水杨酸的处理和表达GydF4y2BaRNA依赖性RNA聚合酶1GydF4y2Ba转基因抑制烟草花叶病毒侵染过程中的致死症状和分生组织入侵GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

宿主RNA依赖的RNA聚合酶(RDRs) 1和6有助于植物抗病毒RNA沉默。RDR6是组成性表达的，以前被证明可以限制细胞的侵袭GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba分生组织被马铃薯X病毒感染，从而抑制病害的发展。RDR1由水杨酸（SA）和其他几种植物激素诱导。虽然它有助于烟草花叶病毒（TMV）的基础抗性，但SA诱导的抗性在接种叶片中是不必要的。实验室加入GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba是一种天然的GydF4y2Bardr1型GydF4y2Ba突变体，对TMV高度敏感。然而，TMV诱导的症状在表达TMV的转基因植株中得到了改善GydF4y2Ba截形苜蓿GydF4y2BaRDR1。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba表达绿色荧光蛋白(TMV. gfp)的TMV在未接种的上部叶片中的传播不受抑制。然而，在这些植物中排除了TMV。与对照相比，在根尖分生组织和邻近茎组织中产生的GFP明显增加，SA增强了这种排斥效应。烟草花叶病毒通常杀死GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物虽然GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植物最初表现出病毒诱导的坏死，随后恢复。水杨酸治疗可明显促进病后恢复GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植株，而对照植株，SA延缓但没有阻止系统坏死和死亡。在SA处理之后GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植物，提取的RDR酶活性增加，Western blot分析显示RDR提取物与MtRDR1抗体产生交叉反应。的表达GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba在转基因植物中GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物由一个来自花椰菜花叶病毒的组成型35S启动子驱动，证实对水杨酸无反应。这表明SA对MtRDR1的作用是在转录后水平发挥的。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

MtRDR1通过限制病毒向被感染植物的生长尖扩散来抑制严重症状的发展。因此，RDR1可能以类似于RDR6的方式发挥作用。MtRDR1和SA共同作用，进一步促进疾病症状的恢复GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植物。因此，SA可能通过转录后效应促进MtRDR1活性和/或稳定性。GydF4y2Ba

水杨酸（SA）是植物防御系统维持和激活的重要信号分子。在超敏反应（hypersensitive response，HR）过程中，SA是限制病原体传播的必需条件，这是一种由基因决定的耐药机制，病原体被限制在感染部位附近。触发HR可以诱导一种额外的诱导抗性机制，称为系统获得性抗性（SAR），它也是SA依赖性的。合成孔径雷达是有效的对付非常广泛的病原体，包括病毒，卵菌，真菌和细菌[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

SAR，无论是通过HR的结果还是通过耐药诱导化学物质的应用，都与转录组的显著变化有关[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．这些变化包括编码致病相关(PR)蛋白的基因转录增加，其中一些有助于抵御真菌、卵菌和细菌[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]但不是对病毒[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．事实上，对病毒的诱导抗性仍然知之甚少[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba］．sa诱导的对病毒的抗性不是由任何已知的PR蛋白介导的，也不依赖于PR蛋白非表达因子1 (NPR1)的转录激活因子GydF4y2Ba公关GydF4y2Ba基因诱导及有效SA诱导的非病毒性病原菌抗性和SAR[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba,GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

sa诱导的病毒抗性的潜在机制之一是RNA沉默。RNA沉默在抗病毒防御中的重要性可以从以下事实推断出来:大多数植物病毒拥有反防御蛋白(RNA沉默的病毒抑制蛋白:VSRs)，它们抑制宿主沉默机制中一个或多个成分的活性或稳定性。黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus, CMV)的2b VSR通过结合小RNA抑制RNA沉默[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba–GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]也抑制SA诱导的耐受该病毒的复制和局部运动[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]表明SA诱导的抗性与沉默有一定关系。随后的研究证实，马铃薯y病毒的HC-Pro-VSRs对SA介导的病毒传播抗性有不同的影响[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba,GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

谢等人发现了一种独立的证据暗示在SA诱导的病毒耐受病毒中的抗性的证据。[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]他发现烟草中SA增加了编码RNA依赖性RNA聚合酶（RDR）1的转录物的积累(GydF4y2BaNtRDR1公司GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba还发现了一个SA诱导的RDR1基因[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba］．RDRs是一种宿主酶，可以启动或放大RNA沉默，包括抗病毒沉默，通过合成作为dicer样(DCL)核酸酶底物的dsRNA分子[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．dcl介导的切割产物是短干扰的dsrna，在进一步加工成ssRNA后，由Argonaute (AGO)蛋白直接对同源靶RNA分子进行序列特异性切割或翻译抑制[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba,GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]. 植物有一个RDR同源家族，其中6个成员在拟南芥中[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．在拟南芥中，RDR1和RDR6(不受SA影响)在限制病毒感染或降低病毒滴度方面有明显的作用GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba物种[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba,GydF4y2Ba19GydF4y2Ba,GydF4y2Ba26GydF4y2Ba–GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]. 有趣的是，编码AGO2的基因，AGO蛋白之一，具有已知的抗病毒作用[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba–GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba，对SA的诱导更加敏感，存在表达2b VSR的转基因[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．这进一步支持抗病毒沉默和SA诱导的电阻之间的连接。GydF4y2Ba

尽管有充分的证据表明沉默在SA诱导的抗药性中起作用，但RNA沉默并不是SA诱导成功抗病毒所必需的。在拟南芥中，dcl2、3和4对SA诱导的TMV和CMV抗性是不必要的[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba］．因此，SA似乎诱导了多种抗病毒系统，不仅包括RNA沉默，还包括其他机制;例如，sa通过线粒体信号过程诱导的病毒复制和运动的抑制[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

与此同时，RDR1在病毒抗性中的作用仍不完全清楚。表达反义结构的转基因烟草GydF4y2BaNtRDR1公司GydF4y2Ba它们对烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯X病毒（PVX）的抗药性在SA诱导下没有减弱（见文献报道）[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba])。最近的研究表明GydF4y2BaRDR1型GydF4y2Ba表达不仅由水杨酸诱导，还可由多种其他植物激素（包括茉莉酸）诱导，RDR1调节植物的抗虫性GydF4y2Ba野生烟草GydF4y2Ba[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba］．这GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba通常用于研究的登入是一种自然现象GydF4y2Bardr1型GydF4y2Ba表达一种非功能形式的酶（NbRDR1m）的突变体，这解释了为什么这种植物对TMV过敏[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]. 与RDR1在病毒抗性中的重要作用一致，TMV诱导的疾病在转基因中得到了改善GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba组成性表达MtRDR1的植物GydF4y2Ba截形苜蓿GydF4y2Ba[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]. 然而，应和同事[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]提供的数据显示烟草的转基因表达GydF4y2BaNtRDR1公司GydF4y2Ba在里面GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba提高植物对马铃薯y病毒和李痘病毒的敏感性。这是令人惊讶的鉴于以前的工作表明，下调GydF4y2BaNtRDR1公司GydF4y2Ba烟草植株的表达增加了对另一种potyvirus，马铃薯病毒Y的易感性[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]. 为了更好地了解RDR1在SA介导的抗病毒防御中的作用，我们研究了SA对病毒积累和运动的影响，以及SA对RDR1基因表达和活性的影响GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

组成性MtRDR1表达和SA处理抑制TMV在小鼠分生组织附近的传播GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba

利用TMV基因工程表达绿色荧光蛋白(TMV. gfp)，我们研究了SA对TMV运动的影响GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物。五到六周大GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba转基因植株和空载体(EV)对照植株(由“空”转化载体转化的植株)在接种TMV.GFP前，连续4天每天用1mm SA或对照溶液喷洒在叶片上。每天监测植株上部未接种的叶片中GFP荧光的出现。在6个独立的实验中，我们注意到SA治疗持续导致TMV首次出现延迟1到2天。GFP在上部，未接种的叶片。对照组与对照组之间无明显差异GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-transcanic植物在TMV.GFP的时序或图案化的植物涂在上部非接种叶片中（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba),虽然GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植株的发育迟缓程度低于对照植株(附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba). 在接种后14天（dpi）对TMV外壳蛋白在系统感染叶片中积累的Western blot分析表明，病毒外壳蛋白存在于两组植物的上部叶片中（图。GydF4y2Ba1 bGydF4y2Ba)．当在UV照射下研究植物以评估非接种组织中的TMV.GFP荧光时，在第一次出现的时序中没有明显的差异或控制之间的GFP荧光的表观程度GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba上叶中的植物（图。GydF4y2Ba1 cGydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

然而，仔细研究sa处理过和未处理的对照茎的最上层区域GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-表达植物在TMV的表达程度上存在显著差异。GFP(图传播。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)．荧光显微镜观察表明，水杨酸处理抑制了TMV的扩散范围。GFP进入非转基因和ev对照植株的上茎区域(图。GydF4y2Ba2AGydF4y2Ba额外的文件GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba). 在表达MtRDR1的转基因植株中，TMV.GFP完全排除在分生组织和大部分上部茎附近（图。GydF4y2Ba2AGydF4y2Ba)．进一步检查显示，SA治疗扩大了TMV产生的区域。GFP被排除在外GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物（图。GydF4y2Ba2B.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

复苏的GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2BaSA治疗植物中来自严重TMV病的植物GydF4y2Ba

烟草花叶病毒。无论是GFP，还是其来源的TMV.30B载体，都能引起强烈的疾病症状GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]. 然而，该寄主感染的U1株TMV引起强烈的症状，最终导致全身坏死和死亡的感染植物。有趣的是，TMV感染了GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-表达GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物出现了温和的症状，植物没有死亡[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．在这里，我们发现SA处理减缓，但没有阻止tmv诱导的转基因植物的死亡，所有植物(SA处理和未处理)死亡35 dpi(图。GydF4y2Ba3AGydF4y2Ba). 到这个时间点不GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植株已经死亡，尽管它们确实表现出TMV u1诱导的叶片坏死，在许多叶片出现其他症状(叶片卷曲和褪绿)之前，sa处理的植株坏死的开始较慢。坏死的范围不够大，不足以完全致死GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba转基因植物。疾病发展的进展GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba对转基因植株进行监测，直到75 dpi，发现所有这些植株的坏死扩散都减弱了，新生叶片变绿，植株恢复了生长。GydF4y2Ba3B.GydF4y2Ba)．这种明显的疾病恢复情况进一步加强GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-在接种TMV之前用SA处理过的转基因植株。SA处理GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植株比未经处理的植株高出75 dpi（图。GydF4y2Ba3B.GydF4y2Ba). 用抗外壳蛋白血清进行的westernblot分析表明，TMV存在于植物产生的新叶组织中（图。GydF4y2Ba3CGydF4y2Ba)表明尽管GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-表达转基因的植株从TMV诱导的疾病中恢复，并且这种恢复在SA处理的植株中得到增强，它们没有形成对病毒的真正抗性。GydF4y2Ba

SA处理增加了提取性RDR活性GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba但没有改变GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba转录物积累GydF4y2Ba

SA对持久的影响GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba在从TMV诱导的疾病中恢复和恢复生长方面得到改善的植物（图。GydF4y2Ba3B.GydF4y2Ba). 这表明SA增强或启动RDR1介导的TMV防御。然而，GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba转基因在这些植物中的表达受花椰菜花叶病毒35S启动子的控制[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]，也就是说，尽管含有与许多sa反应植物启动子(例如GydF4y2BaPR1a型GydF4y2Ba[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]），未通过这种植物激素激活[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

以证实35S启动子用于构建GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植株的表现与预期一致，即对SA没有反应，我们从对照转基因植株和转基因植株中提取总RNAGydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba用1mm SA或对照溶液浸渍72 h后的植株。半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测显示SA诱导表达，而非对照溶液GydF4y2BaPR1a型GydF4y2Ba表明该SA浓度可有效诱导SA应答基因表达（图。GydF4y2Ba4AGydF4y2Ba,GydF4y2BaBGydF4y2Ba)．RT-PCR也显示，而编码天然的、无功能的RDR1GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba（NBRDR1M）由SA诱导，转基因编码GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba成绩单保持在类似的水平GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植物在存在或不存在SA处理(图。GydF4y2Ba4CGydF4y2Ba)．通过RT-定量PCR（RT-QPCR）分析证实，稳态水平GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba转录组中未受SA治疗的影响GydF4y2BaMTRDR1-GydF4y2Ba转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物（图。GydF4y2Ba4D.GydF4y2Ba额外的文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba). 因此，35S启动子用于构建GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植物不受水杨酸的影响，这意味着观察到的水杨酸增强RDR1介导的抗病毒作用（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3B.GydF4y2Ba)必须在转录后水平进行调控。GydF4y2Ba

为了确定SA处理是否影响RDR活性水平，请提取RDR活性丰富的提取物[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]由未感染的对照转基因和GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba在组织收获前48小时，叶片被SA或对照溶液浸润(图。GydF4y2Ba4EGydF4y2Ba)．GydF4y2BaN. Tabacum.GydF4y2Ba（烟草）具有SA-Imucible基因GydF4y2BaNtRDR1公司GydF4y2Ba，它编码了一个功能RDR1 [GydF4y2Ba18GydF4y2Ba，以及非转基因的样本GydF4y2BaN. Tabacum.GydF4y2Ba作为SA诱导RDR活性的阳性对照纳入分析。对照处理EVGydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物包含不归因于RDR1和预期的活动RDR，GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba与EV对照植物相比，植物含有更高水平的可提取RDR活性（图。GydF4y2Ba4EGydF4y2Ba)．尽管SA处理没有增加ev对照植物中活性RDR的提取量(与已知SA诱导的RDR活性缺失相一致)GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba)， SA治疗确实增加了RDR活性GydF4y2BaMTRDR1-GydF4y2Ba转基因植物。这种效应只在SA应用于完整的植物组织时观察到，而在未处理的RDR提取物中观察不到GydF4y2BaN. Tabacum.GydF4y2Ba或GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-表达GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物与水杨酸或生物活性的水杨酸异构体体外孵育(附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

在水杨酸处理的RDR提取物中可检测到MtRDR1蛋白GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物GydF4y2Ba

自体外RDR活性的提取物GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-用水杨酸预处理后，转基因植株增加了约2.5倍，我们研究了这些提取物中MtRDR1蛋白的积累是否有任何变化。用自制的麦芽糖结合蛋白（MBP）MtRDR1融合蛋白制备兔抗MtRDR1多克隆血清GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba（附加文件）GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．用于rdr富集提取物的Western blot分析(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．由于抗MTRDR1血清检测到许多背景植物蛋白条带，还进行了用预imune血清的蛋白质印迹分析（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．抗mtrdr1血清中唯一特异性检测到的多肽为GydF4y2BaCGydF4y2Ba.131 kDa, MtRDR1的预测质量(附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba），这仅存在于来自SA治疗的RDR富集的提取物中，GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植物（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．预计MtRDR1蛋白序列将发生泛素化和多个磷酸化位点(附加文件GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba). 这增加了SA处理稳定蛋白质（通过磷酸化或抑制泛素介导的降解）的可能性，或者SA触发MtRDR1募集到活性复合物中的可能性。GydF4y2Ba

我们研究了RDR1对TMV长距离运动和传播的影响。MtRDR1在GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba不阻止TMV.GFP进入未接种的叶片组织或增强SA对病毒进入这些组织的抑制作用。然而，MtRDR1的表达抑制了向顶端分生组织近端区域的扩散，并且这种运动限制在治疗后变得更加明显GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba- 与SA的自糖植物。Schwach和同事[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba显示了击倒GydF4y2Ba丁腈橡胶6GydF4y2Ba同一宿主的基因表达(GydF4y2BaRDR6i型GydF4y2Ba-转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba)允许PVX进入分生组织，这导致整个植物PVX诱导的疾病症状加重。与以往的工作一致[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]我们发现了GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba在植物中，TMV.GFP进入分生组织附近的组织，尽管它似乎没有进入分生组织本身。在GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-然而，转基因植物TMV.GFP接近分生组织的能力被大大削弱。此外，在GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba- 制株植物TMVU1的通常致命作用是改善和从疾病中恢复。我们的结果具有本构表达的结果GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba补充和扩展Schwach及其同事的研究结果和结论[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba];说明RDR1和RDR6可以抑制病毒进入分生组织附近的组织。两项研究都指出了RNA沉默介导的从分生组织和邻近组织中排除病毒的有效性与病毒引起的疾病症状的严重程度之间的关系。这表明，植物细胞和组织在疾病症状的形成过程中存在一个关键的发育阶段，这一阶段在物理上对应于亚顶区的某一点。如果病毒进入这些组织的时间延迟，例如由于宿主的防御机制，直到这一关键的发育阶段完成后，植物将在一定程度上能够从病毒感染中恢复。GydF4y2Ba

实验结果表明，在实验条件下，纳米材料的磁化率较高GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba包括TMV在内的许多烟草病毒都是由于该物种缺乏活性RDR1引起的[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．应及同事[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]提出了另一种假说，认为RDR1可以增强病毒的传播和积累，并认为RDR1功能的缺失可以增强病毒的传播和积累GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba可能是由于rdr6依赖的抗病毒防御水平的选择性压力。这一假设主要是为了解释攻击非烟草病毒后的结果，因为攻击TMV并没有改变症状，充其量只是温和地减少病毒在系统感染组织中的积累GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba表达NtRDR1的植物[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]. 在我们的研究中，我们没有发现对TMV的易感性增加GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物表达的转基因源于GydF4y2BaM截形GydF4y2Ba．此外，野生的品种GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba含有非截断的、功能良好的NbRDR1基因的病毒，自然能够预防烟草病毒感染的严重症状，并且对粪便病毒或cucumovirus感染的易感程度并不高于其他病毒GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba运送GydF4y2BaNBRDR1米GydF4y2Ba（43）表明RDR1确实在改善小鼠烟草病毒感染方面具有特殊作用GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

RDR1和RDR6对病毒传播的影响在PVX的传播模式上有明显的差异。GFP进入上部未接种的叶片中GydF4y2BaRDR6i型GydF4y2Ba植物(GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]系统性TMV.GFP运动模式GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植物在本研究(图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．具体来说,混战的GydF4y2Ba丁腈橡胶6GydF4y2Ba而MtRDR1的结构性表达并没有减缓TMV的出现。绿色荧光蛋白在这些叶子中。这些差异表明，rdr 1和rdr 6的作用并不完全重叠，而且正如以前所指出的那样，它们在抵御具有不同感染和移动策略的不同病毒方面可能都是有效的[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

这些结果表明，RDR1可能在保护分生组织免受病毒入侵方面发挥类似于RDR6的作用。强烈的GydF4y2Baatrdr1.GydF4y2Ba徐及同事观察到拟南芥韧皮组织的启动子活性[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba可能也有助于限制病毒向血管系统和随后的分生组织的传播，尽管奇怪的是GydF4y2BaAtRDR1启动子：β-葡萄糖醛酸酶GydF4y2Ba报告基因在较年轻的组织中活性较差。然而,由于GydF4y2BaRDR1型GydF4y2Ba与SAR相关的化学信号（SA、一氧化氮和过氧化氢）诱导基因表达[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]以及许多其他植物激素（茉莉酸，脱落酸，植物素，乙烯）和伤害[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba,GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]这可能是由于影响RDR1表达的多种因素及其复杂的调控，使得植物能够在逆境中加强分生组织对入侵的保护，或者在发育过程中控制这种组织对内源因子的可及性。GydF4y2Ba

先前的研究表明，表达功能性RDR1的植物对tmv诱导的疾病的易感性较低，但在直接接种的叶片中，似乎并不需要RDR1来成功诱导对病毒的抗性[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba,GydF4y2Ba19GydF4y2Ba,GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．有趣的是，我们不仅在这里发现的表达GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba启用GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba从TMV株U1引起的严重疾病中恢复，但SA处理也能增强这种恢复。而这可能是由于已知存在的一个或多个RDR1独立的SA诱导抗病毒防御系统的活性所致[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]， SA处理控制转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物仅将tmv诱导的植物死亡延迟了几天，这表明在这种情况下，SA诱导的其他抗病毒防御系统的保护活性不足以解释SA处理后的恢复显著增强GydF4y2BaMTRDR1-GydF4y2Ba转基因GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba植物。GydF4y2Ba

尽管SA和MtRDR1在预防TMV引起的严重疾病方面起协同作用，但尚不能确定这些因素是共同作用还是单独作用。然而，SA增强RDR1活性的假设受到以下观察结果的支持：GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植物在SA处理后含有更多的RDR活性，尽管没有伴随SA诱导的RDR活性增加GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba转基因表达。SA对植物提取物的体外RDR活性没有直接影响（附加文件）GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)表明SA间接影响RDR活性GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba．在sa处理但未处理的rdr1富集制剂中检测与MtRDR1抗体交叉反应的条带GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因植株的RDR1活性较高。研究还表明，RDR1可以通过翻译后过程(es)被SA调控，要么产生更稳定的MtRDR1，要么涉及到MtRDR1蛋白被招募到复合物中。一个GydF4y2Ba生物信息学GydF4y2Ba对MtRDR1蛋白序列的分析揭示了许多候选泛素化和磷酸化位点（补充文件1）GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)．翻译后蛋白质改性在宿主免疫中起重要作用[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba]，例如:泛素依赖蛋白水解负调控烟草中的防御反应[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba];NPR3和4是E3连接酶适配器，在拟南芥中以sa依赖的方式通过蛋白水解控制NPR1活性[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba];和SUMO蛋白酶负调控SA生物合成[GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba］．因此，SA可能以某种方式诱导MtRDR1蛋白对小修饰蛋白介导的降解和/或磷酸化激活/失活的稳定。最近的研究发现，包括RDR6在内的一些RNA沉默因子彼此之间以及与膜等其他细胞成分形成复合物，使得复合物组装的想法更加合理[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba］．另一种可能性是增强了GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba导致MtRDR1蛋白合成增加的转录物，但很难设想其可能的机制。GydF4y2Ba

总之，我们的结果支持植物激素诱导因子RDR1通过限制病毒进入分生组织附近的区域从而改善病毒诱导疾病的严重性在抗性中的重要作用。其抑制进入分生区的能力与TMV诱导的疾病症状的改善相关，并被SA增强。我们的数据表明，SA可能在转录后水平上增强RDR1的活性，除了先前报道的这种激素对基因转录的影响之外GydF4y2BaRDR1型GydF4y2Ba基因。GydF4y2Ba

植物生长条件GydF4y2Ba

实验室种子GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba多明。[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]非转基因、对照转基因（品系V19-1）和GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba-转基因(系R15-1)株系[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]还有烟草(GydF4y2BaN. Tabacum.GydF4y2BaL简历。在控制环境室（加拿大马尼托巴省温尼伯市Conviron有限公司）培养的土壤和植物中发芽，光周期为16小时（200μE.mGydF4y2Ba^2.GydF4y2Ba．s^{−1.GydF4y2Ba}在22°C和60%相对湿度下。GydF4y2Ba

病毒菌株，化学处理和感染检测GydF4y2Ba

本研究使用的病毒株为TMV常见(U1)株[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba]和TMV.GFP（Shivprasad等人构建的TMV30B.GFP）[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]). 如前所述，通过体外转录重新产生带帽的TMV.GFP感染性RNA，并将其接种到3-5周龄的小鼠上GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba根据Murphy等人的描述[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba］．用SA整株处理，5- 6周龄GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba连续4天喷洒一种对照溶液[0.05% (GydF4y2Baw/v公司GydF4y2Ba)乙醇]或1 mM SA溶于0.05%(GydF4y2Baw/v公司GydF4y2Ba)乙醇，然后机械接种TMV U1或TMV。在一或两片下部叶子上的绿色荧光蛋白[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]. 如前所述，用溶于0.05%的2.5 mM SA进行渗透处理(GydF4y2Baw/v公司GydF4y2Ba)乙醇[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．使用抗TMV外壳蛋白血清的Western blot检测TMV采用前面描述的方法[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]. 使用手持式紫外线灯和尼康Cool Pix数码相机或使用尼康Optiphot 2（英国泰晤士河金斯顿尼康有限公司）的荧光显微镜观察GFP荧光[GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

RNA提取、cDNA合成和PCRGydF4y2Ba

制备总RNA [GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba]用TURBO-DNase处理dna酶I-GydF4y2Ba免费的GydF4y2Ba套件（Ambion，Austin，TX）。根据制造商的说明，使用载体III（Invitrogen，Paisley，UK）用1μg处理的RNA进行第一链cDNA合成。用于半定量或定量PCR的引物被列为额外文件中的表GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba．对于植物基因表达的半定量RT-PCR分析，使用以下条件用RedTAQ DNA聚合酶（Sigma-Aldrich，Poole，UK）扩增cDNA：1个94℃的循环2分钟;27至40次循环为94℃，5℃，55℃，30s，72℃，40秒;和1个72℃的循环5分钟。通过电泳在1.5％琼脂糖凝胶上进行PCR产物。用于RT-QPCR分析GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba将cDNA模板1:5稀释，按照制造商说明使用SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)进行qPCR。在Chromo4 PCR系统(Bio-Rad, Hemel-Hempsted, UK)上重复进行反应(40个循环:94°C for 15 s, 57°C for 30 s, 72°C for 40 s)，并使用LinRegPCR程序分析[GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba］．相对转录本水平GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba使用2GydF4y2Ba^{——ΔΔC (t)GydF4y2Ba}方法[GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba] 使用GydF4y2BaNbEF1αGydF4y2Ba作为内部参照物(在SA存在时为稳定性而事先认证的)[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba])。GydF4y2Ba

RDR活性的分离与测定GydF4y2Ba

对富含rdr1的提取物进行了分离，并对rdr1活性进行了测定，如Xie及其同事所述[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．叶组织（2克鲜重）从21天老GydF4y2BaN. Tabacum.GydF4y2Ba或GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba用0.05% (0.05%)1mm SA浸泡48 h后收获。GydF4y2Baw/v公司GydF4y2Ba)乙醇或对照溶液[0.05% (GydF4y2Baw/v公司GydF4y2Ba)乙醇]。组织在4 ml缓冲液A（50 mM三醋酸盐pH 7.4，10 mM醋酸钾，1 mM EDTA，10 mM 2-巯基乙醇和0.5 mM苯甲磺酰氟）中均化，在1000℃下离心 × GydF4y2BaGGydF4y2Ba12min, 14000 ×再次离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba将甘油加入最终比例为20%后，持续10分钟(GydF4y2Bav / vGydF4y2Ba)．等体积的4m (NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba加入到每个上清液中，在轨道摇床上轻轻搅拌(50 rpm) 2小时后蛋白质沉淀。用1 ml缓冲液B [25 mM Tris-acetate pH 8.2, 1 mM EDTA, 20% (GydF4y2Bav / vGydF4y2Ba）甘油和3mm 2-巯基乙醇]两次。将RDR1富含蛋白质提取物重新悬浮在300-500μL缓冲液B中并透析缓冲液B.所有制备步骤在4℃下进行。使用Bradford的方法测定蛋白质浓度[GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba使用Bio-Rad蛋白定量试剂盒。GydF4y2Ba

在含有25μg RDR1富集蛋白制剂（含50 mM Tris–HCl（pH 8.0）、10 mM MgCl）的50μl最终体积中进行体外RDR测定GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba，1 mM DTT，1 mM ATP、GTP、UTP和2μM CTP各添加α-[GydF4y2Ba^32GydF4y2BaP]CTP (perkinelmer, Little Chalfont, UK)和4 μg总RNAGydF4y2BaN. Tabacum.GydF4y2Ba树叶 [GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．通过加入RDR1富集的蛋白质制剂并在30℃下孵育2小时来引发反应。通过在95℃下孵育5分钟并置于冰上的反应。纳入α-[GydF4y2Ba^32GydF4y2BaCTP转化为RDR反应产物，采用闪烁计数法对三氯乙酸可沉淀物质中的放射性进行定量[GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba]使用Optiphase Hisafe 3闪烁鸡尾酒（Perkin-Elmer）和2000 Tri-Carb液体闪烁分析仪（Packard，伊利诺伊州，美国）。使用至少三种生物重复进行RDR测定。GydF4y2Ba

重组MTRDR1的表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba并生产兔多克隆抗MTRDR1GydF4y2Ba

质粒pMAL-MtRDR1是通过在pMAL-c2E（新英格兰生物实验室，马萨诸塞州，美国）中克隆MtRDR1到MBP编码序列的羧基末端，使用KpnI和HindIII限制性内切酶位点获得的。细胞GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaTB1菌株(NEB)与pMAL-MtRDR1和CodonPlus质粒(Stratagene)共转化。CodonPlus质粒包含分别识别精氨酸密码子AGA和AGG、异亮氨酸密码子AUA和亮氨酸密码子CUA的tRNAs基因，这提高了最常限制富含at的真核基因翻译的tRNAs的可用性GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba. 如制造商说明书（NEB）（附加文件）所述，通过直链淀粉树脂柱层析法诱导并纯化由pMAL-RDR1克隆表达的重组蛋白GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．直链淀粉柱馏分在连接AKTA纯化系统(GE Healthcare Life Sciences, USA)的HiLoad Superdex200柱上进一步纯化。纯化组分在SDS-PAGE凝胶上运行，并用考马斯亮蓝R-250染色(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．从SDS page凝胶中提取假定的MBP-MtRDR1融合蛋白，并用MALDI-TOF MS进行验证[GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba]（数据未显示）。将含有1 mg MtRDR1蛋白的凝胶切片送至Covance Inc.（美国宾夕法尼亚州丹佛市）进行抗体生产，在对免疫前血清取样后的14、35、49和70天，向两只兔子（OK127和OK129）分别注射125μg MtRDR1蛋白。在第45天收集试验出血，在第59天和第77天收集生产出血。用NAb蛋白A/G旋转柱（美国皮尔斯）纯化试验出血和生产出血。从兔OK129获得的抗体在初步实验中表现出更好的活性（数据未显示）。因此，本研究使用了抗MtRDR1和相应的兔OK129免疫前血清。GydF4y2Ba

MtRDR1的Western印迹分析GydF4y2Ba

如上所述制备富含RDR1的蛋白质提取物，并用SDS-PAGE在15%条件下分析等量的蛋白质(GydF4y2Baw/v公司GydF4y2Ba)丙烯酰胺凝胶[GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba]在电泳转移到硝酸纤维素之前[GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba]. 用胭脂红S染色法证实了蛋白质样品的等载量。用兔多克隆抗MtRDR1血清（1:10000稀释）或对照免疫前兔血清（1:10000稀释）作为一级抗体，然后用与辣根过氧化物酶结合的抗兔IgG（1:15000稀释）作为二级抗体，进行MtRDR1累积的Western blot分析。使用Western Lightning化学发光试剂Plus（PerkinElmer）和Konica Minolta AX胶片（Konica Minolta Medical and Graphic，日本）检测结合抗体。GydF4y2Ba

生物信息学GydF4y2Ba预测MtRDR1序列的磷酸化和泛素化位点GydF4y2Ba

生物信息学GydF4y2Ba翻译的GydF4y2BaMtRDR1型GydF4y2Ba用ExPASy翻译工具进行cDNA序列分析(GydF4y2Bahttp://web.expasy.org/translate/GydF4y2Ba)来自瑞士生物信息学研究所ExPASy生物信息学资源门户。利用netphos2.0软件预测MtRDR1蛋白序列中潜在的磷酸化位点(GydF4y2Bawww.cbs.dtu.dk /服务/ NetPhos /GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba]. NetPhos 2.0生成0.000到1.000范围内的分数，以指示丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸作为磷酸化位点的可能性，分数>0.500的残基被指定为潜在的磷酸化位点。UbPred软件(GydF4y2Bahttp://omictools.com/ubiquitination-sites-categoryGydF4y2Ba)用于预测潜在的泛素化位点[GydF4y2Ba70GydF4y2Ba］．泛素化评分>0.62的残基被认为是潜在的泛素化位点，评分在0.62 - 0.69之间的残基是低置信度预测，评分在0.69-0.84之间的残基是高置信度预测。GydF4y2Ba

支持数据的可用性GydF4y2Ba

支持本文结果的数据集包含在本文及其附加文件中。GydF4y2Ba

以前：GydF4y2Ba

ArgonauteGydF4y2Ba

巨细胞病毒：GydF4y2Ba

黄瓜花叶病毒GydF4y2Ba

DCL:GydF4y2Ba

骰子样核酸酶GydF4y2Ba

企业价值：GydF4y2Ba

空向量GydF4y2Ba

绿色荧光：GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

人力资源：GydF4y2Ba

过敏的反应GydF4y2Ba

MBP:GydF4y2Ba

麦芽糖结合蛋白GydF4y2Ba

建议制定规则1：GydF4y2Ba

Pr蛋白的非富沸点1GydF4y2Ba

PR：GydF4y2Ba

pathogenesis-related蛋白质GydF4y2Ba

PVX：GydF4y2Ba

马铃薯X病毒GydF4y2Ba

RDR编号：GydF4y2Ba

依赖RNA的RNA聚合酶GydF4y2Ba

南非：GydF4y2Ba

水杨酸GydF4y2Ba

特别行政区:GydF4y2Ba

系统获得性耐药GydF4y2Ba

烟草花叶病毒:GydF4y2Ba

烟草马赛克病毒GydF4y2Ba

VSR:GydF4y2Ba

RNA沉默的病毒抑制因子GydF4y2Ba

我们感谢陈志祥对RDR分析方案的建议。萧强望和甄天磊在塞缪尔罗伯茨贵族基金会的AKTA纯化方案和重组MBP：MTRDR1融合蛋白的分析。感谢David Baulcombe、Peter Palukaitis、Joel Milner和Lydia Hunter的积极讨论和有益建议，感谢Adrienne Pate的专家技术援助。FSF由剑桥海外信托基金和台湾教育部资助，WSL由生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC）资助，Carr实验室的工作由BBSRC资助（BB/D008204/1，BB/D014376/1，BB/J011762/1），Leverhulme信托基金（F/09 741/F，RPG-2012-667）和剑桥大学艾萨克牛顿信托基金[格兰特12.07（1）]。RSN和SRC由塞缪尔罗伯茨诺贝尔基金会资助。GydF4y2Ba

资助者不参与数据的设计、收集、分析和解释;在手稿的写作中;并在决定将稿件提交出版。GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. Shih-Feng傅GydF4y2Ba

   现住址:台湾省彰化市金德路1号彰化教育学院生物系GydF4y2Ba

2. 翼假李GydF4y2Ba

   现任地址:英国罗瑟斯塔研究所，哈彭登，赫特福德郡，AL5 2JQGydF4y2Ba

3. 马修G。路易GydF4y2Ba

   现址:澳大利亚拉筹伯大学生命科学学院动物、植物和土壤科学系农业生物科学中心GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 剑桥大学植物科学系，唐宁街，剑桥，英国CB2 3eaGydF4y2Ba

   李永善、傅世峰、李峥、M。墨菲，伊丽莎白A。多布森，劳拉·加兰，马修·G。Lewsey&John P。卡尔GydF4y2Ba

2. 美国阿德摩尔山姆诺布尔公园路2510号，OK, 73401，塞缪尔·罗伯茨诺布尔基金会植物生物学部GydF4y2Ba

   Srinivasa Rao Chaluvadi和Richard S。纳尔逊GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba约翰·p·卡尔GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

WSL、FSF、ZL和AMM在EAD、LG和MGL的基础上进行了实验。SRC和RSN制备并表征了抗mtrdr1，并提供了抗mtrdr1的种子GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba用空向量或包含MtRDR1的向量进行变换。JPC发起并指导了这项研究。JPC、WSL、AMM和FSF撰写了手稿，所有作者都提供了额外的信息。所有作者都阅读并批准了最后的手稿。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文在知识共享归属4.0国际许可条款下发布(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，允许在任何介质中不受限制地使用、分发和复制，前提是您给予原始作者和来源适当的信任，提供到知识共享许可证的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域放弃(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba