栽培番茄型vi腺腺瘤的发展GydF4y2Ba茄属植物lycopersicumGydF4y2Ba和一个相关的野生物种GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

VI型腺状毛是番茄植株叶和茎上最丰富的毛状体类型，对植物的抗草食性有重要作用，尤其是野生植物。尽管如此，迄今为止对它们的发展研究很少。这项研究的目的就是填补这一空白。利用多种细胞成像技术，详细记录了栽培番茄中VI型毛状体的解剖和发育阶段(GydF4y2Ba茄属植物lycopersicumGydF4y2Ba)及相关野生物种(GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba)提供。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在两个物种中，这些结构的发展遵循高度可复制的细胞分裂模式。这两个物种的毛状头的形状不同，是圆形的GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba就像四叶草一样GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba，与大型细胞间腔的存在相关GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba产生的代谢物聚集的地方。在两个物种中，中间细胞和四个腺细胞之间的连接点构成了一个断点，有利于毛状体的脱落，从而快速释放代谢物。一种强烈的自荧光化合物暂时积累在发展的早期阶段，提示在分化过程中的潜在作用。最后，用识别特定细胞壁组分的抗体进行免疫标记，表明果胶和阿拉伯半乳聚糖组分在VI型毛状体的分化中起关键作用。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的观察结果解释了促进代谢物储存和释放的VI型粒子的适应形态，并提供了一种进一步研究这些重要的代谢细胞工厂的框架。这是为了更好地利用它们的潜力，特别是在番茄中抗毒性抗性的培育。GydF4y2Ba

植物表皮是植物的重要组成部分，它不仅在植物与生物和非生物环境的相互作用中起着至关重要的作用，而且在植物的生长发育和营养物质的获取中起着至关重要的作用。这些不同的功能是由一系列表皮分化来实现的，从地下的根毛到气孔和不同种类的毛在地上部分。毛状体是表皮上的突起，形状和大小千差万别[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．它们可以是单细胞或多细胞，腺或非腺体，并且在植物物种内可以存在明显的毛状体。与此相反GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba它本质上只有一种单细胞非腺毛，像番茄这样的物种可以展示多达七种不同的类型，不少于四种不同的腺毛[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．毛状使一个有吸引力的系统来研究器官发育和分化的基本过程，因为它们不是必需的器官。因此，毛状体的GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba已成为众多遗传学和分子研究的对象，导致对其发展和模式形成过程的分子遗传学的详细剖析[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．相比之下，也有直到腺毛发展到现在比较少的分子遗传学研究。最近，我们提出了番茄（GydF4y2Ba茄属植物lycopersicumGydF4y2Ba以及相关的野生种），作为对腺毛的研究模型系统，由于其广泛的遗传资源，序列化基因组和一个活跃的研究社区[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．番茄的腺毛主要有三种类型。VII型是短的腺状毛体，有一个单柄细胞和一个浆果状的头状体，头状体的分泌细胞数量不同。在烟草中，类似于番茄VII型毛状体的短腺毛状体产生一种叫做叶平面蛋白的蛋白质，具有抗真菌活性[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．I型和IV型胎儿相关，并且具有多细胞茎和一对一的腺头细胞。I型毛状体长，并存在于几种番茄种类中，包括GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba，而较短的IV型仅限于野生物种，例如GydF4y2Ba彭内利沙门菌GydF4y2Ba和GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba现在有大量证据表明，I型和IV型毛状体是合成各种酰基糖的主要场所[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．vi richomes型代表了几种番茄物种中最丰富的毛状体类型，包括GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba，具有特定的结构，其中四个腺细胞排列在一个中间细胞和一个茎细胞的顶部的一个平面上。它们是多种化合物的生物合成场所，包括萜烯和甲基酮，其多样性不仅区分物种，也区分物种内的资源[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．番茄VI型毛状体中的一个特别的特征是从cisoid异戊二烯二磷酸萜的生物合成。在GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba，Neryl二磷酸（NPP）是单选萜类化合物如α-phellandrene的基材，以及GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba生产了一系列倍半萜，如α-檀香烯、佛手柑烯和姜黄烯GydF4y2BaZ ZGydF4y2Ba-fpp [GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]有大量证据表明，由各种类型的番茄腺毛产生的代谢物提供了抵御一系列植物害虫的主要防御屏障[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]．特别是野生番茄品种，对一些节肢动物的抗性不断增强，这可以追溯到毛状体的分泌物[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．三种交叉允许将毛状体从野生物种引入GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba．然而，这些多粒性性状的选择不仅需要吩咐代谢物生物合成的基因，而且还需要深入的知识，而且还需要确定毛状物的生物合成的基因，但确定毛状体密度，培养型架构和生产和分泌大量代谢物的能力的基因．确实有证据表明，产生的代谢物量影响阻力水平[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]．虽然在过去几年中阐明了培养的滴毛组特异性代谢物途径的重大进展[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]，腺毛状体生物学的其它方面在分子遗传水平基本上还未，如腺细胞的分化或生物合成途径的转录调节。此外，有部分证据表明，控制腺毛发展的调节机制可能不相同的非腺毛[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]，尽管启动机制可能是共享的[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]．因此，人们可以预见，关于拟南芥毛状体发育和分化的广泛知识可能不能直接转移到具有腺状毛状体的物种。GydF4y2Ba

