b。这导致了以下有趣的观察结果:首先，根据图中原始的OPLS-DA分类器，第1批和第2批样本中的第11个样本被预测在第2类和第3类之间。3 b。其次，O2PLS-DA分类器很好地维持了ds2 -未成熟果实的排序，偶有误差与图中OPLS-DA分类器观察到的相似。3 b。这两个观测结果进一步证实了O2PLS-DA模型的有效性。第三，第二次采集的样本比第一次采集的样本更分散，在2类和3类之间的中间区域有一定的密度，这也反映在图中的密度图中。4摄氏度。这可能是由于在第一次采收中，市场上销售的枣的采收后条件得到了更严格的控制。最后，在DS1-bolon和ds2成熟的情况下，接近2类的枣样品似乎含有相对较高的蔗糖水平。除了作为软类型注释的141-SEED-LY(附加文件)2)，其他高蔗糖含量和已知类型的品种均属于干型或半干型。1类和2类ds2未成熟果实中也观察到高蔗糖水平(图2)。4 b)。

成熟枣中PC1的代谢空间与果实成熟的生物学规律一致

23类代谢物具有共同的结构或功能主题和可比较的PC1负荷值，如方法部分所述被定义。这种分组是合理的，因为具有强阳性和强负负荷值的代谢物在“内部”高度相关，而在“之间”呈反相关。负荷值范围两端的强相关性证明了代谢产物的生物类别在范围两端的富集。同样，代谢物负荷值与PC分数之间也存在着密切的关系，代谢物负荷值表达了代谢物丰度曲线与整个样本的PC分数之间的相关程度。代谢物水平、PC1负荷值和DS2-mature评分之间的关系如图所示。5DS1-bolon的类似图形可以在附加文件中找到1:图S4。x轴通过增加PC1评分值来显示数据样本的排序，而y轴通过两个标准来显示代谢物的排序:首先代谢物类别按其中位负荷值排序，然后代谢物按其在每个类别中的负荷值排序。

图3热图的检验5如前面介绍部分所述，显示了枣成熟的生物化学特征，其他细节与稍后讨论的一般水果成熟过程一致。简而言之，PC1得分最高的枣样品具有最高水平的胺和调节性多胺、谷胱甘肽介导的抗氧化活性、能量产生、溶血磷脂、氨基酸、单宁、非还原性糖和激素。后三类代谢物的富集模式进一步与磷化物a的富集模式相似(图2)。6)，叶绿素的降解产物，与枣的Khalal早熟阶段的生化特征一致，在此期间，果实不绿并获得颜色(更多细节请参阅背景)。所有上述代谢物的丰度水平在PC1得分中等的日期样本中下降。这与一般苯丙途径的代谢物、核酸核苷、维生素、TCA中间体、鞘碱和溶血磷脂降解产物保持稳定的丰度水平不同。细胞壁果胶降解导致酮-辛糖酸富集，PC1评分中等(图1)。6 b)可能表明增加的水果软化，这是典型的Rutab成熟阶段的日期(参考背景)。PC1分数极负的枣子富含不饱和脂肪酸、氨基酸和苯丙素降解产生的香气挥发物、还原糖和糖脱水产物。后者也可以来自美拉德反应[34];与枣的成熟阶段一致(参考背景)。糖酵解糖和核糖体结构降解产物的积累可能表明果实在这一阶段的代谢活动减慢。DS1-bolon数据也观察到类似的代谢物类别沿PC1的富集/耗尽模式1:图S4)，在磷脂代谢方面存在边际差异。

有趣的是，来自不同国家的枣品种显示出相似的PC1值，因此具有相似的成熟相关生化特征。例如，来自阿尔及利亚和突尼斯的Deglet Nour日期样本117-DGNR-DZ和64-DGTNR-TN分别位于PC1的正端;来自沙特阿拉伯和卡塔尔的Sufri日期样本41-SFR-SA和52-SFR-QA均具有中间范围的PC1值，而来自沙特阿拉伯和卡塔尔的Mabroom日期样本44-MBRM-SA和48-MBRM-QA位于PC1的负端(图2)。5和附加文件1:图S4)。

