西瓜中MAPK和MAPKK基因的特性、表达模式和功能分析(GydF4y2BaCitrullus lanatusGydF4y2Ba)GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联是所有真核生物中普遍存在的信号传导模块，在植物的许多生理生化过程中发挥着重要作用。然而，人们对西瓜中的MPK和MKK家族知之甚少。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在本研究中，我们对CLMPK和CLMKK家族进行了系统表征，包括鉴定和命名法，染色体定位，系统发育关系，CLMPK-CLMKK相互作用，不同组织中的表达模式以及响应非生物和生物应激和瞬态表达 -基于功能分析的抗病性抗性。基因组调查确定了十五GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba还有六个GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba西瓜基因组和系统发育分析表明，ClMPK和ClMKK家族可分为4个不同的类群。酵母双杂交分析显示ClMPK和ClMKK家族成员之间存在显著的相互作用，确定了推测的ClMKK2-1/ClMKK6-ClMPK4-1/ClMPK4-2/ClMPK13和ClMKK5-ClMPK6级联。ClMPK和ClMKK家族中的大多数成员在不同组织中表现出不同的表达模式，并对非生物（例如干旱、盐、冷和热处理）和生物（例如细菌感染）作出反应GydF4y2BaFusarium oxysporumGydF4y2Baf . sp。GydF4y2Ba奈姆GydF4y2Ba)压力。瞬时表达GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba和GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba在里面GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba增强了对GydF4y2Ba灰葡萄孢GydF4y2Ba而瞬时表达的防御基因表达上调GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba导致对GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba. 此外，瞬时表达GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba也导致超敏反应（HR）样细胞死亡和HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们确定了十五岁GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba还有六个GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba分析了西瓜基因的系统发育关系、表达模式、蛋白质相互作用及其在抗病性中的作用。结果表明，ClMPK1、ClMPK4-2和ClMPK7对小麦的抗性有正向调节作用，而ClMPK6和ClMKK2-2对小麦的抗性有负向调节作用GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba当瞬间表达为GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2BaClMPK7通过调节H的产生，作为hr样细胞死亡的调节因子GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联广泛存在于真核生物中，是受体/传感器下游高度保守的信号模块，将细胞外刺激转化为细胞内反应[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba］．MAPK级联由三个顺序作用蛋白激酶组成，即MAPKK激酶（MEKKS），MAPK激酶（MKKS）和MAPKS（MPKS），并通过磷酸化方式激活[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．通常，在感知细胞外环境和细胞内生长/发育信号时，级联的顶部激酶，百慕士，通过磷酸化激活其下游发布，这又磷酸化MPK [GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．具体而言，MAPK级联中的MKKS充当双特异性激酶，通过在激活环中通过T-X-Y基序的双磷酸化激活MPK。在该磷酸化继电器期间，可以通过MAPK级联扩增输入信号，并且最终通过磷酸化改变活化的MAPK，通过磷酸化改变一组特定下游靶蛋白，例如转录因子和其他信号传导组分，导致下游基因的表达的活化[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在过去的20年里，人们进行了广泛的遗传和生化研究，以探索MAPK级联在模式植物物种和一些重要经济作物(如水稻)中的功能。这些研究表明，MAPK级联及其单个组分在调节植物生长发育和胁迫反应中发挥着重要作用。此外，一些参与生长/发育和应激反应的功能完整的MAPK级联已被生物化学特征[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．例如，烟草NPK1-NQK1-NRK1和Arabidopsis Yoda-MKK4 / MKK5-MPK3 / MPK6在细胞划分中起重要作用，而拟南芥MEKK1-MKK4 / MKK5 -MPK3 / MPK6和MEKK1-MKK1 / 2-MPK4充当阳性或信号通路的负调节剂调节免疫应答[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

MAPK级联的组成部分通常由不同的基因家族组成，即MPK、MKK和MEKK家族，这些家族在包括拟南芥在内的许多植物物种的基因组水平上都具有特征[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]，大米[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]，杨树[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]，大豆[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]，玉米[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba,GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]，番茄[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba–GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]，油菜[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba,香蕉GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]，苹果[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba],GydF4y2BaGossypium raimondii.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba20GydF4y2Ba]，桑树[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba),GydF4y2Ba短足GydF4y2Ba[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]. MPK和MKK家族的数量在不同物种间差异很大。例如，在拟南芥中有20个MPKs[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]米17[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]，玉米19[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba， 21杨树[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]番茄16[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba， 12在油菜籽[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]，10在桑椹[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]，葡萄藤12[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]，17 in烟草[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba， 38在大豆[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]，28 inGydF4y2BaG. Raimondii.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba20GydF4y2Ba]16英寸GydF4y2BaB. Distachyon.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．同样地，拟南芥10个发布会[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]，米中8 [GydF4y2Ba9GydF4y2Ba， 9在玉米中[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]，番茄5[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba,GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]在菜籽油中[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]，11在大豆中[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba， 11在杨树[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]，和12英寸GydF4y2BaB. Distachyon.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba被确定。从结构上看，MPKs包含11个结构域(I-XI)，在结构域VII和VIII之间存在的保守的苏氨酸和酪氨酸残基形成了激活环，被认为是磷酸化的MPKs的激活[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]. 众所周知，植物mpk有两种不同的激活环基序，TEY或TDY；然而，最近在植物MPKs中发现了其他新的激活环变体[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]. 根据系统发育和保守的TEY/TDY基序，MPKs可分为四类，每一类具有不同的功能[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．类似地，根据S / T-X5-S / T域和“D网站”，MKKS也可以分为四组[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

西瓜 （GydF4y2BaCitrullus lanatusGydF4y2Ba）是重要的园艺作物之一，在全球范围内提供最喜欢的新鲜水果。然而，到目前为止，西瓜中的MPK和MKK家族知之甚少或没有任何东西。最近完成西瓜的基因组测序[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]提供了一个强大的平台，使得在全基因组水平上描述基因家族成为可能。在本研究中，我们对西瓜MPK和MKK家族进行了全基因组鉴定，并对ClMPK和ClMKK家族的命名、染色体分布、保守基序和系统发育关系进行了广泛的研究。我们通过对ClMPK和ClMKK家族成员的瞬时表达功能分析，探讨了它们在非生物和生物胁迫下的蛋白质相互作用关系、不同组织间的表达模式以及可能的抗病功能GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba. 我们对西瓜ClMPK和ClMKK家族的研究为进一步研究ClMPK和ClMKK在西瓜中的功能提供了一个有用的平台。GydF4y2Ba

西瓜ClMPK和ClMKK家族的特征分析GydF4y2Ba

为了鉴定西瓜中推测的MPK和MKK基因，我们以拟南芥AtMPKs和AtMKKs为查询对象，对西瓜基因组数据库进行了BLAST搜索，分别鉴定了15个和6个推测的MPK和MKK基因的非冗余序列。推测的ClMPKs和ClMKKs的预测氨基酸序列被ExPASy Proteomics Server进一步检测是否存在特征性的保守结构域。总体而言，我们的系统分析显示，ClMPK和ClMKK家族分别由西瓜基因组中的15个和6个成员组成。为了方便起见，我们给每个已鉴定的ClMPK和ClMKK基因分配了唯一的身份，其中两个字母的编码对应于GydF4y2BaC. lanatus.GydF4y2Ba（Cl），后跟姓氏（MPK或MKK）和数字（表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)根据拟南芥MPK和MKK命名系统[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．值得注意的是，预测的LOCI CLA022002（402bp）和CLA022003（867bp）与PLAZA DICOTS 3.0数据库中的LOCI CL08G09900和CL08G09910完全相同（GydF4y2Bahttp://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/GydF4y2Ba)，确实是编码ClMPK6的相同基因，并且编码对应于AtMPK6的1–121 aa和122–395 aa的多肽。的编码序列GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba根据预测的cla2002和cla2003的cDNA序列设计引物克隆全长cDNA，进一步证实了这一点。GydF4y2Ba