要建立番茄腺毛发育和分化的模型系统，首先要对这些过程进行准确描述，并对其进行特定阶段的分类。利用各种显微镜技术，我们在这里收集了野生物种中VI型毛状体发育阶段的详细序列GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2BaLA1777和GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2BaLA4024。我们的观察结果指向高度可重复和确定的一组事件，导致具有特异性结构特征的专用腺结构，并提供了一种框架，用于进一步分子研究腺瘤的发育和番茄分化。GydF4y2Ba

小鼠VI型腺毛外观的差异GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba和GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba由独特的内部架构反映GydF4y2Ba

有许多报告证明，在野生番茄种有较高的腺状毛的代谢生产力GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba与其耕种相比GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]．造成这种差异的原因有两个:毛状体密度的增加和每根毛状体代谢活动的增加。我们估计每册册的第VI类腺毛的数目(GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 5) on the adaxial side at 2573 ± 161 cm^{−2.GydF4y2Ba}在GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba与611±171厘米GydF4y2Ba^{−2.GydF4y2Ba}在GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba在面积为1.6±0.2厘米的小叶上测量GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba2.1±0.9 cmGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba分别。然而，单凭这一点还不能解释毛状体产生的代谢物含量的巨大差异，这些代谢物的绝对数量可超过100倍。事实上，产生倍半萜羧酸的量GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2BaLA1777可以达到高达12毫克克GydF4y2Ba^{−1.GydF4y2Ba}FW [GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]，而芦丁是植物腺毛产生的最丰富的次生代谢物GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba，范围为70 ~ 170 μgGydF4y2Ba^{−1.GydF4y2Ba}FW [GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．已经观察到GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba和GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba相貌不同[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba]．在GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba腺体的腺体看起来很吻GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba四种腺细胞轮廓清晰可见。我们通过环境扫描电子显微镜(ESEM)的观察证实了这种形状上的差异(图)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.两种物种的VI型毛体具有相同的整体结构，有一个腺头，一个中间细胞和一个连接毛体和叶子的单柄细胞。毛状体位于单个基细胞的顶部，基细胞的直径略大于茎细胞(图)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.圆形毛状体中的腺细胞GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba不能与外面区分开。但在发育早期阶段存在沟（图。GydF4y2Ba1CGydF4y2Ba)表明GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba也可能含有四个腺体细胞。附着在叶子上的毛状体薄片和在荧光显微镜下直接观察毛状体，证实了两个物种中都存在四个腺细胞(图。GydF4y2Ba2AGydF4y2Ba和GydF4y2BaBGydF4y2Ba）.此外，这些图像显示了GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba一个大的细胞间隙，代谢物可以在这里聚集。相比之下，栽培番茄的VI型毛状体要么没有细胞间隙，要么细胞间隙非常小，因此代谢产物的储存空间很小。从茎尖和发育中的叶片的ESEM照片显示，在叶原基上已经存在完全成熟的毛状体GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1)。毛状体首先出现在背面，然后出现在正面，在那里它们最终变得更密集(附加锉刀GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1)。这表明，毛状体起始和分化发生在一个单一的叶内的不同位置的不同时间。因此即使是很年轻的叶子会含有混合发展阶段的毛状体人口。GydF4y2Ba