仔细检查第二次样本采集的少量样本的测量湿度值范围(参考方法)表明，在队列中存在潮湿的Rutab日期(25% <湿度水平< 30%)(图2)。5)。这些可能已经经历了积极的成熟相关变化，可能不被认为是成熟的枣，因为它们的表型可能已经改变，如果它们被允许更多的时间来完成成熟(参考日期成熟度的定义方法)。因此，他们被纳入队列是偶然的。有趣的是，在PC1阳性的范围内，也观察到低水分含量(在[18 - 25%]范围内)可以表明稳定的代谢活动，因此成熟。5)，捕捉早熟的代谢活动。这表明枣的成熟种群具有不同程度的成熟代谢周转的特征。进一步的分析表明，在PC1阳性范围内，成熟枣的干型和半干型丰富，果实变色增加，而软型在阴性范围内过度代表(图1)。5和附加文件1:图S4)(基于PC1评分与date_type和date_color变量的关联分析，DS1-bolon/DS2-mature的p值分别为6.063e-09/0.05和0.018/0.002)。

根据DS1-bolon和DS2-mature的PC2、3和4的负荷值，重新评估了同一类代谢物。对于每个成分和数据集，按代谢物类别排列的负载值的箱形图如图所示。7和附加文件1图S5。有趣的是，来自两个数据集的PC2似乎携带着相同的代谢特征sphingoids和溶血磷脂在加载值范围的两端观察到的类(图2)。7)。此外，发现两个数据集之间PC2负荷值的每代谢类中位数的绝对相关性为0.68。在两个数据集中，PC3和PC4的每类中位负荷值之间没有发现一致性，这意味着PC3和PC4捕获了每个数据集固有的代谢效应。对于DS1-bolon, PC3在代谢类之间捕获相反的效应柠檬酸还有另外两类:非还原糖和n -乙酰化氨基酸而PC4则突出了阶级之间的对比柠檬酸和类不饱和脂肪酸和氧化脂类(附加文件1:图5)。对于DS2-mature，代谢类之间的趋势相反不饱和脂肪酸和氧化脂类和核糖体rna核苷适用于PC3及PC3之间糖类和糖酵解PC4。

成熟过程可以在不同程度上完成成熟的软和干类型的枣，导致果实成分的主要变化

在本研究中，研究人员利用代谢组学技术和多变量统计分析对两组枣进行了测量，以提取和表征解释其代谢组学数据中大多数变异性的主要成分。这两种收集的枣子有根本的不同:第一次收集的枣子主要来自海湾地区，而从商店获得的那一部分枣子很可能经过了分级和干燥过程，以符合市场标准。相比之下，第二次采集的枣子大多是北非品种，从树上和当地市场上新鲜采集。尽管存在这些差异，但在这两种情况下，分别为每个数据集得出的PC1都与生产水果的国家显著相关，从广义上讲，在PC1尺度的两端观察到来自东海湾地区和北非西部的日期。另一个被证明与PC1密切相关的因素是成熟过程中代谢转化的程度。水分分析表明，这部分是由于偶然出现了未成熟的潮湿果实，可能尚未完全成熟。这是相当预期的，也是将开发阶段数据集作为第二队列一部分的原因。然而，低水分枣子的表型不会发生任何进一步的变化，根据定义是成熟的，它们跨越了PC1的整个范围，显示出不同程度的成熟代谢周转。换句话说，一些枣子样品在经过严格的成熟活动(PC1的负范围)后达到成熟，而另一些枣子样品在进行了较低程度的代谢周转(PC1的正范围)后变得成熟和干燥。进一步分析表明，前一种日期一般来自软型，后一种日期主要来自干型。 The soft/dry phenotype is variety specific and was, in this study, collected from the literature. It is important to note that the phenotype in question does not refer to a development or maturity stage per-se but to a collection of physiochemical properties that distinguish the fresh naturally ripened fruit from the two types: Dates from the soft class are characterized by higher moisture, softer texture and higher levels of sucrose to reducing sugars in the ripe fruit (refer to background for more details). Due to their high moisture level, dates from the soft class often necessitate additional drying to become mature unlike the dry type which matures naturally on the trees.