评估GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因有表达支持，我们使用预测的cDNA序列作为查询，对西瓜EST数据库进行搜索(GydF4y2Bahttp://www.icugi.org/cgi-bin/icugi/tool/blast.cgi.GydF4y2Ba). 搜索结果表明，14个ClMPK和2个ClMKK基因具有EST支持（表1）GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)分别占总收入的93.3%和33.3%GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba分别是基因。我们试图克隆所有基因的全长cDNAGydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba为了确认预测序列和功能和蛋白质 - 蛋白质相互作用研究。但是，我们未能放大全长CDNAGydF4y2BaClMPK9-1GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-3GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-4GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba，具有EST支持，以及GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK9型GydF4y2Ba，哪些没有EST支持（表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．最终，我们扩增并克隆了10个GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和图4GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因,包括GydF4y2BaClMPK13型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba没有EST支持(表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)为进一步研究蛋白质间的相互作用和功能分析奠定了基础。GydF4y2Ba

开放式阅读框（ORF）的大小GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba基因范围为1107bp(GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba）到1926年BP（GydF4y2BaClMPK9-1GydF4y2Ba)相应地，编码蛋白质的大小在368到641个氨基酸之间。ClMPK蛋白的分子量在42.57 kD和72.87 kD之间，pIs在4.97到9.37之间（表1）GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．与拟南芥同源物AtMKK9相比，预测的ClMKK9可能是一个不完整的MKK，在n端缺少大约100个氨基酸。其他五个的ORF大小GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因范围为1023 bp(GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba）至1557 bp（GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba)，因此编码的蛋白质的大小从340到518个氨基酸。这些ClMKK蛋白的分子量在38.13 kD到57.77 kD之间，pi在5.26到8.91之间(表1)GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

ClMPKs和ClMKKs的结构特征及系统发育分析GydF4y2Ba

序列比对表明ClMPK蛋白包含高度保守的区域，在N末端附近跨越大约300个氨基酸，这些区域由11个特征结构域（I–XI）组成（图。GydF4y2Ba1a级GydF4y2Ba). 拟南芥AtMPKs系统发育树分析表明，ClMPKs可分为4个类群，即A、B、C和D。GydF4y2Ba2a级GydF4y2Ba)．在15个CLMPK，CLMPK3和CLMPK6中属于A组，CLMPK4-1，CLMPK4-2和CLMPK13是B组成员，只有CLMPK1落入C组，其他8个成员（CLMPK9-1，CLMPK9-2，CLMPK9-3，CLMPK9-4，CLMPK16，CLMPK19，CLMPK20-1和CLMPK20-2属于D组（图。GydF4y2Ba2a级GydF4y2Ba和表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba). 一些高度保守的特征基序，例如激活环、P环和C环，也在ClMPK蛋白质中被鉴定出来（图。GydF4y2Ba1a级GydF4y2Ba)．在所有CLMPK中存在激活 - vII和VIII和VIII，并且在活动中磷酸化的TXY基序（图。GydF4y2Ba1a级GydF4y2Ba)．A，B和C组的成员具有Tey图案，而D组中的CLMPK具有TDY MOTIF（图。GydF4y2Ba1a级GydF4y2Ba和表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．但是，在所有CLMPK中都没有发现其他TXY变体[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba,GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]. 此外，一个保守的CD结构域具有（LH）dxde（P）xC序列，被认为是MAPK级联中上游mkk的结合位点[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]，存在于A组和B组ClMPKs中，但在C组和D组ClMPKs中不存在。含TDY的CLMPK具有延伸的C-末端区域，通常存在于其他植物的TDY类MPK中[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba14GydF4y2Ba,GydF4y2Ba18GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]. 西瓜中有7个含有TEY基序的clmpk和8个含有TDY基序的clmpk（表1）GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba). 这类似于大米和蔬菜GydF4y2BaB. Distachyon.GydF4y2Ba，它包含比含Tey的MPK更具含有的MPK [GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]但不同于拟南芥、番茄、大豆和大豆GydF4y2BaG. Raimondii.GydF4y2Ba，其中包含的含TEY的mpk比包含TDY的mpk多[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba11GydF4y2Ba,GydF4y2Ba14GydF4y2Ba,GydF4y2Ba20GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

序列比对发现，除ClMKK9为不完全MKK外，ClMKKs还包含11个具有丝氨酸/苏氨酸特异性的蛋白激酶结构域[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]. 在ClMKKs中发现了保守的基序。结构域VII和VIII之间的特征性S/T-x5-S/T基序，包括丝氨酸/苏氨酸残基，其磷酸化是MKK激活所必需的，并且活性位点D（I/L/V）K基序在CLMKs中是保守的（图。GydF4y2Ba1b级GydF4y2Ba). 此外，在ClMKK2-1、ClMKK2-2、ClMKK3和ClMKK6中还存在具有K/R-K/R-K/R-x（1–6）-L-x-L/V/I特征序列的假定对接区（图。GydF4y2Ba1b级GydF4y2Ba)．拟南芥的系统发育树分析显示，CLMKK可以分为四组，即A，B，C和D（图。GydF4y2Ba2b级GydF4y2Ba)．在6个ClMPKs中，ClMKK2-1、ClMKK2-2和ClMKK6分别属于A组，而ClMKK3、ClMKK5和ClMKK9分别属于B组、C组和D组。GydF4y2Ba2b级GydF4y2Ba和表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba). 与玉米相似[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba)，在西瓜中没有发现AtMKK7/AtMKK8/AtMKK9的同源物(图1)。GydF4y2Ba2b级GydF4y2Ba)．此外，CLMKK家族比其他植物种类（如拟南芥）（10个大气）（10个ATMK）相对小GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]，米饭（8盎司）[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]，玉米（9 ZmMKKs）[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]，大豆（11 GmMKKs）[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]; 流行（13 ptmkk）[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba),GydF4y2BaB. Distachyon.GydF4y2Ba(12 BdMKKs) (GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．西瓜中相对较小的ClMKK家族可能是进化过程中物种特异性多样化的结果，这意味着ClMKK蛋白可能在不同的生物过程中进化出多效性。GydF4y2Ba

基因组分布与演变GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba家庭GydF4y2Ba

15岁GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和6GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因锚定在11条西瓜染色体中的10条上（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba). 染色体分布型表明，一些染色体和染色体区域具有较高的染色体密度GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba或者GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因，例如两者都不是GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba也不GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因位于染色体5上。在GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba家庭，一个GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba基因位于第1、2、4、9染色体上；二GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba发现基因位于8和三个染色体上GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba基因分布在每一个染色体3,6和7(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．在里面GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba一家人，两个GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因位于11号染色体上，而只有一个GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因位于染色体3,4,7和10中的每一个上（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．在染色体200kb或更小的区域内存在四个或更多基因的标准所定义的基因簇[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]，是为GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba家庭。然而，五个平行对数对，如GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-1GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMPK9-4GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2/ClMKK5型GydF4y2Ba在序列上具有高度的相似性，分布在不同的染色体上（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)，表明它们不是串联重复的基因对。尽管GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK13型GydF4y2Ba它们紧密地位于3号染色体上，在氨基酸序列水平上只有65%的同源性，也不是串联重复基因。因此，串联重复可能在基因进化中起着有限的作用GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因。这类似于番茄的观察GydF4y2BaSlMAPK公司GydF4y2Ba和GydF4y2BaSLMKK.GydF4y2Ba家庭[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba,GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

