异络型G-蛋白Picea amies以及他们的监管番荔枝。感染

背景

异络型G-蛋白是所有真核生物王国存在的重要信号交换机。在植物中，他们调节几种发育功能并在植物微生物相互作用中发挥重要作用。目前关于植物G-蛋白的知识主要基于模型高管，并且关于G蛋白曲目和在其他谱系中的功能很少。在这项研究中，我们研究了Pinaceae的异映酰基G-蛋白亚基曲目，包括与其他植物衬里有关的系统发育关系，辐射和序列分集水平。我们还研究了G-蛋白复合物的功能多样化Picea amies通过分析G蛋白亚基在不同组织中的转录调控以及对病原体感染的反应。

结果

在一些针叶树物种中鉴定出了完整的G蛋白亚基库在Silico.. 全长p .冷杉属克隆了1个Gα-、1个Gβ-和4个g γ-亚基的编码区并进行了测序。g γ亚基的系统发育分析显示，PaGG1与a型亚基聚类，PaGG3和PaGG4与c型亚基聚类，而PaGG2及其同源物代表一种新的针叶树特异性g γ亚基类型。基因表达的定量PCR分析p .冷杉属g蛋白亚基表现出g α亚基基因的特异性上调PaGPA1g γ-亚单位基因第1页为了应对异孢霉感染。

结论

针叶树拥有完整的G蛋白亚基。微分调节PaGPA1和第1页表明异三聚体g蛋白复合物是其中的关键番荔枝。感知和下游信令P冷杉。

异三聚体G蛋白是由三个亚基（α、β和γ亚基）组成的蛋白质复合物。它们遍布植物、动物和真菌王国。它们具有识别和响应各种内外刺激的能力，调节许多不同的发育和环境反应，如细胞增殖、细胞壁组成、各种激素反应、离子通道调节、气孔开闭、糖信号、病原体和激发子反应等[1-12］．

与真菌和动物已知的G蛋白激活的典型模型相比，许多植物显示出综合复合物的强烈自激活，可能是由相对的波动和动态螺旋蛋白质域的运动[9.那13那14］．Gα-亚基的构象变化将释放Gβγ二聚体，并通过该途径激活下游信号通路通过gα-亚基和/或Gβγ二聚体[15那16］．通过失活的循环完成杂种酰胺蛋白质复合物的似乎不仅在植物和动物中不同，但甚至在植物王国中9.］．

Gα-亚基的下游信号和Gβγ二聚体[3.]可以起到协同和拮抗作用[15］．Pandey等人。[17]评估下游信号传播的不同模型，发现一个信号分量只能解释可能反应的部分范围，表明两个部件涉及并需要异映射型G蛋白信号传导和功能的变异性。信令中的特异性由Gγ-亚基的互斥表达模式部分确定拟南芥，虽然例如开花信号传导中的亚基特异性不能用这个假设来解释[18]. 此外，功能多样性假设是由复杂成分的数量和序列变化决定的，例如在动物和真菌中，各种各样的gα亚基可以解释功能多样性[19那20]. 然而，植物具有很小的Gα-和Gβ-库存[9.]说明植物异源三聚体G蛋白复合物的功能多样性取决于Gγ亚基的数量和变异[21］．

因此，植物中的Gγ-亚基形成一个小型基因家族，最多有三个成员通常显示强序列多样化[9.那22］．系统发生，植物Gγ-亚基序列可以分为三个亚型[22]，根据序列，给出其c端区域的长度和其中的基元。a型g γ-亚基是与真菌和动物g γ-亚基相似的含有c端CAAX基序的短蛋白[22]，是绿藻中唯一鉴定出的g γ-亚基类型[23]. B型也是短蛋白，但在单子叶植物和双子叶植物中分化，分别具有C端基序KGSDFS和SRXXKRWI[22］．Trusov和同事[22]在裸子植物中没有发现类似B型序列，提示他们建议B型在裸子植物分裂后从A型分叉，300我以前的300（MYA）到150 Mya（基于PIRE和DOLAN[24]），在Brassicaceae中具有二次损失。C型富含富含半胱氨酸的C-末端的蛋白质，但在该组中的长度变化显着变化[22]. 有趣的是mossPhyscomitrella金属盘预计有一个g γ-亚单位在种子植物中不代表[22]，建议可以发现额外的Gγ-亚基类型。

根据异源三聚体G蛋白在信号感知和信号转导之间的重要作用，我们对被子植物中异源三聚体G蛋白对环境和发育线索的转录调控进行了详细的研究[21那25-28]，并进一步支持序列变异作为广泛的信号传递功能中的关键。基因表达模式分析A. Thaliana.揭示全能agb1.(Gβ)表达与g γ-亚基一致AGG1公司-以及聚集2-表达，尽管后两者的表达依赖于组织，且大多相互排斥[21］．