为了进一步了解VI型毛状体的发展和结构，我们使用荧光和电子显微镜以及免疫染色进行了一系列的实验，这些将在接下来的章节中介绍。GydF4y2Ba

脱离型VI毛状体的荧光显微镜GydF4y2Ba

毛状体很难直接在叶子上近距离观察，因为叶子表面不规则，毛状体容易断裂。因此，我们首先从之前发表的方法中获得灵感，使用玻璃珠击打程序(见材料和方法)分离它们[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．对栽培番茄(LA4024)和野生番茄(LA1777)进行了试验研究。将分离的毛体直接用荧光显微镜观察，无需进一步处理。如图所示，可以观察到不同的发展阶段。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba在这两个物种中，斑片状的红色自体荧光表明在整个发育阶段存在叶绿体。99%以上的毛状体处于成熟阶段，即具有四个明显个体化的腺细胞（图。GydF4y2Ba3f，l，rGydF4y2Ba和GydF4y2BaxGydF4y2Ba）.然而，该图可能是高估的，因为成熟毛粒的头部倾向于比年轻毛状体更容易破裂。这是通过中间电池始终看到仅具有一个或两个预分泌细胞的幼粒细胞的头部的事实证实了（图。GydF4y2Ba3g、h、sGydF4y2Ba和GydF4y2BaTGydF4y2Ba)而这种细胞不存在于分离的成熟毛状体中GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba，成熟阶段中的胎体的叶绿体似乎同样地分布，表明细胞占据滴毛瘤头部的大部分体积（图。GydF4y2Ba3RGydF4y2Ba).相反，在GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba，体层似乎在周边聚集并且完全没有中心，划清腺体细胞之间的细胞间腔（图。GydF4y2Ba3FGydF4y2Ba）.这两个物种的区别在发育的后期阶段最为明显，此时腺体细胞之间的收缩被清楚地标记出来GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba3 p-rGydF4y2Ba和GydF4y2BaV-XGydF4y2Ba)而在GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba四个细胞形成一个圆形(图。GydF4y2Ba3D-F.GydF4y2Ba和GydF4y2BaJ-L.GydF4y2Ba）.在早期的阶段，开发遵循两个物种中的非常相似的路径。利用这种制备方法，我们可以隔离的最早阶段在尖端追随中间电池的尖端具有一个细胞（图。GydF4y2Ba图3a，G，MGydF4y2Ba和GydF4y2BasGydF4y2Ba）.在该阶段的显影毛状体头的直径为大约20微米。在尖端的单细胞经历不显著放大两个连续分裂，导致25-30微米的直径（图1的4芯头。GydF4y2Ba3 c, i, oGydF4y2Ba和GydF4y2BaUGydF4y2Ba）.毛状体头部明显增大，达到60 μM左右。平均直径为69.5 μm±6 (GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 50) inS.哈布菊属GydF4y2Ba和57.0μm ± 4.9 (GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 50) in美国lycopersicumGydF4y2Ba．在特殊情况下（少于0.5％）可以检测到超过100μm的滴毛头GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S2）。用的叶片表面上活毛状体荧光显微镜观察结果表明，在最成熟的阶段，毛状体头部中的细胞间空腔GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba约占总体积的65%(图。GydF4y2Ba2B.GydF4y2Ba），剩余的细胞质在毛状体头的周边形成薄层。从此以来GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba，头部细胞似乎形成了细胞间腔之前放大，这表明细胞内体积显着降低作为毛状体的成熟。GydF4y2Ba

滴毛瘤早期阶段的黄酮衍生荧光物质的瞬态积累GydF4y2Ba

一个显着特点常见的两种物质是强烈的黄绿色自发荧光的在发展的早期阶段，其中，所述第二分割在成熟阶段完全消失（图之后逐渐减小的存在。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba和额外的文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S3）。荧光光谱使人联想到类黄酮类化合物（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S4），尽管应该注意的是，类黄酮通常是自动荧光不良的。因此，这种未知物质不太可能是未改性的黄酮类化合物。由于化合物的高瞬态存在和少量初期的发展阶段，我们未能分离足够量的材料以鉴定化合物。有趣的是，在最近的稿件中，编码醌异构酶（Chi）的基因中的番茄突变体具有较小的VI粒细胞，其产生显着较少的单波通[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]．由于CHI是类黄酮生物合成的关键酶，因此确定在WT中观察到的这种荧光是否在该突变体中仍然存在(GydF4y2Ba茄属植物lycopersicumGydF4y2Ba加入LA1049）。因此，从LA1049植物毛状体中分离，并用荧光显微镜观察。值得注意的是，黄色荧光现在集中在离散的点（图GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)，在光学显微镜下也可见，表明荧光集中在囊泡状结构中。共聚焦显微镜观察显示这些小泡位于细胞内(图。GydF4y2Ba4 fGydF4y2Ba和GydF4y2BaLGydF4y2Ba）.此外，该荧光材料是可见的整个包括在具有四个头单元毛状体毛状体的发展，而在野生型中，荧光在成熟阶段消失。这些观察结果证实，在野生型中看到的荧光化合物是一种类黄酮，并且它在VI型腺体毛状体的正确分化中发挥着关键作用，进入活性萜烯分泌结构。GydF4y2Ba

头部细胞和中间细胞之间的连接构成易于释放代谢物的脆弱点GydF4y2Ba

我们注意到，当收集到VI型毛体时，只有头部细胞存在，除了在最早期的发育阶段，头部只有一个或两个细胞，这些细胞仍然附着在中间细胞上。在GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba，仍然绑定到叶子的毛状体具有完全圆形的外观（图。GydF4y2Ba5GydF4y2Ba)相比之下，分离的毛状头看起来像是折叠的，腺细胞之间的细胞壁呈波浪状（图。GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba）.这些观察指向作为插件防止代谢物的释放的中间细胞的作用形成细胞间空腔。此外，这也表明在中间电池和头单元之间的接合处构成了一个脆弱的点有利于代谢物的释放时的毛状体被物理损坏，例如通过食草动物。这一假设的确认通过断头毛状体的观察通过表明断裂发生的四个头细胞和中间细胞（图之间发生荧光显微镜提供。GydF4y2Ba5度GydF4y2Ba).中间细胞显示出强烈的蓝色荧光，表明细胞壁中存在酚类化合物，并且仍然附着在茎细胞上。电子显微镜图像（见下文）提供了头细胞和中间细胞之间连接处作为脆性点的进一步证据。GydF4y2Ba