CLMPK和CLMKK之间的相互作用GydF4y2Ba

为了检测ClMPKs和ClMKKs之间的相互作用和特异性，我们进行了一系列酵母双杂交试验，以建立ClMKKs和ClMPKs之间的相互作用关系。为此，四GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因(GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba)还有八个GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba基因(GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-2GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK13型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK16型GydF4y2Ba）分别克隆到相应的DNA结合结构域和GAL4活化结构域质粒中。在共转化到酵母菌株YH2GOLD之后，通过在加入X-α-GAL之后通过选择性培养基和制造蓝色颜料的生长来监测相互作用。在我们的实验中，总是包括阳性对照（PGADT7-T + PGBKT7-53）和阴性对照（PGADT7-T + PGBKT7-LAM）以排除可能的假相互作用（图。GydF4y2Ba4a级GydF4y2Ba)．如图所示。GydF4y2Ba4b级GydF4y2Ba，检测了被测ClMPKs与ClMKKs之间的相互作用。ClMKK2-1与CllMAPK4-2、ClMPK13和ClMPK4-1有较强的相互作用；而ClMKK2-2与ClMPK1有显著的相互作用（图。GydF4y2Ba4b级GydF4y2Ba)．类似地，观察到CLMKK6和CLMPK4-1，CLMPK4-2或CLMPK13之间的显着相互作用以及CLMKK5和CLMPK6-1或CLMPK7（图。GydF4y2Ba4b级GydF4y2Ba). 在测试的CLMKs中，没有发现ClMPK9-2和ClMPK16与四个CLMKs中的任何一个相互作用，可能与其他CLMKs有相互作用。GydF4y2Ba

表达模式GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

组织特异性表达模式GydF4y2Ba

众所周知，MAPK级联在植物生长发育中起着重要作用[GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba]. 深入了解GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba本研究利用qRT-PCR (quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)技术，分析了西瓜根、茎、叶3种不同组织中与生长发育有关的基因表达模式。如图所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba, 15GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和6GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba在所有测试组织中组成基因组成基因，但表现出不同的表达模式。在里面GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba家人，GydF4y2BaClMPK9-1GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba和GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba在根，GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK13型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba和GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba在茎中，和GydF4y2BaClMPK9-3GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK16型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-4GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-2GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba在叶片中表达量最高，而在GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba家族中，表达水平最高的GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba在根，GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba在茎和GydF4y2BaClMKK9型GydF4y2Ba观察到叶片（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba). 表达模式的比较确定了一些组织特异性表达GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因，例如。，GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba在茎中高表达，在根和叶中低表达，GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba在根中具有高表达水平，但茎和叶子的水平非常低，GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba在叶中表现出高表达水平，但在根和茎中表现出极低水平（图。GydF4y2Ba5a级GydF4y2Ba),GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba在茎中有高表达水平，但在根和叶中的表达水平很低（图。GydF4y2Ba5b条GydF4y2Ba），表明这一点GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba可能分别在茎、根和叶中发挥特定作用。此外，平行对数对GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-1GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMPK9-4GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba在根、茎和叶中表现出不同的表达模式。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)，表明这些基因在特定组织中的高表达水平可能是由它们的生物学功能决定的，而不是序列相似性。GydF4y2Ba

表达模式对非生物胁迫和ABA的响应GydF4y2Ba

众所周知，MAPK瀑布在植物中非生物应激反应中起重要作用，MAPK级联的一些组成部分被特征为植物反应对干旱，盐和温度胁迫的关键调节剂[GydF4y2Ba30GydF4y2Ba,GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]. 探讨GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba利用qRT-PCR技术分析了非生物胁迫反应基因在干旱、盐分、低温和高温四种胁迫处理及胁迫激素脱落酸（ABA）胁迫下的表达模式和表达变化。一般来说，表达水平为15GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和6GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba干旱、盐、冷、热胁迫处理后，西瓜植株的基因发生了明显的变化GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因在至少两种处理下表现出不同的表达模式（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．具体来说,13GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba(GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-1GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-2GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK13型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK16型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba）和四GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba(GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba）通过干旱胁迫（放置在没有供水的实验室长凳上）引起的（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 其中，基因的表达水平GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba和GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba在干旱胁迫处理后12小时表现出>15倍的增加（图。GydF4y2Ba6安培GydF4y2Ba)．响应于盐胁迫（用200mM NaCl浸没），表达十GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba(GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-2GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK16型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba)还有三个GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba(GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba)在不同水平诱导（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 在高温（42℃热处理）应力条件下，10GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba(GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-3GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-4GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba）和四GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba(GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba)与对照植物相比，在不同倍数的增加中被上调（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 其中热诱导GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因的表达水平GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-4GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba在热处理后12小时显示>3倍的增加（图。GydF4y2Ba6安培GydF4y2Ba)．与大多数成员的上调表达式模式不同GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba家庭在应对干旱、盐和热胁迫时，表达GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba在低温条件下(4℃冷处理)表现出不同的花纹。例如，表达式级别为5GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba(GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK13型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK16型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba)还有三个GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba(GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK9型GydF4y2Ba）在表达七个时增加了GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba(GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-1GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-2GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK9-4GydF4y2Ba)还有两个GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba(GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba和GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba)在冷处理后12小时下调（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 相比之下GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-3GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba在冷应激条件下，对其影响不明显（图1）。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 总的来说，一些成员GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba在GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba家庭和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba在GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba家系在三种胁迫处理下表达上调(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)，表示这些GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因可能具有对多种应激反应的功能。有趣的是，表达GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba在冷应激中被压抑，但在热应激中显着诱导（图。GydF4y2Ba6安培GydF4y2Ba），建议CLMPK7可以通过不同的MAPK级联在寒冷和热应力响应中发挥相反的作用。此外，Paralog对的表达GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba显示相似的模式，而平行对数对GydF4y2BaClMPK9-1GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMPK9-4GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba/GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba响应于不同的非生物应激处理表现出明显的图案（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

众所周知，ABA和ABA介导的信号通路在植物的非生物胁迫反应中起着重要的作用，通过触发基因表达和适应性生理反应的重大变化[GydF4y2Ba30GydF4y2Ba,GydF4y2Ba32GydF4y2Ba,GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]. 最近，MAPK级联被证明与ABA信号有关，ABA信号与非生物胁迫反应有关[GydF4y2Ba30GydF4y2Ba]. 因此，我们进一步分析了基因的表达模式GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMAKKGydF4y2Ba外源ABA应答的基因。如图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba，三个表达水平GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba(GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK9-3GydF4y2Ba)还有三个GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba(GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK9型GydF4y2Ba)的表达量增加，6个表达量增加GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba(GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-1GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-4GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba）和一个GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba(GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba)ABA处理后细胞凋亡率降低。相比之下GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-2GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK13型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK16型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba不受外源aba的影响（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 值得注意的是，一些成员的表达GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPAK20-1型GydF4y2Ba在GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba家庭和GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba在GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba家庭表现出响应非生物应激和外源ABA的明显甚至相反的模式（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 这并不意味着ABA及其信号不参与调节这些基因表达的非生物胁迫反应GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba因为MAPK级联的活性和功能很大程度上取决于组分的磷酸化状态。GydF4y2Ba

响应病原体感染的表达模式GydF4y2Ba

MAPK级联在植物抗病性中的作用已在模式植物和作物中得到广泛的研究[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]. 探索GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba在抗病性方面，我们分析了它们在西瓜植株上的表达模式GydF4y2BaFusarium Oxypsorum.GydF4y2Baf . sp。GydF4y2Ba奈姆GydF4y2Ba(GydF4y2BafGydF4y2Ba)是引起西瓜枯萎病的重要土传真菌病原，在世界许多地区限制了西瓜的生产[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba,GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．要做到这一点，我们接种了两周的植物GydF4y2BafGydF4y2Ba孢子悬浮和监测疾病进展超过3周。在我们的4个独立实验中，平均发病率约为90%。接种后第9天出现枯萎病的典型症状，表现为叶片萎蔫GydF4y2BafGydF4y2Ba- 植物植物，但不在嘲弄接种植物和大部分内GydF4y2BafGydF4y2Ba- 在18dpi下植物死亡（图。GydF4y2Ba7个GydF4y2Ba). 以西瓜为试材，研究了西瓜植株在不同温度下的防御反应GydF4y2BafGydF4y2Ba，我们分析比较了两个防御相关基因的表达模式，GydF4y2BaClPR5型GydF4y2Ba和GydF4y2Ba几丁质酶GydF4y2Ba， 在里面GydF4y2BafGydF4y2Ba- 植物和嘲弄接种植物。如图所示。GydF4y2Ba第7b条GydF4y2Ba，表达水平GydF4y2BaClPR5型GydF4y2Ba和GydF4y2Ba几丁质酶GydF4y2Ba在GydF4y2BafGydF4y2Ba-接种植株与模拟接种植株在6dpi时的结果相当；但是GydF4y2BafGydF4y2Ba-接种植株在9dpi时显著增加，显示出比模拟接种植株增加约8倍和3倍（图。GydF4y2Ba第7b条GydF4y2Ba），表明防御响应的激活GydF4y2BafGydF4y2Ba- 植物植物。然后我们分析了表达式模式GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba回应GydF4y2BafGydF4y2Ba使用从GydF4y2BafGydF4y2Ba- 通过监测疾病进展和防御相关基因的表达来验证和嘲弄接种植物（图。GydF4y2Ba7a和bGydF4y2Ba)．如图所示。GydF4y2Ba7C和D.GydF4y2Ba表达水平为12GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba(GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-1GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-2GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-3GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK13型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK16型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK20-1型GydF4y2Ba）和四GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba(GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba)在之后的西瓜植株中发生了明显的变化GydF4y2BafGydF4y2Ba感染，表明这些GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba是GydF4y2BafGydF4y2Ba-可诱导的。但是GydF4y2BaClMPK9-4GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK20-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Ba时钟K3GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK9型GydF4y2Ba未受到严重影响GydF4y2BafGydF4y2Ba感染。此外，这些表达GydF4y2BafGydF4y2Ba- 宽容GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba表现出不同的模式，在时间进程和规模的影响GydF4y2BafGydF4y2Ba诱导的表达。例如，表达水平GydF4y2BaClMPK9-2GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK16型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba在6dpi时表达显著增加，在9dpi时表达进一步增加，而其他基因的表达水平则显著增加GydF4y2BafGydF4y2Ba- 宽容GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba在9 dpi中仅增加了显着增加（图。GydF4y2Ba7C和D.GydF4y2Ba)．在9 dpi，表达水平GydF4y2Baclmpk2-1GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk2-2GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK9-3GydF4y2Ba表现出>的3倍和表达水平GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba显示>比模拟接种的植株增加了6倍(图。GydF4y2Ba7C和D.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

函数GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba抗病性GydF4y2Ba

由于西瓜不能进行常规转化，因此，我们通过西瓜异位瞬时表达进行了功能分析GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba进一步研究GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba抗病性。到这个结束，9GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba(GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK9-2GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK13型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba)和5GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba(GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK9型GydF4y2Ba)短暂表达于GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba通过agroinfiltration。农渗后24 h采集的样品进行qRT-PCR分析，结果表明，大部分样品入选GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba正常表达GydF4y2BaN. BenthiaminaGydF4y2Ba它们的表达水平，表现为GydF4y2BaNbActinGydF4y2Ba基因，在个人中变化很大GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba——或者GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba-渗透的叶子，而没有所选的成绩单GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba在egfp浸润的叶片中检测到(图。GydF4y2Ba8安培GydF4y2Ba). 表达水平GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba约为16-，5.5-和3.4倍，以及所选择的剩余表达水平GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba约为0.3-2.1倍GydF4y2BaNbActinGydF4y2Ba基因(图。GydF4y2Ba8安培GydF4y2Ba)．不幸的是，我们无法察觉GydF4y2BaClMPK9-2GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK9型GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba因此我们没有对这两个基因做进一步的实验。农渗后48 h，采集农渗叶片进行瞬时表达GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba在叶子的两侧。接种后3天的疾病表型显示出来的GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba使得病变在GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba- ，GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba- ，GydF4y2BaClMPK13型GydF4y2Ba- ，GydF4y2BaClMPK19型GydF4y2Ba- ，GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba- ，GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba——或者GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba-渗入的叶片与eGFP-或缓冲液渗入的对照叶片上的叶片相似（图。GydF4y2Ba8B和C.GydF4y2Ba），表明这些瞬态表达了这些GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba没有影响抵抗力GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba. 相比之下GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba使得病变在GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba- ，GydF4y2Baclmpk4.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-， 和GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba-渗入叶片明显变小（图。GydF4y2Ba80亿GydF4y2Ba)，体积分别减小了38、36和80%(图5)。GydF4y2Ba8摄氏度GydF4y2Ba)，而病灶GydF4y2BaClMPK6型-GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba-浸润的叶片明显变大(图。GydF4y2Ba80亿GydF4y2Ba），导致103％和87％的大小增加（图。GydF4y2Ba8摄氏度GydF4y2Ba)，与eGFP-或缓冲渗透叶片相比，表明瞬时表达GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba或者GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba影响了对GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba. 对这项研究的成绩单进行分析GydF4y2BaB灰霉菌肌动蛋白GydF4y2Ba基因GydF4y2BaBcactinaGydF4y2Ba作为率的指标GydF4y2Ba在车前GydF4y2Ba真菌的生长表明生长GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba在GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba- ，GydF4y2Baclmpk4.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-， 和GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba-渗透叶片显著降低，分别下降52%、50%和91%；然而GydF4y2BaClMPK6型-GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba-与eGFP渗透的对照叶片相比，渗透叶片显著增加，分别增加72%和160%（图。GydF4y2Ba8天GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

它以前表明拟南芥的过度表达GydF4y2BaAtMKK7公司GydF4y2Ba导致激活系统获得的阻力[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]，植物中一种诱导诱导的免疫反应形式[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]. 因此我们研究了GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba或者GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba影响远端组织抵抗GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba．为此目的，土壤杆菌携带含有的构建体GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba或者GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba被渗透到一半的叶子和疾病测定用GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba分别于农渗后2天在对半叶上进行测定。接种后3天的疾病表型显示出来的GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba-在大脑的另一半造成了损伤GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba- ，GydF4y2Baclmpk4.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-， 和GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba-渗入叶片明显变小（图。GydF4y2Ba9甲GydF4y2Ba），分别显示38,25和64％的尺寸减小（图。GydF4y2Ba9亿GydF4y2Ba)另一半的病灶GydF4y2BaClMPK6型-GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba-浸润的叶片明显变大(图。GydF4y2Ba9甲GydF4y2Ba)，导致体积分别增长了12%和35%(图5)。GydF4y2Ba9亿GydF4y2Ba)与eGFP渗透对照叶片相比。GydF4y2Ba

探讨其作用的分子机制GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba在疾病抵抗力中，我们分析了这些的瞬态表达GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba影响细胞防御相关基因的表达GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba．表达水平GydF4y2BaNbPR1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaNbPR2型GydF4y2Ba和GydF4y2BaNbPR5型GydF4y2Ba，三个防御相关基因[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]， 在GydF4y2BaClMPK1型-GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk4-2-GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK7型-GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK6型-GydF4y2Ba或者GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba对瞬时表达的叶片进行分析，并与egfp浸润的叶片进行比较。如图所示。GydF4y2Ba9摄氏度GydF4y2Ba，农渗后0 h未检测到相关防御基因的表达;而农渗24h后，这些基因表达量增加GydF4y2BaClMPK1型-GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk4-2-GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK7型-GydF4y2Ba，或GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba-观察到瞬时表达的叶片。表达水平GydF4y2BaNbPR1型GydF4y2Ba和GydF4y2BaNbPR5型GydF4y2Ba农渗24h后显著增加GydF4y2BaClMPK1型-GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk4-2-GydF4y2Ba或者GydF4y2BaClMPK7型-GydF4y2Ba瞬时表达叶片，导致1.3 ~ 10.8次折叠GydF4y2BaNbPR1型GydF4y2Ba和5.5〜15.5折GydF4y2BaNbPR5型GydF4y2Ba在eGFP渗透的叶片上（图。GydF4y2Ba9摄氏度GydF4y2Ba). 表达增加GydF4y2BaNbPR2型GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaClMPK1型-GydF4y2Ba或者GydF4y2BaClMPK7型-GydF4y2Ba瞬时表达叶子GydF4y2BaNbPR1型GydF4y2Ba和GydF4y2BaNbPR5型GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaClMKK2-2型-GydF4y2Ba还观察到瞬时表达的叶子（图。GydF4y2Ba9摄氏度GydF4y2Ba)．但是，表达水平GydF4y2BaNbPR1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaNbPR2型GydF4y2Ba和GydF4y2BaNbPR5型GydF4y2Ba在里面GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba-瞬时表达的叶片与eGFP渗透的叶片相似（图。GydF4y2Ba9摄氏度GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

功能GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba细胞死亡等过敏反应GydF4y2Ba

在我们的瞬态表达的功能分析中GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba在抗病方面，我们注意到GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba-瞬时表达的叶片表现出典型的超敏反应（HR）样细胞死亡，而其他选择GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba或者GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba-瞬时表达的叶片没有。GydF4y2Ba9甲GydF4y2Ba)，表示涉及GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Bahr样细胞死亡为此，我们进行了几次实验来证实其可能的功能GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba类似HR的细胞死亡。在农业渗透后24小时，ClMPK7蛋白作为ClMPK7-GFP融合物在ClMPK7-GFP渗透的叶片中明显累积，而在eGFP渗透的叶片中仅检测到GFP（图。GydF4y2Ba10安培GydF4y2Ba). 在ClMPK7-GFP浸润的叶片中，在24小时时观察到典型的HR样细胞死亡，在浸润区域出现小的坏死病灶，这些坏死病灶随着时间的推移而扩大，在农业浸润后7天形成大的坏死区域（图。GydF4y2Ba10亿GydF4y2Ba)．在egfp浸润的叶片中，只有少量的细胞在浸润部位死亡，这可能是由于在浸润过程中受伤所致(图1)。GydF4y2Ba10亿GydF4y2Ba)．此外，H的大量积累GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba用3，3-二氨基联苯胺（DAB）染色法观察到，ClMPK7-GFP渗透叶片不仅在渗透部位，而且在渗透部位周围的组织中也有表达，而在ClMPK7-GFP渗透的叶片中，3，3-二氨基联苯胺（DAB）染色的结果表明，ClMPK7-GFP不仅在渗透部位，而且在渗透部位周围的组织中也有表达GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba仅在渗滤点有堆积现象。GydF4y2Ba10摄氏度GydF4y2Ba). 这些数据表明ClMPK7可能通过调节H的产生在HR样细胞死亡中发挥作用GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

MAPK级联是在生长发育和应激反应中起关键作用的主要途径之一。MPKs和MKKs是MAPK级联的最后两个组分，它们被表示为多基因家族，已经在许多植物的基因组水平上进行了详细的研究。我们的全基因组调查在西瓜中发现了15个ClMPKs和6个ClMKKs，它们可以分为4个不同的类群。我们详细研究了ClMPK和ClMKK家族的一些成员的蛋白质相互作用关系、在不同组织中的表达模式以及对非生物和生物胁迫的反应，可能的抗病功能为ClMPK和ClMKK家族在西瓜中的生物学功能提供了初步证据。GydF4y2Ba

MAPK级联组件的功能和活动取决于它们的直接物理交互。在本研究中，观察到CLMPK和CLMKK之间的复杂相互作用关系和特异性。例如，CLMPK4-1与两个CLMKKS（CLMKK2-1和CLMKK6）相互作用，而CLMKK2-1与三个CLMPK（CLMPK4-1，CLMPK4-2和CLMPK13相互作用（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba). ClMKK2-2与ClMPK1特异性相互作用，反之亦然（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba). ClMKK2-1和ClMKK2-2，它们具有高度的序列相似性（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)，与不同的ClMPKs相互作用(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．CLMPKS和CLMKKS之间的复杂的相互作用关系和特异性表明它们可以集成到不同的信号通路中并确定特定的生物学功能[GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba39GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

被认为与上游mkk相互作用的CD域[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]，似乎不是负责蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质与CLMPKS和CLMKK之间的相互作用的唯一结构域。它是合理的，CLMPK4-1，CLMPK4-2，CLMPK6和CLMPK13以相应的CLMKKS差异相互作用（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)，因为这四个CLMPK都包含CD域。然而，令人惊讶的是，没有CD结构域的ClMPK1和ClMPK7分别与ClMKK2-2和ClMKK5相互作用（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．这类似于先前的观察结果GydF4y2BaB. Distachyon.GydF4y2BaBDMPK7-1 / 14/17和CANOLA BNAMPK9 / 19/20缺少CD域，可以与上游相应的MKKS相互作用[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]. 因此，ClMPKs中的其他域/基序可能参与确定与上游clmk的相互作用。GydF4y2Ba

先前研究表明，拟南芥AtMKK1/AtMKK2与AtMPK4相互作用，形成AtMKK1/AtMKK2-AtMPK4级联，而AtMKK4/AtMKK5与AtMPK3/AtMPK6相互作用，形成AtMKK4/AtMKK5-AtMPK3/AtMPK6级联[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba–GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］．ClMPKs和ClMKKs之间也观察到类似的相互作用。如ClMKK2-1，与AtMKK1/AtMKK2密切相关(图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)与两个与AtMPK4系统学聚集的ClMPK4-1和ClMPK4-2显著相互作用（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)而ClMKK5，一个假定的AtMKK4和AtMKK5的同源基因，与ClMPK6，一个与AtMPK6高度相似的ClMPK，有强烈的相互作用。ClMKK6与ClMPK2-1、ClMPK2-2和ClMPK13相互作用的事实与拟南芥AtMKK6相似，后者可以相互作用并磷酸化AtMPK4和AtMPK13[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba–GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]. 有趣的是，ClMKK2-1和ClMKK6与相同的clmpk相互作用，包括ClMPK4-1、ClMPK4-2和ClMPK13（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．统称，西瓜的CLMKK2-1 / CLMKK6-CLMPK4-1 / CLMPK4-2 / CLMPK13和CLMK35-CLMPK6可能构成单独的MAPK级联。但是，就像拟南芥和米饭那样[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba,GydF4y2Ba49GydF4y2Ba]进一步综合分析clmk和ClMPKs之间的蛋白质相互作用，将有助于建立MAPK级联及其信号网络。GydF4y2Ba

虽然MAPK级联的活性可以在转录水平和翻译后水平上进行调节，但MPK和MKK基因表达的转录调节在许多植物中已有报道。人们普遍认为，在组织中或在发育阶段或在应激条件下大量表达的基因可能暗示其与发育和应激反应有关的功能。在这方面，表达模式GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba在不同的组织中或对生物和非生物胁迫的反应可能表明了西瓜中ClMPKs和ClMKKs的生物学功能及其可能的关系。在假定的ClMKK2-1/ClMKK6-ClMPK4-1/ClMPK4-2/ClMPK13和ClMKK5-ClMPK6级联中，成员的表达表现出类似的上调模式GydF4y2BafGydF4y2Ba感染（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba). 同样地GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba在ClMKK5-ClMPK6叶栅中，干旱、高温和低温胁迫同步上调（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 然而，在这两个假定的MAPK级联中的成员在不同组织中以及在非生物和生物胁迫处理下的不同表达模式也被注意到。例如，盐胁迫诱导了蛋白质的表达GydF4y2BaClMPK4-1型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba但没有影响表达的GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．表达模式的差异的成员在一个假定的MPAK级联也可能被解释成MAPK级联的生化功能的性质主要是由磷酸化状态的组件级联或其他组件存在形式未知具体增长和应力条件下的级联。另一方面，观察到一些相似对的不同表达模式。ClMPK9-1/ClMPK9-4、ClMPK20-1/ClMPK20-2、ClMKK2-1/ClMKK2-2在不同的非生物胁迫胁迫下表现出不同的表达模式。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．这与棉花MPK家族在不同非生物胁迫处理下的结果相似[GydF4y2Ba20GydF4y2Ba］．因此，ClMPK和ClMKK家族的一些成员可能保留了功能保护，而其他成员可能进化出不同的功能，以应对不同的环境挑战。GydF4y2Ba

我们的表达分析显示了GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba家庭以不同的方式回应GydF4y2BafGydF4y2Ba感染之类的GydF4y2Baclmpk3.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba被显着诱导GydF4y2BafGydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)表明它们可能参与了西瓜的防御反应激活GydF4y2BafGydF4y2Ba. 进一步基于瞬时表达式的功能分析表明GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk4.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba和GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba肯定GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba负面调节抵抗力GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba当瞬间表达为GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba). 事实上GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba,GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba影响远端组织对GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba不仅证实了它们在抗病性中的作用，而且表明它们对防御反应的激活有系统的影响（图。GydF4y2Ba9GydF4y2Ba)．GydF4y2Baclmpk1.GydF4y2Ba和GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba属于C组，与拟南芥有亲缘关系GydF4y2BaAtMPK1GydF4y2Ba,GydF4y2BaAtMPK2GydF4y2Ba,GydF4y2BaAtMPK7型GydF4y2Ba和GydF4y2BaATMPK14GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)．在本研究中，我们发现表达了GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba是由几种非生物胁迫和GydF4y2BafGydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)瞬时表达GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba导致抗性增加GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba9GydF4y2Ba)．这与我们观察到的拟南芥AtMPK7作为AtMKK3-AtMPK7级联的一个组成部分，在对AtMKK3-AtMPK7的防御反应中发挥作用是一致的GydF4y2BaP. inringae.GydF4y2Bapv。GydF4y2Ba番茄GydF4y2BaDC3000在棉花中的过度表达GydF4y2BaGhMPK7GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba增强了抵抗力GydF4y2Ba烟草炭疽菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba,GydF4y2Ba51GydF4y2Ba]. ClMPK4-2与拟南芥AtMPK4关系密切（图。GydF4y2Ba2a级GydF4y2Ba). 表达GydF4y2BaClMPK4-2型GydF4y2Ba感染后6dpi诱导GydF4y2BafGydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）和瞬态表达GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba导致抗性增加GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba9GydF4y2Ba)．它以前表明拟南芥GydF4y2BaATMPK4GydF4y2Ba突变体与番茄GydF4y2BaSlMPK4型GydF4y2Ba- 植物植物表现出增强的易感性GydF4y2Ba十字花格孢GydF4y2Ba和GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba，分别[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba,GydF4y2Ba53GydF4y2Ba，而过度表达GydF4y2BaBnMPK4型GydF4y2Ba在油菜植株中显著增强了对烟草的抗性GydF4y2Basclerotinia sclerotiorum.GydF4y2Ba和GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］．这些数据表明，植物MPK4包括CLMPK4-2作为防治病原体的防御反应的正常调节因子。另一个具有疾病抵抗力的CLMPKGydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba是CLMPK6，显示与Arabidopsis Atmpk6的高度相似度（图。GydF4y2Ba2a级GydF4y2Ba)它是MEKK1–MKK4/MKK5–MPK3/MPK6级联调节免疫应答的关键组成部分[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．发现ATMPK3和ATMPK6的激活阻碍了感染GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]尽管缺乏AtMPK6并不影响对小麦的基本抗性GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba]. 这与我们在本研究中观察到的GydF4y2Baclmpk6.GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba导致阻力降低GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba9GydF4y2Ba). ClMKK2-2是拟南芥AtMKK1和AtMKK2的同源基因（图。GydF4y2Ba2b级GydF4y2Ba)在AtMKK1/AtMKK2-AtMPK4级联中，负性调节免疫[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］．然而，ClMKK2-2与clmpk2 -2没有相互作用。GydF4y2Ba4b级GydF4y2Ba)，与AtMPK4、AtMPK11以及ClMKK2-2在抗GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba与ClMPK4-2不同（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba9GydF4y2Ba)．因此，ClMKK2-2和ClMPK4-2不可能形成功能性MAPK级联。虽然ClMKK2-2与ClMPK1相互作用(图。GydF4y2Ba4b级GydF4y2Ba)它们对小麦的抗性有相反的影响GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba当瞬间表达为GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba9GydF4y2Ba). ClMKK2-2和ClMPK1是否形成真正的功能性MAPK级联尚需进一步研究。GydF4y2Ba

在本研究中我们还发现GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba引发了HR样细胞死亡，并且可能通过异常ROS积聚开始CLMPK7诱导的HR样细胞死亡（图。GydF4y2Ba10GydF4y2Ba)．这与之前的观察结果相似，即烟草SIPK/Ntf4/WIPK和Aabidopsis AtMKK4/AtMKK5级联的激活积极促进ROS的产生，而ROS在HR细胞死亡的信号传导和/或执行中发挥重要作用[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba–GydF4y2Ba59GydF4y2Ba]. 值得注意的是，瞬时表达GydF4y2Baclmpk7.GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba导致显着的HR样细胞死亡和抗性增加GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba9GydF4y2Ba和GydF4y2Ba10GydF4y2Ba)与拟南芥AtMKK4、烟草NtMEK2和番茄SlMKK2/SlMKK4在HR样细胞死亡和增强抗病性中的作用一致GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba,GydF4y2Ba41GydF4y2Ba,GydF4y2Ba58GydF4y2Ba]. 另一方面，众所周知，MKKs组成性活性形式的表达可以触发植物HR样细胞死亡[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba,GydF4y2Ba38GydF4y2Ba,GydF4y2Ba41GydF4y2Ba,GydF4y2Ba58GydF4y2Ba］．但是，我们没有观察到叶片中的任何HR样细胞死亡GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba植物渗透结构携带野生型形式GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba)，表明这些野生型形式的瞬时表达GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba无法触发类似HR样的细胞死亡。这与观察结果一致的观察结果番茄SLMKK2和SLMMK4的过表达和SLMMK4和ARABIDOPSIS ATMKK3没有诱导HR样细胞死亡或影响抗病性，但对组成型活性磷酸磷酸磷酸化形式的过表达诱导显着的HR样细胞死亡或疾病抵抗性 [GydF4y2Ba16GydF4y2Ba,GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]. 因此GydF4y2BaClMKK2-1型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK2-2型GydF4y2Ba,GydF4y2BaClMKK5型GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKK6型GydF4y2Ba在HR样细胞死亡中，需要使用组成型活性的磷酸染色形式进一步研究。GydF4y2Ba

迄今为止，对MPK和MKK家族及其在西瓜中可能的生物学功能知之甚少。除了西瓜中ClMPK和ClMKK家族的全基因组特征之外，本研究证明了ClMPK和ClMKK家族成员之间的重要相互作用，包括推测的ClMKK2-1/ClMKK6-ClMPK4-1/ClMPK4-2/ClMPK13和ClMKK5-ClMPK6级联，并显示了ClMPK和ClMKK家族中大多数成员在不同组织中的差异表达模式以及对非生物胁迫的反应（例如干旱、盐、冷处理和热处理）和生物（例如。GydF4y2BafGydF4y2Ba感染）压力。更重要的是，我们发现C组的ClMPK1和ClMPK7以及B组的ClMPK4-2是阳性的，而A组的ClMPK6和A组的ClMKK2-2则是阴性的GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba当瞬间表达为GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2BaC组的ClMPK7是HR样细胞死亡的调节因子。表中总结了ClMPK和ClMKK家族的表达模式、蛋白质-蛋白质相互作用关系、可能的抗病功能及其潜在的拟南芥功能同源基因GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba. 本研究为今后CLMPK和CLMKK家族在西瓜生长发育和逆境胁迫中的功能研究提供了重要的基础。进一步通过基因表达和RNA干扰技术对西瓜进行遗传研究，对阐明ClMPKs和ClMKKs的生物学功能和分子机制具有重要意义。GydF4y2Ba

植物生长与处理GydF4y2Ba

西瓜 （GydF4y2BaCitrullus lanatusGydF4y2Ba） 简历。Zaojia用于所有实验。植物在钙钛矿的混合物中生长：蛭石：在荧光灯下的生长室中的植物灰（1：6：2）（200μEmGydF4y2Ba^2.GydF4y2BaSGydF4y2Ba^{−1.GydF4y2Ba})在22–24°C、60%相对湿度和14小时光照/10小时黑暗循环条件下，除非另有说明，否则使用三周龄的植物。为了分析组织特异性表达，采集叶片、茎和根样本并储存在−80°C直至使用。ABA处理以100μM ABA或0.1%乙醇和0.02%吐温-20等体积溶液为对照。对于冷胁迫处理，将植株移入4℃的生长室或保持在25℃作为对照24小时。对于热处理，将植物转移到42℃的生长室中或作为对照在25℃下保持24小时。对于干旱胁迫处理，将植株置于不供水的实验室混合器上或置于饱和过滤纸上作为对照12h。对于盐胁迫处理，在25℃下用200mmNaCl溶液或水作为对照进行灌溉。基因表达分析GydF4y2BafGydF4y2Ba感染，按照先前报告的方法进行接种[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba]. 简单地说，分生孢子是从10天大的培养基中收集的GydF4y2BafGydF4y2Ba座圈1并调整为1 × 10GydF4y2Ba^6.GydF4y2BaConidia / ml。仔细拔除两周的植物，在自来水中洗涤，然后将植物的根部浸入分析悬浮液中或作为模拟接种对照的蒸馏水中浸入30秒。在土壤中小心地将接种的植物仔细覆盖，并如上所述在相同的生长室中生长。在处理后在指定的时间点收集叶样品，并在-80℃下储存直至使用。GydF4y2Ba

西瓜ClMPK和ClMKK基因的鉴定和命名GydF4y2Ba

以拟南芥AtMPKs和AtMKKs为查询材料，对西瓜基因组数据库中推测的MPK和MKK蛋白进行了研究GydF4y2Bahttp://www.icugi.org/GydF4y2Ba．通过域分析程序PFAM检查所获得的核苷酸和蛋白质序列（GydF4y2Bahttp://pfam.sanger.ac.uk/GydF4y2Ba)而且很聪明(GydF4y2Bahttp://smart.emblheidelberg.de/GydF4y2Ba)使用默认的截止参数。等电点和分子量在ExPASy蛋白质组服务器上进行预测(GydF4y2Bahttp://expasy.org/GydF4y2Ba)．序列对准由Clustalx程序执行。使用Mega6程序的邻近方法构建系统发育树，具有P距离和完整的删除选项参数。使用具有1000重复的自动启动方法测试所获得的树的可靠性。GydF4y2Ba

克隆GydF4y2Baclmpk.GydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKGydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

总RNA由Trizol regent提取，并根据制造商的说明用无RNase DNA酶（TaKaRa，中国大连）处理。根据制造商的说明，使用寡d（T）引物，使用AMV逆转录酶（Takara，中国大连）合成第一链cDNA。将获得的cdna用于qRT-PCR和克隆。的编码序列GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba使用基因特异性引物进行扩增（附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：表S1）基于探测CDNA设计，并通过T / A克隆克隆到PMD19-T载体中，产生PMD19-CLMPK或PMD19-CLMKK。通过测序确认后，将这些PMD19-CLMPK或PMD19-CLMKKS质粒用作模板以扩增靶基因以进行进一步的实验。GydF4y2Ba

酵母双杂化测定GydF4y2Ba

根据制造商的说明(Clontech, Mountain View, CA, USA)，使用Matchmaker Gold酵母双杂交系统(Matchmaker Gold酵母双杂交系统)检测ClMPKs和ClMKKs之间假定的相互作用。使用基因特异性引物扩增ClMPKs和ClMKKs的编码序列(附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：表S1）从pMD19 ClMPKs或pMD19 CLMKs克隆到pGADT7和pGBKT7载体。将所得质粒转化到酵母菌株Y2HGold中，经菌落PCR鉴定。转化酵母在SD/Trp上培养GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba伊斯GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba30°C培养基培养3天，然后加入X-α-gal(5-溴-4氯-3吲哚基- d -半乳糖苷)。根据转化酵母细胞在SD/Trp上的生长情况，评估ClMPKs和ClMKKs之间的相互作用GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba伊斯GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba添加X-α-Gal后的培养基和蓝色颜料的生产。PGBKT7-53或PGBKT7-LAM和PGADT7-T的共转化分别为正和阴性对照。GydF4y2Ba

瞬时表达GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba疾病检测GydF4y2Ba

所选编码序列GydF4y2BaClMPKsGydF4y2Ba和GydF4y2BaClMKKs公司GydF4y2Ba使用基因特异性引物进行扩增（附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：表S1）从相应的pMD19 ClMPKs或pMD19 CLMKs质粒中分离，并在不同的限制性内切酶位点克隆到pFGC Egfp中，产生pFGC ClMPKs或pFGC CLMKs。将重组质粒pFGC-ClMPKs或pFGC-ClMKKs及空载体pFGC-Egfp导入大肠杆菌GydF4y2Ba农杆菌肿瘤术GydF4y2Ba使用基因脉冲剂II电穿孔系统（Bio-rad Laboratories，Hercules，Ca，USA）电穿孔菌株GV3101。携带PFGC-CLMPKS的农杆菌，PFGC-CLMKKS或PFGC-EGFP在YEP培养基（50μg/ ml利福平，50μg/ ml kanamycin和25μg/ ml庆大霉素）中生长24小时，在28℃下连续摇动，收集离心并重新悬浮在浸润缓冲液中（10mM MgClGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba，10 mM MES，200μM乙酰丁香酮，pH5.7）。为了获得瞬时表达，携带不同结构的农杆菌渗入4周龄的叶片GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba使用1毫升无针注射器的植物。在农业渗透2天后采集叶片样品，通过qRT-PCR分析目标基因的表达水平，通过westernblot分析蛋白质积累水平或进行疾病检测。GydF4y2Ba

对于疾病检测，接种GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Ba使用孢子悬浮液（1 × 10GydF4y2Ba^5.GydF4y2Ba根据先前报道的程序[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．简而言之，通过滴下5μL孢子悬浮液，然后在22℃下保持密封托盘以促进疾病发育，接种分离的叶子以促进疾病的发育。通过测量通过QRT-PCR分析转录物的损伤尺寸和真菌生长来估算疾病进展GydF4y2BaB灰霉菌GydF4y2Baactina基因作为真菌生长的指示[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba,GydF4y2Ba61GydF4y2Ba]使用一对引物BcActin-F和BcActin-R（附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：表S1）。GydF4y2Ba

对于ClMPK7蛋白的Western blot分析，将叶盘研磨在200μL裂解缓冲液（50 mM Tris–HCl，pH7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM DDT，0.1%Triton X-100和1×蛋白酶抑制剂混合物，1 mM PMSF）中，然后添加100μL负载缓冲液。煮沸5分钟后，样品在10000×100℃下离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba将20μL上清液在12%SDS-PAGE凝胶上分离，然后通过半干转移转移到PVDF膜上。用多克隆兔抗GFP抗体（1:5000稀释度；GenScript，南京，中国）和辣根过氧化物酶结合抗兔抗体（1:10000稀释；GenScript，中国南京）按照制造商的说明。SDS-PAGE凝胶中的蛋白质通过超信号West Pico化学发光底物（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）检测。GydF4y2Ba

H的检测GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba积累GydF4y2Ba

H的检测GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaDAB染色[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba］．叶片样品采集自GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba浸泡48 h后的植株瞬时表达，浸入DAB溶液(1 mg/mL, pH3.8)中。室温暗孵育8 h后，将daba处理过的叶片转入乙酸/甘油/乙醇(1:1:1,vol/vol/vol)中煮沸5 min，然后用同一溶液多次洗涤。用数码相机拍摄被dabb染色的叶子。GydF4y2Ba

基因表达qRT-PCR分析GydF4y2Ba

总RNA采用Trizol试剂(TaKaRa，中国大连)按照制造商说明书提取。RNA用RNase-free DNase处理，然后使用PrimeScript RT试剂试剂盒(TaKaRa，大连，中国)逆转录成cDNA。获得的cdna用于实时定量PCR的基因表达分析。每个qPCR反应包含12.5 μL SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa，中国大连)，0.1 μg cDNA和7.5 pmol基因特异性引物(附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：表S1）以25μL的最终体积，并具有三个独立的生物重复。QPCR在CFX96实时PCR检测系统（Bio-rad，Hercules，USA）中进行。使用2计算相对基因表达水平GydF4y2Ba^{–GydF4y2Ba△GydF4y2Ba△GydF4y2Ba计算机断层扫描GydF4y2Ba}方法如前所述。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

所有实验均独立重复三次，并且根据学生的三次独立实验获得的数据获得统计分析GydF4y2BaTGydF4y2Ba-测试。概率值GydF4y2BaPGydF4y2Ba ≤ 0.05被认为是治疗组和相应对照组之间的显著差异。GydF4y2Ba

西瓜和拟南芥系统发育树中MPKs和MKKs的序列信息可以在LabArchives数据库中找到GydF4y2Ba10.6070/高4hq3wxbGydF4y2Ba(GydF4y2Bahttps://mynotebook.labarchives.com/share/Dayong%2520Li/MjYuMHwxMDIwMDkvMjAvVHJlZU5vZGUvNzg5MzI4ODZ8NjYuMAGydF4y2Ba==）。GydF4y2Ba

阿巴：GydF4y2Ba

脱落酸GydF4y2Ba

B灰霉菌GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

灰葡萄孢GydF4y2Ba

轻而快地擦掉：GydF4y2Ba

3,3-二氨基苯胺GydF4y2Ba

新闻部：GydF4y2Ba

接种后天数GydF4y2Ba

fGydF4y2Ba:GydF4y2Ba

Fusarium Oxypsorum.GydF4y2Baf . sp。GydF4y2Ba奈姆GydF4y2Ba

人力资源：GydF4y2Ba

过敏反应GydF4y2Ba

地图：GydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶GydF4y2Ba

MKK公司：GydF4y2Ba

MAPK激酶GydF4y2Ba

MEKK公司：GydF4y2Ba

MKK激酶GydF4y2Ba

N. Benthamiana.GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

烟草benthamianaGydF4y2Ba

ORF：GydF4y2Ba

打开阅读框GydF4y2Ba

QRT-PCR：GydF4y2Ba

定量反转录PCRGydF4y2Ba

本研究由现代农业工业技术研究系统（CARS-26-11）基金和高等教育博士博士计划专业​​研究基金的优先发展方案（20130101130006）的优先发展计划的财务支持。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 浙江大学生物技术研究所，水稻生物学国家重点实验室，杭州，310058GydF4y2Ba

   Quiuming Song，Dayong Li，Yi Dai，Shixia Liu，Lei Huang，Yongbo Hong，Huijuan Zhang＆Feng明歌GydF4y2Ba

2. 台州学院生命科学学院，浙江泰州，318001，P.R中国GydF4y2Ba

   惠娟张GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba惠娟张GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

作者声明他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

采用FS、HZ、DL、QS设计了实验装置。采用QS、YD、LH、SL、YH和HZ进行实验。FS, DL, HZ和QS起草了手稿，FS对手稿进行了修改。所有作者阅读并批准最终稿件。GydF4y2Ba

开放存取GydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可的条款分发(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，允许在任何介质中不受限制地使用、分发和复制，前提是您给予原始作者和来源适当的信任，提供到知识共享许可证的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域放弃(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。GydF4y2Ba

转载和许可GydF4y2Ba