最近，G-蛋白质信号传导是单焦质和双斑点中病原体反应中的主要组分。suharsono等。[29]表明，在水稻中，g α-亚基是被激活的防御反应的重要中介稻瘟病菌诱导子，提示Gα亚单位在效应触发免疫（ETI）中的作用。然而，异三聚体G蛋白复合物的几个亚单位对微生物相关分子模式（MAMPs）有反应[12那30那31]，表明其在模式触发免疫(PTI)中的作用。在A. Thaliana.PTI的激活需要功能性的Gβ亚单位和某些Gγ亚单位，而唯一的C型Gγ亚单位，聚合3，似乎没有参与PTI [30］．这表明G蛋白亚基曲目中的功能分化A. Thaliana.，以及异三聚体g蛋白库的物种特异性使用。与此相一致的是，异三聚体g蛋白成分是宿主和非宿主抗性所必需的A. Thaliana.，除了AGG3 [32］．李和同事[32]同时表明，所有相关的亚基在生物胁迫下都有显著的高表达。

尽管异三聚体g蛋白是一种重要的信号开关，但其研究主要集中在一年生植物上。在植物的多年生生活方式，如树木，非生物和生物的压力是持久的威胁，植物必须不断作出反应。因此，一个快速且功能特异的开关对植物的寿命至关重要。此外，关于裸子植物g蛋白亚基库的信息将为异三聚体g蛋白的进化提供重要信息。然而，尽管它们的进化历史和它们的生态和经济重要性，我们对裸子植物中异三聚体g蛋白的认识是非常肤浅的。大部分松科植物的Gα-、Gβ-和g γ-亚基基因序列是基于EST序列预测的[9.那22］．该数据表明Pinaceae，如大多数血管植物，具有一个Gα-，一个Gβ-和小家族的Gγ-亚基基因。然而，借助于新出版的第一个基因组从针叶树，挪威云杉[Picea amies（L.）岩溶。]基因组[33]，可获得更多信息。

在欧洲松科最重要的经济病原菌是担子菌真菌Heterobasidion annosum(Fr) Bref。拉托感官（S.L.)．它是一种专门针对针叶树的坏死病原体，其传播与宿主相似(Korhonen和Stenlid评论，[34]). 独立于共同进化史，由H番荔枝。在p .冷杉属建议是非特定的[35-37]，类似于pti。在欧洲，两个Heterobasidion已知物种会感染p .冷杉属那H狭义番荔枝（S.S.),h . parviporum[38]导致受感染树木的茎和根腐烂，使木材贬值，增加风吹的风险[34］．

在这项研究中，我们使用新可用的挪威云杉基因组合与EST数据库结合，以阐明Pinaceae中的异映型G蛋白络合物以进行进化分析。在Gα-和Gβ-亚基方面，我们的文学发育和包括更多的Pinaceae序列，与先前的植物演化研究相干。Gγ-亚基的系统发育表示谱系特异性辐射。我们识别特定的DiCot特定的A型，以及一种在更基础或更高的谱系中没有表示的新型裸子植物。序列多样化表明Pinaceae中不同Gγ-亚基的子官能化，其由挪威云杉中的组织特异性表达支持。我们观察响应于伤口，茉莉酸甲酯（MEJA），脱落酸（ABA），腹毛刺真菌和虚张症病原体的异映酰基蛋白亚基基因表达模式的变化H番荔枝。这与模式触发的反应相一致，该反应要么是独立的，要么是激素信号通路的上游。据我们所知，本文首次报道了多年生植物异三聚体g蛋白对生物胁迫的信号传递。

针叶树编码并表达完整的异三聚体g蛋白亚基

先前的研究[9.那22]已经报道了一些基于EST序列的松科异三聚体g蛋白复合物的序列。我们鉴定了1个Gα-、1个Gβ-和4个g γ-亚单位样基因序列p .冷杉属基因组[33]. 这个same number was identified inPicea sitchensis.，其中Gβ-和g γ -亚基类序列分别为1个和3个Picea glauca.和Pinus Taeda.．urano等人以前报道了这两种物种的Gα-亚基样序列。[9.］．此外，我们还在额外鉴定了Gα-亚基样序列松果体物种。所有在当前研究中使用的序列列在附加文件中1．我们发现了所有亚基的基因模型p .冷杉属基因组装配仅限第1页有一个高度自信的基因模型覆盖了整个序列。这并不奇怪，因为基因组大小大，内含子长，重复区域含量高，这限制了p .冷杉属大会(33］．我们证实了在Silico.从中鉴定出Gα、Gβ和Gγ样基因p .冷杉属从cDNA文库中克隆并测序全长编码序列[KM197161 (PaGPA1）和KC825350.1-KC825354.1（多环芳烃1-第4页)]。在我们随后的研究中，我们使用的序列来自p .冷杉属互补脱氧核糖核酸。