vi richomes类型的超微结构GydF4y2Ba

深入钻研类型VI毛状体的结构，通过透射电子显微镜观察到的顶点超薄切片。从LA4024 LA1777和毛状体仍然附着在叶子和处于不同发展阶段的图像可以观察到，并说明如下。GydF4y2Ba

滴毛组开始的最早阶段可以追溯到凸出表面的扩大表皮细胞（图。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.在这个阶段，它是不是真的有可能不同类型的毛状体将从这些皮毛首字母出现的区分。指向型VI毛状体的开发的第一个迹象是毛状体初始的第一不等分割，从而导致一个小的顶端细胞和将来柄细胞（图GydF4y2Ba6 bGydF4y2Ba）.顶端细胞再次不均匀分裂，产生顶端细胞和中间细胞，虽然这个阶段不能直接观察到。在荧光显微镜下可以看到，顶端细胞经历了第一轮的垂斜分裂(图)。GydF4y2Ba6摄氏度GydF4y2Ba）然后再次产生四个腺细胞。这种模式相同GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba和在GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba，表明在这两个物种相似的发育程序。在早期阶段，顶和中间细胞具有与一个更大的液泡和一些小液泡致密细胞质。与此相反，茎细胞具有大的液泡占据大部分的细胞体积。所有主要的细胞器可以清楚地区别在早期阶段在顶端和中间细胞，包括线粒体和质，其中淀粉颗粒也可以观察到（图GydF4y2Ba7A，CGydF4y2Ba和额外的文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S5)。在这些阶段，细胞核很大，并且在所有细胞中都显示中央核仁(插入图)。GydF4y2Ba7A，CGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

成熟的皮毛有两个物种之间共同的显着特征。在这两个物种，小空泡的数量正在增加，并逐步填满最蜂窝空间中的腺体和中间细胞（图GydF4y2Ba7 bGydF4y2Ba和GydF4y2BaDGydF4y2Ba)，尽管细胞内有越来越多的小液泡GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba比在GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba．在中间细胞细胞核中依然清晰可见，但核仁小很多。相反，深色核材料现在积累在外围衬核膜，其通常对应于凝聚染色质（图的团块。GydF4y2Ba8 bGydF4y2Ba和GydF4y2BaFGydF4y2Ba）.在成熟毛状体的分泌细胞的细胞核中，这些变化似乎更为明显(图中插入的部分)。GydF4y2Ba7 bGydF4y2Ba和GydF4y2BaDGydF4y2Ba）.成熟毛状体的染色质浓缩量似乎比幼毛状体大得多，表明在毛状体分化和成熟过程中染色体结构的广泛重塑。另一个常见的特征是在中间细胞和腺细胞之间的连接处存在一个细胞外物质块(图)。GydF4y2Ba图8b-CGydF4y2Ba和GydF4y2Baf-gGydF4y2Ba)这种材料覆盖了腺细胞的厚细胞壁和中间细胞的薄细胞壁。两个细胞壁之间的边界也清晰可见，很可能描绘了分离发生的位置（图。GydF4y2Ba8 cGydF4y2Ba和GydF4y2BaGGydF4y2Ba）.虽然这种材料之间具有不同的外观GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba和GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba，它在腺细胞和中间细胞之间的位置和分布表明了类似的作用。这种细胞壁外物质的积累可以在脱落带中看到[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]．在这两个物种中，成熟毛状体中的叶绿体没有可识别的类囊体膜(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S5B和F）。相反，它们含有较深的染色贴片，特别是在La4024中，没有明显的组织结构，似乎在小型空泡或囊泡的密集网络之间挤压。叶绿体是否正在退化或具有特定于毛状物的组织仍有待确定仍有待确定的待确定。两种物种之间的一个主要区别是蜂窝间空间的大小。在GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba，这个空间现在占据腺体的大部分大部分（估计为65％）。几乎没有任何电子吸收材料，表明在制备用于其中储存的代谢物在其上被释放或代谢物是电子透明的，但是排出将与之结合的聚合物材料的存在细胞壁。通过分离腺细胞的内部细胞壁的水解，该空腔可能形成，并且该细胞壁的遗骸仍然可以在早期阶段被视为碎片（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S5C和D）并且作为从成熟阶段的空间的顶部到底部的波浪螺纹（图。GydF4y2Ba2DGydF4y2Ba和额外的文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S5D)。相比之下,在GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba腺样细胞仍然占体积的大部分，虽然细胞间的小空间可以清楚地看到。在这里可以看到电子吸收物质，这表明细胞壁水解不像在细胞中那样广泛GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba7 dGydF4y2Ba）.这也支持了衬砌该空间的内部细胞壁显着厚的事实GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba7 dGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

对中间细胞的观察也揭示了两个物种之间的共同和不同的特征。两种植物的胞间连丝位于近端，即中间细胞和茎细胞之间。GydF4y2Ba8 bGydF4y2Ba和GydF4y2BaFGydF4y2Ba，详情请参见附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S5G)。另一方面，中间物的远端显示出差异。在GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba，与空腔接触并与腺细胞交界的区域看起来像一个可能是细胞外的空间(图。GydF4y2Ba8 bGydF4y2Ba）.该空间由膜界定，在几个地方，与腺细胞接触。衬砌该区域的细胞壁衬砌松动和污渍差，表明可能的降解。在相应的区域GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba，结构良好的细胞壁是可见的，并且存在Plasmodesmata，虽然没有像近侧一样清晰可见（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S5H）。这可能是由于然而截面的取向。这些观察指向共同机制用于中间和柄细胞之间，但关于各中间体和腺细胞之间的通信不同的特性的通信。GydF4y2Ba

另一个有趣的特征是腺细胞的外膜。在这两个物种中，它有较深的染色薄边缘，可能对应于角质层的蜡质层和较淡染色的厚的内部部分，可能代表细胞壁材料。在早期阶段，它已经相当厚了(在0.6 ~ 0.8 μM之间)(图4)。GydF4y2Ba7一个GydF4y2Ba和GydF4y2BaCGydF4y2Ba)，尽管细胞会明显增大。在成熟细胞中，它有相同的厚度，这表明一定有物质的沉积来调整增加的表面来覆盖(图。GydF4y2Ba8 dGydF4y2Ba和GydF4y2BaHGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

细胞壁成分的免疫标记GydF4y2Ba

细胞间腔和厚包膜的存在表明，在六型毛状体的发育过程中可能发生特定的细胞壁代谢和重塑事件GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2BaLA1777。为了对这些方面有一个初步的了解，我们使用了几种可以识别不同细胞壁成分的市售抗体进行免疫标记，然后使用荧光显微镜(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.在幼叶上进行切片，观察毛状体在不同发育阶段仍然附着在叶片上。JIM7能选择性地识别果胶的甲酯，而不与未酯化的同半乳糖醛酸结合。JIM7标记持续导致发育和成熟毛状体的外细胞壁的强烈标记，而内壁仅在发育的非常早期阶段给出光信号(图2)。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba上面一行)。相比之下，LM19的标记，优先识别未酯化的同半乳糖醛酸，但也结合酯化果胶，在细胞壁内壁给出了强烈的信号，特别是在空洞形成的阶段(图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba，从顶部的第二行和附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S6）。因此，果胶去甲基化似乎发挥了内部电池壁的裂解和蜂窝间腔的形成作用。LM13具体识别阿拉伯甘油聚合物，并在成熟阶段特异性地具有中间电池的强标记的引人注目的图案（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba，来自顶部的第三行和附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S6）。最后，除了阿拉伯人之外，除了阿拉伯人还认识到阿拉伯半乳蛋白（AGPS），在外部电池壁上给出了在内部电池壁上的信号在成熟的4细胞壁上的信号（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba第四行)。这表明agp是外部细胞壁特别是内部细胞壁的组成部分。GydF4y2Ba

VI型腺毛具有高度重复性的架构GydF4y2Ba

我们基于ESEM、荧光显微镜和光镜或透射电子显微镜分析的切片观察表明，两种物种的VI型毛状体的结构都是不变的。它由一个柄细胞、一个中间细胞和四个与中间细胞相连的腺细胞组成。腺细胞通过连续两次相等的背斜分裂而出现，导致腺细胞在同一平面上的特征性分布。这种整体结构强烈地让人想起薄荷的盾状毛状体，薄荷是唇形科的代表[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．Turner等人的茎细胞[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba对应于我们的中间细胞，我们的茎细胞对应于它们的基底细胞。我们提出这一命名是因为在VI型毛状体中，中间细胞不伸长，而柄细胞明显伸长，使腺细胞位于表皮以上200-300 μm的高度。与此相反，薄荷毛状体嵌在表皮的小凹陷处，因此盾状毛状体几乎与表皮表面平齐。此外，薄荷毛状体通常有8个腺细胞，表明另一轮分裂。然而，罗勒(GydF4y2BaOCimum Basilicum.GydF4y2Ba）Peltate Trichomes有四个腺体细胞[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]另一个显著的区别是，番茄毛状体中没有亚表皮下的储存空间，这是唇形科盾状毛状体的特征[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]．相反，VI型番茄毛状体有一个大小不同的细胞间腔，这取决于物种(见下文)。尽管有这些差异，但番茄和唇形科毛状体有许多共同的特征，这些器官不变的结构使其成为植物发育生物学研究的特别有价值的材料。番茄属具有优良的遗传学和最近测序的基因组，因此代表了一个适当的模式系统，以详细研究腺毛的发育遗传学。GydF4y2Ba