重要的是，从软型和干型中观察到的代谢转换变化可以解释它们已知的表型差异。干型的低代谢周转可能限制颜色物质的合成和纤维结构的有效降解。这可以解释这种类型的枣的果实变色和坚硬的质地[4]。另一方面，软枣的高代谢转换可能伴随着纤维的最佳降解和颜色分子的积累，这证明了软枣的质地和颜色的增强。此外，干枣和软枣中的高蔗糖和高还原糖水平可以归因于发育效应，因为随着成熟的进行，早期积累的蔗糖很容易分解成还原糖。有趣的是，蔗糖在成熟过程中被转化酶水解，在软枣中比在干枣中表现出更快的动力学[35]。蔗糖的缓慢降解可能是干燥品种成熟过程的限制因素，因为它会影响下游成熟反应的很大一部分。转化酶的活性是否是枣软/干分类的单独原因还有待研究。此外，潜在的因素，无论是遗传性质的还是仅仅由低水活度组成的，或两者兼而有之，都需要加以解决;尽管文献中的证据表明软型和干型之间存在遗传多样性[17]，与果实成熟过程的直接联系仍有待确定。研究水分活性作用的一个途径是通过改变灌溉量和频率，实验性地改变软枣和干枣的含水量[36，37]。这与更大范围的干枣和软枣的全球代谢组学特征相结合，可能为水活性与枣的软表型和干表型的相关性提供重要线索。总之，本研究中PC1捕获的成熟效应不仅限于具有持续成熟活动的新鲜未成熟枣，也包括在成熟过程中表现出不同程度代谢转换的干/软类成熟枣。

重要的是，干型和软型枣子在PC1两端的富集解释了PC1分数与地理之间的相关性。在阿拉伯世界，不同类型的枣椰树种植区具有不同的气候，往往更适合任何一种类型的枣椰树:北非国家典型的绿洲地区，包括突尼斯、摩洛哥、阿尔及利亚、利比亚和埃及，以半干燥和干燥的枣椰树而闻名，而埃及、苏丹、利比亚、沙特阿拉伯和阿曼的近海干燥地区主要适合干燥品种。最后，巴林、阿拉伯联合酋长国和卡塔尔典型的沿海地区潮湿的性质更适合软枣品种[15，16]。重要的是，北非和阿拉伯海湾地区之间已确定的遗传变异日期[38]可能与不同的气候条件有关，这导致了两个地区在品种类型上的偏见。

与PC2、3和4相比，PC1在数据中捕获了更高比例的方差。此外，在这项工作中，与PC2、3和4不同，PC1与枣的可用表型特征显著相关，包括生产国、软/干类型和颜色强度。这证明了它是本研究的重点。尽管如此，PC2、3和4的代谢特征将在稍后详细讨论。

多变量技术是有用的探索性和综合工具，用于单一和多个测量的代谢组学数据集

在这项研究中，使用了一系列多变量技术来全面了解日期样本中代谢变化的决定因素。最初，非监督PCA被用来提取这种变异。为了评估与成熟过程的关系，在ds2 -未成熟数据集上训练了一个OPLS-DA分类器来模拟枣的成熟过程。然而，OPLS-DA模型的先决条件是样本的类分离，这在这个数据集中显然是缺失的。这是因为在成熟过程中，ds2未成熟的果实没有在预先设定的时间间隔内收集，因此无法跨样品对齐以创建所需的类别。相反，PCA分析揭示了一个显性PC1，它基本上捕获了ds2未成熟果实的成熟过程，并相应地将组成果实组织成三个大簇。聚类2和3作为OPLS-DA模型的训练集，不包括聚类1。这是合理的预期，预测集，由ds2成熟，将位于集群2和集群3之间，因为集群1的特点是绿色枣成熟的早期阶段，没有在预测集中表示。为了在一个独立的数据集中复制PC1与果实成熟生物化学之间的关联，将发育效应映射到第一次枣采集的DS1-bolon上是很重要的。所使用的模型基于O2PLS-DA程序，该程序能够从训练集的第1批和第2批测量中提取系统变化，从而始终区分指定的样本类别。 It follows that the O2PLS-DA procedure was used in this study to consolidate separate batch measurements of the same samples as although the measuring technique was essentially the same, slight operational changes may have been introduced between the two batch measurements which were well separated in time. This is, in principal, similar to the way the technique has been traditionally applied to bring together measurements of the same biological samples by different analytical methods [30.]。

枣成熟代谢时间方面的综合表征

在代谢水平上，PC1具有成熟特征，这也是为什么它能够区分经历不同成熟动力学的干型和软型表型的原因。软枣和干枣具有不同的气候要求，这可以解释PC1与地理之间的关联。我们现在将重点放在PC1的代谢特征上，并将讨论部分的剩余部分用于对比观察到的沿PC1代谢产物类别的富集与已知的水果成熟的生物化学(尽管，在讨论与之相关的代谢类别时，我们偶尔会提到其他pc)。根据图2的结果，我们将PC1的正负两端对应的成熟曲线隐式地表示为早熟和晚熟。5。我们将经常参考附加文件6它显示了沿PC1沿各自生物类别组织的所有代谢物丰度曲线的散点图。

氨基酸及相关代谢物

在这项研究中，在与其他水果相似的早熟枣子中观察到游离氨基酸的富集[8，39(图。5)。在所有检测到的氨基酸中，丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的水平在成熟较晚的日期下降最少(附加文件)6)，与之前研究番茄成熟的研究结果一致[39]。一般来说，氨基酸是水果成熟过程中关键中间体和最终产物合成的基础[8]。特别是芳香氨基酸，也在这项研究中测量，产生了无数的次级代谢物，特别是赋予颜色和味道的苯丙素。在本研究中，观察到的二肽富集在早熟的枣果实中(图2)。5)可能与蛋白质降解活动有关，这些蛋白质降解活动是由激素在成熟开始时吸收，以消除成熟前的酶[8]。二肽的另一个潜在来源是附着在预折叠核蛋白上的靶向肽序列，该序列在蛋白质进入包括染色质在内的细胞器结构时被消化[40]。色质体是缺乏叶绿素的叶绿体的分化形式，在早熟时作为代谢中心，需要从细胞核不断地流入效应蛋白[41]。靶向肽序列主要含有疏水性氨基酸残基[40]，这与本研究中观察到的二肽氨基酸成分中疏水缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的高比例(70%)一致。有趣的是，染色质靶向预折叠蛋白的n -乙酰化被认为是细胞器特异性的一种机制[42]。这可能是本研究中具有早熟特征的枣样品中n -乙酰化氨基酸富集的原因。5);虽然乙酰化有时是氨基酸代谢过程中必要的中间反应。最后，丰富的谷胱甘肽活性的枣与早熟概况(图。5)与水果在早熟时抗氧化活性的增加是一致的[43]。

伯胺和多胺

在这项研究中，从丝氨酸、谷氨酸、5-羟基色胺、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸脱羧产生的乙醇胺、GABA、血清素、酪胺、色胺和苯乙胺都被发现在具有早熟特征的枣中富集(附加文件)6)。这与许多果实中氨基酸脱羧酶的早熟表达导致胺合成是一致的[44，45]。酪胺和色胺是合成防御介质生物碱的前体，以前在枣中检测到[46]而苯乙胺转化为抗病原体挥发物苯乙醛和苯乙醇也起到同样的作用[8，45]。血清素在水果成熟中的作用尚未得到充分研究;然而，从n -乙酰5 -羟色胺(我们的数据中也观察到5 -羟色胺的衍生物)中提取的褪黑素最近被发现，当外源给予绿番茄时，可以促进成熟的各种生理方面[47]。最近，GABA的减少与番茄成熟过程中维持高水平的必需谷氨酸和天冬氨酸有关[48]。在早熟枣(PC1的正端)中多胺腐胺的富集与先前报道的在转基因番茄成熟开始时结合成熟特异性启动子的小鼠鸟氨酸脱羧酶的表达一致[49]。先前的研究表明，催熟激素乙烯与多胺(精胺和亚精胺)(腐胺的衍生物)之间存在协同作用[39，50]。腐胺的潜在调节作用可能证明其在具有早熟特征的枣中与其降解途径的产物共存(附加文件)6)。

次生代谢

在我们的数据中，苯丙素途径次生代谢物的最早迹象包括单宁原花青素B1、原花青素B2和儿茶素单体，它们都在早熟的枣中显示出最高水平(附加文件)6)，根据文献[8，51]。涩味单宁低聚物在青果中含量丰富，只有在成熟过程中发生结构变化时才会失去涩味[52]。除单宁外，黄酮类化合物和羟基肉桂酸类化合物在不同的PC1范围内均有峰值，有的与PC1无相关性。一般来说，这些代谢物的差异很难用PC1来解释6)。这可能是由于遗传背景的影响更大[8]，这可能有助于形成个别品种独特的味道和颜色特征。有趣的是，来自DS2-mature的PC4在班级之间呈现相反的趋势糖类和柠檬酸在一只手和积累的磷酸化糖，捕获下类糖酵解,另一方面。这种影响可以通过糖酵解过程中磷酸化糖的初始降解和下游TCA活性合成苯丙素所需的能量来解释。第三类次生代谢物由挥发物组成，挥发物是水果香气的主要贡献者。在这项研究中，在成熟较晚的枣中观察到支链氨基酸衍生挥发物和羟基肉桂酸衍生挥发物的增加。5和附加文件6)，与文献一致[8]。挥发物是种子分散剂的强引诱剂，在过熟果实中挥发物的急剧增加可能是在衰老开始前最大限度地消耗种子的机制。

细胞壁和细胞膜的变化

人们早就知道，在成熟过程中会发生细胞膜组成的改变[53- - - - - -55]，但最近的文献很少关注。成熟过程中膜磷脂的关键变化包括脂肪酸酰基链的去饱和水平增加，促进了它们的过氧化。少量去饱和酶异构体的诱导表达与桃子成熟过程中脂氧合酶(LOX)途径中亚油酸和亚麻酸底物的持续通量密切相关[56]。这一途径被认为是多种C6挥发性醛和醇的合成机制，这些醛和醇对水果香气有重要贡献[8]。在本研究中，观察到一系列单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，包括LOX底物及其氧化衍生物氧脂，在PC1负范围内，在成熟较晚的枣中普遍急剧下降。

最初切除脂肪酰基链导致早熟枣中溶血磷脂的积累，而晚熟枣中溶血磷脂降解产物的积累较晚(图2)。5)。其中包括单酰基甘油、磷酸化的头基、游离的头基和剩余的溶血磷脂酸[57]以及n -酰基乙醇胺，通过n -酰基磷脂酰乙醇胺中间体生成溶血磷脂的衍生物[31[附加文件6)。这些降解产物，除了鞘基外，可能在果实中具有信号作用，其中一些已经被认为是其他植物器官脱落信号的下游介质[58- - - - - -60]。在这两个数据集中，PC2对溶血磷脂和鞘磷脂的相反趋势很有趣，可能表明在某些枣品种成熟过程中信号模式发生了变化，或者是对某些外部刺激的反应。例如，鞘脂信号在植物干旱条件下被诱导[59]。

成熟过程中的水果软化与纤维降解酶活性的增加有关，其中许多酶针对细胞壁结构[8]。果胶是植物细胞壁的主要成分，它的水解似乎为纤维素和半纤维素多糖基质的协同分解开辟了道路[8]。在本研究中，酮脱氧辛糖酸(一种位于鼠李糖半乳糖酸II类果胶侧链上的酸性单糖)的丰度在日期中达到峰值，中间范围为PC1(图1)。6 b)。这有助于建立一个链接到Rutab阶段，其特点是最大的果实柔软(参考结果)。

糖代谢，能量和基因表达活性

在本研究中，在PC1阳性范围内的早熟果实中，蔗糖和相关的非还原糖酮糖和melezitose(来自DS1-bolon)含量最多(图2)。5、附加文件6)。在水果中，在晚熟的绿色阶段观察到蔗糖水平的增加，而蔗糖在成熟开始后被转化酶分解[8]。释放的糖单体通过早期戊糖磷酸途径进行代谢，为芳香族氨基酸、次生代谢物、维生素和嘌呤/嘧啶的合成提供碳前体分子。与此同时，通过糖酵解和下游TCA循环的通量有助于维持成熟过程中基因表达和合成代谢反应所需的能量水平。前体非还原糖和产物TCA中间体之间的关系被DS1-bolon的PC3捕获，可能反映了整个日期群中不同的糖酵解/TCA动力学。

在本研究中，能量分子NAD+和AMP的丰度水平在成熟较晚的枣中最低(图2)。5、附加文件6)。这与TCA循环中间体富马酸的积累、糖酵解途径的成员和核糖体核苷可能源自核糖体降解(附加文件)6)可能表明在成熟的后期代谢活动减少。有趣的是，来自柠檬酸/核糖体rna核苷阶级似乎形成了对比不饱和脂肪酸和oxylipinsPC4/PC3分别来自DS1-bolon/DS2-mature。在某些种类的枣中，氧化脂素的后期合成可能需要残余的TCA活性和关键酶的后期合成。

在本研究中，还原糖在成熟较晚的枣中的积累(图2)。5)证实在Tamr后期的日期有类似报告[10]。其中观察到的糖(也显示在附加文件中)6)木糖、焦糖、阿拉伯糖和葡萄糖可能来源于成熟过程中细胞壁的水解活性。核酮糖和木酮糖可能来源于戊糖磷酸途径的磷酸化形式，而糖醇、糖内酯和衍生酸可能源于成熟枣中醛糖/酮糖氧化还原酶的上调，这在之前的蛋白质组学方法中得到了证实[61]。重要的是要注意，除了有助于水果风味，糖醇是一种多元醇渗透保护剂，可以减轻水果在这个阶段干燥的影响。

维生素和激素

在这项研究中，已检测到一系列维生素，包括核黄素、烟酸、吡哆醇和烟酸盐(附加文件)6)。早熟枣中吡哆醇的富集可能是由于它在成熟早期氨基酸脱羧酶的氨基酸合成和代谢中起重要作用。相反，苏酸盐的积累(附加文件)6)，一种维生素C的降解产物，在成熟较晚的枣中，与先前描述的Tamr阶段维生素C的减少一致[1]。

枣子表现得像更年期的水果，这意味着乙烯起着主要的调节作用，尽管与脱落酶的相互作用可能对某些成熟事件起作用。8]。在这项研究中，没有测量成熟激素乙烯(低于仪器施加的质量截止值)，但观察到两种相关代谢物(附加文件)6)。一种是氰丙氨酸，它是半胱氨酸和氰化物的结合物(氰化物是乙烯合成的有毒副产品)[62])和5-甲基硫腺苷(Yang循环中的一种中间体，可以补充乙烯前体SAM)。在PC1阳性范围内，这两种分子在早熟枣中的含量最高(附加文件)6)。这个范围以前被映射到Khalal阶段(参考结果)，这是在日期的更年期乙烯峰值之后[63]。细胞分裂素激素玉米素的前体异戊烯腺苷也有类似的模式，这与报道的番茄成熟过程中玉米素的丰度相符[64]。在更年期果型番茄中，脱叶是先于乙烯的早期调节剂[j]。65，66]。在乙烯的峰值之后，abscisate的丰度略有增加[67]，这可以解释本研究中在PC1值中等范围的日期中观察到的小峰。总之，作为这项工作的一部分，我们测量了关键激素和相关代谢物，从而推动了未来与其他代谢物的部分相关性分析，以揭示在枣果实成熟过程中不同方面运作的调节机制。

这项研究揭示了枣果实生物学的重要方面。结果表明，成熟枣在成熟过程中代谢转化的程度不同，其成分可能会发生显著变化，这与枣的干/软分类一致。因此，干枣和软枣的营养价值各不相同，而干枣富含氨基酸、胺类、磷脂、能量分子和蔗糖，软枣含有更多的香气挥发物、还原糖、糖醇和酸、更简单的脂质，并且可能由于人工干燥而携带脱水产物的痕迹。除了成熟效应外，地理因素还与变异的主要成分(PC1)有关。这也与干燥和柔软的表型有关，因为这两种类型对气候的要求不同。我们对早熟枣和早熟枣代谢物类别的分析揭示了与其他水果成熟的相似性，并强调了磷脂的变化，而这些变化在目前的文献中没有得到充分的详细描述。本研究的结果在两个独立的数据集中得到证实，其中一个数据集由两个独立的代谢组学平台测量，以显示相同的效果。代谢组学技术的可靠性和合理的成本可能会激发对非模式水果的进一步研究，有助于更广泛地了解水果生物学的各个方面。

本研究中Metabolon测量的代谢组学数据集可在附加文件中获得4&附加文件5。

挥发性有机化合物的仪器:

挥发性有机化合物

DS1-bolon:

代谢组学数据集来自Metabolon测量的第一次数据集

DS1-sysX:

代谢组学数据集来自MetaSysX测量的第一次数据集

DS2:

代谢组学数据来自由Metabolon测量的第二个数据集

DS2-immature:

来自发育阶段样本的代谢组学数据，是由Metabolon或DS2测量的第二次数据收集的子集

DS2-mature:

代谢组学数据来自第二次数据采集，由Metabolon(或DS2)测量，不包括发育阶段样本

第一批和第二批样品:

第一次采集的10个样本沿着第二次采集的样本再次测量

这项研究的资金由卡塔尔国家研究基金提供，该基金是卡塔尔基金会在国家优先研究计划-特别奖(NPRP-EP) NPRPX-014-4-001下的成员。这项工作还得到了卡塔尔威尔康奈尔医学院“生物医学研究项目”基金的支持，该项目由卡塔尔基金会资助。所有声明仅由作者负责。

从属关系

1. 卡塔尔基金会教育城，卡塔尔多哈，邮政信箱24144，威尔康奈尔医学院生理与生物物理系

   我是哈梅·迪本，斯威蒂·马修，安娜·哈拉玛和卡斯滕·苏雷

2. 基因组学实验室，威尔康奈尔医学院，多哈，卡塔尔

   玛丽亚姆·阿尔·雷亚希，玛丽亚·托雷斯和乔尔·马利克

3. 生命科学研究部，ADLQ，多哈，卡塔尔

   穆罕默德Elrayess

4. 威尔康奈尔医学院遗传医学系，卡塔尔多哈

   乔尔马列

5. MetaSysX GmbH，波茨坦，德国

   迈克尔Meret

6. Metabolon, Inc.， Durham, USA

   罗伯特·p·莫尼和爱德华·d·卡洛里

相应的作者

对应到Ilhame Diboun。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

研究设计:JM, KS。样品收集:SM, ID, JM, MT, ME, MA, AH。数据分析:ID。代谢组学分析:RM, EK来自Metabolon Inc.， MM来自MetaSysX, GmbH论文代写:所有作者。所有作者都阅读并认可了稿件的最终版本。

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