通常，Pinaceae中的G蛋白曲目在研究之间的数量相似。预测的Pinaceae的物种之间存在预测的G-蛋白样亚基氨基酸序列的长度，除了推定p . taedaGG3的38个氨基酸短于直晶PAGG3（图。1)．g α -亚基样PaGPA1和g β-亚基样PaHGB1蛋白的预测分子量p .冷杉属分别为45.4和41.4 kDa，而Gγ亚基样蛋白的分子量预计等于或低于23.4 kDa（表1）1)．

预测的Gγ亚基分为两个短（PaGG1=336个氨基酸和PaGG2=318个氨基酸）和两个长（PaGG3=513个氨基酸和PaGG4=624个氨基酸）蛋白质（表1)．基于高度可变的N端和c端，g γ类亚基被分为四种不同的类型。我们鉴定了松科植物中不同的g γ-亚基样蛋白的4个保守的n端基序:GG1 - meet (Picea./ meqet（松果体），GG2 - MQGT（Picea / Pinus.)， gg3 -水貂(Picea.) / MISKS (松果体）和GG4 - MIK（Picea.)（图。1). 此外，他们还显示了特定的C-末端（图。1): PaGG1包含CAAX基序(CWII)，将PaGG1及其同源物归类为a型g γ-亚基;PaGG3和PaGG4的c端较长，半胱氨酸含量分别为29% (PaGG3)和30% (PaGG4)，代表c型g γ-亚基;而短亚基PaGG2及其同源体包含一个新的基序(SRGCGCCL)，以前没有在单子叶或双子叶中发现[22］．PAGG1但不是PAGG2显示完整的G蛋白γ亚基样（GGL） - admain [39]（附加文件）2)．

针叶树含有一种新型Gγ-亚基类型

为了更好地理解异抗体G-蛋白质复合物的发展方式是如何进行组分的系统发育分析。我们的系统发育分析证实了Gα-亚基样和Gβ-亚基样序列主要遵循以前公布的植物系统[24那40那41.(附加文件3.那4.和5.)．

由此产生的Gγ亚基样序列的系统发育树显示了类型依赖性，而不是由植物进化决定的拓扑结构（图。2)．我们获得了分别代表一种类型的B型和C型蛋白的簇（图。2，附加文件6.)．PAGG1及其在PINACEAE中的矫形器与ACANISPERM A型序列聚集（图。2)．PaGG2与其针叶树同源物形成了一个单独的枝支，与独特的c端末端一致，与a型簇相关(图1)。2)．这与PaGG1和PaGG2之间的氨基酸相似性较高(56.5%)相一致p .冷杉属g γ-亚单位样型(29.9%)。c型聚类分为两组:一组含有双子叶植物蛋白，另一组含有针叶树蛋白，包括PaGG3和PaGG4(图。2)．

针叶树G蛋白亚基的酵母双杂交分析

为了使异三聚体g蛋白具有功能，Gα-， Gβ-和g γ-亚基必须在物理上相互作用，正如在其他模式生物中所显示的那样[12那42.］．为了分析挪威云杉的G-蛋白成员之间的这种蛋白质 - 蛋白质相互作用，我们进行了综合酵母双杂化测定。将所有亚基与Gal 4活化剂结构域（Ad）和Gal4结合结构域（DB）融合。随后将这些构建体转化为单倍体酵母菌株并以简单的横向基质配合（图。3.)．基于选择培养基对酵母生长进行评分蛋白质 - 蛋白质相互作用，但在自动激活介质上没有生长。随着预期的PagPA1-AD与PAHGB1-DB相互作用（图。3.). 此外，PAHG1-AD与Gγ亚基PaGG1-DB、PaGG3-DB和PaGG4-DB有相互作用，但与PaGG2-DB没有相互作用（图。3.)．相反，PAGG2-AD与PAGG1-DB相互作用，而不是自身，PAGG3-DB或PAGG4-DB。

Gγ-和g α-亚基之间的有限相互作用已被报道[42.]在没有哺乳动物系统中的Gβ-亚基的情况下[43.-45.我们还测试了PAGPA1与所识别的Gγ-亚基之间的相互作用。实际上，PAGPA1-AD与PAGG1，PAGG2-，PAGG3和PAGG4-DB相互作用（图。3.)．

不同程度的序列变异表明Gγ亚基的亚功能化

Gγ-亚基在植物王国表现出低的总体守恒，这表明序列变异可能导致功能性发散。因此，我们通过在Pinaceae，Brassicaceae和Fabaceae中进行A-和C型Gγ-亚基簇中的氨基酸保守的成对比较，评估Gγ-亚基是否在不同的进化约束下进化。将Brassicaceae和Fabaceae选择为有效的Anuiosperm比较作为其分歧时间（125 mya [46.])与属间分化时间相似Picea.和松果体(145米娅(40那41.])。为了比较，我们还对同一类群的g α-亚基进行了分析。g α-亚基的序列变异最小(图1)。4A). 在被子植物C型样Gγ亚基中发现了最高的序列变异（图。4B.)．序列变异显着（P.≤0.05)，所有针叶树g γ-亚基类和g α-亚基类序列均低于被子植物(图1)。4.)．

Gγ亚基基因的差异表达提示了细胞亚功能化p .冷杉属

观察到的Gγ亚单位类型之间氨基酸保守性的差异可能表明亚功能化或新功能化。为了验证这一点，我们研究了PAG1、PAHG1、PaGG1、PaGG2和第3页在子叶和根p .冷杉属转移到新鲜培养基后4,24和72小时的幼苗（图。5.)．根表现出更高的表达（P.≤0.05)PaGPA1、PaHGB1 PaGG1和页码2随着时间的推移而与子叶相比。第3页表达量随时间和组织变化稳定，但72 h后在子叶中表达量下降。

在建立基础表达水平之后，我们研究了非生物和生物胁迫对G蛋白亚基基因表达的影响。表达式PAG1、PAHG1、PaGG1、PaGG2和第3页在感染(hpi)后4、24和72 h，分别对鼠茅和根进行了分析H. Annosum S.S.Conidiospores。在单独的实验中，用防御信号激素脱落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（MEJA）以及伤口处理处理幼苗。表达水平PaGPA1那多环芳烃1那第1页和第3页显着（P.≤0.05)诱导入p .冷杉属72 hpi后的根H番荔枝属。S（桌子2)．的感应PaGPA1已经在24 HPI中可检测到，并在72 HPI达到五倍诱导。表达式第3页在子叶中诱导，以及根部。荷尔蒙治疗或伤口没有诱导任何基因表达的任何变化（附加档案7.)．

进一步调查PaGPA1那第1页那页码2和第3页到H番荔枝。他们的表达在4岁的树皮中分析了p .冷杉属植物受伤或接种h . parviporum或者腐生真菌巨静脉病，无法殖民p .冷杉属树皮组织[47.]. 直接在接种/损伤部位和远离接种部位2cm的远端位置对72 hpi/损伤的表达水平进行定量。页码2树皮中的表达低于测定的检测限。与局部位点的伤害相比，响应于真菌接种物而差异表达其他亚基基因差异表达（图。6A)．但是，在远端位置，表达PaGPA1和第1页被诱发了h . parviporum感染，但不是由p . gigantea，与受伤对照组相比（图。6B.)．

针叶树具有一种独特的短Gγ亚基类型，这在其它陆地植物中是不存在的

本研究旨在研究异三聚体g蛋白在木本植物中的存在和功能。我们关注针叶树p .冷杉属还有它的一些近亲。我们鉴定并验证了一个Gα-，一个Gβ-和四个不同的g γ-亚基基因的存在p .冷杉属并发现其他针叶树中的正交基因。我们的调查确定了额外的Gγ-亚基基因p .冷杉属和p . sitchensis，不存在P. glauca.和p . taeda．观察p . taeda和P. glauca.与此前报道的松科3个g γ-亚基基因一致[9.]，并建议Picea.第四个g γ亚单位基因后来丢失在P. glauca.．但是，作为针叶树序列，除了p .冷杉属，我们不能排除其他基因的存在。

四种不同的预测Gγ亚基样蛋白序列p .冷杉属可以分为短而长的变体。根据Trusov等人的描述，模块化结构将PAGG1作为α型Gγ-亚基，并且PAGG3和PAGG4作为C型Gγ-亚基组的成员。[22］．我们发现这与他们在我们当前研究中的系统发育位置完全一致。系统发育研究表明，GG3和GG4是针叶树进化过程中出现的新物种。根据我们的数据，最简约的假设表明，复制事件发生在属的分裂之后Picea.和松树，以GG3为祖先序列。PaGG2及其针叶同源物的序列包含了一个既不匹配a -或C-type-like序列，也不匹配单子叶或双子叶特定的B-type序列的新的c端基序。系统发育分析表明，PaGG2和PaGG1具有较高的相似性，PaGG2及其同源系已经偏离了a型分支。因此，PaGG2及其同源物可能代表了一种新的、针叶树特有的g γ亚基类型。

针叶树g γ-亚基与PaHGB1和PaGPA1的相互作用不同

结果表明，papa1与PaHGB1在酵母-2杂交筛选中相互作用。除了g γ-亚基的n端外，较小的g γ-亚基基本上埋在g β亚基中，[42.]形成Gβγ-二聚体[15];我们发现PaHGB1与g γ亚基PaGG1、PaGG3和PaGG4相互作用，而与新的针叶树特有的g γ亚基PaGG2没有相互作用;对PaGG2的功能提出了一个问题。对预测的PaGG2蛋白二级结构的检查表明，PaGG2在ggl结构域中只形成一个α-螺旋，而不是两个α-螺旋[39］．这种不完整的GGL结构域可以仅与Gβ-亚基弱相互作用。

根据之前哺乳动物系统的报告，我们发现PaGPA1也与每一个p .冷杉属包括PaGG2 Gγ亚基。哺乳动物g β-亚基缺失时Gγ-和g α-亚基之间的相互作用[42.-45.]已被认为依赖于Gγ蛋白的n端区域[45.]突出于Gβγ-二聚体，并对Gα亚单位的活化有潜在影响[48.然而，尚未从植物报告相应的结果。

异三聚体g蛋白复合物的序列差异在针叶树和被子植物中是不同的

在大多数植物物种中，Gγ-亚基是唯一具有多于一个基因家族成员的异校型G-蛋白质复合物的一部分[9.］．此外，它们的顺序高度变化，并且其转录响应的差异被认为是G-蛋白反应广泛作用的关键因素[18那21那22那32］．高序列分歧和特异性基因调节是副和/或新官能化的指示剂。Gγ-亚基序列序列表明了与Gα-亚基（≤15％氨基酸取代）相比的C型样序列（≤75％氨基酸取代）中的更强的序列多样化。该结果与大多数植物中的Gγ-亚基基因的变量数对齐[9.］．有趣的是，我们还发现松科植物的g蛋白亚基序列相对于双子叶植物的g蛋白亚基序列更保守，而不是亚基类型。我们知道裸子植物的进化通常比被子植物慢，这可能是因为它们的寿命长和有效种群规模大[49.，我们把这种观察归因于针叶树的生活方式。这种序列差异可能表明功能差异，基因表达模式互斥的芸苔科AGG1和AGG2同源类群之间存在显著差异[21］．

针叶树g蛋白复合物具有特异性调控作用

不同级别的序列保护促使我们研究异映型G蛋白复合物的基因表达p .冷杉属在不同的组织中。与绿藻相比凯达·布劳恩[23]，我们发现所有亚基的表达模式普遍存在，但组织分化。在这方面，表达模式更类似于在被子植物中看到的，而不是更多的基础谱系，类似于那些报道的假定同源芸苔属植物显著和A. Thaliana.[3.那21那26那27]. 这个多环芳烃1Expression也与Expression of一致第1页和页码2与预期的相互作用的Gβ亚单位和Gγ亚单位一样，尽管我们不能证明它们之间的相互作用多环芳烃1和页码2在酵母双杂交试验中。有趣的是，本构式表达第3页在p .冷杉属幼苗的构成表达是按照聚合3在A. Thaliana.苗(3.］．

H番荔枝。以响应mamp的方式触发g蛋白的表达

我们对病原体防御信号传导中异络G-蛋白反应的功能分歧的兴趣引用了我们研究表达模式p .冷杉属g蛋白亚基基因在不同组织和不同病原体相关处理下。在P. Abies-h。Annosum S.L.病理系统，伤口和病原体接种显示出定性相似的反应，尽管对病原体的反应具有较高的幅度和持续时间[35那36那47.］．这表明防御反应对H番荔枝。触发混搭，但类似于潮湿触发的[50.]伤口反应[35-37那47.]. 这种反应还涉及激素触发的防御途径，如JA介导的抗性[35那47.]. 有趣的是p .冷杉属蛋白亚基PaGPA1、PaHGB1 PaGG3和第1页在幼苗根系中回应H. Annosum S.S.处理，但不伤苗。4年生幼苗的树皮反应相似，但处理间没有差异H. annosum s.l。和P. Gigantea，非致病性真菌[47.]，表明基于mamp的信号提示与幼苗年龄无关。差动调节第1页和页码2在年轻幼苗的根部表明它们之间的功能分化那根据不同层次的直系间序列守恒。

我们还观察到损伤反应和对腐生菌的反应p . gigantea在四岁幼苗的分支机接种的树皮中，距离会削弱[47.]，而对h . parviporum持续。我们建议发生这种现象，因为病原体和伴随的连续释放了生物吠声。最后，PaGPA1和第1页是否仅在远端部位有明显诱导h . parviporum治疗方法。观察到的反应h . parviporum和p . gigantea不同的同意schwacke和hager的结果[51.]，表明p .冷杉属响应随着激发子的增加而增加H. annosum s.l。与外生菌根真菌的诱导子相比。根据药理学研究，Schwacke和Hager观察到的反应[51.]已经被认为是由膜结合受体激酶在G蛋白激活之前的（自动）磷酸化或（和）激活G蛋白的下游直接介导的[52.]. 这些观察结果与我们的结果和我们关于异源三聚体G蛋白在JA信号传导上游起作用的建议一致，即使Gα亚单位激活剂mastoparan的特异性在[52.，已被质疑[53.我们认为，PaGPA1及其同源物在松科植物MAMP感知中的作用值得进一步研究。

p .冷杉属拥有全部的G蛋白质亚基，包括一种新的针叶树特异性短gγ-亚基类型（巴勒斯坦权力机构GG2及其正射影像）。但是，的功能巴勒斯坦权力机构考虑到这种蛋白质似乎不会与GG2发生相互作用，因此GG2值得怀疑巴勒斯坦权力机构HGB1。序列差异表明g γ-亚基相对于g α-亚基进化较为宽松，这是重复基因的典型模式。不同的g γ-亚基之间的进化限制伴随着不同的表达反应，对非挑战和挑战的情况。这表明了副推理g γ-库的亚功能化。进一步，差别化监管PaGPA1和第1页为了应对H番荔枝。这表明异三聚体g蛋白复合物在病原体感知和下游信号应答中是一个关键的关键。

数据库搜索

我们在NCBI核苷酸、蛋白质和EST数据库中进行了blastx和blastp搜索，基因索引项目(the Gene Index databases - dana Faber Cancer Institute;[54.-56.]，Uniprot（Uniprot Consortium，2012），p .冷杉属基因组v1.0[33]和植物血统v9.1 [57.]收集我们的数据集。我们的数据库搜索分两步进行：1）GPA1、AGB1、AGG1、AGG2和AGG3蛋白序列（来自A. Thaliana.)作为输入数据检索第一组序列，2.)然后使用这第一组经过验证的序列重复数据库搜索，以确保我们的数据集的高覆盖率。利用序列操作套件的翻译功能(带有标准遗传密码)将恢复的核苷酸序列翻译为氨基酸序列[58.］．要验证检索到的数据集，我们查询了rabidopsis信息资源（https://www.arabidopsis.org/）蛋白质数据库，并以最高的相似性分析。此外，我们评估了Gα-和Gβ-亚基的可对齐A. Thaliana.序列和搜索Trusov等人描述的保守域[22]在可能的gγ-亚基中。

将检索到的序列与已鉴定的双子叶g γ-亚基和全长g α-亚基结合P. glauca.和p . taeda从Urano et al[9.]（附加文件）1）用于系统发育分析。Gα-亚基样和Gβ-亚基样的数据集包括来自Brassicaceae，Fabaceae和Pinaceae的物种的序列P. Paten.Gβ-亚基样序列。我们创建了一种类似Gγ-亚基的数据集，来自Brassicaceae，Fabaceae，Pinaceae和金属盘。

我们观察到了不寻常的富含缬氨酸的C-TerminiMedicago Truncatula.我们数据集中的Gγ亚单位C型。基因组序列分析显示，预测的外显子边界发生了帧移（PhytozomeV9.1）[57.]）在所有三个序列中：MEDTR8G021170.1显示了其最后一个外显子的单架帧移位，MEDTR2G042200.1在第二个到最后外显子的两个基础帧移位由MEDTR2G042200.1和MEDTR4G125190.1 A五- 在第二个到最后外显子的5'末端伸长率，以获得富含半胱氨酸的C-Termini。有关对齐的更多信息，请参阅其他文件4.那5.和6.．

放大p .冷杉属G蛋白序列

我们克隆了该基因的全长异三聚体G蛋白亚基编码序列p .冷杉属．根据检索到的3种松科植物的est和核苷酸序列设计引物:p . sitchensis那P. glauca.和p .冷杉属．引物序列列于附加文件8.．

这PaGPA1基因似乎被分成了两个不同的预测成绩单，Comp92545_C0_SEQ1和Comp92545_C1_Seq1p .冷杉属1.0基因组数据库。预测的1173bp全长转录物的扩增是在由1x Dream-Taq绿色缓冲液组成的PCR反应中，每种引物的0.25μm，0.2mM DnTPS，6.25u Dream-Taq聚合酶（Fermentas）和1μlp .冷杉属互补脱氧核糖核酸。初始变性在95℃下5分钟，然后在95℃下在95℃，20s处在58℃和120s处，在72℃下的最终伸长步骤，在72℃下为58℃。

这多环芳烃1序列扩增自p .冷杉属互补脱氧核糖核酸通过使用Advantage®2 DNA聚合酶混合物(Clontech Laboratories, Inc.)进行两步PCR，第一反应1:50稀释后的PCR产物作为第二反应的模板，以增加产物量。

gγ-亚单位样序列Pagg1，Pagg2，Pagg3和第4页从3′-和5′-聪明的™ RACE cDNA（Clontech Laboratories，Inc.）文库p .冷杉属感染h . parviporum，根据手册在两步PCR方法中的说明（PaGG1, PaGG2和第3页)和套式PCR方法(第4页)．

PCR产物PaGPA1、PaHGB1 PaGG2和第3页采用GenJET™凝胶提取试剂盒按照说明书提取琼脂糖凝胶，第1页和第4页用Genjet™PCR纯化试剂盒直接纯化。使用Topo®TA克隆（Life Technologies）克隆纯化的PCR产物根据说明书（Amsterdam，荷兰）测序质粒。使用具有序列操作套件的标准遗传密码的翻译功能将良好的质量序列翻译成氨基酸序列[58.］．我们将所有氨基酸序列验证为TAIR和NCBI中的异络型G蛋白复合体，如前所述。使用基础软件预测氨基酸序列的二次结构（http://bioinformatica.isa.cnr.it/PRESSAPRO/)．

系统发育分析

用MEGA-5.0软件分析了异源三聚体G蛋白不同亚基类型的系统发育关系[59.]. 所有数据集均采用邻接算法、1000次bootstrap重复、p距离估计作为统计模型、均匀替换率和95%的部分序列截断值构建系统发育。Gα亚单位样序列和Gβ亚单位样序列使用CLUSTALW进行比对，默认选项，Gγ亚单位序列由于其高度的序列变异性而被手动比对。

g - γ序列序列特征Picea amies

利用蛋白质分子量函数进行分子量预测和序列恒等相似性分析鉴别和SIM序列操作套件的功能[58.]. 序列相似性预测基于图。1和类似氨基酸按照MEGA 5.0的建议进行分组[59.，以便更好地比较数据。

异源三聚体G蛋白的保守性

对于g α-类亚基序列和A-类和c -类g γ-亚基序列，我们将序列差异估计为平均氨基酸错配/序列长度的两两比较。每个差距都被认为是不匹配的。在包含至少一个不完全序列的比较中，只考虑两个序列所覆盖的区域。为了进一步了解松科植物g蛋白的进化，我们分析了豆科-花椰菜科，豆科，花椰菜科，松科的序列差异。Picea.和vi）松果体，如果群集包含超过三种不同的物种。省略了豆科酸的agg1样簇，因为不完全的不完整性豇豆属unguiculata序列FF393368.1由于高序列变异性而偏置结果。使用单向ANOVA进行群集之间的统计差异，然后进行Tukey Hoc测试。

生物材料

H. Annosum S.S.隔离Sä16-4[60.]在黑格姆培养基上培养[60.在黑暗中在25℃下板，直到板材覆盖有菌丝体。与高压灭菌的水和Drigalski Spatula的表面分离出分类。通过玻璃棉过滤悬浮液。使用血细胞计数（Bürker，ScherfPräzision）测定分类浓度。

种子p .冷杉属（S09 / 120）用33％过氧化氢灭菌的表面灭菌，加入一个滴剂，并在灭菌溶液中轻轻旋转1℃，然后用高压灭菌水洗涤6次。种子被水覆盖并在4℃下含有夜间。将种子允许在水琼脂上发芽，然后用0.35％凝胶（Duchefa）转移到倾斜¼Schenk-Hildebrandt培养基（pH 5.6; Duchefa Biochemie）直至开发第一个真针。在长期条件下在22℃下在垂直位置孵育幼苗。

基因表达实验设置

p .冷杉属在表达研究中使用的幼苗是I）转移到Schenk-Hildebrandt培养基，其中10μmaba（100％EtOH;锡格玛ald;σaldrich），ii）用针III伤害，用3ml处理一种H. Annosum S.S.分离Sä16-4分生孢子悬液1.5 x 10^6.±31 x 10^5.(SE)孢子/ml和iv)用MeJA (Sigma Aldrich)处理。MeJA处理后的幼苗在每1 l室体积添加75 μl 10% MeJA的密闭色谱室中培养。样品分别在处理后0、4、24和72 h采集。分别采集根和子叶，用液氮冷冻，保存在−70℃，待进一步使用。每个处理和对照设3个生物重复，每个重复5株幼苗。

表达分析p .冷杉属吠声在四岁的植物分支机构中完成，来自源自瑞典育种计划的全SIB系列S21H982005，接种p . gigantea（rotstop s），h . parviporum(Rb175)或Arnerup等人所述的伤害[47.］．分析72例hpi伤/接种部位(0 ~ 0.5 cm)和远端(1.5 ~ 2.5 cm)标本。每个处理设3个生物重复。

定量聚合酶链反应

通过Chang等人的方案基本上基本上进行RNA提取。[61.］．样品按照制造商的说明用DNase (Sigma Aldrich, USA)处理，用NanoDrop(分光光度仪ND 1000, Saven Werner)测定RNA浓度。使用iScript™cDNA合成试剂盒(BIO-RAD, Sundbyberg，瑞典)按照制造商的说明将300 ng总RNA逆转录成cDNA。

根据说明书使用SsoFast™EvaGreen®Supermix (BIO-RAD)进行定量PCR，每个引物0.3 μM。qPCR采用iQ5™多色实时荧光定量PCR检测系统热循环(Bio-Rad)进行，使用95°C初始变性30s, 95°C变性5s, 60°C变性10s的程序进行40个循环。熔体曲线分析用于验证扩增子。相对表达式(fold change)用2^-ΔΔct方法 [62.］．单向Anova与Tukey Hoc测试或Mann-Whitney你GraphPad Prism 5.0统计软件包（GraphPad Inc.）中的测试用于测试表达的统计差异。

针叶树g蛋白亚基酵母双杂交试验

PAG1、PAHG1、PaGG1、PaGG2、PaGG3页和PAGG4 cDNA序列用Attb引物扩增(附加文件8.)在由1x Dream Taq绿色缓冲液、每个引物0.25μM、0.2 mM dNTPs、6.25U Dream Taq聚合酶（酵素）和1μlp .冷杉属互补脱氧核糖核酸。初始变性在95℃下5分钟，然后在95℃下在95℃，20s处在58℃和120s处，在72℃下的最终伸长步骤，在72℃下为58℃。用Genjet TM PCR纯化试剂盒直接纯化PCR产物。然后通过Gateway®BP重组将纯化的PCR产物克隆到PDONR TM / Zeo载体中。转化TOP10富集细胞，并在具有50μg/ mL Zeocin的LB培养基中选择菌落。在液体LB培养基上生长菌落在液体LB培养基上生长，使用Genjet™质粒小质粒分离了50μg/ ml Zeocin，并通过PCR使用attB引物来验证质粒，用于不同的G蛋白亚基。

PAG1、PAHG1、PaGG1、PaGG2、PaGG3页和第4页通过Gateway®LR重组从PDONR / ZEO进入载体转移到PDEST-DB和PDEST-AD-CYH2载体中，以分别产生GAL4 DNA结合结构域（DB）和GAL4活化域（AD）杂交蛋白。使用LR反应转化为TOP10富集细胞，并在具有100μg/ mL氨苄青霉素的LB板上选择菌落。菌落在液体LB培养基上生长过夜，用100μg/ ml氨苄青霉素和质粒使用Genjet™质粒小磷脂混浊，并在宏观（Amsterdam，荷兰）测序质粒进行确认。

将得到的DB和AD质粒单独转化为单倍体酵母（酿酒酵母）菌株Y8930（Matα）和Y8800（Mata）分别如上所述创建诱饵和捕食63.]. 简言之，Y8930和Y8800菌株在液体YEPD中过夜生长。第二天早上准备0.1 OD培养物。当OD值达到0.4-0.6时，收集细胞并准备转化。诱饵和猎物是在Difco上选择的™ 亮氨酸缺失酵母氮基（YNB）(−五十） 和色氨酸流失(−T） 选择性培养基。在YEPD中，单倍体诱饵酵母菌株和被捕食酵母菌株以o/n配对。将二倍体酵母细胞筛选到YNB-LT选择性液体培养基上，然后在YNB-LTH和含有环己酰亚胺（CHX）的LH选择性培养基上进行斑点检测。此外，我们还通过添加组氨酸生物合成的竞争性抑制剂3-氨基-1，2，4-三唑（3AT）来测定蛋白质-蛋白质相互作用的强度。酵母在含-LTH而非-LH的CHX培养基上的生长被认为是正相互作用。在含有CHX的-LTH和-LH上发现的酵母生长是由于德从头自动激活，从而从数据集中删除。

支持本文结果的数据集包含在文章及其附加文件中。

我们要感谢Katarina Ihrmark博士在实验室提供的技术帮助，以及Mukesh Dubey博士对手稿进行的有价值的讨论。瑞典战略研究基金会(SSF)提供了资金支持，资助编号为R8b08-0011，瑞典研究理事会FORMAS提供了拨款nr 2012-1276。M. Shahid Mukhtar获得了阿拉巴马大学伯明翰分校生物系的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或手稿准备方面没有任何作用。

从属关系

1. 瑞典农业科学乌普萨拉生物监察大学森林植物科学与植物病理学系，瑞典大学

   Sophie de Vries, Miguel nemesion - gorriz, Magnus Karlsson & Malin Elfstrand

2. 海因里希·海涅大学群体遗传学研究所，Düsseldorf，德国

   Sophie de Vries.

3. 美国阿拉巴马大学伯明翰分校生物学系

   彼得B。布莱尔和M。沙希德·穆赫塔尔

通讯作者

对应到马林Elfstrand．

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

SdV和我构思了这项研究并设计了实验。SdV和MNG进行了实验。MK和SdV进行基因家族进化分析。MNG、PBB和SMM设计并执行了Y2H研究。SdV分析了数据。SdV和我起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最后的手稿。

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