毛状体分化的早期阶段以一种自发荧光类黄酮的短暂存在为标志GydF4y2Ba

引人注目的是这种荧光消失，毛状体进入其分化的最后阶段，即当四个腺细胞增大，达到他们的最终大小。虽然荧光化合物的身份不能被确定的，荧光光谱是让人联想到一个类黄酮类物质（见附加文件1：图GydF4y2BaS3GydF4y2Ba和GydF4y2BaS4GydF4y2Ba）.有趣的是，最近发表的一篇文章显示，番茄查尔酮异构酶(CHI)突变体(GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Baaccession LA1049)具有较小的VI型毛状体，同时毛状体中产生的萜烯量也大大减少[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba，这反过来又会导致对昆虫食草动物过敏。Kang等人提出了几种假说来解释类黄酮和萜类代谢之间的这种有趣联系，其中之一是代谢反馈控制，因为这两个途径都有磷酸烯醇丙酮酸作为前体。我们发现，在这个突变体中，荧光具有完全不同的分布，并在离散的囊泡中积累(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.用共聚焦显微镜获得的图像表明，这些囊泡位于细胞内（图GydF4y2Ba4 fGydF4y2Ba和GydF4y2BaLGydF4y2Ba）.这些观察结果强烈支持WT中所见荧光化合物的类黄酮性质。此外，荧光不再像WT中那样是短暂的，但即使在LA1049成熟的毛状体中也仍然存在(图10)。GydF4y2Ba4 eGydF4y2Ba和GydF4y2BaLGydF4y2Ba）.这种化合物在WT中的短暂存在并不真正支持Kang等人提出的代谢反馈控制[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]，因为当胎儿在活性分泌阶段（4个细胞阶段）时趋于消失。其瞬态存在宁可指出腺体毛细胞的晚分化中的功能，而不是与萜类途径直接代谢连接。GydF4y2Ba

黄酮类药物通常荧光差，但有一些关于这一课程的强烈自动荧光化合物的报道。所有这些报告指向5个位置的修改。5-GydF4y2BaO.GydF4y2Ba- 从中​​分离出甲基槲皮素衍生物，例如zalein或zaleatinGydF4y2BaPlantagoGydF4y2Ba和GydF4y2Ba杜鹃GydF4y2Ba种类[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba), 5 -GydF4y2BaO.GydF4y2Ba-各种黄酮类化合物的葡萄糖苷也可在各种植物中鉴定[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]．有趣的是，蚕茧，GydF4y2BaBombyx Mori.GydF4y2Ba，能够在5个位置糖基化槲皮素，并且所得到的荧光化合物被示出提供增强的紫外线保护茧[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．需要进一步的工作，以了解番茄粒细胞中存在的荧光物质确实是5-GydF4y2BaO.GydF4y2Ba-糖基化或-甲基化的类黄酮。GydF4y2Ba

VI型腺毛状体具有间细胞间储存腔，其显着扩大GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba

VI型腺毛状体的荧光显微镜下的薄切片并观察显示在4个腺细胞之间的细胞间空间的存在。有趣的是，该空腔中大大地放大GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba.在成熟的毛状体中GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba，我们估计高达65％的胎儿头部由这种细胞腔组成，这代表了在腺体细胞中产生的代谢物的显着存储空间。这两个物种之间的这种差异也解释了原因GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba累积的次级代谢物（主要是倍半萜羧酸）比GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba，从而增强了对该物种食草动物的抵抗力。这个腔出现在终端细胞第二次分裂后，即当四个腺细胞存在时。这种类型的胞间腔在分泌毛状体是罕见的，但类似的病例以前已经被描述过，例如在各种物种GydF4y2Ba杜鹃GydF4y2Ba[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]．它的发生是高度受控的，需要腺体细胞共同的内壁的降解，但只在中央和底部。四个腺细胞在顶部仍然相互连接，而在底部的中间细胞确保了凝聚力，并构成一个堵塞，以阻止代谢物的释放。如免疫标记所示，这种选择性的细胞壁降解与去甲基化果胶的存在有关。果胶的甲基化状态在植物细胞壁重构中起着关键作用。例如，小孢子四分体的分离需要果胶的去甲基化，这在果胶甲基酯酶(PME)突变体中得到了证实，从而形成了典型的果胶GydF4y2Ba四重奏GydF4y2Ba表型GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

腺体细胞和中间细胞之间的连接构成微脱痂区：适应代谢物的快速释放GydF4y2Ba

我们注意到，成熟的毛总是在当他们收获的同一位置突破：连接到柄细胞而四个腺细胞粘在一起，中间细胞停留。在GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba，这种断裂导致毛头的坍塌，这可以从细胞壁的波状外观和扁平的细胞中看到。这表明，细胞间腔内的代谢物施加压力，当头部折断时释放压力。轻轻一碰就足以导致毛状体被斩首。这可以看作是对与毛接触的食草动物突然释放代谢物的一种适应。结构特征是这种适应的基础。首先，在中间细胞和腺细胞之间的外部连接处可以看到一圈分泌物质。在拟南芥中过表达花脱落调控基因GydF4y2Ba偶像GydF4y2Ba（GydF4y2Ba花序缺乏脱落GydF4y2Ba），大量的阿拉伯酰甲蛋白（AGP）沉积在脱落区周围[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]．有趣的是，用LM13的免疫标记，一种特异性识别阿拉伯人的单克隆抗体，给出了局限于中间细胞的强信号。围绕滴毛体的破损点累积的材料是由阿拉伯酰亚胺蛋白制成的，但仍然显示。其次，可以在腺体细胞的厚细胞壁和中间细胞的较薄的细胞壁之间看到不同的边界。外部材料可以将两个电池类型一起保持在一起并在轻触时分解。GydF4y2Ba

两种番茄物种中的VI型腺毛状体的发展分享了许多共同特征，主要是在早期阶段。当四个腺细胞到位时，差异开始清晰可见。GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba基本上与形成大的细胞间腔的形成，胎儿头部的平滑圆形外观以及腺体细胞周边处的叶绿体的定位。我们的观察结果指向高度监管的开发和分化计划，包括严格的细胞分裂序列，偏振和局部细胞壁裂解和重塑，以及微静脉脱落区的形成。这些结果为未来的研究建立了基础，该研究将包括在表演阶段特异性转录组和代谢物分析中。GydF4y2Ba

植物材料及生长条件GydF4y2Ba

加入种子LA1777 (GydF4y2BaS.哈布菊属GydF4y2Ba)及LA4024 (GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba)来自美国加州大学戴维斯分校番茄遗传资源中心。植物在温室中生长，控制条件是白天25°C和55%的湿度，夜间20°C和75%的湿度。植物被光照16小时(从早上6点到晚上10点)，光照强度为5至25 Klux，视情况而定。每周用肥料溶液(0.1% Kamasol Brilliant Blau, Compo Expert GmbH, Germany)浇灌一次植株。用于收集毛状体或显微镜观察的叶材料来自于2至4个月龄植株的顶端(包括长达1-2厘米的幼叶)。GydF4y2Ba

收获腺毛GydF4y2Ba

采用Schilmiller等人改良的方法采集VI型毛状体的腺头[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]．从2至4个月龄的植株中收集1-2厘米大小的顶端，放入250ml玻璃瓶中，其中装有冷隔离缓冲液(200 mM山梨醇，50 mM Tris-HCl, 20 mM蔗糖，10 mM KCl, 5 mM MgCl)GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，5mM的琥珀酸，1mM的EGTA和0.5毫米的KGydF4y2Ba_2GydF4y2BaHPO.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba，)和15克0.75 - 1毫米玻璃珠。用手摇瓶2分钟分离VI型腺体。然后将材料通过两个150和63 μm目的钢筛过滤，除去顶端和玻璃珠。最后，将VI型毛状体的头部收集到25 μm筛上，用隔离缓冲液洗涤，经短时间离心浓缩。GydF4y2Ba

环境扫描电子显微镜（ESEM）GydF4y2Ba

使用ESEM XL-30 FEG（FEI/Philips，Eindhoven，荷兰）在湿模式下操作，拍摄新鲜未固定植物材料的扫描电子显微照片。通过引入水蒸气调节ESEM室内的气压（1.5 mBar）。使用气体二次电子检测器进行成像。GydF4y2Ba

在PEG 1500中嵌入植物材料GydF4y2Ba

用改良自Hause等人的方法嵌入用于薄切片的植物材料[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．的尺寸为0.5cm 1月龄植物的顶点在4％多聚甲醛/ 0.1％的Triton X-100的PBS收集。随后，将植物材料进行真空渗入3次，每次5分钟。被固定在室温下轻轻摇动2小时完成。顶点在一系列的乙醇浓度上升的在PBS中15分钟，然后洗涤两次，脱水在室温下，如下所示：30分钟10％的乙醇，60分钟30％的乙醇，60分钟50％EtOH中，过夜70％乙醇，30分钟90％的乙醇，30分钟100％EtOH中。PEG 1500的后续浸润在50℃下如下，30分钟100％的乙醇，60分钟25％PEG的EtOH，60分钟50％PEG的EtOH，60分钟75％PEG的EtOH，60分钟100％PEG进行在乙醇。100％的PEG溶液一次交换，并温育顶点的嵌入和嵌入的材料在室温下过夜固化之前另外60分钟。GydF4y2Ba

光和荧光显微术GydF4y2Ba

对分离的VI型头进行了正在发育的毛状体的显微镜分析。在使用上述玻璃珠程序分离毛状体后，将毛状体直接放置在玻片上，并在亮场和荧光模式下观察(Filterset 9;励磁450 - 490海里;使用AxioImager Z1显微镜(蔡司，耶拿，德国)。用LSM 710显微镜(Zeiss, Jena, Germany)观察了叶上和分离的毛状体。在405 nm处激发自荧光，在420-545 nm(细胞壁)和645-735 nm(叶绿体)处记录自荧光。GydF4y2Ba

透射电子显微镜GydF4y2Ba

叶片在室温下用3%戊二醛（德国Taufkirchen Sigma-Aldrich）在pH值为7.2的二甲酰钠缓冲液（SCB）中固定4小时，用SCB清洗，用1%四氧化锇（德国卡尔罗斯，卡尔斯鲁厄）在SCB中后固定，在分级乙醇系列中脱水，并包埋在环氧树脂中[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]．聚合后的材料用超微切片机S(徕卡;位于德国)。超薄切片(80 nm)转移到formva涂层网格上，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。切片用120 kV的蔡司天秤座120透射电子显微镜(德国奥伯科臣卡尔蔡司显微镜)观察。采用双速轴上SSCCD相机(BM-2k-120;TRS, Moorenweis,德国)。GydF4y2Ba

疣状GydF4y2Ba

在Verhertbruggen等人的修改方案后，在PEG 1500嵌入材料上进行免疫抑制物。[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]．将3 μm厚度的切片转移到多聚赖氨酸(Sigma-Aldrich)涂层玻片上，用PBS冲洗两次。0.1 M NH孵育后GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba一抗(LM6, LM13, LM19和JIM7)均来自PlantProbes (GydF4y2Bahttp://www.personal.leeds.ac.uk/~bmbjpk//pp/GydF4y2Ba）.加入1:10稀释液，4℃孵育过夜。在PBS中分别用0.1% BSA洗涤3次和PBS中分别用1% BSA洗涤1次后，玻片与山羊(Sigma-Aldrich，目录号F6258)产生的fitc偶联抗大鼠二抗1:100稀释，室温孵育2小时。玻片用PBS再冲洗4次，干燥后用60 μl抗褪色溶液(Citifluor)覆盖。染色切片用LSM 710显微镜(Zeiss, Jena, Germany)观察，使用405 nm激光线激发并记录505-570 nm的发射。GydF4y2Ba

AGP：GydF4y2Ba

阿拉伯半乳聚糖蛋白GydF4y2Ba

BSA：GydF4y2Ba

牛血清albumineGydF4y2Ba

Chi：GydF4y2Ba

查尔酮异构酶GydF4y2Ba

整体:GydF4y2Ba

环境扫描电子显微镜GydF4y2Ba

Etoh：GydF4y2Ba

乙醇GydF4y2Ba

FITC：GydF4y2Ba

荧光素异硫氰酸酯GydF4y2Ba

弗兰克-威廉姆斯:GydF4y2Ba

鲜重GydF4y2Ba

LSM:GydF4y2Ba

激光扫描显微镜GydF4y2Ba

NPP:GydF4y2Ba

neryl二磷酸GydF4y2Ba

PBS：GydF4y2Ba

磷酸缓冲盐GydF4y2Ba

挂钩:GydF4y2Ba

聚乙二醇GydF4y2Ba

中外职业:GydF4y2Ba

果胶甲酯酶GydF4y2Ba

渣打银行:GydF4y2Ba

二甲磺酸钠缓冲液GydF4y2Ba

Z ZGydF4y2Ba-FPP:GydF4y2Ba

cis,独联体GydF4y2Ba通过二磷酸GydF4y2Ba

这项工作得到了德国科学基金会(Deutsche Forschungsgemeinschaft)的支持，批准号为TI 800/1-1。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 莱布尼兹植物生物化学研究所细胞与代谢生物学系，温伯格3 06120，海尔，萨尔，德国GydF4y2Ba

   Nick Bergau，Stefan Bennewitz＆Alain TissierGydF4y2Ba

2. 马丁-路德大学材料科学跨学科中心4,06120，德国萨尔市哈雷市GydF4y2Ba

   弗兰克SyrowatkaGydF4y2Ba

3. 马丁·路德大学哈勒 - 维滕贝格，Weinbergweg 22，06120，哈勒，萨勒，德国生物中心GydF4y2Ba

   Gerd房屋GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba阿兰蒂塞尔GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

AT构思了这个项目并撰写了手稿。NB进行了实验。SB和FS进行了ESEM实验。GH进行了电子显微镜实验。所有作者都已阅读并批准了手稿的最终版本。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可的条款分发(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba